BR112021000115A2 - Transportadores de bicarbonato da bestrofina das algas verdes - Google Patents

Transportadores de bicarbonato da bestrofina das algas verdes Download PDF

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James V. Moroney
Chun Sing Lau
Luke C. M. Mackinder
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Abstract

a presente invenção refere-se a plantas e/ou algas geneticamente modificadas com eficiência aumentada no uso de carbono como um resultado de uma capacidade aumentada para o bicarbonato cruzar membranas dentro das células das plantas. outros aspectos da presente descrição referem-se aos métodos de fabricação das referidas plantas e/ou algas assim como cultivo dessas plantas geneticamente modificadas para aumentar a eficiência no uso de carbono e/ou desenvolvimento dessas algas geneticamente modificadas para aumentar a eficiência no uso de carbono.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRANSPORTADORES DE BICARBONATO DA BESTROFINA DAS ALGAS VERDES".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-americano No. 62/769,214, depositado em 19 de novembro de 2018, e Pedido de Patente Provisório Norte-americano No. 62/697,840, depositado em 13 de julho de 2018, os quais são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.
SUBMISSÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS COMO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão no arquivo de texto ASCII é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da listagem de sequências (nome do arquivo: 794542000140SEQLIST.TXT, data de registro: 18 de junho de 2019, tamanho: 461 KB).
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente invenção refere-se a plantas geneticamente modificadas. Em particular, a presente invenção refere-se a plantas geneticamente modificadas contendo transportadores de bicarbonato da bestrofina de algas verdes que preferivelmente proveem eficiência aumentada no uso de carbono.
ANTECEDENTES
[004] As algas verdes e outros organismos aquáticos fotossintéticos são frequentemente expostos a baixas e flutuantes condições de CO2 no ambiente natural. Existe uma variedade de fatores que podem reduzir a disponibilidade de CO2 para esses organismos, incluindo a lenta difusão de gases na água, lenta interconversão de duas formas de carbono inorgânico (Ci), dióxido de carbono (CO2) e bicarbonato (HCO3), e mudanças no pH. Como um resultado do ambiente natural modificável, a maioria dos organismos fotossintéticos aquáticos desenvolveu um mecanismo de concentração de dióxido de carbono (CCM) que é induzível sob condições limitantes de CO2. O CCM permite que os organismos fotossintéticos aquáticos tais como algas verdes concentrem de forma eficaz Ci para fixação por RuBisCO (Giordano et al., Ann Rev Plant Bio 56: 99-131, 2005). O modelo de CCM atual para a alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Jungnick et al., Photosynth Res 121: 159-173, 2014; Wang and Spalding, Plant Physiol 166:2040-2050, 2014) inclui transportadores de bicarbonato na membrana plasmática e e envelope de cloroplasto como componentes principais do CCM permitindo o movimento de Ci, particularmente HCO3-, através das membranas. As enzimas anidrase carbônicas que interconvertem CO2 e HCO3- são um componente mais importante do modelo de CCM (Mitra et al., Can J Bot 83: 780-795, 2005; Moroney et al., Photosynth Res 109: 133-149, 2011).
[005] Em C. reinhardtii, um compartimento chamado o pirenoide está localizado na base do cloroplasto. O pirenoide é a localização onde RuBisCO é sequestrado sob as condições limitantes de CO2 (Kuchitsu et al., Plant Cell Phys 29: 1269-1278, 1988; Rawat et al., Planta 198:263-270, 1996; Borkhsenious et al., Plant Physiol 116: 1585-1591, 1998). Uma extensiva rede de túbulos tilacoides e mini-túbulos está associada com o pirenoide (Engel et al., Elife 13:04889, 2015), presumidamente para prover uma via para HCO3- entrar no pirenoide. A anidrase carbônica tilacoide CAH3 é encontrada nesses túbulos e especula-se que CAH3 converta HCO3- em CO2 para fixação dentro do lúmen (Moroney and Ynalvez, Eukaryotic Cell 6: 1251-1259, 2007).
