BR112019016317A2 - Método para produzir proteína hsl tendo atividade catalítica melhorada para o inibidor de 4-hpdd de oxidação dependentemente de ácido oxoglutárico - Google Patents
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Abstract
a invenção refere-se a um método para produzir uma proteína hsl com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-hppd de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato; e um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-hppd utilizando o método para produzir a proteína hsl, foi revelado que, por mutação da posição 140 a um aminoácido básico em uma proteína hsl, a atividade catalítica de proteína para oxidar um inibidor de 4-hppd de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato pode ser aumentada, e uma atividade da proteína para decompor o inibidor pode ser aumentada.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA PRODUZIR PROTEÍNA HSL TENDO ATIVIDADE CATALÍTICA MELHORADA PARA O INIBIDOR DE 4-HPDD DE OXIDAÇÃO DEPENDENTEMENTE DE ÁCIDO OXOGLUTÁRICO.
Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a um método para criar uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima. Além disso, a presente invenção também refere-se a um método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD e a um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima.
Técnica Antecedente [002] Nos dias de hoje, os componentes herbicidas tal como o benzobiciclona, tefuriltriona, sulcotriona, mesotriona e tembotriona foram desenvolvidos e postos em prática.
[003] Esses herbicidas são todos agentes (inibidores da 4-HPPD) que inibem a função da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenosina (4-HPPD) e, inibindo a função dessa enzima, indiretamente inibem o sistema da síntese do carotenoide para causar a degradação da clorofila, branqueando as plantas e murchando as plantas até a morte, como mostrado na Figura 1. Uma vez que a segurança para cultivares comestíveis foi suficientemente confirmada, estes inibidores têm se espalhado rapidamente no cultivo de arroz e similares.
[004] Entretanto, alguns cultivares são fracos para os inibidores do 4-HPPD, e têm sido relatados que existe a possibilidade de alguns cultivares murcharem até a morte em alguns casos. Por esta razão, tem havido exigências para os desenvolvimentos de um método para
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2/61 aumentar a resistência aos inibidores de 4-HPPD e um método para identificar de forma confiável a resistência ou suscetibilidade aos inibidores de 4-HPPD.
[005] Em relação a este ponto, os presentes inventores descobriram anteriormente que um gene (gene sensível ao inibidor da 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase NQ. 1 (HIS1)), que o arroz tem e codifica para uma oxidase (dioxigenase dependente de 2-oxoglutarato) dependente do íon de ferro divalente e 2-oxoglutarato, e um gene homólogo do mesmo (gene HSL1) contribuem para a resistência ou para a suscetibilidade aos inibidores de 4-HPPD. Os presentes inventores também descobriram que uma planta com resistência aumentada ou suscetibilidade a um inibidor de 4-HPPD pode ser produzida utilizando o gene, e ainda descobriram que genes tendo uma alta homologia com o gene HIS1 de arroz também existiam na cevada, sorgo, milho e similares (PTL 1).
Lista de Citações
Literatura de Patente [006] PTL 1 Publicação Internacional NQ. WO2012/090950 Sumário da Invenção Problema Técnico [007] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2oxoglutarato. Além disso, outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima. Além disso, ainda outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD, e um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima.
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Solução para o Problema [008] Como um resultado de estudos sérios repetidos, os presentes inventores confirmaram que a proteína HIS1 do arroz tem uma atividade para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato e assim decompor o inibidor. Contudo, por outro lado, os presentes inventores constataram também que uma proteína OsHSLI exibindo uma homologia elevada com a proteína HIS1 (uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4) tem pouca atividade catalítica. Com base nas novas descobertas, os presentes inventores concluíram que uma ligeira diferença na sequência de aminoácido entre a proteína HIS1 e a proteína OsHSLI contribuiu para a atividade catalítica. Em seguida, os presentes inventores prepararam mutantes substituindo os resíduos de aminoácido em locais que se supunha contribuir para estas atividades catalíticas nas proteínas OsHSLI com correspondentes resíduos de aminoácido da proteína HIS1 e avaliaram as atividades catalíticas nestes mutantes.
[009] Como um resultado, os presentes inventores revelaram que a atividade catalítica foi melhorada substituindo a fenilalanina na posição 140 na proteína OsHSLI por um aminoácido básico tal como a histidina. Os presentes inventores também descobriram que em uma proteína homóloga à HIS1 (a proteína ZmHSL2 e a proteína SbHSLI) em outros cultivares, a atividade catalítica foi melhorada através da mutação de um aminoácido correspondente à posição 140 da proteína OsHSLI a um aminoácido básico. Além disso, os presentes inventores descobriram que em Arabidopsis thaliana e um cultivar de arroz suscetível ao inibidor de 4-HPPD expressando a proteína OsHSLI na qual a posição 140 foi substituída por histidina, a resistência ao inibidor de 4-HPPD foi melhorada. Estas descobertas levaram à conclusão da presente invenção.
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4/61 [0010] Mais especificamente, a presente invenção é a seguinte:
[0011] <1> Um método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato, compreendendo a etapa de mutar, em uma proteína HSL, posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico.
[0012] <2> Um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo as etapas de:
(I) mutar, em uma proteína HSL de uma célula de planta, na posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou em um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico; e (II) regenerar uma planta a partir da célula de planta na qual a mutação de aminoácido é introduzida na etapa (I).
[0013] <3> O método de produção de acordo com <1> ou <2>, em que o aminoácido básico é histidina, lisina ou arginina.
[0014] <4> Um método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo:
detectar um nucleotídeo que codifica para a posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição em um gene de HSL de uma planta de teste; e se o nucleotídeo codifica um aminoácido básico, determinar que a planta de teste tem resistência a um inibidor de 4-HPPD.
[0015] <5> Um método para criar uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, o método compreendendo as etapas de:
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5/61 (a) cruzar uma cultivar de planta tendo resistência a um inibidor de 4-HPPD com qualquer cultivar;
(b) determinar a resistência de um indivíduo obtido pelo emparelhamento na etapa (a) a um inibidor de 4-HPPD pelo método de acordo com <4>; e (c) selecionar um indivíduo determinado a ter resistência ao inibidor de 4-HPPD.
Efeitos Vantajosos da Invenção [0016] De acordo com a presente invenção, é possível aumentar a atividade catalítica de uma proteína HSL para oxidar um inibidor de 4HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato por mutação, na proteína, da posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição (em seguida, também referido simplesmente como um aminoácido na posição 140 a um aminoácido básico.
[0017] Em particular, em um caso onde o inibidor de 4-HPPD é benzobiciclona (em seguida, também referido como BBC) e o seu hidrolisado (em seguida, também referido como hidrolisado de benzobiciclona ou BBC-OH), é possível aumentar ainda mais a atividade catalítica para oxidar o inibidor substituindo também a posição 204 ou posição 298, ou um aminoácido correspondente à posição de cada um com outro aminoácido, além da posição 140.
[0018] Em seguida, na presente invenção, também é possível produzir uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4HPPD utilizando esse método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato.
[0019] Além disso, como descrito acima, com base na constatação de que um aminoácido na posição 140 em uma proteína HSL é um aminoácido que afeta a atividade catalítica, de acordo com a presente
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6/61 invenção, também é possível determinar a resistência de uma planta de teste a um inibidor de 4-HPPD detectando um nucleotídeo que codifica para um aminoácido na posição 140 em um gene HSL da planta de teste. Além disso, de acordo com a presente invenção, é também possível fornecer um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima.
Breve Descrição dos Desenhos [0020] Figura 1 é um diagrama que mostra um esboço e uma relação entre uma trilha metabólica de tirosina e uma trilha da biossíntese de carotenoide e um inibidor de 4-HPPD.
[0021] Figura 2 é um espectro mostrando os resultados da análise das atividades de decomposição do hidrolisado de benzobiciclona (BBC-OH) de uma proteína HIS1 e uma proteína OsHSLI usando cromatografia líquida de alto desempenho, onde triângulos indicam cada qual um pico derivado de um degradante de BBC-OH.
[0022] Figura 3 é um espectro que mostra os resultados da análise das atividades de decomposição da tefuriltransona da proteína HIS1 e da proteína OsHSLI usando cromatografia líquida de alto desempenho, onde os triângulos indicam cada qual um pico derivado de um degradante de tefuriltriona.
[0023] Figura 4 é um espectro mostrando os resultados da análise das atividades de decomposição da sulcotriona da proteína HIS1 e da proteína OsHSLI usando cromatografia líquida de alto desempenho, onde os triângulos indicam cada qual um pico derivado de um degradante de sulcotriona.
[0024] Figura 5 é diagramas de padrão de estrutura tridimensional que mostra os resíduos de aminoácido previstos como locais de ligação de substrato e resíduos de aminoácido previstos como bolsas de substrato circundantes na proteína HIS1 e na proteína OsHSLI,
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7/61 que são preparadas usando, como um padrão, antocianidina sintase de Arabidopsis thaliana, cuja estrutura cristalina tridimensional de proteínas foi interpretada (veja um painel no lado direito da Figura 5).
[0025] Figura 6 são espectros mostrando os resultados da análise das atividades de decomposição de BBC-OH de mutantes da proteína OsHSLI (um mutante de dois sítios de F140H e F298L, um mutante de dois sítios de, F140H e L204F, e um mutante de sítio único de F140H) usando cromatografia líquida de alto desempenho.
[0026] Figura 7 são espectros mostrando resultados da análise das atividades de decomposição de BBC-OH de mutantes de proteína OsHSLI (um mutante de dois sítios de L204F e F298L e um mutante de um sítio único de F298L) utilizando cromatografia líquida de alto desempenho.
[0027] Figura 8 são espectros mostrando os resultados da análise das atividades de decomposição de sulcotriona dos mutantes da proteína OsHSLI (o mutante de dois sítios de F140H e F298L, o mutante de dois sítios de F140H e L204F e o mutante de dois sítios de L204F e F2 98L ) usando cromatografia líquida de alto desempenho.
[0028] Figura 9 é um gráfico mostrando os resultados da análise das atividades de decomposição de vários mutantes da proteína HIS1 e da proteína OsHSLI contra vários inibidores de 4-HPPD, usando cromatografia líquida de alto desempenho, onde HIS1 indica várias atividades de decomposição de inibidores 4-HPPD da proteína HIS1, HSL1 140H, indica aquelas do mutante de sítio único (F140H) da proteína OsHSLI, HSL1 140H 204F indica aquelas de um mutante de dois sítios (F140H e L204F) da proteína OsHSLI HSL1 140H 298L indica aquelas do mutante de dois sítios (F140H e F298L) da proteína OsHSLI, HSL1 140H 204F 298L indica aquelas de um mutante de três sítios (F140H, L204F e F298L) da proteína OsHSLI HSL1 140H 204F 229T 298L indica aquelas de um mutante de quatro
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8/61 sítios (F140H, L204F, S229T e F298L) da proteína OsHSLI e HSL1 1181 140H 204F 229T 298L indica aquelas de um mutante de cinco sítios (V118I, F140H, L204F, S229T e F298L) da proteína OsHSLI, e onde o eixo vertical indica um valor relativo quando os valores das atividades de decomposição do inibidor de 4-HPPD da proteína HIS1 são, cada qual, ajustados para 100.
[0029] Figura 10 são fotografias mostrando os resultados da observação das condições de crescimento de Arabidopsis thaliana em que os mutantes da proteína OsHSLI (o mutante de cinco sítios de V118I, F140H, L204F, S229T e F298L, o mutante de quatro sítios de F140H, L204F, S229T e F298L, o mutante de três sítios de F140H, ou L204F e F298L) são expressos em meio de crescimento de ágar contendo 0,05 μΜ ou 0,06 μΜ de benzobiciclona (BBC), onde os quartos inferiores direitos nas respectivas duas placas no lado direito mostram resultados da observação das condições de crescimento de Arabidopsis thaliana que não foi transformada e as setas indicam indivíduos que pegaram verde.
[0030] Figura 11 são fotografias mostrando os resultados da observação das condições de crescimento de Yamadawara, que é um arroz suscetível a benzobiciclonas, Yamadawara, em que um tipo selvagem da proteína OsHSLI é expresso (na Figura 11, HSL1 (tipo selvagem) recombinante) e Yamadawara em que um mutante (o mutante de um sítio de F140H) da proteína OsHSLI é expresso (na Figura 11, mHSL1 (F140H) recombinante), em meios MS contendo BBC.
Descrição das Formas de Realização <Método para Produzir Proteína HSL com Atividade Catalítica Aumentada para Oxidar o Inibidor de 4-HPPD de Maneira Forma Dependente de 2-Oxoglutarato>
[0031] A presente invenção fornece um método para produzir uma
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9/61 proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato, compreendendo a etapa de mutar, em uma proteína HSL, da posição 14 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico. Os inibidores de 4-HPPD na presente invenção significam agentes (inibidores de 4-HPPD) que inibem a função de 4-HPPD (4hidroxifenilpiruvato dioxigenase, Número EC: 1.13.11.27, 1.14.2.2). Como mostrado na Figura 1, os inibidores de 4-HPPD inibem a função de 4-HPPD e assim indiretamente inibem o sistema de síntese de carotenoides para causar a degradação de clorofila, branqueamento de plantas e murchamento das plantas até a morte.
