JP2002514042A

JP2002514042A - 植物中で病気抵抗性を増強する遺伝子

Info

Publication number: JP2002514042A
Application number: JP50187598A
Authority: JP
Inventors: マーティン，グレゴリー・ビー; チョウ，ジャンーミン
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1996-06-12
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2002-05-14
Also published as: BR9709688A; EP0921719A1; WO1997047183A1; US6653533B1; CA2258127A1; PL330415A1; EP0921719A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物遺伝子工学により病原体に対して植物を保護するための方法および材料に関し、より具体的には、植物防御機構の活性化に関与するＲ遺伝子産物と物理的に相互作用するタンパク質をコードすることによって植物内の病気抵抗性を増強する遺伝子に関する。本発明はさらに、クローニング、単離かつ配列決定された３種のヌクレオチド配列、それによってコードされる３種のアミノ酸配列、並びに病原体に抵抗する植物の能力を増強するように機能する本発明により選択される外来ヌクレオチド配列をゲノムの中に取り込んでいるトランスジェニック植物およびその作製方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】植物中で病気抵抗性を増強する遺伝子本発明は、以下の補助金：ＮＳＦにより与えられた補助金番号ＭＣＢ−９６− ３０６３５の下、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。関連出願の引用本出願は、１９９６年６月１２日出願の米国予備出願番号第６０／０９１，６３３号、並びに１９９７年５月１４日出願の「トマト細菌性斑点病に対する抵抗性を付与するＰＴＯキナーゼは病原関連遺伝子のシスエレメントに結合するタンパク質と相互作用する」と題する米国予備出願の利益を請求するものであり、これらの各々はその全てが引用により本明細書に取り込まれる。発明の背景発明の分野本発明は、植物遺伝子工学による病原体からの植物の保護のための方法および物質に関する。より詳細には、本発明は、植物のシグナル伝達経路において病気抵抗性遺伝子（Ｒ遺伝子）によってコードされるタンパク質と物理的に相互作用することによって植物防御機構を活性化するタンパク質をコードすることによって病原体の攻撃に抵抗する植物の能力を増強する遺伝子に関する。本発明はまた、植物のゲノムがその中に病原体に抵抗する植物の能力を増強するために機能する本発明により選択される外来ヌクレオチド配列を取り込んで有している、トランスジェニック植物およびそれの作製方法にも関する。関連技術の説明ウイルス、細菌、真菌および線虫などの病原性生物から生じる作物の損失は、多種多様な農業産業における歴史的かつ一般的な問題である。病原体関連植物損害により生じるこれらの作物の損失は、毎年数１０億ドルに上る経済損失をもたらす。この問題は過去においては、多様な化学物質を使用して植物作物への害虫の損傷を減少することによって扱われていた。しかし、この試みは殺虫性化学物質の広範な使用によって生じた多くの環境問題を伴ってきており、化学物質は作物の一過性水準の保護を提供するにすぎないことが多い。化学物質はまた、ある領域中の全ての生物が無差別に処理され、多くの有益な生物に不要な損傷をもたらすという欠点をも有している。多分より重要なことは、多くの化学物質はヒトおよび動物に対して潜在的に毒性であり、例えば、湖および池および／または他の水源に濃縮されることが多いということである。その結果、作物の損害を減少するために別の方法が探索されており、その一例は病原体抵抗性特性に基づく植物の選択的繁殖である。しかし、抵抗性特性は、多数の遺伝子により調節される場合もあり、所望の属性を満足すべき程度まで遺伝的に選択することは困難である。作物産出量の減少も、選択的繁殖によって開発した抵抗性植物で遭遇する場合がある。従って、病原体による攻撃から植物の抵抗性を改善するための組成物および方法に対する強い要望が存在する。それらは、植物を遺伝的に形質転換して、それによって病原体攻撃に対する植物抵抗性を強化するのに有用な組成物および方法を提供する本発明によって、供給される。本発明によって選択されるヌクレオチド配列などの転移遺伝子は、形質転換された植物で発現して細胞中にそれによってコードされるタンパク質を産生する。簡単に言うと、ＤＮＡ配列の転写は、ＤＮＡ配列のプロモーター領域に対するＲＮＡポリメラーゼの結合によって開始される。転写の間、ＤＮＡ配列に沿ったＲＮＡポリメラーゼの移動は、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を形成し、その結果、ＤＮＡ配列は対応するｍＲＮＡに転写される。このｍＲＮＡは次いで、粗面小胞体のリボソームに移動し、それが転移ＲＮＡ（「ｔＲＮＡ」）によりｍＲＮＡをそれによってコードされるタンパク質に翻訳する。形質転換された宿主中にかくして産生した本発明のタンパク質は次いで、病原体抵抗性に対応する植物のシグナル伝達経路で重要な機能を演じる。抵抗性機構に関与する事象の順番は十分に理解されていないが、本発明によって意図されるタンパク質がこのシグナル伝達経路に参加することによって植物の抵抗性応答を増強することは明らかである。一般的に病原体に対する植物抵抗性に対して解説するために、植物は病原体感染に対して多様な方法で応答し、例えば、感染部位での局在化した壊死の急速な誘導(過敏性応答、ＨＲ)、抗微生物性化合物の産生、リグニン形成、酸化的破裂、および防御関連遺伝子の発現の増加などが含まれる。２種のカテゴリーの遺伝子、従ってタンパク質が植物の応答系に関与しており、それは病気抵抗性（Ｒ）遺伝予と防御遺伝子である。Ｒ遺伝子は典型的には病原体認識および／またはシグナル伝達において役割を演じるタンパク質をコードする。Ｒ遺伝子は、特定の植物種ではそれらの多形性に基づいて同定されるかもしれない。即ち、ある作物の変種は特定のＲ遺伝子を含有し、他のものはその遺伝子を欠いているかもしれない。