[006] As células de C. reinhardtii desenvolvidas sob condições de alto CO2 (5% v/v) exibem uma baixa afinidade por Ci. Quando as células aclimatadas em alto CO2 são expostas a condições inferiores de CO2
(por exemplo, ambiente 0,04% até baixo <0,01% v/v), a indução de transportadores de Ci de alta afinidade foi relatada. Enquanto CO2 se difundirá pelas membranas na célula (Gutknecht et al., J. Gen. Physiol 69: 779-794, 1977), vários estudos já estabeleceram a necessidade por um sistema de transporte ativo para facilitar o movimento de Ci (particularmente HCO3-) para a localização onde a fixação por RuBisCO possa ocorrer em células desenvolvidas sob condições de baixo CO2 (Moroney et al., Plant Physiol 83: 460-463, 1987; Sultemeyer et al., Planta 176: 256-260, 1988; Badger et al., Physiologia Plant 90: 529-536, 1994; Ohnishi et al., Plant Cell 22: 3105-3117, 2010). Além disso, os estudos moleculares e fisiológicos também confirmaram a ocorrência de múltiplas formas de transportadores de Ci na membrana plasmática e envelope de cloroplasto das células (Amoroso et al., Plant Physiol 116:193-201, 1998; Duanmu et al., PNAS 106: 5990-5995, 2009; Atkinson et al., Plant Biotechnol J 5: 12497, 2015; Gao et al., Plant 82: 1-11, 2015; Yamano et al., PNAS 112: 7315-7320, 2015).
[007] Em cianobactérias que vivem em ambientes marinhos, o transporte de HCO3- na membrana plasmática é frequentemente acoplado à concentração iônica de Na+ alta externa da água salgada. Nos ambientes de água doce onde C. reinhardtii é encontrada, acredita- se que o transporte seja acoplado a H+ já que a concentração de Na+ é relativamente baixa (Morth et al., Nat Rev Mol Cell Biol 12: 60-70, 2011; Taylor et al., Trends Plant Sci 17: 675-684, 2012). Consequentemente, os estudos genômicos com C. reinhardtii e Volvox carteri revelaram a presença de ambos os transportadores acoplados a H+ e Na+ para sulfato e fosfato (Pootakham et al., Plant Physiol 153: 1653-1668, 2010). Ainda não está claro se este tipo de acoplamento iônico também é importante para a captação de bicarbonato.
[008] Até hoje, duas proteínas de transporte de bicarbonato de alta afinidade e uma proteína de transporte de bicarbonato de baixa afinidade em C. reinhardtii foram caracterizadas e são conhecidas por serem funcionais sob condições de baixo CO2. O primeiro transportador de alta afinidade, proteína 3 ativada por luz (HLA3), é um transportador do tipo (ABC) de cassete de ligação a ATP da família da proteína de resistência a múltiplos fármacos, e está localizado na membrana plasmática (Im and Grossman, 2002). O transcrito Hla3 é induzido por ambas as condições altas e baixas de luz e CO2 e é controlado pelo “regulador master” CCM codificado pelo gene Cia5. Duanmu et al. (2009) mostraram uma redução significativa na afinidade de Ci e captação de Ci em mutantes knockdown de RNAi HLA3, sustentando o papel desta proteína no transporte de HCO3-. O segundo transportador de alta afinidade, proteína induzível por baixo carbono 1 (LCI1), é uma proteína relativamente pequena. LCI1 é fortemente infrarregulada em células desenvolvidas sob condições de baixo CO2, e ela foi localizada na membrana plasmática (Ohnishi et al., Plant Cell 22: 3105-3117, 2010). Além disso, a superexpressão da proteína LCI1 na Lcr1 (cepa de Chlamydomonas que carece de um fator de transcrição de MYB) resultou em captação de Ci aumentada. Sendo assim, entende-se que HLA3 e LCI1 são ambos transportadores de Ci localizados na membrana plasmática.