[0032] Os inibidores de 4-HPPD na presente invenção são classificados em (1) tipo ciclo-hexanodiona, (2) tipo pirazol, (3) tipo biciclo, (4) tipo isoxazol (veja, From Pesticides to Agrobioregulators disease, pest, and weed controls at present and in the future, Japan, CMC Publishing Co., Ltd., December, 2009).
[0033] (1) O tipo ciclo-hexanodiona inclui, por exemplo, tefuriltriona (número de registro CAS: 473278-76-1), sulcotriona (número de registro CAS: 99105-77-8), mesotriona (número de registro CAS: 104206-82-8), tembotriona (número de registro CAS: 335104-84-2), lancotriona (número de registro CAS: 1486617-21-3) e 2-[2-nitro-4(trifluorometil)benzoil]ciclo-hexano-1,3-diona (Nitisinona, NTBC, número de registro CAS: 104206-65-7).
[0034] (2) O tipo pirazol inclui, por exemplo, pirazolinato (número de registro CAS: 58011-68-0), benzofenape (número de registro CAS: 82692-44-2), pirazoxifeno (número de registro CAS: 20 71561-11-0), topramezona (número de registro CAS: 210631-68-8) e pirassulfotol (número de registro CAS: 365400-11-9).
[0035] (3) O tipo biciclo inclui, por exemplo, benzobiciclona (BBC,
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10/61 número de registro CAS: 156963-66-5), hidrolisado de benzobiciclona (BBC-OH, número de registro CAS: 126656-88-0) e biciclopirona (número de registro CAS: 352010-68-5).
[0036] (4) O tipo isoxazol inclui, por exemplo, isoxaflutol (número de registro CAS: 141112-29-0).
[0037] O inibidor de 4-HPPD para o qual a presente invenção foi feita é preferivelmente um inibidor de 4-HPPD do tipo ciclohexanodiona ou do tipo biciclo tal como benzobiciclona (BBC) ou um hidrolisado do mesmo (hidrolisado de benzobiciclona, BBC-OH), tefuriltriona, biciclopirona tefuriltriona, sulcotriona, ou NTBC, sulcotriona, mesotriona, tembotriona, lancotriona, mais preferivelmente BBC, BBC-OH, mesotriona ou tembotriona, ainda preferivelmente BBC, BBC-OH ou tefuriltriona, e particularmente preferivelmente BBC ou BBC-OH.
[0038] Observa-se que se um certo composto tem a atividade inibidora de 4-HPPD, pode ser determinado por análise se a geração de ácido homogentísico do ácido 4-hidroxifenilpirúvico, que é promovido pela enzima 4-HPPD, é suprimida na presença do composto (veja, por exemplo, as descrições de Schulz, A. Ort, O. Beyer, P. Kleinig, H. (1993), FEBS Lett., 318, 162-166, e Secor, J. (1994), Plant Physiol., 106, 1429-1433).
[0039] A atividade catalítica na presente invenção significa, como mostrado na seguinte fórmula de reação, a atividade para catalisar a reação de oxidação de um inibidor de 4-HPPD (R na seguinte fórmula de reação), que serve como um substrato, de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato (2OG na seguinte fórmula de reação).
R + 2OG + O2 —> RO + ácido succínico + CO2 [0040] Observa-se que esta reação envolve a geração de ácido succínico e dióxido de carbono resultante da descarboxilação de 2OG.
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11/61 [0041] A proteína HSL cuja atividade catalítica é aumentada na presente invenção significa uma proteína (proteína HSL) tendo uma alta homologia com uma proteína HIS1 (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 2). A alta homologia é uma homologia de sequência de pelo menos 60% ou mais, e preferivelmente 80% ou mais (por exemplo, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% ou mais). A homologia da sequência pode ser determinada utilizando o programa BLASTP (nível de aminoácido) (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). Este programa baseia-se na explosão de algoritmo por Karlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 5873-5877, 1993). Quando uma sequência de aminoácido é analisada usando o BLASTP, os parâmetros são definidos em, por exemplo, pontuação = 50, tamanho da palavra = 3. Por outro lado, quando uma sequência de aminoácido é analisada usando o programa Gapped BLAST, a análise pode ser conduzida como descrito em Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Além disso, quando ambos os programas BLAST e Gapped BLAST são usados, os parâmetros padrão de cada programa são usados. Procedimentos específicos destes métodos de análise são conhecidos.
[0042] A fonte da proteína HSL de acordo com a presente invenção não está particularmente limitada desde que a fonte seja uma planta, que inclui, por exemplo, arroz, cevada, trigo, milho e sorgo. Mais especificamente, a proteína HSL derivada de arroz inclui uma proteína OsHSLI (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4), uma proteína OsHSL2 (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 6), e similar. A proteína HSL derivada de cevada inclui uma proteína HvHSLI (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID N°: 8), uma proteína HvHSL2 (tipicamente,
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12/61 uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 10), uma proteína HvHSL3 (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 12) e similares. A proteína HSL derivada do trigo inclui uma proteína TaHSLI (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 14), uma proteína TaHSL2 (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 16) e similares. A proteína HSL derivada do milho inclui uma proteína ZmHSLI (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 18), uma proteína ZmHSL2 (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 20) e similares. A proteína HSL derivada do sorgo inclui uma proteína SbHSLI (tipicamente, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 22) e similares. No entanto, a proteína HSL de acordo com a presente invenção não está limitada a estas. Além disso, a sequência de aminoácido de uma proteína também muda como um resultado da mutação de uma sequência de nucleotídeo na natureza (isto é, não artificialmente). Por isso, deve ser apreciado que o alvo da presente invenção abrange não apenas as proteínas tendo as sequências de aminoácido típicas acima descritas, porém, também tais mutantes naturais.
[0043] Além disso, o aminoácido básico com o qual a posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição na proteína HSL acima descrita é substituída de modo a aumentar a atividade catalítica inclui, por exemplo, histidina, lisina e arginina, e é preferivelmente histidina do ponto de vista de que a histidina permite que a atividade catalítica seja mais facilmente aumentada.
[0044] Além disso, na presente invenção, a mutação pode ser introduzida em um aminoácido em outra posição em vez da posição de mutação 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um
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13/61 aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico. Tal mutação significa que um ou uma pluralidade de aminoácidos de uma proteína HSL são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos em posições diferentes da posição 14 da sequência de aminoácido de SEQ ID N- 4 ou a porção correspondente à posição. Aqui, a pluralidade não está particularmente limitada, porém, é normalmente 2 a 40, preferivelmente 2 a 30, mais preferivelmente 2 a 20 e ainda mais preferivelmente 2 a 10 (por exemplo, 2 a 8, 2 a 4 ou 2 a 2).
[0045] A mutação a ser introduzida em outra porção não está particularmente limitada. No entanto, do ponto de vista que a atividade catalítica para oxidar BBC ou BBC-OH é mais facilmente aumentada, é preferível que pelo menos um aminoácido fora da posição 204 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição e posição 298 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou a um aminoácido correspondente à posição ser cada qual substituído com outro aminoácido, e é mais preferível que estas 2 posições sejam cada qual substituída por outro aminoácido. Além disso, tal outro aminoácido também não está particularmente limitado. No entanto, do mesmo ponto de vista, é preferível que a posição 204 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição seja substituída por fenilalanina, e é preferível que a posição 298 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição possa ser substituída por leucina.
[0046] Observa-se que na presente invenção, a posição correspondente é uma posição que está emparelhada com a posição 140 ou similar da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 quando a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 e uma sequência de aminoácido de outra proteína SL é alinhada entre si utilizando o
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14/61 software da análise de sequência de aminoácido (GENETYX-MAC, Sequencher ou similares), BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), CLUSTALW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/).
[0047] Adicionalmente, a mutagênese em uma proteína HSL pode ser conduzida por um método de mutagênese a um nível de sequência de aminoácido ou por um método de mutagênese a um nível de sequência de nucleotídeo.
[0048] O método de mutagênese em um nível de sequência de aminoácido inclui um método que inclui sintetizar quimicamente o mutante usando um sintetizador de peptídeo comercialmente disponível baseado na sequência de aminoácido da proteína HSL, cuja mutação foi introduzida em uma posição desejada.
[0049] Adicionalmente, a mutagênese em um nível da sequência de nucleotídeo inclui, por exemplo, um método de mutagênese direcionado ao sítio, um modo de edição de genôma, um modo de síntese de ADN químico baseado na informação da sequência de nucleotídeo codificando para uma proteína HSL na qual a mutação foi introduzida em uma posição desejada. Em sequida, com base no nucleotídeo preparado por um tal método de mutagênese, é possível obter uma proteína HSL ou similar em que a posição 140 é substituída por um aminoácido básico, utilizando um sistema de síntese biológica ou um sistema de síntese de proteína livre de células.
[0050] O sistema de síntese biológica inclui células tal como levedura, células de planta, células de inseto e células animais. Por introdução, em tais células, um cassete (um vetor plasmídico ou similar) capaz de expressar um nucleotídeo que codifica para a proteína HSL ou similares nas células, é possível preparar a proteína ou similar.
[0051] Adicionalmente, o sistema de síntese de proteína isento de célula inclui, por exemplo, sistemas de síntese derivados de germe de
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15/61 trigo, derivados de escherichia coli, derivados de reticulócitos de coelho e derivados de células de inseto. Na adição, a um tal sistema de síntese (um extrato de célula ou similar), um cassete (um vetor de plasmídeo ou similar) capaz de expressar um nucleotídeo codificando para a proteína HSL ou similares no sistema de síntese, é possível preparar a proteína ou similar.
[0052] Observa-se que entre tais sistemas de síntese, um sistema de síntese de proteína livre de célula derivado de germe de trigo é preferível do ponto de vista de que é fácil preparar uma proteína HSL tendo a atividade catalítica como mostrado nos Exemplos descritos mais tarde. Adicionalmente, um sistema de síntese utilizando tris(2carboxietil)fosfina (TCEP) como um agente de redução é preferível do ponto de vista da influência supressora na atividade catalítica de uma proteína HSL.
[0053] Além disso, se a atividade catalítica foi aumentada pela mutagênese acima descrita pode ser avaliada, por exemplo: processando um inibidor de 4-HPPD na presença de uma proteína HSL em que a mutação foi introduzida, íons de ferro divalentes, 2oxoglutarato e oxigênio; em seguida, medindo diretamente a quantidade de um óxido do inibidor de 4-HPPD ou medindo a quantidade de um produto (degradante) gerado durante a oxidação por meio de uma análise por cromatografia líquida de alto desempenho; e comparando a quantidade medida com a quantidade na proteína HSL antes da introdução da mutação, como mostrado nos Exemplos descritos mais adiante. Além disso, como mostrado na fórmula de reação acima descrita, tal reação também gera não apenas um óxido do inibidor de 4-HPPD, porém, também ácido succínico ao mesmo tempo. Por esta razão, também é possível determinar se a atividade catalítica foi aumentada, medindo a quantidade de ácido succínico gerada na presença de uma proteína HSL na qual a mutação foi
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16/61 introduzida e comparando a quantidade medida com a quantidade na proteína HSL antes da introdução da mutação.
<Método de Produção de Plantas com Resistência Aumentada ao Inibidor de 4-HPPD>
[0054] Como descrito acima, substituindo a posição 140 de uma proteína HSL com um aminoácido básico, é possível aumentar a atividade para oxidar e decompor o inibidor de 4-HPPD e, por sua vez, também para melhorar a resistência ao inibidor de 4-HPPD em uma planta em que a proteína foi expressa, como mostrado nos Exemplos descritos mais adiante.
[0055] Portanto, a presente invenção também pode fornecer um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo as etapas de:
(I) mutar, em uma proteína HSL de uma célula de planta, posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico; e (II) regenerar uma planta a partir da célula de planta na qual a mutação de aminoácido é introduzida na etapa (I).
[0056] A planta cuja resistência a um inibidor de 4-HPPD pode ser aumentada pelo método de acordo com a presente invenção não está particularmente limitada e inclui, por exemplo, plantas de Poaceae tais como arroz, cevada, trigo, sorgo, milho, e capim-panasco serpiginoso, plantas de Brassicaceae tal como Arabidopsis thaliana, plantas de Solanaceae tal como tomate, plantas de Fabaceae tais como soja, alfafa, e Lotus japonicas, plantas de Malvaceae tal como planta de algodão e plantas de Chenopodiaceae tal como beterraba sacarina. Entre estas plantas, cultivares sensíveis ao inibidor de 4-HPPD são particularmente preferíveis como um alvo ao qual a presente invenção é aplicada para aumentar a resistência a um inibidor de 4-HPPD. Um cultivar de arroz sensível ao inibidor de 4-HPPD inclui, por exemplo,
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Yamadawara (Kanto 239), Habataki, Takanari, Momiroman, Mizuhochikara, Ruriaoba, Odorokimochi, Hyogo-ushiwakamaru, Kasalath e similares, porém, não está limitado aos mesmos.