抵抗性および感受性の作物変種の間での遺伝的交配の子孫の分析により、染色体上の特定の領域にＲ遺伝子をマッピングすることが可能になる。Ｒ遺伝子は常にではないがしばしば、優性遺伝子作用を示し、病気抵抗性の付与において重要な質的な役割を演じる。それらはしばしばゲノム中の一カ所にマップされ、遺伝子ファミリーの一員であることが判明することが多い。Ｒ遺伝子は、防御応答の後期において（病原体認識後に）病気抵抗性で役割を担う場合がある他の遺伝子とは相違する。これらの他の「下流」遺伝子はしばしば「防御遺伝子」または「防御関連遺伝子」と称され、「病原関連」(ＰＲ)遺伝子として知られる遺伝子のクラスを含む。防御関連遺伝子の発現の増加に関して、一組の植物防御関連遺伝子の転写活性化が病原体侵入に一般に関連していることが長らく認識されていた。防御遺伝子には、例えば、病原関連タンパク貿(ＰＲｓ)、ヒドロキシプロリン・リッチ・糖タンパク質、およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）およびカルコン（chalcone）シンターゼなどのフィトアレキシン生合成のための酵素をコードする遺伝子が含まれる。植物病気抵抗性におけるこれらのタンパク質の役割は十分に理解されていないけれども、それらの酵素の機能は、それらが病原体に対する防御に十分に適していることを示している。予備的探索の結果は、広大な調査を防御遺伝子の生物的機能と防御遺伝子が活性化される機構へと駆り立てた。Ｒ遺伝子に関して、植物の病気抵抗性は病原体および植物宿主の両方における単一遺伝子の遺伝的相互作用によって誘導されるかもしれないと仮定されていた。病気抵抗性の現象は病原体と宿主の潜在的適合可能部分との物理的接触によって開始されると考えられる。通常は病原体の風または雨によって運ばれた堆積の結果として、そのような接触が一度生じると、病原体は発病プロセスを開始するためにそのような接触が確立したことを認識しなければならない。同様に、宿主によるそのような認識も抵抗性応答を開始するためには必要である。かなりの量の研究が現在そのような認識が生じる正確な様式を解明することに焦点が向けられている。病原体認識は、植物組織の低ｐＨまたは植物特異的代謝産物の存在に関連すると考えられている。植物認識は種特異的機構の結果として生じ、そこでは宿主病気抵抗性（Ｒ）遺伝子のタンパク質産物が病原体の非病原性遺伝子の産物を認識するものと考えられる。その結果、植物の防御応答は活性化され、多様な因子の産生（例えば、ガムまたはコルクの産生、病原体プロテアーゼの阻害剤の産生、細胞壁におけるリグニンとヒドロキシプロリン・リッチ・タンパク質の堆積）並びに攻撃的抵抗性因子の産生（例えば、フィトアレキシンの産生、分泌されたキチナーゼ）が導かれる。これらの因子を産生する遺伝子の活性化の速度およびレベルが十分に高ければ、宿主は病原体に対する優越性を獲得することができる。反対に、病原体が感染プロセスのより初期の段階で十分に活性化されれば、植物の攻撃的および防御的抵抗性因子の両方を圧倒するかもしれない。この点に関して、誘発物質および病原体により誘導された防御遺伝子発現に関与するシス作用要素の同定に多くの努力が向けられてきており、防御応答に関与する幾つかの推定上の転写因子が同定されている。多くの防御関連遺伝子は適合性（感受性）および非適合性（抵抗性）植物病原体相互作用の両方で誘導される。しかし、多くの防御遺伝子の発現は非適合性病原体を受けた植物中ではより急速で著しい。多くの植物病原体相互作用において、これらの防御応答は、対応するＲ遺伝子を含有する植物宿主による特異的非病原性（ａｖｒ）遺伝子を保持する病原体の認識により活性化される。特に、植物Ｒ遺伝子および対応する病原体ａｒｖ遺伝子を含む非適台性相互作用は、加速された植物防御遺伝子発現を導く。多くのＲ遺伝子は、ａｒｖ遺伝子によって決まるシグナルの認識またはシグナル伝達の初期段階の何れかに関与するらしいタンパク質をコードする。しかし、Ｒ遺伝子と防御遺伝子の活性化との間の直接の関連は以前には確立されていない。トマトにおいては、細菌病原体Pseudomonas syringae pv.tomato（細菌斑点病を引き起こす）に対する抵抗性が優性遺伝子作用を示す単一の部位（Pto）に関連していることが示された。非病原性遺伝子ａｖｒＰｔｏを発現するPseudomo nas syringae pv.tomato株に対するＰｔｏ部位を有する植物の抵抗性は、特異的Ｒ遺伝子によって仲介されるシグナル伝達経路のためのモデル系である。この系は、複数の成分に対する遺伝子がクローン化されているＲ遺伝子仲介抵抗性経路の唯一の例を構成する。現在、３つの成分がＰｔｏによって仲介されるシグナル経路に関与することが知られている：セリン／トレオニンプロテインキナーゼＰｔｏ、第２のセリン／トレオニンキナーゼＰｔｉ１、およびロイシン・リッチ反復型タンパク質Ｐｒｆ。Ｐｔｏ遺伝子はLycopersicon pimpinellifolium、野生トマト種で最初に発見され、マップに基づいたクローニングによって単離された。細菌斑点抵抗性トマト株の変異誘発により第２の遺伝子、Ｐｒｆが明らかになり、これはＰｔｏ仲介抵抗性およびフエンシオン感受性（Ｆｅｎ遺伝子によって仲介される関連した表現型）の両方に必要である。餌（bait）としてＰｔｏを有する酵母２ハイブリッド系を使用して、本発明者らは、Ｐｔｏの下流で作用するらしく、過敏性応答に関与する別のプロテインキナーゼＰｔｉ１を同定した。本発明によれば、植物転写因子の大きなファミリーの中に属する３つの追加のＰｔｏ相互作用タンパク質、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５およびＰｔｉ６（本明細書中では、Ｐｔｉ４／５／６とも称する）が同定される。これらのタンパク質は、「病原関連」(ＰＲ)遺伝子の間で広く保存されているシス要素に結合し、非適合性植物−病原体相互作用の間にこれらの遺伝子の調節に関係している。Ｐｔｉ４／５／６は各々、転写因子に典型的な特徴を有する。本発明者らは、Ｐｔｉ４／５／６がＰＲタンパク質をコードする多数の遺伝子のプロモーター領域に存在するＤＮＡ配列を特異的に認識しそれに結合することを見いだした。従って、病気抵抗性遺伝子と植物防御遺伝子の特異的活性化との間に直接の関係が見つかった。