[009] O terceiro transportador, NAR1.2 (também conhecido como LCIA), é uma proteína envelope de cloroplasto da família transportadora de formiato/nitreto. Embora a proteína NAR1.2 tenha menor afinidade por bicarbonato (conforme revelado no valor K1/2 o qual cai na faixa de mM), expressando NAR1.2 em oócitos de Xenopus laevis resultados na captação aumentada de HCO3- (Mariscal et al., Protist 157: 421-433, 2006; Atkinson et al., Plant Biotechnol J 5: 12497, 2015). NAR1.2 mostrou estar localizado no envelope de cloroplasto, e acredita-se que esteja envolvido na captação de Ci, porém o mecanismo molecular para isto permanece pouco claro (Yamano et al., PNAS 112: 7315-7320,
2015). Os resultados experimentais indicam que as proteínas NAR1.2 e HLA3 têm um papel cooperativo dentro de CCM (Yamano et al., PNAS 112: 7315-7320, 2015). Sob condições muito baixas de CO2, NAR1.2 mostrou agir em conjunto com a proteína B induzível com baixo CO2 (LCIB). Esses resultados sugeriram um modelo no qual LCIB está envolvido na captação de CO2 e recaptura de CO2 que sobra do pirenoide, enquanto NAR1.2 está envolvido na via de captação e transporte de HCO3- (Wang and Spalding, Plant Physiol 166:2040-2050, 2014).
[0010] Além das proteínas provavelmente envolvidas no CCM que são descritas acima, papéis para múltiplas outras proteínas foram sugeridos. Por exemplo, as duas proteínas solúveis LCIB e LCIC formam um complexo que foi observado para intimamente se associar com o pirenoide quando as células são aclimatadas em CO2 muito baixo (Yamano et al., Plant Cell Physiol 51: 1453-1468, 2010), porém ainda não está certo qual deve ser o papel deste complexo (Jin et al., PNAS 113:14716-14721, 2016). Um outro exemplo é provido por CCP1 e CCP2, que são outros transportadores putativos de Ci que mostraram estar localizados na mitocôndria (Atkinson et al., Plant Biotechnol J 5: 12497, 2015). Esta localização sugere que a mitocôndria pode ser importante na função de CCM, porém ainda não está claro quais devem ser os mecanismos ou qual papel a mitocôndria pode ter.
[0011] Bestrofinas são uma família de proteínas de membrana que exibem a atividade do canal de Cl- e também funcionam como reguladores de canais de Ca2+ dependentes de voltagem. Verificou-se que as bestrofinas humanas e de camundongo têm alta permeabilidade e condutância a HCO3- (Qu and Hartzell, Am J Physiol Cell Physiol 294: C1371-C1377, 2008). No entanto, verificou-se que os aminoácidos nas proteínas de bestrofina fototrófica mostram alta diversidade comparado com as suas contrapartes em mamíferos usando alinhamento de proteína e análises da árvore filogenética. Por exemplo, os resíduos que formam o aparelho de detecção de Ca2+ em bestrofina animal não são conservados nas proteínas do tipo bestrofina em Arabidopsis (AtBest1 e AtBest2), sugerindo que Ca2+ não seja necessário para a ativação do canal AtBest no cloroplasto. Deste modo, durante a evolução, as proteínas bestrofina nos fototróficos podem ter adquirido diferentes propriedades eletrofisiológicas a partir daquelas em mamíferos (Duan et al. Journal of Integrative Plant Biology 58: 848-858, 2016). Em C. reinhardtii, LCI11 e Cre16.g662600 sugeriram como bestrofinas putativas, e Cre16.g663400 é proposta como uma proteína do tipo bestrofina (Mackinder et al., Cell 171:133-147, 2017), porém estas ainda não foram caracterizadas.
[0012] Os dados atuais apenas de forma não ambígua sustentam a necessidade de cinco proteínas para o influxo do carbono inorgânico (Ci) em C. reinhardtii, incluindo HLA3, LCI1, LCIA, CAH3 e LCIB (Mackinder, New Phytologist 217: 54-61, 2018). Conforme descrito acima, essas proteínas estão localizadas na membrana plasmática e no envelope de cloroplasto. O modelo atual de C. reinhardtii CCM sugere que pelo menos um transportador ou canal adicional na membrana tilacoide de cloroplasto seja necessário para manter um fluxo de HCO3- a partir do estroma ao CAH3 no lúmen (Mackinder New Phytologist 217:54-61, 2018). Além do mais, identificar as proteínas de transporte de bicarbonato funcional continua como um objetivo importante. A pesquisa atual identificou muitas proteínas de transporte de bicarbonato possíveis, mas apenas poucas dessas têm resultados experimentais promissores, e existem poucos dados mecanísticos disponíveis.