[0057] A célula de planta da presente invenção inclui, além das células da cultura, células em plantas. Além disso, a célula de planta da presente invenção inclui células de planta em várias formas, por exemplo, células em cultura suspensas, protoplastos, seções foliares, calo, embriões imaturos, pólens e similares.
[0058] Um método para a mutação, em uma proteína HSL de uma célula de planta, de um aminoácido na posição 140 para um aminoácido básico inclui a edição do genoma. Em tal edição do genoma, uma pessoa versada na técnica pode certamente substituir um aminoácido na posição 140 em uma célula de planta com um aminoácido básico, por exemplo, utilizando proteínas de fusão tais como ZFNs (Patentes dos Estados Unidos NQS. 6265196, 8524500, e 7888121, Patente Européia NQ. 1720995), TALENs (Patente dos Estados Unidos NQ. 8470973 e Patente dos Estados Unidos NQ. 8586363), PPR (repetição pentatricopeptídeo) associada com um domínio de nuclease (Nakamura et a!., Plant Cell Physiol 53: 11711179 (2012)) e complexos de ARNs guia e proteínas tais como CRISPR-Cas9 (Patente dos Estados Unidos NQ. 8697359, Publicação Internacional NQ. WO2013/176772), CRISPR-Cpf1 (Zetsche B. et ai., Cell, 163 (3): 759-71, (2015)), eTarget-AID (K. Nishida et al., Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems, Science, DOI: 10.1126/science. aaf 8729, (2016)).
[0059] Adicionalmente, outro método para a mutação, em uma proteína HSL de uma célula de planta, um aminoácido na posição 140 a um aminoácido básico inclui um método de recombinação genética. Neste método, um nucleotídeo codificando para uma proteína HSL na qual um aminoácido na posição 140 foi substituído por um aminoácido
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18/61 básico é introduzido em uma célula de planta, o que causa recombinação homóloga entre o nucleotídeo e um gene de HSL no genoma da célula, substituindo o aminoácido na posição 140 pelo aminoácido básico na célula (o que é denominado como direcionamento de gene). Observa-se que uma pessoa versada na técnica pode preparar o nucleotídeo, por exemplo, por meio de um método descrito na mutagênese em um nível de sequência de nucleotídeo acima descrita. Além disso, a introdução do nucleotídeo em uma célula de planta pode ser conduzida conforme apropriado, por exemplo, utilizando um método descrito em um método de regeneração de uma planta, que é descrito mais tarde.
[0060] Além disso, como é óbvio, no método para produzir uma planta de acordo com a presente invenção também, a mutação pode ser introduzida não apenas na posição 140 ou em um aminoácido correspondente à posição, porém, também em um aminoácido em outra posição. Como a mutação em outra posição, por exemplo, do ponto de vista que a resistência a BBC ou BBC-OH é mais facilmente aumentada, é preferível que pelo menos um aminoácido fora da posição 204 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição e posição 298 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou a um aminoácido correspondente à posição, seja cada qual substituído por outro aminoácido, e é mais preferível que estas duas posições sejam cada qual substituídas com outro aminoácido. Além disso, tal outro aminoácido também não está particularmente limitado. No entanto, do mesmo ponto de vista, é preferível que a posição 204 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição seja substituída por fenilalanina, e é preferível que a posição 298 da sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição possa ser substituída por leucina.
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19/61 [0061] Na presente invenção, a regeneração de uma planta a partir de uma célula de planta na qual a mutação de aminoácidos foi introduzida pode ser conduzida por meio de um processo conhecido publicamente por uma pessoa versada na técnica, dependendo do tipo de célula de planta.
[0062] Por exemplo, várias técnicas do procedimento para a produção de plantas de arroz regeneradas já foram estabelecidas, tal como um método no qual um gene é introduzido em protoplastos usando polietileno glicol e uma planta é regenerada (Datta, S. K. In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp. 6674, 1995); um método no qual um gene é introduzido em protoplastos utilizando pulso eléctrico e uma planta é regenerada (Toki et al. Plant Physiol. 100, 1503-1507, 1992); um método em que um gene é diretamente introduzido nas células por um método de pistola de partícula e uma planta é regenerada (Christou et al. Bio/technology, 9: 957-962, 1991); e um método em que um gene é introduzido usando Agrobacterium e uma planta é regenerada (Hiei et al. Plant J. 6: 271 282, 1994). Estes são amplamente utilizados no campo técnico da presente invenção.
[0063] Além disso, o procedimento para produzir plantas de cevada regeneradas inclui métodos descritos em Tingay et al. (Tingay S. et. al. Plant J. 11: 1369-1376, 1997), Murray et al. (Murray F et al. Plant Cell Report 22: 397-402, 2004) e Travalla et al. (Travalla S et al. Plant Cell Report 23: 780-789, 2005).
[0064] Além disso, o procedimento para produzir plantas de trigo regeneradas inclui, por exemplo, um método descrito em Taiich Ogawa, Japanese Journal of Pesticide Science, 2010, vol. 35, N2. 2, pp. 160 a 164.
[0065] Além disso, o procedimento para a produção de plantas de milho regeneradas inclui, por exemplo, métodos descritos em Ishida
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Y. et al., Nat Protoc., 2007, vol. 2, NQ. 7, pp. 1614 a 1621, Hiei Y. et al., Front Plant Sci., November 7, 2014; 5: 628. doi: 10. 3389/fpls. 2014. 00628. eCollection 2014. Hiei et al., Breeding Science Study, 2000, pp. 205 a 213.
[0066] Como o método para regenerar plantas de sorgo, preferivelmente utilizadas são, por exemplo, um método em que um gene é introduzido em embriões imaturos ou calos por um método de Agrobacterium ou um método de pistola de partículas e uma planta é regenerada; e um método em que pólens tendo um gene nele introduzido utilizando ultra-sons são utilizados para polinização (J. A. Able et a!., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 341-348, 2001, A. M. Casas et a!., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216, 1993, V. Girijashankar et al., Plant Cell Rep. 24: 513-522, 2005, J. M. JEOUNG et al., Hereditas 137: 20-28, 2002, V Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24 (9): 513-522, 2005, Zuo-yu Zhao et al., Plant Molecular Biology 44: 789-798, 2000, S. Gurel et al., Plant Cell Rep 28 (3): 429-444, 2009, ZY Zhao, Methods Mol Biol, 343: 233-244, 2006, AK Shrawat e H. Lorz, Plant Biotechnol J, 4 (6): 575-603, 2006, D Syamala e P Devi Indian J Exp Biol, 41 (12): 1482-1486, 2003, e Z Gao et al., Plant Biotechnol J, 3 (6): 591-599, 2005).
[0067] Além disso, o procedimento para Arabidopsis thaliana inclui um método de Akama et al. (Akama et al. Plant Cell Reports 12: 7-11, 1992). Na presente invenção, estes métodos podem ser preferivelmente utilizados.
[0068] Além disso, também em relação a outras plantas, a transformação e regeneração das plantas podem ser conduzidas usando um método descrito em Tabei et al., (Tabei Y. Ed., Protocols of Plant Transformation, Kagaku-Dojin Publishing Company, INC, publicado em 20 de setembro de 2012).
[0069] Uma vez obtida uma planta com resistência aumentada a
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21/61 um inibidor de 4-HPPD, é possível obter uma descendência da planta por reprodução sexual ou reprodução assexuada. Adicionalmente, materiais de propagação (por exemplo, sementes, frutos, espigões, tocos, calos, protoplastos e similares) são obtidos a partir da planta ou de uma descendência ou seu clone, a partir do qual a planta também pode ser produzida em massa.
[0070] Além disso, se a resistência da planta a um inibidor de 4HPPD foi melhorada pelo método acima pode ser determinada, por exemplo, examinando se a resistência foi melhorada na planta produzida, introduzindo a mutação acima descrita na planta, como descrito nos Exemplos descritos mais adiante. Especificamente, com a concentração de um inibidor de 4-HPPD com o qual uma planta antes da mutagênese é clareada (por exemplo, 0,05 μΜ ou mais no caso onde Arabidopsis thaliana (A. thaliana: ecótipo Columbia) é usada), se uma planta em que a mutação de aminoácido acima descrita foi introduzida pode ser cultivada sem ser embranquecida, pode ser determinado que a resistência da planta foi aumentada.
[0071] Embora a forma de realização preferida do método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD de acordo com a presente invenção tenha sido descrita até agora, o método para produzir uma planta de acordo com a presente invenção não está limitado à forma de realização acima descrita.
[0072] Como mostrado nos Exemplos descritos mais adiante, mesmo quando a recombinação homóloga não ocorre no método de recombinação genética descrito acima (por exemplo, mesmo quando o nucleotídeo é inserido randomizadamente no genoma da célula de planta), é possível produzir uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, introduzindo o nucleotídeo na célula de planta. [0073] Assim, a presente invenção também pode fornecer um método para produção de uma planta com resistência aumentada a
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22/61 um inibidor de 4-HPPD, compreendendo as etapas de:
(I) introduzir um nucleotídeo que codifica para uma proteína HSL na qual um aminoácido na posição 140 é substituído por um aminoácido básico em uma célula de planta; e (II) regenerar uma planta a partir da célula de planta na qual o nucleotídeo é introduzido na etapa (I).
[0074] Como descrito acima, uma pessoa versada na técnica pode preparar o nucleotídeo, introduzir o nucleotídeo em uma célula de planta e obter uma planta a partir da célula de planta, utilizando métodos publicamente conhecidos, conforme apropriado. Além disso, como descrito acima, da mesma forma neste método de produção utilizando também o método de recombinação genética, a mutação pode ser introduzida não apenas na posição 140 ou em um aminoácido correspondente à posição, porém, também em um aminoácido em outra posição.
[0075] Além disso, neste método, a planta da qual o nucleotídeo é derivado e a planta da qual a célula é derivada podem ser da mesma cultivar (por exemplo, ambos são arroz) como no Exemplo 6 descrito mais tarde. Alternativamente, a planta da qual o nucleotídeo é derivado e a planta da qual a célula é derivada podem ser cultivares diferentes (por exemplo, o primeiro é derivado do arroz e o último é derivado de Arabidopsis thaliana) como no Exemplo 5 descrito mais tarde.
<Método para Determinação da Resistência da Planta ao Inibidor de 4HPPD>
[0076] Como mostrado nos Exemplos descritos mais adiante, o aminoácido na posição 140 de uma proteína HSL contribui grandemente para a resistência a um inibidor de 4-HPPD. Assim, a presente invenção também fornece um método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo:
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23/61 detectar um nucleotídeo que codifica para a posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 ou um aminoácido correspondente à posição em um gene de HSL de uma planta de teste; e se o nucleotídeo codifica um aminoácido básico, determinando que a planta de teste tem resistência a um inibidor de 4-HPPD.
[0077] A preparação de um nucleotídeo a partir de uma planta de teste no método de determinação da presente invenção pode ser conduzida utilizando um método convencional, por exemplo, o método de CTAB. Como a planta para preparar um nucleotídeo, não apenas plantas cultivadas, porém, também sementes ou plantas infantis podem ser usadas.
[0078] O nucleotídeo obtido desta maneira codificado para o aminoácido na posição 140 da SEQ ID NQ: 4 em um gene de HSL pode ser detectado conduzindo o sequenciamento. Além disso, além de tal determinação direta de uma sequência de nucleotídeo, a análise pode ser feita indiretamente por vários métodos. Tais métodos incluem, por exemplo, o método de PCR-SSCP (polimorfismo de fila única), o método de RFLP e o método de PCR-RFLP utilizando o polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), a eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), o método de hidridização de oligonucleotídeo específico de alelo (ASO), e o método de divagem não pareado de ribonuclease A.
<Método para Criação de Plantas de Acordo com a Presente Invenção [0079] A presente invenção fornece um método para criar uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD. Este método de criação compreende as etapas de: (a) cruzar um cultivar de planta tendo resistência a um inibidor de 4-HPPD com qualquer cultivar; (b) determinar a resistência de um indivíduo obtido pelo acasalamento na etapa (a) a um inibidor de 4-HPPD pelo <Método
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24/61 para Determinação da Resistência da Planta ao Inibidor de 4-HPPD>; e (c) selecionar um indivíduo determinado a ter resistência ao inibidor de 4-HPPD.
[0080] O qualquer cultivar de planta a ser cruzado com um cultivar de plantas tendo resistência a um inibidor de 4-HPPD inclui, por exemplo, um cultivar suscetível ao inibidor de 4-HPPD e um indivíduo obtido cruzando um cultivar resistente ao inibidor de 4-HPPD e um cultivar susceptível ao inibidor de 4-HPPD, porém, não se limita a estes.