発明の要旨本発明は、病原体活性に直面した場合に防御機構を活性化する植物の能力を増強する転写因子をコードすることによって病原体に関連した病気に抵抗する植物の能力を増強するのに有用な、例えば、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５およびＰｔｉ６（「Ｐｔｉ４／５／６」）などのようなヌクレオチド配列の単離、精製および使用に関する。ｐｔｉ４／５／６によってコードされるタンパク質は、病原体の攻撃に抵抗する植物の能力を増強するのに有用である。Ｐｔｉ４／５／６ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は各々、ＤＮＡ結合ドメイン、推定核局在化シグナル（ＮＬＳ）および酸性アミノ酸に富む領域を保持する。Ｐｔｉ４／５／６の新たに単離されたＤＮＡ配列がＰｔｏキナーゼと物理的に相互作用する転写因子をコードすることが今回示される。本発明は、ウイルス、細菌および真菌を含む多種の型の病原体に対する新規な形態の植物の保護を提供する。本発明がその有利な効果を達成する機構によって本発明を限定することは意図されないが、これらの転写因子の操作により植物病気抵抗性に関与する多数の遺伝子の調和した調節が可能になると考えられる。従って、本発明は、本明細書中に記載した、Ｐｔｉ４／５／６遺伝子のＤＮＡ配列およびＰｔｉ４／５／６タンパク質のアミノ酸配列、並びにそれと実質的な同一性を有し、同様のレベルの活性を有するＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を特徴とする。本発明の遺伝子を発現ベクターに挿入して、組み換えＤＮＡ発現系を産生できるが、これも本発明の一面である。本発明の一つの側面では、植物に病気抵抗性を付与する本発明のＤＮＡ配列を使用して、細胞を形質転換したり植物を形質転換する。本発明の別の側面では、本発明の組み換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換され、そのＤＮＡ配列を発現できる植物細胞を生育させることによって植物に病気抵抗性を付与する方法が提供される。本発明のヌクレオチド配列によって形質転換された植物はそれによって、植物抵抗性遺伝子に対応するａｖｒ遺伝子を有し、病原体による攻撃に抵抗する増強された能力を有する。本発明の目的は、植物に病気抵抗性を付与するのに有用な単離、配列決定および精製されたタンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、上記タンパク質をコードし、植物または微生物のための形質転換体としてベクターまたはプラスミド中に取り込んだ際に有利な用途を有する単離されたヌクレオチド配列を提供することである。さらに、本発明の目的は、病原体による攻撃に抵抗する増強された能力を有する形質転換された植物を提供することである。本発明のさらなる目的、利点および特徴は本明細書中の詳細な説明から明らかであろう。図面の簡単な説明本発明の特徴的な特徴は請求の範囲中に特定的に記載されるであろうが、本発明自体、および本発明を作製し使用する様式は、本発明の一部を形成する添付図面に関連してなされる以下の説明を参照することによってより理解することができるかもしれない。図１は、Ｐｔｉ４／５／６アミノ酸配列を比較用に並べたものである。プリティ・ボックス・プログラム（ＧＣＧパッケージ、バージョン７．０）を使用して最適に並べたものを作成した。また図１には、アミノ酸コンセンサス１モチーフ（「Ａ」）およびアミノ酸コンセンサス２モチーフ（「Ｂ」）をも示す。図２は、本明細書中の実施例１に記載した実験の結果を記載する。簡単に言うと、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５またはＰｔｉ６の餌食（prey）(ｐＪＧ４−５中に)とＰｔｏ、ＰｔｏまたはＢｉｃｏｉｄのえさ（balt）を（ｐＥＧ２０２中に）含むＥＧＹ４８酵母細胞をガラクトースＵｒａ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｘ−Ｇａｌ培地上で生育させた。プレートを３０℃で３日間インキュベートし、写真を取った。４つの独立した代表的コロニーを各々のえさ／餌食の組み合わについて示す。図３は、本明細書の実施例２に記載したゲルブロット分析操作の結果を記載する。図４は、本明細書の実施例４に記載したゲル移動度シフトアッセイの結果を記載する。発明の詳細な説明本発明の原理の理解を促進する目的のために、本発明の特定の態様を参照し、特定の用語を使用して本発明を説明する。にもかかわらず、本発明の範囲の限定はそれによって意図されることはないものと理解され、本発明におけるそのような変更およびさらなる改良、並びに本明細書に記載した通りの本発明の原理のそのようなさらなる応用は、本発明が属する分野の通常の知識を有する者によって通常行われるであろうと推認されるであろう。本発明は、Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質と物理的に相互作用して、例えばＰＲ遺伝子などの植物防御遺伝子の活性化を増強するタンパク質をコードすることによって植物に病気抵抗性を付与するヌクレオチド配列に関する。本発明者らは３種の生物学的かつ商業的に有用なタンパク質(Ｐｔｏ相互作用タンパク質、または「Ｐｔｉ」タンパク質）、Ｐｔｉ４／５／６を単離、配列決定および同定し、またそれらＰｔｉ４／５／６をコードする３種の新規なヌクレオチド配列を単離、配列決定およびクローニングした。本発明のヌクレオチド配列の向上した発現を本発明に従って植物中で達成する場合、植物は病原体の攻撃に抵抗する改善された能力を有するであろう。そのように、本発明の有利な特徴には、病原体攻撃に対する優れた抵抗性を提供するための多様な農業的および／または商業的に価値のある植物種の多種多様な植物の形質転換が含まれる。本発明による３種のアミノ酸配列を以下の配列番号１（Ｐｔｉ４）、配列番号２（Ｐｔｉ５）および配列番号３（Ｐｔｉ６）に記載する。用語「タンパク質」および「アミノ酸配列」とは、順番の配列で結合した複数のアミノ酸を示すために本明細書中では可変的に使用される。当業者ならば、変異および／または進化の過程を通じて、（ａ）アミノ酸配列ホモロジー；および（ｂ）病原体抵抗性に関する優れた機能性によって本発明のタンパク質と関連する、異なる長さを有し異なる構成成分を有する、即ち、アミノ酸挿入、置換、欠失などを有するタンパク質が生じるかもしれないことを認識するであろう。