BREVE SUMÁRIO
[0013] De modo a atender essas necessidades, a presente descrição se refere aos polipeptídeos de bestrofina da alga verde que agem como proteínas de transporte de bicarbonato. Certos aspectos da presente descrição se referem a uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em alguns aspectos, A presente descrição se refere a uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de cruzamento da membrana de bicarbonato é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos
95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de pelo menos um cloroplasto dentro de uma célula da planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0014] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência do uso de carbono aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0015] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência no uso da água aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0016] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência no uso de nitrogênio aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0017] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com fotoinibição reduzida contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0018] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima a sequência de ácido nucleico modificada é estavelmente integrada no genoma nuclear da planta. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada adicionalmente contém uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde, onde a expressão da sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento resulta na localização do polipeptídeo de bestrofina a um envelope de cloroplasto ou membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta.
[0019] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a eficiência no uso de carbono aumentada, a eficiência no uso de água aumentada, a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, ou a fotoinibição reduzida é o resultado de expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a eficiência no uso de carbono aumentada, a eficiência no uso de água aumentada, a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, ou a fotoinibição reduzida é o resultado de expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID
NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, ou SEQ ID NO:63.
[0020] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta é feijão frade (isto é, feijão fradinho, Vigna unguiculata), soja (isto é, feijão de soja, Glycine max), mandioca (isto é, mandioca, Manihot esculenta), arroz (isto é, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Zizania spp.), trigo (isto é, trigo comum, espelta, durum, Triticum aestivum, Triticum spelta, Triticum durum, Triticum spp.), cevada (isto é, Hordeum vulgare), centeio (isto é, Secale cereale), aveia (isto é, Avena sativa), batatotato (isto é, Solanum tuberosum), tomate (isto é, Solanum lycopersicum), ou uma outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades, a planta é tabaco (isto é, Nicotiana tabacum, Nicotiana edwardsonii, Nicotiana plumbagnifolia, Nicotiana longiflora) ou Arabidopsis (isto é, aubrieta, Arabidopse do tale, Arabidopsis thaliana). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta não é milho (isto é, milho, Zea mays), sorgo (isto é, sorgo, painço, milhete, Sorghum bicolor), cana de açúcar (isto é, cana de açúcar, Saccharum officinarum), painço (isto é, painço ragi, painço comum, painço bajra, painço vermelho, Eleusine coracana, Panicum miliaceum, Pennisetum glaucum, Setaria italica), switchgrass (isto é, tall panic grass, thatchgrass, Panicum virganum), ou uma outra planta de cultura C4.
[0021] Em algumas modalidades, a parte da planta de qualquer uma das modalidades acima é uma folha, um caule, uma raiz, uma flor, uma semente, uma fruta, uma célula ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, a parte da planta é uma fruta. Em algumas modalidades, a parte da planta é um grão, uma semente, uma fava, ou um tubérculo.
[0022] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um grão de pólen ou um óvulo de qualquer uma das modalidades acima.
[0023] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um protoplasto produzido a partir de qualquer uma das modalidades acima.
[0024] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma cultura de tecido produzida a partir de protoplastos ou células de qualquer uma das modalidades acima, onde as células ou protoplastos são produzidos a partir de uma das partes da planta no grupo de folha, antera, pistilo, caule, pecíolo, raiz, ponta da raiz, fruta, semente, flor, cotiledônea, hipocótilo, embrião ou célula meristemática.
[0025] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma semente geneticamente alterada contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana.
Em algumas modalidades, a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em algumas modalidades, a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em algumas modalidades, a planta expressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a planta expressa pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a planta expressa pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a planta expressa um polipeptídeo selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, ou SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta. Em algumas modalidades, a planta é feijão frade, soja, mandioca, arroz, soja, trigo ou outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades, a planta não é milho, sorgo ou outras plantas de cultura C4.