[0081] A utilização do método de criação de acordo com a presente invenção torna possível selecionar uma cultivar resistente ou susceptível ao inibidor de 4-HPPD nos estágios de sementes e plantas infantis e permite, assim, cultivar uma cultivar com estes caracteres em um curto período de tempo.
[0082] Embora as formas de realização preferidas da presente invenção tenham sido descritas até agora, a presente invenção não está limitada às formas de realização acima descritas.
[0083] Como mostrado nos Exemplos descritos mais adiante, quando o BBC ou BBC-OH é utilizado como substrato para um inibidor de 4-HPPD, a atividade catalítica para oxidar o agente pode ser aumentada substituindo também a posição 204 e/ou a posição 298 de uma proteína HSL cada qual com outro aminoácido (por exemplo, substituindo a posição 204 por fenilalanina e substituindo a posição 298 por leucina) sem substituir a posição 140 por um aminoácido básico. Além disso, a atividade catalítica para oxidar não só BBC e BBC-OH, porém, também sulcotriona, mesotriona e tembotriona pode ser aumentada substituindo a posição 204 e a posição 298 de uma proteína HSL por outro aminoácido (por exemplo, substituindo a posição 204 por fenilalanina e substituindo a posição 298 com leucina).
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25/61 [0084] Por isso, a presente invenção fornece o seguinte.
[0085] <6> Um método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato, compreendendo a etapa de: mutar, em uma proteína HSL, aminoácidos na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou posição 298 ou uma porção correspondente à posição de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 a cada outro aminoácido.
[0086] <7> Um método para produção de uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo as etapas de:
(I) mutar, em uma proteína HSL de uma célula de planta, aminoácidos na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou posição 298 ou uma porção correspondente à posição de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 a cada outro aminoácido; e (II) regenerar uma planta a partir da célula de planta na qual a mutação de aminoácidos introduzida na etapa (I).
[0087] <8> Um método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD, compreendendo: detectar um nucleotídeo que codifica para aminoácidos na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou posição 298 ou uma porção correspondente à posição da SEQ ID NQ: 4 em um gene de HSL de uma planta de teste; e se o nucleotídeo codifica para a fenilalanina na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou para a leucina na posição 298 ou uma porção correspondente à posição, determinando que a planta de teste tem resistência a um inibidor de 4HPPD.
[0088] <9> Um método para criação de uma planta tendo resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, o método compreendendo as etapas de:
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26/61 (a) cruzar um cultivar de plantas tendo resistência a um inibidor de 4-HPPD com qualquer cultivar;
(b) determinar a resistência de um indivíduo obtido pelo emparelhamento na etapa (a) a um inibidor de 4-HPPD pelo método de acordo com <8>; e (c) selecionar um indivíduo determinado a ter resistência ao inibidor de 4-HPPD.
[0089] Por outro lado, quando a tefuriltriona é utilizada como um substrato para um inibidor de 4-HPPD, a atividade catalítica para oxidar o agente pode ser reduzida substituindo a posição 204 e/ou a posição 298 de uma proteína HSL cada qual com outro aminoácido (por exemplo, substituindo a posição 204 por fenilalanina e substituindo a posição 298 por leucina) como mostrado nos Exemplos descritos mais tarde.
[0090] Por isso, a presente invenção também fornece o seguinte.
[0091] <10> Um método para produção de uma proteína HSL com atividade catalítica reduzida para oxidar a tefuriltriona de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato, o método compreendendo a etapa de:
mutar, em uma proteína HSL, aminoácidos na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou posição 298 ou uma porção correspondente à posição de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 cada qual com outro aminoácido.
[0092] <11> Um método para produção de uma planta com resistência reduzida a benzobiciclona, hidrolisado de benzobiciclona ou sulcotriona, o método compreendendo as etapas de:
(I) mutar, em uma proteína HSL de uma célula de planta, aminoácidos na posição 204 ou uma porção correspondente à posição e/ou posição 298 ou uma porção correspondente à posição de uma sequência de aminoácido de SEQ ID NQ: 4 cada qual com outro aminoácido; e
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27/61 (II) regenerar de uma planta a partir da célula de planta na qual a mutação de aminoácidos é introduzida na etapa (I).
Exemplos [0093] Embora a presente invenção seja descrita em maior detalhe com base nos Exemplos abaixo, a presente invenção não está limitada aos seguintes Exemplos.
[0094] Os presentes inventores descobriram anteriormente que um gene (HIS1) de arroz e um gene homólogo (gene HSL1) contribuem para a resistência ou suscetibilidade a um inibidor de 4-HPPD. Os presentes inventores também descobriram que uma planta com resistência ou suscetibilidade aumentada a um inibidor de 4-HPPD podería ser produzida utilizando estes genes, e ainda descobriram que genes tendo uma alta homologia com o gene HIS1 de arroz também existem na cevada, sorgo, milho e similares (PTL 1).
[0095] Além disso, foi suposto pelos presentes inventores que o HIS1 e o OsHSLI são dioxigenases dependentes de 2-oxoglutarato (2OGDs), que são oxidases dependentes de íons de ferro divalentes e 2-oxoglutarato de acordo com a pesquisa de motivos de aminoácido. O 2OGD é uma proteína que contém íons de ferro não-heme, e é uma proteína solúvel que existe localmente no citoplasma das plantas. O 2OGD requer 2-oxoglutarato (2OG) e uma molécula de oxigênio como cossubstratos e requer um íon de ferro divalente como um cofator. Como descrito abaixo, o 2OGD catalisa a oxidação do substrato (R na seguinte fórmula de reação) e esta catálise envolve a geração de ácido succínico e dióxido de carbono como um resultado da descarboxilação de 2OG.
R + 2OG + O2 —> RO + ácido succínico + CO2.
[0096] O centro catalítico de cada 2OGD individual tem uma estrutura de hélice β de fita dupla e tem um motivo de sequência preservado, His-Xaa-Asp/Glu-(Xaa)n-His (SEQ ID NQ: 23). Este motivo
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28/61 liga-se a um ion de ferro divalentes para formar uma tríade catalítica. Os 2OGDs podem ser vistos a partir de bactérias, animais, através de plantas, e têm uma ampla variedade de funções tal como modificação de DNA, síntese de colágeno, produção de antibióticos, síntese de hormônios de planta e resposta ao estresse A partir da busca de informação genética, foi previsto que existem 114 tipos de arroz e 130 tipos de Arabidopsis thaliana (Kawai et al., Evolution and diversity of the 2-oxoglutarato-dependent dioxygenase superfamily in plants. The Plant Journal vol. 78 pp. 328-343, 2014).
<Exemplo 1>
Avaliação da Atividade de Decomposição do Inibidor de 4-HPPD da Proteína HIS1 e Proteína Homologada mesma (Proteína OsHSLD [0097] Tendo em conta o acima exposto, os presentes inventores sintetizaram HIS1 e uma proteína homóloga do mesmo por um método de síntese de proteína isento de célula utilizando um extrato de germe de trigo descrito mais tarde e avaliaram a atividade de decomposição do herbicida (inibidor de 4-HPPD) destes.
[0098] Observa-se que no inicio, os presentes inventores tentaram sintetizar uma proteína HIS1 e similares utilizando sistemas de expressão de proteína de escherichia coli (o sistema pET, o sistema pCold e similares), porém, não um método de síntese de proteína isento de célula utilizando um extrato de germe de trigo. No entanto, apenas proteínas HIS1 insolúveis foram produzidas por qualquer um dentre o sistema pET, o sistema pCold e similares, e a atividade não foi recuperada nem mesmo para proteínas solubilizadas. Por esta razão, as proteínas HIS1 foram sintetizadas por um sistema de síntese de proteína isento de célula usando um extrato de germe de trigo para obter proteínas HIS1 solúveis.
[0099] Em seguida, a reação de decomposição de um inibidor de 4-HPPD foi examinada na presença de íons divalentes, 2-oxoglutarato
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29/61 e oxigênio molecular em um tubo de ensaio, por um método descrito mais tarde utilizando a proteína HIS1 preparada por este sistema de síntese de proteína isento de célula.
[00100] Aqui, em extratos de germe de trigo disponíveis comercialmente, o ditiotreitol (DTT) é utilizado como um agente de redução e um líquido de reação de síntese de proteína também contém DTT. Foi confirmado com antecedência por cromatografia líquida que sob a coexistência de íons de ferro bivalente e ácido ascórbico, que é um estabilizador para os íons de ferro divalentes, o DTT gerou compostos de radicais livres e secundariamente afetou a reação enzimática das proteínas HIS1. Por esta razão, no presente Exemplo, um sistema de reação de sintetização de proteína não relatado utilizando Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) como um agente de redução em vez de DTT foi recentemente construído, com o qual a síntese de proteína HIS1 e similares foi conduzida para examinar a atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD destes. A atividade de decomposição foi analisada no líquido de reação da proteína e o inibidor de 4-HPPD usando uma cromatografia líquida de alto desempenho (fase móvel; 0,5% de ácido acético:acetonitrila = 65: 35, taxa de fluxo; 1 mL/min, alimentação; isocrática, coluna; CAPCELL PAK ADME S5).
[00101] Como um resultado, como mostrado nas Figuras 2 a 4, foi confirmado que a proteína HIS1 tinha uma atividade de decomposição elevada para todos os inibidores de 4-HPPD, hidrolisado de benzobiciclona (BBC-OH), tefuriltriona e sulcotriona.
[00102] Observa-se que a benzobiciclona (BBC) está na forma do que é denominado como um profármaco e é suposto suprimir a solubilidade da água no solo e sofrer hidroxilação ao redor do sistema radicular de uma planta e ser absorvido principalmente na forma de hidrolisado (BBC-OH) para exercer sua eficácia de fármaco. Assim,
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30/61 uma vez que o BBC-OH serve como um ingrediente ativo real em uma planta, a BBC-OH foi utilizado como um alvo de avaliação para o presente Exemplo.
[00103] Além disso, embora não mostrado, como um resultado do exame da reação de modificação de BBC-OH utilizando a proteína HIS1, o produto de reação foi obtido de forma estável. Como um resultado, a modificação de BBC-OH foi confirmada apenas na presença de íons de ferro divalentes e 2-oxoglutarato. Além disso, como um resultado da análise dos produtos de modificação de BBC-OH, tefuriltriona e sulcotriona com a proteína HIS1 por meio de análise de massa, foi confirmado que todos os inibidores de 4-HPPD foram cada qual convertido em um produto com um átomo de oxigênio adicionado.
[00104] Por outro lado, embora a proteína OsHSLI tenha uma homologia elevada com a proteína HIS1 ao nível da sequência de aminoácido, a atividade de decomposição para BBC-OH e sulcotriona foi dificilmente observada como mostrado nas Figuras 2 e 3. Observase que, como mostrado na Figura 4, foi revelado que a proteína OsHSLI tinha uma atividade de decomposição para a tefuriltriona, que era menor do que a da proteína HIS1.
<Exemplo 2>
Estimativa do Resíduo de Aminoácido Envolvido na Atividade de Decomposição do inibidor de 4-HPPD na Proteína HIS1 [00105] Em vista disto, com base nesta nova descoberta, os presentes inventores concluíram que uma ligeira diferença na sequência de aminoácido entre a proteína HIS1 e a proteína OsHSLI contribuiu para a atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD. Depois, o resíduo de aminoácido envolvido na atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD na proteína HIS1 foi estimado por um método descrito abaixo.
[00106] Primeiro, com o objetivo de prever a estrutura
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31/61 tridimensional da proteína HIS1, os presentes inventores tentaram a análise da estrutura cristalina. No entanto, os presentes inventores desistiram porque a proteína purificada era muito instável e facilmente insolubilizável.
[00107] Em vez disso, entre oxidases dependentes de íons de ferro divalentes e 2-oxoglutarato, cujas estruturas cristalinas de proteína foram reveladas, antocianidina sintase, que é uma enzima de Arabidopsis thaliana e tem a maior similaridade de sequência com HIS1, foi usada como um padrão para preparar o padrão de estrutura de HIS1. O método foi como descrito abaixo.
[00108] Primeiro, a sequência de aminoácido da antocianidina sintase de Arabidopsis thaliana e as sequências de aminoácido da proteína HIS1 de arroz e da proteína OsHSLI foram analisadas usando o software ClustalW (Thompson et al. CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research vol. 22 pp. 4673-4680, 1994) para preparar um alinhamento. A homologia na sequência de aminoácido com antocianidina sintase de Arabidopsis thaliana foi de 28,5% com HIS1 e 28,8% com OsHSLI. Subsequentemente, o Número de acesso 1GP6 registrado como a estrutura da proteína antocianidina sintase de Arabidopsis thaliana foi selecionado de Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), que é um banco de dados público de estruturas de proteína, com base na informação do papel (Wilmouth et al. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from Arabidopsis thaliana. Structure vol. 10 pp. 93-103, 2002), que reportaram a estrutura cristalina tridimensional da proteína da antocianidina sintase de Arabidopsis thaliana. Usando este 1GP6 como um padrão, os padrãos de estrutura tridimensional de HIS1 e OsHSLI foram preparados utilizando o software SWISS-MODEL
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32/61 (Biasini et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research vol. 42 (Wl) pp. W252-W258, 2014.).