多くの欠失、挿入および特に置換は、タンパク質の特徴に急激な変化を生じることが予測されない。しかし、置換、欠失または挿入の正確な影響をそれを行う前に予測することが困難である場合には、当業者ならばその効果を通常のスクリーニングアッセイによって評価できることを理解するであろう。従って、上記で明白に示したタンパク質に加えて、本発明はまた、本明細書に記載したタンパク質と実質的同一性を有するタンパク質をも意図する。アミノ酸配列に関して本明細書中で使用する用語「実質的同一性」とは、十分に類似していて、本発明に従い形質転換した植物内で発現させた場合に、改善された病原体抵抗性を引き起こすものを意味することが意図される。本発明の一つの好ましい側面では、配列番号１、２および３に記載したアミノ酸配列と少なくとも約５０％の同一性を有する、上記したもののような潜在的修飾を有する変異体が、それに対して「実質的同一性」を有すると考えられる。より低い程度の同一性を有するが、匹敵する生物活性を有する配列は均等であると考えられる。適切な機能性を維持するのに必要な同一性は、タンパク質の三次構造の維持に関係すると考えられ、特定の相互作用配列が正確に位置し、所望の活性を有するのであろう。そのように、アミノ酸配列内には慎重なドメインおよびモチーフが存在していて、それらはタンパク質の有利な機能性および特異性を保持するためにタンパク質のために存在しなければならないと考えられる。本発明がその有利な効果を達成する理論によって本発明を限定することを意図するものではないが、実質的な置換、挿入および／または欠失が配列のどこか他の場所で生じた場合でさえ、これら慎重なドメインおよびモチーフを適切な空間関係で含むタンパク質はＲ遺伝子産物との相互作用に関して良好な活性を有することが意図される。この点に関して、タンパク質が１以上のアミノ酸コンセンサスモチーフを含み、配列番号１、２または３に記載したタンパク質と実質的に同様の活性を有する場合には、そのタンパク質は本発明により有利な用途を有するであろう。本明細書中で使用する用語「アミノ酸コンセンサスモチーフ」とは、本発明のタンパク質の間で実質的に保存されている本発明のアミノ酸配列の全部または一部を示すことが意図される。例えば、図１を参照すると、ボックスで標識した「Ａ」は、アミノ酸コンセンサス１モチーフを含み、一般的には以下の配列を含む。式中、２個のアミノ酸の間または一連のアミノ酸中の「／」は、示されたアミノ酸の何れか１種がその位置に存在することを示し；式中、「−−Ｘ−−」は、１以上のアミノ酸がその位置に存在してもよいが約１５アミノ酸を越えることはないことを示す。ボックスで標識した「Ｂ」は、アミノ酸コンセンサス２モチーフを含み、一般的には以下の配列を含む。式中、２個のアミノ酸の間または一連のアミノ酸中の「／」は、示されたアミノ酸の何れか１種がその位置に存在することを示し；式中、「−−Ｘ−−」は、１以上のアミノ酸がその位置に存在してもよいが約１５アミノ酸を越えることはないことを示す。アミノ酸コンセンサス１モチーフおよび／またはアミノ酸コンセンサス２モチーフを含み、本明細書中に記載したアミノ酸配列と実質的に同様の機能性を有するタンパク質は、本発明の範囲の中に含まれることが意図される。本発明の好ましい側面では、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４(Ｐｔｉ４)、配列番号５（Ｐｔｉ５）および配列番号６（Ｐｔｉ６）として以下に記載するヌクレオチド配列を有する。用語「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドの天然または合成の直線かつ順番の列、およびその誘導体のことを称することが意図される。本発明による使用のために選択されるヌクレオチド配列は、多種多様な植物種に対応するｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることができる。本発明はまた、配列番号１、２および３に記載した配列と実質的同一性を有するヌクレオチド配列を意図する。用語「実質的同一性」とは、ヌクレオチド配列に関して本明細書中では使用され、適度にストリンジェントな条件下でそれにハイブリダイズするであろう上記で明白に記載したものの一つに十分に類似した配列をヌクレオチド配列が有することを示し、同一性を測定するこの方法は本発明が属する技術分野で周知である。簡単に言うと、適度にストリンジェントな条件は Sambrook他、Molecular Cloning;a Laboratory Manual,2ed.Vol.1,pp.101-104,C old Spring Harbor Laboratory Press(1989)に定義されており、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のプレ洗浄溶液と、約５５℃ での５×ＳＳＣのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の使用が含まれている。用語「実質的同一性」が本発明のヌクレオチド配列に関する場合、その用語のさらなる要件は、それが本発明のタンパク質、即ち、病原体に抵抗する植物の能力を増強する様式でＲ遺伝子産物と物理的に相互作用することができるタンパク質をコードしなければならないということである。本発明による好適なＤＮＡ配列は、例えば、関連分野で周知であるクローニング技術によって入手することができ、または同様に当分野で周知である化学合成技術によって作製することができる。好適なヌクレオチド配列は、配列番号４、５および６に記載した配列；それと実質的同一性を有するヌクレオチド配列；またはそれらの一部などのような本発明に従い選択されたヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用する核酸ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって、多種多様な種から得たＤＮＡライブラリーから単離することができる。本発明のある好ましい側面では、Ｐｔｉ４／５／６、またはそれと実質的同一性を有しその種に天然に存在するＲ遺伝子産物または他の植物種のＲ遺伝子産物との相互作用に関して優れた活性を有するタンパク質をコードする多種多様な植物種由来のヌクレオチド配列を単離および／または増幅することができる。