[0026] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a expressão de anidrases carbônicas endógenas é modulada. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente ou qualquer combinação dos mesmos.
[0027] Certos aspectos da presente descrição se referem a um método de produção de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso do carbono da planta.
[0028] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso da água da planta.
[0029] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso do nitrogênio da planta.
[0030] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, reduzindo assim a fotoinibição da planta.
[0031] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com crescimento ou produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim o crescimento ou produtividade da planta.
[0032] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a expressão de anidrases carbônicas endógenas é modulada. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0033] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produza uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do carbono conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0034] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta a eficiência no uso da água conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0035] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta a eficiência no uso do nitrogênio conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0036] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana reduz a fotoinibição conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0037] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com crescimento ou produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta o crescimento ou produtividade conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0038] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do carbono conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0039] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta a eficiência no uso da água conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0040] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta a eficiência no uso do nitrogênio conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0041] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana reduz a fotoinibição conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0042] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com crescimento e produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta o crescimento ou produtividade conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0043] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a semente, cultura de tecido ou protoplasto tem uma ou mais alterações genéticas que modulam a expressão de anidrases carbônicas endógenas. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0044] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62, ou SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a planta é feijão frade,
soja, mandioca, arroz, soja, trigo ou outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a planta não é milho, sorgo ou outra planta de cultura C4.
[0045] Certos aspectos da presente descrição se referem a uma alga geneticamente alterada contendo uma ou mais alterações genéticas resultando no aumento da capacidade da alga em transportar bicarbonato em um lúmen de um cloroplasto da alga. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em uma membrana tilacoide de cloroplasto. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é superexpressado pelo menos quando a alga está abaixo de condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] CO2 no ar).
[0046] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma alga verde ou parte da mesma com transporte de bicarbonato aumentado contendo uma sequência de ácido nucleico modificada contendo a sequência codificadora de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde; em que o polipeptídeo de bestrofina é superexpressado; em que o polipeptídeo de bestrofina está localizado em membranas tilacoides de cloroplasto; e em que quando a alga é cultivada sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] CO2 no ar), o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma alga do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa a partir da alga WT correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina cultivado sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar). Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0047] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma alga verde ou parte da mesma com crescimento aumentado sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar) contendo uma sequência de ácido nucleico modificada contendo a sequência codificadora de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde; em que o polipeptídeo de bestrofina é superexpressado; em que o polipeptídeo de bestrofina está localizado em membranas tilacoides de cloroplasto; e em que quando a alga é cultivada sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar), o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma alga do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa a partir da alga WT correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina cultivado sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar). Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0048] Em algumas modalidades de qualquer uma das algas acima, a alga verde é selecionada a partir do grupo de Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas eustigma, Volvox carteri f. nagariensis, e Gonium pectorale.
[0049] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma alga com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na alga compreendendo o aumento da capacidade de transportar bicarbonato em um lúmen de um cloroplasto da alga, aumentando assim a eficiência no uso do carbono da alga. Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de transporte é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0050] As FIGS. 1A-1D mostram a similaridade dos genes de C.
reinhardtii (BST1, BST2 e BST3) e proteínas (BST1, BST2 e BST3) entre elas, assim como a similaridade de BST1-3 com outras proteínas da família bestrofina. A FIG. 1A mostra uma representação esquemática dos genes BST1, BST2 e BST3, onde os quadrados cinza-claros representam exons, as linhas finas cinza representam íntrons, as linhas grossas cinza representam regiões não traduzidas (UTRs), e as linhas sobrepostas (sobrepostas em exons e íntrons) indicam a região comum compartilhada pelos três genes. A FIG. 1B mostra a localização e orientação dos genes BST1, BST2 e BST3 no genoma de C. reinhardtii. A FIG. 1C mostra um alinhamento de aminoácido das proteínas BST1 (SEQ ID NO:1), BST2 (SEQ ID NO:2) e BST3 (SEQ ID NO:3), onde os asteriscos na fileira inferior indicam aminoácidos que são idênticos em todas as três proteínas. A FIG. 1D mostra uma árvore filogenética das sequências da proteína de homólogos de C. reinhardtii BST1, BST2 e BST3 em plantas vasculares (grupo segundo a partir de cima), plantas não vasculares (grupo terceiro a partir de cima), diátomos (grupo quarto a partir de cima), e algas verdes (grupo na parte inferior).