[00109] Como um resultado, foi confirmado que um resíduo de aminoácido no qual os íons de ferro divalentes são coordenados foi armazenado em três tipos de proteínas em comum, e foi confirmado que uma vez que este resíduo foi substituído por outro aminoácido, a atividade enzimática de HIS1 desapareceu.
[00110] Além disso, com base no padrão de estrutura tridimensional (veja Figura 5) preparado usando SWISS-MODEL em relação aos resíduos de aminoácido previstos como sítios de ligação ao substrato e resíduos de aminoácido previstos como bolsas de substrato circundante no papel (Wilmouth et al. Structure and mechanism of anthocyanidin synthase from Arabidopsis thaliana. Structure vol. 10 pp. 93-103, 2002), que relatou a estrutura cristalina tridimensional da proteína antocianidina sintase, os presentes inventores compararam principalmente as estruturas secundárias, isto é, as estruturas de hélice α e folha β para selecionar resíduos de aminoácido que eram diferentes entre HIS1 e OsHSLI.
[00111] Especificamente, os presentes inventores descobriram a possibilidade de que entre os resíduos de aminoácido da proteína HIS1 que foram previstos para serem expostos à bolsa de substrato, a isoleucina na posição 119 foi substituída por valina na posição 118 em OsHSLI, a histidina na posição 141 foi substituída por fenilalanina na posição 140 em OsHSLI, a fenilalanina na posição 205 foi substituída por leucina na posição 204 em OsHSLI, a treonina na posição 229 foi substituída por serina na posição 230 em OsHSLI e a leucina na posição 299 foi substituída por fenilalanina na posição 298 em OsHSLI.
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33/61 <Exemplo 3>
Preparação de Mutantes de Proteínas OsHSLI e Avaliação das Atividades de Decomposição do Inibidor de 4-HPPD Destes Mutantes [00112] Em vista disso, para examinar tal possibilidade, os resíduos de aminoácido na proteína OsHSLI que são diferentes daqueles da proteína HIS1 foram substituídos por aqueles de HIS1, conforme apropriado, e se a atividade enzimática do tipo HIS1 foi capaz de ser adicionada à proteína foi analisada por um método descrito abaixo. <Projeto de iniciadores de Mutagênese>
[00113] Primeiro, a fim de substituir um dos resíduos de aminoácido nas posições 118, 140, 204, 229 e 298 da proteína OsHSLI com a proteína HIS1 de acordo com um método de mutagênese direcionado ao sítio, os iniciadores de mutagênese usados para este método foram projetados como ilustrado abaixo.
1) Substituição de Aminoácido de Resíduo de Valina na Posição 118 de OsHSLI com Resíduo de Isoleucina (HSL1 V1181) [00114] Os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de valina na posição 118 de OsHSLI por um resíduo de isoleucina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticódon do mesmo.
V118IFW: 5’-CGACGGCAAGAACTTCCAGattgAAGGGTATGGAACTGAC-3’ (SEQ ID Ns: 24)
V118IRV: 5’-GTCAGTTCCATACCCTTCaatCTGGAAGTTCTTGCCGTCG-3’ (SEQ ID Ns: 25) [00115] O att da posição 20 à posição 22 do iniciador V118IFW (um códon correspondente à isoleucina, I) e o aat da posição 19 à posição 21 do iniciador V118IRV (a sequência complementar do códon correspondente à isoleucina, I) foram projetados de GTG (valina, V) de um OsHSLI tipo selvagem. O resíduo de valina na posição 118 é
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34/61 substituído por um resíduo de isoleucina, alterando o códon GTG para ATT.
2) Substituição do Aminoácido do Resíduo de Fenilalanina na Posição 140 de OsHSLI para o Resíduo de Histidina (HSL1 F140H) [00116] Os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de fenilalanina na posição 140 de OsHSLI por um resíduo de histidina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticódon do mesmo.
F140toH141 FW: 5'-GGTCTGATCGGCTGcatCTCAGAGTTGAACCC-3' (SEQ ID N2: 26)
F140toH141 RV: 5'-GGGTTCAACTCTGAGatgCAGCCGATCAGACC-3' (SEQ ID N2: 27) [00117] O cat da posição 15 para a posição 17 do iniciador F140toH141FW (um códon correspondente à histidina, H) e o atg da posição 16 para a posição 18 do iniciador F140toH141RV (a sequência complementar do códon cat correspondente à histidina, H) foram projetados de TTT (fenilalanina, F) de um OsHSLI tipo selvagem. O resíduo de fenilalanina na posição 140 é substituído por um resíduo de histidina alterando o códon TTT para CAT.
3) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Leucina na Posição 204 de OsHSLI com Resíduo de Fenilalanina (HSL1 L204F) [00118] Os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de leucina na posição 204 de OsHSLI por um resíduo de fenilalanina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticódon do mesmo.
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L204toF205FW:
5'-CAACAAAGCTCCTGCAtttgCAAGATTCAACTACTACCC-3' (SEQ ID N2: 28)
L204toF205RV:
5'-GGGTAGTAGTTGAATCTTGCaaaTGCAGGAGCTTTGTTG-3'(SEQ ID N2: 29).
[00119] O ttt da posição 17 para a posição 19 do iniciador L204toF205FW (um códon correspondente à fenilalanina, F) e o aaa da posição 21 para a posição 22 do iniciador F140toH141RV (a sequência complementar do códon ttt correspondente à fenilalanina, F) foram projetados a partir de CTT (leucina, L) do OsHSLI tipo selvagem. O resíduo de leucina na posição 204 é substituído por um resíduo de fenilalanina alterando o códon CTT para TTT.
4) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Serina na Posição 229 de OsHSLI com Resíduo de Treonina (HSL1 S204T) [00120] Os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de serina na posição 229 de OsHSLI por um resíduo de treonina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticódon do mesmo.
S229TFW: 5'-CCTCACTCCGACGGCaccCTCTTTACGATTCTTC-3' (SEQ ID N2: 30)
S229TRV: 5'-GAAGAATCGTAAAGAGggtGCCGTCGGAGTGAGG-3' (SEQ ID N2: 31) [00121] O acc da posição 16 para a posição 18 do iniciador S229TFW (um códon correspondente à treonina, T) e o ggt da posição 17 para a posição 19 do iniciador S229TRV (a sequência complementar do códon acc correspondente à treonina, T) foram projetados de TCC (serina, S) do OsHSLI tipo selvagem. O resíduo de
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36/61 serina na posição 229 é substituído por um resíduo de treonina alterando o códon TCC para ACC.
5) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 de OsHSLI com Resíduo de Leucina (HSL1 F298L) [00122] Os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir um aminoácido por um resíduo de fenilalanina na posição 298 de OsHSLI por um resíduo de leucina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observase que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticodon do mesmo.
F298toL299FW:
5'-GGATCTCACTGGCCATGttaTACAGTGTGAATGATGAG-3’ (SEQ ID NQ: 32)
F298toL299RV:
5'-CTCATCATTCACACTGTAtaaCATGGCCAGTGAGATCC-3’ (SEQ ID NQ: 33) [00123] O tta da posição 18 para a posição 20 do iniciador F298toL299FW (um códon correspondente à leucina, L) e taa da posição 19 para a posição 21 do iniciador F298toL299RV (a sequência complementar do códon tta correspondente à leucina, L) foram projetados a partir de TTT (fenilalanina, F) do OsHSLI tipo selvagem. O resíduo de fenilalanina na posição 298 é substituído com um resíduo de leucina alterando o códon TTT para TTA.
<Preparação de DNA Introduzido por Mutação [00124] Em seguida, a mutação direcionada ao sítio é introduzida nas proteínas OsHSLI usando o Kit de Mutagênese Direcionado ao Sítio QuikChange II (fabricado por Agilent) e os iniciadores projetados por introdução da mutação como descrito acima.
[00125] Especificamente, um plasmídeo AK241948/pFLC1 no qual o cDNA codificando para a proteína OsHSLI foi clonado (fornecido
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37/61 pelo Gene Bank do Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) foi utilizado como um padrão e PCR inversa foi conduzida utilizando o conjunto de iniciador de mutagênese acima descrito para obter um produto de PCR em que a mutação foi introduzida no cDNA.
[00126] Para ser específico, a composição da reação de PCR foi obtida misturando 5 μΙ de tampão fornecido ao kit, 1 μΙ de mistura de dNTP fornecida ao kit, 1 μΙ (2,5 unidades) de DNA polimerase de pfu fornecida ao kit, 1 μΙ (125 ng) de cada um dos iniciadores Fw e Rv, 1 μΙ (10 ng) de DNA de plasmídeo padrão e 40 μΙ de água destilada. Em seguida, 50 μΙ deste líquido de reação foram mantidos a 95°C durante 30 segundos e depois a reação a 95°C durante 30 segundos, a 55°C durante um minuto e a 68°C durante 4,5 minutos foi repetida durante 16 ciclos, seguido por resfriamento a 4°C para preparar o produto de PCR, utilizando um dispositivo de reação de PCR (TaKaRa PCR Thermal Cycler TP350 fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).
[00127] Subsequentemente, 1 μΙ (10 unidades) de Dpnl fornecido ao kit foi adicionado ao produto de PCR amplificado, seguido por manutenção a 37°C durante uma hora. Com esta reação, o plasmídeo padrão no qual a mutação não foi introduzida foi cortado.
[00128] Após a conclusão da reação, 1 μΙ do produto de PCR tratado com Dpnl foi submetido à transformação de uma célula competente de escherichia coli fornecida ao kit, e um plasmídeo introduzido por mutação foi preparado a partir da colônia resistente a fármaco emergente.
[00129] Depois, a proteína OsHSLI introduzida por mutação assim preparada foi preparada por um método de síntese de proteína isento de célula utilizando um extrato de germe de trigo (Kanno et al. Structure-Based in vitro Engineering of Anthranilate Synthase, a Metabolic Key Enzyme in the Plant Tryptophan Pathway. Plant Physiology vol. 138 pp. 2260-2268, 2005).
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38/61 [00130] Observa-se que após a reação, o líquido de reação foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). A eletroforese foi depois seguida de coloração com CBB para confirmar que uma proteína tendo um peso molecular desejado foi sintetizada.
<Mutagênese Direcionada a Múltiplos Sítios>
[00131] Além disso, uma pluralidade de resíduos de aminoácido em quaisquer das posições 118, 140, 204, 229 e 298 da proteína OsHSLI foi substituída pelos da proteína HIS1 pelo mesmo método acima, como mostrado abaixo.
6) Substituição de Aminoácido de Resíduo de Fenilalanina na Posição 140 e Resíduo de Leucina na Posição 204 de OsHSLI com Resíduo de Histidina e Resíduo de Fenilalanina, Respectivamente (HSL1 F140H L204F) [00132] Um plasmídeo pFLCI-HSL1 (L204F) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de leucina na posição 204 de OsHSLI com um resíduo de fenilalanina foi usado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de fenilalanina na posição 140 foi substituído por aminoácido com um resíduo de histidina utilizando os iniciadores F140toH141FW e F140toH141RV acima descritos.
7) Substituição de Aminoácido de Resíduo de Fenilalanina na Posição 140 e Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 de OsHSLI com Resíduo de Histidina e Resíduo de Leucina, Respectivamente (HSL1 F140H F298L).
[00133] Um plasmídeo pFLCI-HSL1 (F298L) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de fenilalanina na posição 298 de OsHSLI com um resíduo de leucina foi utilizado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de fenilalanina na posição 140 foi substituído por aminoácido com um resíduo de
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39/61 histidina utilizando os iniciadores F140toH141FW e F140toH141RV acima descritos.
8) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Leucina na Posição 204 e Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 de OsHSLI com Resíduo de Fenilalanina e Resíduo de Leucina, Respectivamente (HSL1 L204F F298L).
[00134] Um plasmídeo pFLCI-HSLI (F298L) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de fenilalanina na posição 298 com um resíduo de leucina foi utilizado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de leucina na posição 204 foi substituído com um aminoácido com um resíduo de fenilalanina utilizando os iniciadores L204toF205FW e L204toF205RV acima descritos.
9) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Fenilalanina na Posição 140, Resíduo de Leucina em 204 e Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 de OsHSLI com Resíduo de Histidina, Resíduo de Fenilalanina e Resíduo de Leucina, Respectivamente (HSL1 F140H L204F F298L) [00135] Um plasmídeo pFLCI-HSL1 (L204F F298L) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de leucina na posição 204 e um resíduo de fenilalanina na posição 298 de OsHSLI com resíduo de fenilalanina e resíduo de leucina, respectivamente, foi utilizado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de fenilalanina na posição 140 foi substituído por um aminoácido com um resíduo de histidina utilizando os iniciadores F140toH141FW e F140toH141RV acima descritos.
10) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Fenilalanina na Posição 140, Resíduo de Leucina na Posição 204, Resíduo de Serina na Posição 229 e Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 de OsHSLI com Resíduo de Histidina, Resíduo de Fenilalanina, Resíduo
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40/61 de Treonina e Resíduo de Leucina, Respectivamente (HSL1 F140H L204F S229T F298L).
[00136] Um plasmídeo pFLCI-HSL1 (F140H L204F F298L) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de fenilalanina na posição 140, um resíduo de leucina na posição 204, e um resíduo de fenilalanina na posição 298 de OsHSLI com um resíduo de histidina, um resíduo de fenilalanina e um resíduo de leucina, respectivamente, foi utilizado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de serina na posição 229 foi substituído por um aminoácido por um resíduo de treonina utilizando os iniciadores S229TFW e S229TRV acima descritos.
11) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Valina na Posição 118, Resíduo de Fenilalanina na Posição 140, Rresíduo de Leucina na Posição 204, Resíduo de Serina na Posição 229 e Resíduo de Fenilalanina na Posição 298 com Resíduo de Isoleucina, Resíduo de Histidina, Resíduo de Fenilalanina, Resíduo de Treonina, e Resíduo de Leucina, Respectivamente (HSL1 V118I F140H L204F S229T F298L).
[00137] Um plasmídeo pFLC1-HSL1 (F140H L204F S229TF298L) obtido por aminoácido substituindo um resíduo de fenilalanina na posição 140, um resíduo de leucina na posição 204, um resíduo de serina na posição 229 e um resíduo de fenilalanina na posição 298 com um resíduo de histidina, um resíduo de fenilalanina, um resíduo de treonina e um resíduo de leucina, respectivamente, foi utilizado como um padrão, e a mutagênese foi conduzida de tal forma que um resíduo de valina na posição 118 foi substituído por um aminoácido com um resíduo de isoleucina utilizando os iniciadores V118IFW e V118IRV descritos acima.
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41/61 <Exemplo 4>
Preparação de Mutantes de Proteínas HSL1 (Exceto para Proteína OsHSLD e Avaliação da Atividade de Decomposição do Inibidor de 4HPPD Destes Mutantes [00138] Além disso, para avaliar a atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD de um grupo de proteína HSL derivado de arroz, exceto OsHSLI e um grupo de proteína HSL que exibe uma homologia com HIS1, em relação a cultivares que não o arroz, estas proteínas foram preparadas de acordo com um método descrito abaixo.
(Preparação de Construções de Expressão Isentas de Célula de Proteínas HSL) [00139] A preparação de DNAs artificialmente sintetizados foi solicitada à Eurofins Genomics, onde nos DNAs sintetizados artificialmente, a sequência de reconhecimento de Spel e a sequência de reconhecimento de Sail foram adicionadas a montante e a jusante de regiões transladadas de genes homólogos HIS1 (genes HSL) derivados de arroz (Oryza sativa), trigo (Triticum aestivum), cevada (Hordeum vulgare), sorgo (Sorghum biocolor) e milho (Zea mays), exceto para HIS1 e OsHSLI (em relação ao gene OsHSL2 derivado do arroz, a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NQ: 5; em relação ao gene HvHSLI derivado da cevada, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 7; em relação ao gene HvHSL2 derivado da cevada, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 9, em relação ao gene HvHSL3 derivado da cevada, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 11, em relação ao gene TaHSLI derivado do trigo, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 13, em relação ao gene TaHSL2 derivado do trigo, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 15, em relação ao ZmHSLI derivado do milho, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 17, em relação ao ZmHSL2 derivado do milho, a sequência de
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42/61 nucleotídeo da SEQ ID NQ: 19; em relação ao SbHSLI derivado do sorgo, a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NQ: 21). Os DNAs sintetizados artificialmente obtidos foram processados com as enzimas de restrição Spel e Sail para isolar os genes alvo. Os genes obtidos foram introduzidos nos vetores de plasmídeo pYT08 para translação isenta de célula que também foram processados com a mesma enzima de restrição, de forma que as construções de expressão isentas de célula pYT08-QsHSL2, TaHSLI, TaHSL2, HvHSLI, HvHSL2, HvHSL3, SbHSLI, ZmHSLI e ZmHSL2 foram preparadas.
<lntrodução de Mutação em ZmHSL2 e SbHSLI >
[00140] Além disso, em relação ao OsHSL2 derivado do arroz, ao ZmHSL2 derivado do milho e ao SbHSLI derivado do sorgo, proteínas introduzidas por mutação em que um resíduo de aminoácido do tipo HIS1 foi introduzido, foram preparadas e as suas atividades modificadoras do inibidor de 4-HPPD foram examinadas.
[00141] Para ser específico, como descrito acima, foi inferido da comparação entre HIS1 e OsHSLI que a histidina na posição 141 e a leucina na posição 299 de HIS1 estavam envolvidas na atividade modificadora de BBC-OH. Em ZmHSL2 e SbHSLI, um aminoácido correspondente à leucina na posição 299 de HIS1 é o mesmo que o de HIS1 e o outro (correspondente à histidina na posição 141 do HIS1) tem um resíduo diferente que o de HIS1. Em vista disso, para ZmHSL2 e SbHSLI, a histidina foi mutada para o resíduo correspondente à posição 141 de HIS1 e a sua atividade foi examinada. Por outro lado, em OsHSL2, um aminoácido correspondente à leucina na posição 140 de HIS1 é o mesmo que o de HIS1 e um aminoácido correspondente à leucina na posição 299 de HIS1 tem um resíduo diferente do que o HIS1. Em vista disso, para OsHSL2, a leucina foi mutada para o resíduo correspondente à posição 299 de HIS1 e a sua atividade foi examinada.
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43/61 (Iniciador de Mutagênese)
1) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Fenilalanina na Posição 301 de OsHSL2 com Resíduo de Leucina (HSL2 F301L) [00142] Como o Exemplo 3 descrito acima, os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir um aminoácido por um resíduo de fenilalanina na posição 301 de OsHSL2 por um resíduo de leucina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado ou um anticodon do mesmo.
[00143] Os2_F301 L_Fw: 5'-ttgTATGCGGTCGATGGGGAGAAG-3’ (SEQ ID N2: 34) [00144] Qs2_F301 L_Rv: 5'-CATGGCTACCGACATCCTCTCAC-3' (SEQ ID N2: 35).
[00145] O ttg da posição 1 para a posição 3 do iniciador Os2_F3 01L_Fw (um códon correspondente à leucina, L) foi projetado a partir de TTC (fenilalanina, F) do OsHSL2 tipo selvagem. O resíduo de fenilalanina na posição 301 é substituído com um resíduo de leucina alterando o códon TTC para TTG.
2) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Glutamina na
Posição 140 de ZmHSL2 com Resíduo de Histidina (ZmHSL2 Q140H) [00146] Como o Exemplo 3 descrito acima, os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir um aminoácido por um resíduo de glutamina na posição 140 de ZmHSL2 com um resíduo de histidina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado. Zm2_Q140H_Fw: 5’catCTAAAGGTCGAGCCAGAGG- 3’ (SEQ ID N2: 36)
Zm2_Q140H_Rv: 5'-CAACCTGTCATTCCAGTCCAAGATG-3' (SEQ ID N2: 37)
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44/61
3) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Glutamina na
Posição 140 de SbHSLI com Resíduo de Histidina (SbHSLI Q140H) [00147] Como o Exemplo 3 acima descrito, os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de glutamina na posição 140 de SbHSLI por um resíduo de histidina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado. Sb1_Q140H_Fw: 5'catCTGAAGGTTGAGCCGGAGG-3’ (SEQ ID NQ: 38) Sb1_Q14 0H_Rv: 5'-GAGTCTGTCGCTCCAGTCGAGAATG-3' (SEQ ID NQ: 20 39)
4) Substituição de Aminoácido do Resíduo de Tirosina na Posição 205 de ZmHSL2 com Resíduo de Fenilalanina (ZmHSL2 Y205F) [00148] Como o Exemplo 3 descrito acima, os iniciadores de mutagênese foram projetados de modo a substituir o aminoácido por um resíduo de tirosina na posição 205 de ZmHSL2 por um resíduo de fenilalanina. As sequências de base dos iniciadores de mutagênese são como descritas abaixo. Observa-se que as letras minúsculas indicam um códon mutado.
[00149] Zm2_Y205F_Fw: 5'-tttgCCCGCTTCAACTACTAC-3’ (SEQ
ID NQ: 40) [00150] Zm2_Y205F_Rv: 5'-GGCTTGGGGACTTGCTC-3’ (SEQ ID
NQ: 41) (Preparação de DNA Introduzido por Mutação) [00151] A mutação direcionada ao sítio foi introduzida através de PCR inversa utilizando iniciadores projetados com metagênese. O vetor pYT08-ZmHSL2 preparado como descrito acima foi utilizado como um padrão e a PCR inversa foi conduzida utilizando o conjunto de iniciador de mutagênese acima descrito para obter um produto de PCR em que a mutação foi introduzida.
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45/61 [00152] A composição da reação PCR continha tampão 1xPCR para KOD plus neo (fabricado por Toyobo Co., Ltd.), 0,2 mM de dNTPs, 1,5 mM de MgSO4, 0,02 unidades/μΙ de KOD plus neo (fabricado por Toyobo Co., Ltd ), 0,3 μΜ dos iniciadores Fw e Rv, e 1 ng do DNa padrão, que foram mantidos a 94 durante 2 minutos, e depois a reação a 98°C durante 10 segundos e a 68°C durante 2 minutos e 15 segundos foi repetida durante 5 ciclos, seguido por resfriamento a 4°C para preparar o produto de PCR, utilizando um dispositivo de reação de PCR (TaKaRa PCR Thermal Cycler TP350 fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).
[00153] Em seguida, 1 μΙ de Dpnl (20 unidades/μΙ) (fabricado por Bio rab Laboratories, Inc.) foi adicionado a 20 μΙ do produto de PCR amplificado, seguido de manutenção a 37°C durante uma hora. Com esta reação, o plasmídeo padrão no qual a mutação não foi introduzida foi cortado.
[00154] Após a conclusão da reação, 1 μΙ do produto de PCR tratado com Dpnl foi misturado com 0,5 μΙ T4 polinucleotídeo cinase (10 unidades/μΙ), 2,5 μΙ de Ligation high (fabricado por Toyobo Co., Ltd.), e 3,5 μΙ de MilliQ, seguido de manutenção a 16°C durante uma hora. O produto de PCR em que a mutação foi introduzida através das reações acima foi autoligado e circularizado para construir um plasmídeo introduzido por mutação.
(Síntese de Proteína Através do Sistema Isento de Célula de Germe de Trigo) [00155] Primeiro, a síntese de DNAs para padrão de transferência foi conduzida através de PCR de acordo com os procedimentos seguintes. Os plasmídeos preparados foram utilizados para preparar padrões de reação de transferência in vitro através de PCR utilizando o iniciador pYT08_Fw2: 5'CGCATCAGGCAGGAAATATTTAGGTGAC-3’ (SEQ ID NQ: 42) e o
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46/61 iniciador pYT08_Rv: 5'-GGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAG-3' (SEQ ID NQ: 43). A composição da reação PGR continha tampão IxExTaq, 2 mM de dNTPs, 0,025 unidades/μΙ de KOD plus neo (fabricado pela Toyobo Co., Ltd.), 0,2 μΜ de iniciadores Fw e Rv e 1 ng de DNA padrão, que foram mantidos a 94°C durante 2 minutos, e depois a reação a 98°C durante 10 segundos e a 68°C durante 2 minutos e 15 segundos foi repetida durante 5 ciclos, seguido por resfriamento a 4°C, utilizando um dispositivo de reação PCR (TaKaRa PCR Thermal Cycler TP350 fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.).
[00156] Em seguida, com o produto de PCR obtido como um padrão, a reação de transferência foi conduzida para sintetizar o mRNA. O mRNA foi sintetizado (transferido) utilizando o produto de PCR obtido diretamente como um padrão. Especificamente, o produto de PCR foi adicionado em uma quantidade de 1/10 a um líquido de reação de transferência [80 mM de HEPES-KOH (pH 7,8), 16 mM de Mg (OAc)2, 10 mM de espermidina, 10 mM de DTT, 3 mM de NTP, 1 unidade/μΙ de inibidor de RNasin RNase (fabricado por Promega Corporation), 1 unidade/μΙ de SP6 RNA polimerase (fabricado por Promega Corporation)]. Após reação a 37°C durante duas horas, a precipitação com etanol e lavagem com etanol a 70% foram conduzidas, seguindo por dissolução em uma quantidade apropriada de água estéril. A absorvência a 260 nm foi medida para calcular a quantidade de RNA.