本明細書中に具体的に記載または本発明により選択されるヌクレオチド配列は、それを単離した種を含むがそれに限定されない、多種多様な植物種において有利に使用できることが期待される。本発明のある好ましい側面では、ＰＣＲプライマーが、ヌクレオチドコンセンサスモチーフがその中に存在することに基づいて上記した用途のために選択される。本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオチドコンセンサスモチーフ」とは、（本明細書中に記載した）アミノ酸コンセンサスモチーフと実質的に同一性を有するアミノ酸配列をコードする本発明のヌクレオチド配列の全部または一部を示すことが意図される。例えば、「ヌクレオチドコンセンサス１モチーフ」と称される好適なヌクレオチドコンセンサスモチーフは、アミノ酸コンセンサス１モチーフの範囲内のアミノ酸配列をコードするものである。別のものは、「ヌクレオチドコンセンサス２モチーフ」であり、これはアミノ酸コンセンサス２モチーフの範囲内のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。他のヌクレオチド配列を、多種多様な植物種中のＰｔｉ４／５／６に対するアナログを同定／単離／増幅するために設計されるＰＣＲプライマーにおける使用のために有利に選択することができる。例えば、サイレントである（即ち、コードされるタンパク質中の異なるアミノ酸の置換を生じない）ヌクレオチドコンセンサスモチーフ中の変異を、本発明に従いＰＣＲプライマーとして使用されるヌクレオチド配列に有利に含めることができる。本発明による使用のために選択されるＤＮＡ配列は、慣用の組み換えＤＮＡ技術を使用して植物または細菌細胞のゲノム中に取り込むことができ、それによって病原体の攻撃に対して抵抗する増強された能力を有する形質転換植物が作製される。この点に関し、本明細書中で使用する用語「ゲノム」は、植物または微生物中に存在し、植物または微生物の増殖中に子孫によって承継しうるＤＮＡのことを言うことが意図される。このように、本発明のトランスジェニック植物はまた、本発明により作製したトランスジェニック植物を第２の植物と交配し、または本発明のトランスジェニック植物を自己増殖させてＦ１またはより高世代植物を形成することによっても作製することができる。形質転換植物およびその予孫は全て本発明により意図され、用語「トランスジェニック植物」の意味の範囲内であることが意図される。一般的に、植物の形質転換はＤＮＡ配列を発現ベクター中に適切な方向および正確なリーディングフレームで挿入することを含む。ベクターは挿入されたタンパク質コード配列の転写用の必要要素を含む。プラスミド、バクテリオファージウイルスまたは他の修飾されたウイルスなどのような当分野で公知の多数のベクター系を本発明により有利に使用することができる。好適なベクターには、以下のウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない：ラムダベクター系λ ｇｔ１１、λｇｔ１０、シャロン４、およびプラスミドベクター、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＲシリーズ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲＫ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１，ｐＣＤＮＡＩＩ、および他の同様の系。ＤＮＡ配列は、本明細書中に参照により取り込まれる、Maniatis他、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Springs Laboratory，Cold Spr ing Harbor，New York（1982）に記載されているような、当分野の標準的クローニング法を使用してベクター中にクローニングされる。プラスミドｐＢＩ１２１は、Clontech Laboratories,PaIo Alto，カリフォルニアから入手可能である。関連した技術を本発明により有利に使用して、例えば、アグロバクテリウム(Agr obacterium)、酵母、大腸菌およびシュードモナス（Pseudomonas）などの微生物を形質転換することができる。本発明の遺伝子または遺伝子フラグメントの効率的な発現を得るためには、プロモーターが発現ベクター中に存在しなければならない。本発明による発現ベクターは、異種の源に由来する部分から天然または人工的の何れかで作製することができ、その部分は天然に発生するものでも化学的に合成したものでもよく、かつその部分はライゲーションまたは当分野で既知の他の手段により結合している。導入されたコーディング配列はプロモーターの調節下にあり、かくして一般的にはプロモーターより下流にあるであろう。別の言い方をすると、プロモーター配列は一般的にはコーディング配列の上流であろう(即ち、５’末端)。このように、一つの代表的実施例では、増強されたＰｔｉ４／５／６産生は、Ｐｔｉ４／５／６ヌクレオチド配列を、宿主細胞で構成的高レベル発現を駆動できるプロモーター配列より下流に機能的に連結してベクター中に挿入することによって達成できる。２つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列およびＰｔｉコーディング配列など）は、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が（１）フレームシフト変異の導入を生じなく、（２）所望のＰｔｉコーディング遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の能力に干渉せず、または（３）プロモーター領域配列によって転写されるべき所望のＰｔｉ配列の能力に干渉しない場合には、機能的に結合していると言われる。ＲＮＡポリメラーゼは通常プロモーターに結合して、ＤＮＡ配列または結合したＤＮＡ配列と調節要素（オペロン）の一群の転写を開始する。プロモーターは、その長さ、即ち、転写を促進する能力が異なる。使用する宿主細胞系に依存して、多種多様な好適なプロモーターを使用することができ、多くが当分野で周知である。例えば、遺伝子産物を、ベクターを構築するための構成的(例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター)、誘導性(例えば、トマトＥ８エチレン誘導性プロモーター)、発達調節された（例えば、トマトポリガラクツロナーゼプロモーター）または組織特異的プロモーターを使用して得ることができる。