[0051] As FIGS. 2A-2B mostram a análise transcrita dos genes de C. reinhardtii BST1, BST2 e BST3. A FIG. 2A mostra RT-PCR semiquantitativo mostrando acúmulo de BST1-3 em baixo CO2 (<0,04% de CO2 no ar) vs. alto CO2 (5% (v/v) de CO2 no ar) em células D66 de cepa do tipo selvagem e células cia5. A FIG. 2B mostra um intervalo de tempo de RT-PCR semiquantitativo mostrando a expressão de BST1-3 em cDNA obtido de células desenvolvidas em alto CO2 (5% de CO2 (v/v) no ar) e em células modificadas para baixo CO2 (<0,04% de CO2 no ar) por 2 horas (2h), 4 horas (4h), 6 horas (6h) ou 12 horas (12h). A actina foi usada como um controle de carga em ambas as FIG. 2A e FIG. 2B, e os resultados mostrados são de uma das duas réplicas.
[0052] As FIGS. 3A-3B mostram imagens de proteína fluorescente em microscópio confocal indicando a localização das proteínas de fusão
BST1-Venus, BST2-Venus e BST3-Venus em C. reinhardtii. A FIG. 3A mostra a localização da expressão das proteínas de fusão BST1-Venus, BST2-Venus e BST3-Venus (coluna “Venus”), a localização de tilacoides de cloroplasto (coluna “clorofila”), e a localização de ambas em relação à outra (coluna “fusão”) em C. reinhardtii. A barra de escala é de 5 μm. A FIG. 3B mostrou imagens aumentadas do pirenoide a partir da fileira de “BST1” na FIG. 3A. As setas realçam onde a fluorescência de BST1-Venus pode ser vista dentro do pirenoide nos túbulos de tilacoide que penetram no pirenoide. A barra de escala é de 1 μm. As imagens para ambas as FIG. 3A e FIG. 3B são imagens representativas de múltiplas réplicas.
[0053] A FIG. 4 mostra resultados da análise de qRT-PCR da expressão de BST1-3 nas cepas de knockdown de RNAi bsti-1 e bsti-2 conforme comparado com a cepa D66 do tipo selvagem. As barras de erro indicam o erro padrão para as três réplicas biológicas.
[0054] As FIGS. 5A-5C mostram resultados da análise do fenótipo de crescimento da cepa knockdown de RNAi bsti-1, assim como cepas mutantes pmp1 e cia3 conforme comparado com a cepa D66 do tipo selvagem sob diferentes condições de pH e CO2. Os pontos verticais representam três diferentes concentrações celulares; 10,000 células, 5,000 células e 2,500 células. A FIG. 5A mostra resultados da análise do fenótipo de crescimento das cepas sob condições de CO2 muito baixo (0,01% de CO2 (v/v) no ar) e um pH de 7 ou 8,4. A FIG. 5B mostra resultados da análise do fenótipo de crescimento das cepas sob baixo CO2 (0,04% de CO2 (v/v) no ar) e um pH de 7 ou 8,4. A FIG. 5C mostra resultados da análise do fenótipo de crescimento das cepas sob condições de alto CO2 (5% de CO2 (v/v) no ar) e um pH de 7 ou 8.4. O experimento da análise do fenótipo de crescimento foi repetido três vezes e os resultados mostrados são representativos.