[00157] Posteriormente, com o mRNA obtido como um padrão, a síntese de proteína foi conduzida pelo método de diálise utilizando um extrato de germe de trigo. Especificamente, o mRNA acima descrito (cerca de 30-35 pg) foi adicionado a um copo de diálise contendo 50 μΙ de um líquido de síntese de proteína isento de célula de germe de trigo. Em seguida, o copo de diálise foi imerso em uma placa de 24 cavidades contendo 650 μΙ de uma solução de substrato em cada
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47/61 cavidade, seguido por incubação a 16°C durante 48 horas. Após a reação, 0,5 μΙ do líquido de reação foi misturado com 10 μΙ de um tampão de carregamento 1x e a desnaturação térmica (95°C, 5 min) foi conduzida, seguida por SDS-PAGE utilizando um gel de poliacrilamida a 12%. A eletroforese foi depois seguida por coloração com CBB para confirmar que uma proteína tendo um peso molecular desejado foi sintetizada.
[00158] Em seguida, as quantidades das proteínas sintetizadas obtidas nos Exemplos 1 a 4, como descrito acima, foram estimadas como descrito abaixo, seguido pela análise das atividades de decomposição do inibidor de 4-HPPD.
(Estimativa da Quantidade de Proteína Sintetizada Utilizando a Contadora de Cintilação Líquida) [00159] A quantidade de cada proteína sintetizada foi estimada pela adição de [14C] -Leucina ao líquido de reação de síntese para conduzir a síntese de proteína isenta de célula e medir a contagem de 14C empregada na proteína sintetizada. Especificamente, o mRNA e [14C]Leucina (fabricados por PerkinElmer Inc.) foram adicionados aos líquidos internos e externos em uma quantidade de 1/100 em um copo de diálise contendo 50 μΙ de um líquido de síntese de proteína isento de célula de germe de trigo, e o copo de diálise foi imerso em uma placa de 24 cavidades contendo 650 μΙ de uma solução de substrato em cada cavidade, seguido de incubação a 16°C durante 48 horas. Após a conclusão da reação, 5 μΙ do líquido da reação foram aplicados em um filtro de papel 3MM CHR (fabricado por GE Healthcare), e precipitação de TCA e lavagem com etanol foram conduzidas, seguido por imersão em Clear-Sol (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.). Em seguida, a contagem de 14C empregada na proteína sintetizada foi medida utilizando uma contadora de cintilação líquida e a contagem total de 14C contida na proteína sintetizada foi calculada (A). Além
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48/61 disso, o 14C total contido no líquido de reação foi aplicado em um filtro de papel e a contagem de 14C foi medida da mesma maneira (B), a relação de [14C]Leu empregada na proteína sintetizada (B/A) foi calculada a partir destes valores (C). Em seguida, a relação de um resíduo específico empregado na sequência de aminoácido da proteína sintetizada (C/D) foi calculada dividindo a relação de [14C]Leu pelo número de Leus (D) contidos na sequência de aminoácido da proteína (E). Em seguida, a quantidade da proteína sintetizada (FxExG) foi calculada multiplicando-a pelo conteúdo de aminoácido (F) no líquido de reação e o peso molecular (G) da proteína sintetizada. (Preparação da Enzima) [00160] A síntese de proteína isenta de célula foi conduzida sem adicionar [14C]-Leucina sob as mesmas condições que aquelas na estimativa da quantidade sintetizada para estimar a concentração de proteína deste líquido de reação de translação a partir da estimativa acima descrita. Em seguida, 100 μΙ do líquido de reação de translação foram submetidos a permuta de tampão a um tampão de translação básico (30 mM de HEPES-KOH (pH = 7,8), 100 mM de KOAc) utilizando a coluna illustra MicroSpin G-25 (fabricada por GE Healthcare). As quantidades da solução antes e depois da permuta e tampão foram medidas e a concentração de proteína estimada foi corrigida.
(Método de Análise de Enzima) [00161] Qualquer líquido de reação de enzima foi preparado misturando-se 250 mM de HEPES-KOH (pH 7,0) com um líquido de mistura, que continha 0,25 mM de FeCh, 1,5 mM de ácido ascórbico, 1,5 mM de 2-oxoglutarato e 0,75 mM de um substrato, e um líquido de reação de translação, que continha uma proteína de enzima sintetizada, em uma proporção de 40% e 60%, respectivamente. Após incubação a 30°C durante 3 horas, metanol a 100% na mesma
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49/61 quantidade que o líquido de reação da enzima foi adicionado e misturado suficientemente, seguindo-se a deixar repousar durante 5 minutos em gelo. Isto foi submetido à separação por centrifugação (20, 400 g, 20 minutos, 4°C) e o sobrenadante foi passado através do Filtro Cosmonice W (0,45 μιτι) (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.) para obter uma amostra para cromatografia líquida de alto desempenho. A análise do substrato e do produto antes e depois da reação de enzima foi realizada carregando uma column_Pro C18 (150x4,6 mm I.D.) (fabricada por YMC Co., Ltd.) em uma cromatografia líquida de alto desempenho device_ELITE LaChrom série L-2000 (fabricada por Hitachi, Ltd.). A eluição foi conduzida a uma velocidade de fluxo de 1 mL/min e uma temperatura de coluna de 40°C sob condições de solvente de acetonitrila:água (1% de ácido acético) = 55:45 ou 50:50 (BBC-OH), acetonitrila:água (ácido acético a 1%) = 45:55 (Sulcotriona), acetonitrila:água (ácido acético a 1%) = 45:55 (Mesotriona), acetonitrila:água (ácido acético a 1%) = 55:45 ou 50:50 (tefriltrona) e acetonitrila:água (ácido acético a 1%) = 55:45 ou 50:50 (Tembotriona), respectivamente, e o composto foi detectado em um comprimento de onda ultravioleta de 286 nm.
[00162] Pelo método descrito acima, as proteínas HIS1 e suas proteínas homólogas (proteínas HSL) bem como os produtos introduzidos por mutação destas foram avaliadas em termos da atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD, e os resultados da avaliação são mostrados nas Tabelas 1 a 6. Além disso, os resultados representativos são mostrados nas Figuras 6 a 8. Além disso, um gráfico no qual os resultados do produto introduzido por mutação das proteínas HSL1 foram compilados é mostrado na Figura 9.
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Tabela 1
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| OsHSLI -mt | ilillilii | |Í|Íi|^ÍI® | ppppe | 5 | ||
| OsHSLI -mt | ippppppppp^pppppppppp | pppppppppppppppppppppppp | iiÉiMi | 5 | ||
| OsHSLI-mt | v | s | 5 | |||
| OsHSLI-mt | v | L | s | il· | 4 | |
| OsHSLI-mt | v | F | s | F | 3 | |
| OsHSLI-mt | v | F | s | II· | 3 | |
| OsHSLI-mt | v | L | s | F | 2 | |
| OsHSLI-mt | v | F | L | s | ΒϊΐϊΐΐϊΜόΐ | 1 |
| OsHSLI-mt | v | L | s | F | 1 | |
| OsHSLI (Tipo selvagem) | v | F | L | s | F | QUASE 0 |
Tabela 2
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| OsHSL2-mt | I | H | T | c | ! | 2 |
| OsHSL2 (Tipo selvagem) | I | H | T | c | F | 0 |
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Tabela 3
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| ZmHSL2-mt | L | P | L | 4,5 | ||
| ZmHSL2-mt | L | Y | P | L | 4 | |
| ZmHSL2 (Tipo selvagem) | L | Q | Y | P | L | 3 |
Tabela 4
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| SBhsl1-mt | L | Y | P | L | 3 | |
| SBhsll (Tipo selvagem) | L | Q | Y | P | L | 2 |
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Tabela 5
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| OsHSL1-mt | V | 5 | ||||
| OsHSL1-mt | V | L | s | o»» | 5 | |
| OsHSL1-mt | V | s | F | 5 | ||
| OsHSL1-mt | V | L | s | F | 5 | |
| OsHSL1-mt | V | L | s | F | 4,5 | |
| OsHSL1-mt (Tipo selvagem) | V | F | L | s | F | 4 |
| OsHSL1-mt | V | F | ^ΙΒΪΒΪΒΪΒί | s | F | 3,5 |
| OsHSL1-mt | V | F | L | s | 2,5 | |
| OsHSL1-mt | V | L | s | F | 2,5 | |
| OsHSL1-mt | V | F | s | 1,5 |
Tabela 6
| Posição 118 | Posição 140 | Posição 204 | Posição 229 | Posição 298 | Atividade de Decomposição de BBC-OH | |
| HIS1 (Tipo selvagem) | I | H | F | T | L | 5 |
| OsHSL1-mt | V | L | s | F | 5 | |
| OsHSL1-mt | V | L | s | 4 | ||
| OsHSL1-mt | V | S | F | 4 | ||
| OsHSL1-mt | V | F | iiiiibIíbíbí | S | ίΟΟΟ|όόόόόόΜόόόόΟΟΟ | 1 |
| OsHSL1-mt | V | L | S | F | 0,5 | |
| OsHSL1-mt (Tipo selvagem) | V | F | L | S | F | QUASE 0 |
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53/61 [00163] Observa-se que a escala de 5 pontos da atividade de decomposição em cada uma das Tabelas 1 a 6 é baseada em um valor relativo do grau de diminuição em uma área de pico derivada de substrato detectada por HPLC, onde o grau de diminuição na proteína HIS1 foi designado por 5. Além disso, as porções de aminoácido apresentadas nas Tabelas 1, 5 e 6 indicam posições na proteína OsHSLI da SEQ ID NQ: 4; nas Tabelas 2, 3 e 4, as porções são lidas como aminoácidos correspondentes a estas posições. Adicionalmente, a Tabela 7 mostra aminoácidos nas 10 porções da proteína OsHSLI, aminoácidos correspondentes aos aminoácidos acima mencionados nas outras proteínas e posições dos aminoácidos correspondentes de cada uma das outras proteínas.
Tabela 7
| OsHSLI (SEQ Na: 4) | Posição 118 VALINA | Posição 140 FENILALANINA | Posição 204 LEUCINA | Posição 229 SERINA | Posição 298 FENILALANINA |
| HIL1 | Posição 119 | Posição 141 | Posição 205 | Posição 230 | Posição 299 |
| (SEQ Na: 2) | ISOLEUCINA | HISTIDINA | FENILALANINA | TREONINA | LEUCINA |
| OsHSL2 | Posição 119 | Posição 141 | Posição 206 | Posição 231 | Posição 301 |
| (SEQ Na: 6) | ISOLEUCINA | HISTIDINA | TREONINA | CISTEÍNA | FENILALANINA |
| ZmHSL2 | Posição 118 | Posição 140 | Posição 205 | Posição 230 | Posição 299 |
| (SEQ Na: 20) | LEUCINA | GLUTAMINA | TIROSINA | PROLINA | LEUCINA |
| SbHSLI | Posição 118 | Posição 140 | Posição 205 | Posição 230 | Posição 299 |
| (SEQ Na: 22) | LEUCINA | GLUTAMINA | TIROSINA | PROLINA | LEUCINA |
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54/61 <lntrodução de Mutação na Proteína OsHSLI >
[00164] Em relação à proteína OsHSLI, no caso em que o substrato foi BBC-OH, apenas foi observada uma atividade de decomposição muito fraca no tipo selvagem, como mostrado na Tabela 1 e na Figura 2. No entanto, como mostrado na Tabela 1, Figura 6, e Figura 9, introdução da mutação F140H aumentou significativamente as atividades. Além disso, foi revelado que a adição da mutação L204F ou adição da mutação F298L melhorou ainda mais as atividades de decomposição de BBC-OH.
[00165] Além disso, como mostrado na Tabela 1, foi revelado que a substituição daquela porção com lisina, que é um aminoácido básico como a histidina, também melhorou a atividade de decomposição da BBC-OH da proteína OsHSLI, que foi no entanto, menos efetiva que a introdução da mutação F140H.
[00166] Além disso, como mostrado na Tabela 1 e na Figura 7, foi revelado que a introdução da mutação F298L também melhorou a atividade de decomposição de BBC-OH da proteína OsHSLI, que foi no entanto, menos efetiva que a introdução da mutação F140H. Além disso, foi revelado que a adição da mutação L204F melhorou ainda mais a atividade.
[00167] Além disso, em relação à proteína OsHSLI, no caso em que o substrato foi a tefuriltriona, como mostrado na Tabela 5 e na Figura 3, foi observado que mesmo o tipo selvagem possuía a atividade de decomposição, que foi, no entanto, menos efetiva que a proteína HIS1. Além disso, como mostrado na Tabela 5, foi revelado que a introdução da mutação F140H melhorou a atividade para um nível tão alto quanto o da proteína HIS1. Por outro lado, na introdução da mutação F298L, foi revelado que, embora a atividade de decomposição de tefuriltriona da proteína OsHSLI tenha diminuído, a adição de ambas mutações (F140H e F298L) permitiu uma atividade
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55/61 de decomposição de tefuriltransona como a da proteína HIS1 novamente.
[00168] Além disso, como mostrado na Tabela 5, foi revelado que a substituição daquela porção com lisina, que é um aminoácido básico como a histidina, também melhorou a atividade de decomposição da tefuriltriona da proteína OsHSLI, que foi, no entanto, menos efetiva que a introdução da mutação F140H.