本発明により好適に使用できる別のプロモーターとしては、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーターおよび天然Ｐｔｉ４／５／６プロモーターが挙げられる。しかし、この列挙が限定的なものであることは意図されず、本発明に従い有利に使用できるプロモーターの例を提供するにすぎない。上記で簡単に述べたように、導入された（即ち、外来）配列の転写を達成するためにプロモーターおよび転写開始部位と協調する他の調節要素（例えば、エンハンサー配列）が存在する場合と存在しない場合があることは周知である。用語「調節下」とは、導入された配列の転写を達成するのに必要な他の要素の存在を意図する。また、組み換えＤＮＡは好ましくは、導入された配列の下流に終始配列を含む。本発明の防御遺伝子が発現系に一度クローニングされると、それは例えば植物細胞などの宿主細胞中に容易に形質転換される。本発明のある好ましい側面による形質転換に好適な植物組織としては、植物全体、葉組織、花芽、根組織、分裂組織、プロトプラスト、胚軸および子葉が挙げられる。しかし、これらの列挙は限定的なものではなく、本発明に従い有利に形質転換することができる組織の例を提供するにすぎないことが理解される。本発明に従い病気抵抗性を付与する遺伝子で植物を形質転換する一つの技術は、そのような植物の組織を、本発明により選択されるＤＮＡ配列を含むベクターで形質転換した細菌の接種源と接触させることによる。一般的には、この方法は、植物組織に細菌の懸濁物を接種し、組織を抗生物質を含まない再生培地上で約２５から２８℃で約４８から約７２時間インキュベートすることを含む。アグロバクテリウム属由来の細菌は、植物細胞を形質転換するのに有利に利用することができる。そのような細菌の好適な種としてはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）およびアグロバクテリウム・リゾジンス（Agrobacterium rhizogenes）が挙げられる・アグロバクテリウム・ツメファシエンス（例えば、ＬＢＡ４４０４またはＥＨＡ１０５株）は植物を形質転換する周知の能力により特に有用である。有利に使用することができる別の技術は、アグロバクテリウムに基づくベクターを使用する花芽の減圧浸潤である。本発明により選択されるＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換する別の方法は、不活性または生物学的に活性な粒子を植物組織または細胞に噴射することを含む。この技術は、全てSanford他の米国特許４，９４５，０５０号、５，０３６，００６号および５，１００，７９２号に開示されており、これらは参照により本明細書中に取り込まれる。一般的に、この方法は、細胞の外側表面を浸透してその内部に取り込まれるのに有効な条件下で細胞に不活性または生物学的に活性な粒子を噴射することを含む。不活性粒子を使用する場合、ベクターは粒子をベクターでコートすることによって細胞中に導入することができる。あるいは、標的細胞はベクターが粒子の覚醒によって細胞内に運び込まれるようにベクターで覆うことができる。生物学的に活性な粒子（例えば、各々導入が求められるＤＮＡ物質を含む乾燥酵母細胞、乾燥細菌またはバクテリアファージ）はまた植物細胞に噴射することもできる。しかし、本発明はベクターまたは宿主細胞の選択によって限定されることは意図されない。当然、全てのベクターおよび発現調節配列が等しく十分に機能して本発明のＤＮＡ配列を発現するものではないことを理解すべきである。全ての宿主機能も同一の発現系について等しく十分に機能するわけではない。しかし、当業者ならば過度の実験なしに、そして本発明の範囲から離れることなくベクター、発現調節配列および宿主の中から選択することができる。組み換えＤＮＡが一度植物組織に導入されれば、マーカー遺伝子、例えば、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子の使用などの標準的技術を使用することによって成功した形質転換体をスクリーニングすることができる。さらに、外来ＤＮＡの発現レベルを転写レベルでまたは合成されたタンパク質として測定することができる。本発明により選択される単離されたＤＮＡ配列を発現系で使用して、裸子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む多種多様な植物細胞中の病気抵抗性を改善することができる。これらのＤＮＡ配列は、米、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマ・イモ、インゲンマメ、エンドウ豆、チコリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ラッディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、カボチャ(squash)、カボチャ(pumpkin)、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、キイチゴ、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、大豆、タバコ、トマト、モロコシおよびサトウキビなどの作物植物細胞で特に有用である。本発明の一つの好ましい側面によれば、標的植物はトマト植物またはジャガイモ植物である。本発明の別の好ましい側面によれば、標的植物は、コメ、小麦またはトウモロコシなどの単子葉植物である。本発明はまた、例えば、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana ）などの非作物植物に関して使用することもできる。当業者は、Ｐｔｉ４／５／６および／またはそれと実質的同一性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を増加または選択的に増加するように構築した植物に内在する農業的利点を認識するであろう。そのような植物は、病原体に対する実質的に改善された抵抗性を有することが期待され、従って、対応する非形質転換植物と比較して改善された収穫量を有することも期待されるであろう。さらに、本発明は病原体により生じる直接の損害を最小化できる植物を提供するのみならず、例えば、一定のトウモロコシ畑などの一定の領域における強力な病原体の集団の確立を防止するのにも有用である。本発明を以下の具体的実施例を参照してさらに説明する。これらの実施例は例示的なものであり、限定的な性質ではないことが理解される。実施例１ＰｔｏとＰｔｉ４／５／６との酵母２ハイブリッド相互作用ＰｔｏのえさとＰｔｉ４、Ｐｔｉ５またはＰｔｉ６の餌食を保有する酵母株を、ＬＥＵ２レポーター遺伝子活性化の指標であるロシシンの不在下で生育した。Ｘ−Ｇａｌプレート上で生育させた場合、これらの酵母細胞はｌａｃＺレポーター遺伝子活性化の結果として青色であった。青色の強度で測定した場合、Ｐｔｏとこれら３つの餌食との相互作用の強度は、Ｐｔｉ６＞Ｐｔｉ４＞Ｐｔｉ５の順序である。対照的に、任意のえさＢｉｃｏｉｄおよび３種の餌食の何れか１種を発現するコントロール酵母株は、ＬＥＵ２またはＬａｃＺレポーター遺伝子を活性化しなかった。図２は、酵母におけるＰｔｉ４、Ｐｔｉ５およびＰｔｉ６とｐｔ０との特異的相互作用を示す。この試験は、これらのＰｔｉタンパク質とＰｔｏとの相互作用が特異的であったことを示す。実施例２トマトゲノムＤＮＡのＤＮＡブロット分析ＲｉｏＧｒａｎｄｅ−ＰｔｏＲ植物からのゲノムＤＮＡ（５μｇ／レーン）を示した制限酵素で消化し、ＤＮＡブロットをＰｔｉ４５６ＣＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。結果を本明細書中の図３に記載し、推定配列を本明細書中に配列番号４、５および６として記載する。実施例３大腸菌における融合タンパク質発現ベクターへのＰｔｉ４／５／６インサートのクローニングＰｔｉｃＤＮＡをＧＳＴ−Ｐｔｉ融合プラスミドから除去した(Zhou，J.Loh， Y.-T.，Bressan，R.A.およびMartin，G.(1995))。トマト遺伝子Ｐｔｉ１は、ｐｔ０によってリン酸化され過敏性応答に関与するセリン／トレオニンキナーゼをコードし(Cell 83，925-935)、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩでＰｔｉ４／５／６のｃＤＮＡインサートで置換してＧＳＴ−Ｐｔｉ４／５／６融合構築物を作製した。Ｐｔｉ４ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１３−９９３）およびＰｔｉ５ｃＤＮＡ（ヌクレオチド８２−７８２）をｐＧＥＸベクターへのライゲーション前にＥｃｏＲＩとＸｈｏＩでｐＪＧ４−５から切り出した。全長Ｐｔｉ６インサートを、鋳型としてpBluescript SK(-)（ストラタジーン社）中の全長Ｐｔｉ６ｃＤＮＡクローンを使用し、上流プライマー５’−ＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＧＧＡＡＡＡＴＴＣＡＧ−３’およびＴ７プライマー５’−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで部分的に最初に消化し、次いでＸｈｏＩで完全に消化した後、ＧＳＴ発現ベクターに挿入した。得られた構築物を大腸菌株ＰＲ７４５（lon-New England Biolabs，Beverly，ＭＡ）に導入し、Guan，K.L.,およびDixon，J.E.(1991)、大腸菌において発現させた真核生物タンパク質；改善されたトロンビン切断およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼによる融合タンパク質の精製、Ana．Biochem．192,262-267に記載されている通りにＧＳＴ−融合タンパク質を発現させ、精製した。実施例４ゲル移動度シフトアッセイ野生型ｇｌｎ２ＰＲ−ボックス２×（ＣＡＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＴ）および変異ＰＲ−ボックス２×（ＣＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴ）を、Ausubel，F.M.,Brent,R.,Kin gston,R.E.,Moore,D.D.,Seidraan,J.G.,Smith,J.A.,およびStruhl,K．(１９９４ )、Current Protocols in Molecular Biology(New York:Greene Publish Associ ates/Jone Wiley and Sons)に記載されている通りに３２Ｐで末端標識した。４ｆｍｏｌのプローブを、２μｇポリ（ｄＡ−ｄＴ）(ｄＡ−ｄＴ)、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、４０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロールおよび１ｍＭのＤＴＴを含む緩衝液中の各々の精製ＧＳＴ−融合タンパク質と混合し、室温で１５分間インキュベートし、０．２５×ＴＢＥ緩衝液中で４％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。Ohme-Takagi，M.およびShi nshi，H.(1995)。エチレン応答性要素と相互作用するエチレン誘導性ＤＮＡ結合タンパク質、Plant Cell 7，173-182。ゲルを次いで乾燥し、Ｘ線フイルムに露出した。図４に示したように、ＧＳＴ−Ｐｔｉ５およびＧＳＴ−Ｐｔｉ６は共に野生型ＰＲボックスに結合した。変異ＰＲボックスをアッセイで使用した場合には結合は検出されなかったことから、ＰＲボックスへのＧＳＴ−Ｐｔｉ５およびＧＳＴ−Ｐｔｉ６の結合は非常に特異的であることが示される。ＧＳＴ−Ｐｔｉ５およびＧＳＴ−Ｐｔｉ６とは対照的に、ＧＳＴ−Ｐｔｉ１もＧＳＴ自体の何れもＰＲボックスに結合しなかった。これらの結果によりさらに、ｇｌｎ２ＰＲボックスへのＰｔｉ５およびＰｔｉ６の結合の特異性が確証された。実施例５植物接種およびＲＮＡブロット分析７週齢のタバコ植物の葉にP.s.tabaci株11528RレースＯまたはｐＰＴＥ６中にａｖｒＰｔｏ遺伝子を有する同一の株を注入した(Ronald,P.C.,Salmeron,J.M.,C arland,F.M.,およびStaskawicz，B.J.(1992))。