[00169] Além disso, no que diz respeito à proteína OsHSLI, no caso em que o substrato era sulcotriona, foi observada apenas uma atividade de decomposição muito fraca no tipo selvagem, como mostrado na Tabela 6 e na Figura 4. No entanto, como mostrado na Tabela 6 e na Figura 9, foi revelado que a introdução da mutação F140H melhorou a atividade até um nível tão alto quanto o da proteína HIS1. Por outro lado, como mostrado na Figura 8 e Figura 9, também foi revelado que a adição da mutação L204F ou adição da mutação F298L diminuiu a atividade de decomposição da sulcotriona.
[00170] Além disso, como mostrado na Tabela 6, foi revelado que, mesmo quando a mutação F140H não foi introduzida, a introdução da mutação L204F e a mutação F298L melhoraram a atividade de decomposição da sulcotriona. Além disso, embora não mostrado nas figuras, em relação à mesotriona e ao tembotriona, foi revelado que esta mutagênese de 2 sítios melhorou a atividade de decomposição.
[00171] Além disso, como mostrado na Tabela 6, a substituição dessa porção com arginina, que é um aminoácido básico como a histidina, também melhorou a atividade de decomposição da sulcotriona da proteína OsHSLI, que foi no entanto, menos eficaz do que a introdução da mutação F140H.
[00172] Além disso, no que diz respeito à proteína OsHSLI, no caso em que o substrato era mesotriona ou tembotriona, embora não mostrado nas figuras, apenas foi observada uma atividade de
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56/61 decomposição muito fraca no tipo selvagem. No entanto, foi revelado que a introdução da mutação F140H melhorou as atividades em ambos os casos para um nível tão alto quanto o da proteína HIS1. <lntrodução de Mutação na Proteína OsHSL2>
[00173] Em relação à proteína OsHSL2, no caso em que o substrato foi BBC-OH, foi observada apenas uma atividade de decomposição muito fraca no tipo selvagem, como mostrado na Tabela 2. No entanto, foi revelado que a introdução da mutação F298L foi melhorada na atividade de decomposição de BBC-OH da proteína OsHSL2.
<lntrodução da Mutação na Proteína ZmHSL2>
[00174] Em relação à proteína ZmHSL2, no caso em que o substrato foi BBC-OH, como mostrado na Tabela 3, foi revelado que mesmo o tipo selvagem tinha a atividade de decomposição, que era, no entanto, menos efetiva que a da proteína HIS1. Além disso, foi revelado que a introdução da mutação Q140H melhorou a atividade até um nível tão alto quanto o da proteína HIS1. Além disso, também foi revelado que a introdução da mutação Y204F melhorou ainda mais a atividade. Além disso, embora não mostrado nas figuras, em relação à proteína ZmHSL2, também foi descoberto que no caso em que o substrato era sulcotriona, a introdução da mutação Q140H melhorou a atividade.
<lntrodução da mutação na proteína SbHSL1>
[00175] Com relação à proteína SbHSLI, no caso em que o substrato foi BBC-OH, como mostra a Tabela 4, confirmou-se que mesmo o tipo selvagem apresentou atividade de decomposição, que foi, no entanto, menos eficaz do que a da proteína HIS1. Além disso, foi revelado que a introdução da mutação Q140H melhorou a atividade até um nível tão alto quanto o da proteína HIS1.
[00176] Como descrito acima, no caso em que qualquer um dentre,
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57/61 hidrolisado de benzobiciclona (BBC-OH), tefuriltriona, sulcotriona, mesotriona e tembotriona, ou um inibidor de 4-HPPD de qualquer destes foi utilizado como substrato, foi revelado que a substituição do amino ácido na posição 140 com um aminoácido básico, particularmente histidina, melhorou a atividade de decomposição da proteína HSL.
[00177] Além disso, como mostrado na Figura 9, também foi revelado que no caso em que o BBC-OH foi usado como substrato, a adição da mutação L204 ou a adição da mutação F298 melhorou ainda mais a atividade de decomposição; por outro lado, no caso em que foi utilizada a tefuriltriona, a sulcotriona ou a mesotriona como substrato, a atividade de decomposição não se alterou nem diminuiu.
[00178] Além disso, foi revelado que a introdução da mutação em três porções F140, L204 e F298 melhorou todas as atividades de decomposição contra BBC-OH, tefuriltriona, sulcotriona, mesotriona e tembotriona até um nível tão elevado como o da proteína HIS1. <Exemplo 5>
Avaliação da Resistência do Mutante OsHSLI contra o Inibidor de 4HPPD em Plantas (Arabidopsis thaliana) [00179] Mutantes OsHSLI (um mutante de cinco sítios de V118I, F140H, L204F, S229T e F298L, um mutante de quatro sítios de F14OH, L204F, S229T e F298L e um mutante de três sítios de F140H, L204F e F298L) cuja atividade de decomposição contra o hidrolisado de benzobiciclona (BBC-OH) foi adicionada no sistema in vitro acima descrito foram expressados em plantas, e no caso da resistência ao benzobiciclona (BBC) na forma de um profármaco ser aumentada, foram avaliados por um método descrito abaixo.
[00180] Especificamente, primeiro, os genes que codificam para cada mutante OsHSLI foram preparados da mesma maneira descrita acima. Em seguida, cada gene foi ligado à jusante do promotor 35S e
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58/61 foi clonado em conjunto com um cassete genica de resistência à canamicina no vetor binário.
[00181] Os vetores assim obtidos foram cada qual introduzidos em Arabidopsis thaliana (Columbia) por um método de imersão floral e transformados. Sementes TO assim obtidas foram semeadas em um meio contendo canamicina e indivíduos resistentes foram obtidos. Então, os indivíduos determinados a ter o gene dessa maneira introduzido foram selecionados, dos quais as sementes T1 foram coletadas e semeadas em um meio de crescimento contendo BBC. As condições de crescimento destas foram observadas. Os resultados assim obtidos são mostrados na Figura 10.
[00182] Como está claro a partir dos resultados mostrados na Figura 10, em qualquer um dos mutantes, foi observado que os indivíduos que pegaram verde apareceram sob condições nas quais indivíduos controle não recombinantes ficaram embranquecidos. Para ser mais específico, a resistência aparente contra BBC foi observada em uma das 3 linhagens de Arabidopsis thaliana em que o mutante de três sítios foi expresso, foi observada em uma das 4 linhagens de Arabidopsis thaliana em que o mutante de quatro sítios foi expresso, e foi observado em três de 4 linhagens de Arabidopsis thaliana em que o mutante de cinco sítios foi expresso. Em outras palavras, foi confirmado que a expressão do mutante OsHSLI fornecido com a atividade de decomposição do inibidor de 4-HPPD em uma planta realçou a resistência da planta contra o inibidor de 4-HPPD.
[00183] Além disso, um mutante sítio único de F140H ou um mutante sítio único de F298L foi expresso em Arabidopsis thaliana, e foi avaliado se a resistência contra a sulcotriona (a concentração de sulcotriona contida no meio de crescimento: 0,1 μΜ), mesotriona (a concentração de mesotriona contida no meio de crescimento: 0,1 μΜ), ou tembotriona (a concentração de tembotriona contida no meio de
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59/61 crescimento: 0,05 μΜ) foi realçada da mesma maneira como descrito acima.
[00184] Como um resultado, embora não mostrado nas figuras, no mutante sítio único de F140H, foi observado que os indivíduos que pegaram verde apareceram sob condições nas quais indivíduos controle não recombinantes (HSL1 (tipo selvagem)) foram embranquecidos, e a eficácia da mutação na melhoria da resistência contra o agente foi confirmada como no caso do sistema in vitro acima descrito. Por outro lado, no mutante de sítio único de F298L, nenhuma melhora da resistência contra o agente foi confirmada.
<Exemplo 6>
Avaliação da Resistência do Mutante OsHSLI ao Inibidor de 4-HPPD em Plantas (Arroz) [00185] Em seguida, a eficácia da mutação de F140H foi confirmada usando arroz. Especificamente, em primeiro lugar, um gene mHSL1 obtido modificando a fenilalanina na posição 140 em um gene de cDNA de HSL1 de arroz para histidina foi preparado. Subsequentemente, o gene mutado ou um gene HSL1 no qual a mutação não foi introduzida foi ligado a jusante do promotor 35S e foi clonado em conjunto com um cassete de expressão do gene de resistência à higromicina no vetor binário. Em seguida, esses vetores foram cada qual introduzidos em uma cultivar suscetível à benzobiciclona Yamadawara por um método de agrobacterium e arroz recombinante foi cultivado.
[00186] As sementes de arroz recombinante (T1) assim produzidas e as sementes da cultivar original Yamadawara foram testadas e semeadas em meio MS contendo 0,25 μΜ de BBC de maneira estéril e cultivadas a 30°C em local claro por 8 dias. Os resultados assim obtidos são mostrados na Figura 11.
[00187] Como é evidente a partir dos resultados mostrados na
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Figura 11, no arroz recombinante mHSL1, os indivíduos que pegaram verdez apareceram sob condições nas quais o controle não recombinante (cultivar original) e arroz recombinante de HSL1 não modificado ficaram embranquecidos (Observa-se que por se tratar de uma hetero-população, os indivíduos que foram embranquecidos também apareceram. No entanto, neste experimento, indivíduos nulos gerados devido à separação dos genes foram removidos.
[00188] Desta maneira, foi confirmado que no arroz também, a resistência ao BBC foi adicionada ao cultivar susceptível ao BBC por superexpressão do gene mHSL1 (F140H).
Aplicabilidade Industrial [00189] Como descrito até agora, de acordo com a presente invenção, é possível aumentar a atividade catalítica de uma proteína HSL para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato por mutação, na proteína, posição 140 para um aminoácido de base. Em seguida, na presente invenção, também é possível produzir uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD utilizando um tal método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato.
[00190] Além disso, como descrito acima, com base na descoberta de que um aminoácido na posição 140 em uma proteína HSL é um aminoácido que afeta a atividade catalítica, de acordo com a presente invenção, também é possível determinar a resistência de uma planta de teste a um inibidor de 4-HPPD detectando um nucleotídeo que codifica para um aminoácido na posição 140 em um gene HSL da planta de teste. Além disso, de acordo com a presente invenção, é também possível fornecer um método para criar uma planta tendo resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, utilizando o método acima.
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61/61 [00191] Por conseguinte, quando as plantas tendo resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD da presente invenção são utilizadas e cultivadas, o controle de ervas daninhas pode ser eficientemente realizado em campos de arroz de cultivo ou campos de cultivo. Além disso, o método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD da presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, para reduzir o risco de germinação de sementes autossemeadas do ano anterior em ciclos de rotação de culturas. Desta maneira, a presente invenção pode contribuir grandemente para a produção estável e aumentar o rendimento de plantas úteis.
Texto Livre de Listagem de Sequência
SEQ ID NQ: 23 <223> tríade catalítica <223> Xaa na posição 2 pode ser qualquer aminoácido.
<223> Xaa na posição 3 é ácido aspártico ou ácido glutâmico.
<223> Xaa na posição 4 pode ser qualquer aminoácido.
SEQ ID NQS: 24 a 43 <223> sequência de iniciadores sintetizados artificialmente
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Claims (5)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para produzir uma proteína HSL com atividade catalítica aumentada para oxidar um inibidor de 4-HPPD de uma maneira dependente de 2-oxoglutarato, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de mutar, em uma proteína HSL, posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID Ns: 4 ou um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico.
- 2. Método para produzir uma planta com resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(I) mutar, em uma proteína HSL de uma célula de planta, a posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID Ns: 4 ou um aminoácido correspondente à posição a um aminoácido básico; e (II) regenerar uma planta a partir da célula de planta na qual a mutação de aminoácido é introduzida na etapa (I).
- 3. Método de produção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o aminoácido básico é histidina, lisina ou arginina.
- 4. Método para determinar a resistência de uma planta a um inibidor de 4-HPPD, caracterizado pelo fato de que compreende:detectar um nucleotídeo que codifica para a posição 140 de uma sequência de aminoácido de SEQ ID Ns: 4 ou um aminoácido correspondente à posição em um gene de HSL de uma planta de teste; e se o nucleotídeo codifica para um aminoácido básico, determinar que a planta de teste tem resistência a um inibidor de 4-HPPD.
- 5. Método para criar uma planta tendo resistência aumentada a um inibidor de 4-HPPD, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) cruzar um cultivar de planta tendo resistência a um inibidor de 4-HPPD com qualquer cultivar;(b) determinar a resistência de um indivíduo obtido pelo emparelhamento na etapa (a) com um inibidor de 4-HPPD pelo método dePetição 870190075980, de 07/08/2019, pág. 71/1492/2 acordo com a reivindicação 4; e (c) selecionar um indivíduo determinado a ter resistência ao inibidor de 4-HPPD.
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