クローン化した非病原性遺伝子ａｖｒＰｔｏは、１０⁶ｃｆｕ／ｍｌから１０⁸ｃｆｕ／ｍｌでＰｔｏ抵抗性遺伝子（J.Bacteriol.174，1604-1611）を含有するトマト品種で病気抵抗性を誘導し、接種後の異なる時点で回収し、全ＲＮＡを抽出した。サンプル当たり１０μｇのＲＮＡを１％ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、二重のＲＮＡブロットを、Zhou,J.,Loh,Y.-T.,Bressan,R.A.およびMartin,G.(1995)に記載されている通りに以下のプローブにハイブリダイズさせた。トマト遺伝子Ｐｔｉ１は、Ｐｔｏによってリン酸化されるセリン／トレオニンキナーゼをコードし、過敏性応答に関与する。Cell 83,92.5-935.:PRP1,CHN50，およびオスモチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01）Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:38） 5/00 ＣＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号４、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列と実質的同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ配列。２．配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と実質的同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。３．細胞を形質転換するのに有用なベクターであって、配列番号４、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列と実質的同一性を有するヌクレオチド配列；および細胞中での配列の発現を調節するのに有効なヌクレオチド配列に隣接した調節要素を含む上記ベクター。４．ヌクレオチド配列を発現することができる、請求項３のベクターで形質転換された植物またはその子孫。５．単子葉植物または双子葉植物から成る群から選択される、請求項４記載の植物。６．ヌクレオチド配列を発現することができる、請求項３のベクターで形質転換された微生物。７．微生物がアグロバクテリウム、酵母、大腸菌およびシュードモナス（Pseu domonas）から成る群から選択される、請求項６記載の微生物。８．病原体に抵抗する植物の能力を増強する方法であって：タンパク質をコードするヌクレオチド配列と標的植物中でのヌクレオチド配列の発現を調節するのに有効なヌクレオチド配列に隣接した調節要素を含むベクターを提供し、そして標的植物をベクターで形質転換して形質転換植物を提供することを含み、上記タンパク質がアミノ酸コンセンサス１モチーフと実質的同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして形質転換植物がヌクレオチド配列を発現することができる、上記の方法。９．標的植物が単子葉植物および双子葉植物から成る群から選択される、請求項８記載の方法。１０．ヌクレオチド配列が配列番号４、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列と実質的同一性を有する、請求項８記載の方法。１１．調節要素が植物のプロモーターを含む、請求項８記載の方法。１２．請求項８記載の方法により得られるトランスジェニック植物またはその子孫。１３．標的細胞を形質転換する方法であって：ヌクレオチドコンセンサス１モチーフと実質的同一性を有するヌクレオチド配列と、標的植物中でのヌクレオチド配列の発現を可能にするのに有効なヌクレオチド配列に隣接した調節要素を含むＤＮＡ配列ベクターを提供し、そして標的植物をベクターで形質転換して形質転換植物を提供することを含み、形質転換細胞はヌクレオチド配列を発現することができる、上記の方法。１４．ヌクレオチド配列が配列番号４、配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列と実質的同一性を有する、請求項１３記載の方法。１５．標的細胞が植物細胞、大腸菌細胞、酵母細胞、アグロバクテリウム細胞またはシュードモナス細胞から成る群から選択される、請求項１３記載の方法。１６．請求項１３記載の方法により作製されたトランスジェニック細胞。１７．形質転換植物を産生する方法であって、アミノ酸コンセンサス１モチーフと実質的同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列を植物の核ゲノム中に取り込んで、病原体に抵抗する形質転換植物の能力を増強するのに有効な量のタンパク質を発現することができる形質転換植物を提供することを含む方法。１８．タンパク質がアミノ酸コンセンサス２モチーフと実質的同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項１７記載の方法。１９．タンパク質が配列番号１、配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列と実質的同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１７記載の方法。２０．アミノ酸コンセンサス１モチーフと実質的同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質であって、抵抗性遺伝子によってコードされるタンパク質と相互作用することができる上記の単離されたタンパク質。２１．単離されたタンパク質がアミノ酸コンセンサス２モチーフと実質的同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項２０記載の単離されたタンパク質。２２．ヌクレオチドコンセンサス１モチーフと実質的同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５またはＰｔｉ６と実質的同一性を有するＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー。２３．ヌクレオチドコンセンサス２モチーフと実質的同一性を有するヌクレオチド配列を含む、Ｐｔｉ４、Ｐｔｉ５またはＰｔｉ６と実質的同一性を有するＤＮＡ配列を増幅するためのプライマー。