[0055] As FIGS. 6A-6F mostram a atividade da evolução de oxigênio fotossintética das linhas BST-RNAi 1 e 2, isto é, bsti-1 e bsti-2, e D66. A FIG. 6A mostra os valores de K0.5 (Ci) (concentração Ci necessária para a metade da evolução máxima de oxigênio) que foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas de Ci para bsti-1 e D66 aclimatados até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 8,4. A FIG. 6B mostra a atividade da evolução do oxigênio medida em diferentes quantidades de Ci e em diferentes valores de pH organizados como curvas para bsti-1 e D66 aclimatados até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 8,4. A FIG. 6C mostra os valores de K0.5 (Ci) (concentração Ci necessária para a metade da evolução máxima de oxigênio) que foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas Ci para bsti-1, bsti-2 e D66 aclimatados até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 7,8. O símbolo “*”indica que as diferenças em K0.5(Ci) foram significativas (P < 0,05 pelo test t de student). A FIG. 6D mostra a atividade da evolução de oxigênio medida em diferentes quantidades de Ci e em diferentes valores de pH organizadas como curvas para bsti-1, bsti-2 e D66 aclimatados até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 7,8. A FIG. 6E mostra os valores de K0.5 (Ci) (concentração Ci necessária para a metade da evolução máxima de oxigênio) que foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas Ci para bsti-1 e D66 aclimatados até alto CO2 (>5% de CO2) por 12 horas em pH 7,8. A FIG. 6F mostra a atividade da evolução de oxigênio medida em diferentes quantidades de Ci e em diferentes valores de pH organizadas como curvas para bsti-1 e D66 aclimatados até alto CO2 (>5% de CO2) por 12 horas em pH 7,8. Para FIGS. 6A-6F, rodadas triplicadas foram feitas em cada concentração de Ci, e as barras de erro representam três réplicas biológicas e são baseadas no desvio padrão. O Vmax de todas as cepas foi configurado para 100% da atividade de evolução do oxigênio.
[0056] As FIGS. 7A-7D mostram captação de carbono inorgânico de bsti-1 e D66. A FIG. 7A mostra um intervalo de tempo de acúmulo intracelular (interno) de Ci em pH 7,8. A FIG. 7B mostra um intervalo de tempo da fixação (Ci) de CO2 em pH 7,8. A FIG. 7C mostra um intervalo de tempo de acúmulo intracelular de Ci em pH 8,4. A FIG. 7D mostra um intervalo de tempo da fixação de CO2 em pH 8,4. As células foram desenvolvidas em elevado CO2 (5% de CO2 no ar) e depois aclimatadas até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas antes dos ensaios. As células foram coletadas e depletadas de Ci endógeno antes da execução dos ensaios, e as amostras triplicadas foram executadas para cada intervalo de tempo. As barras de erro nas FIGS. 7A-7D representam três réplicas biológicas.
[0057] As FIGS. 8A-8C mostram que BST3 é inativado no bst3 mutante a partir do projeto de biblioteca Chlamydomonas (CLiP). A FIG. 8A mostra um esquema do gene BST3, onde exons são apresentados como quadrados cinzas, os íntrons são apresentados como linhas escuras, e as regiões não traduzidas são apresentadas como quadrados cinza escuro. A localização da inserção é mostrada como um triângulo verde claro, e os iniciadores para detectar a inserção são mostrados como setas escuras pequenas. A FIG. 8B mostra os resultados das reações PCR usando os iniciadores mostrados na FIG. 8A para confirmar a localização da inserção no bst3. A faixa 1, iniciadores BST3F e BST3R usando DNA de D66 da cepa WT como modelo; a faixa 2, iniciadores CIB1F e BST3F usando DNA de bst3 como modelo; a faixa 3, iniciadores CIB1R e BST3R usando DNA de bst3 como modelo; a faixa 4, iniciadores BST3F e BST3R usando DNA de bst3 como modelo. A diferença de tamanho entre a faixa 1 e 4 mostra que há um cassete de 1800bp. A FIG. 8C mostra RT-PCR semiquantitativo mostrando acúmulo de BST1-3 em baixo CO2 (<0,04% de CO2 no ar) vs. alto CO2 (5% (v/v) de CO2 no ar) em células D66 e bst3. Conforme indicado pelo quadrado vermelho, BST3 não é expressado em células bst3. A actina foi usada como um controle de carga.
[0058] As FIGS. 9A-9D mostram medições de crescimento e afinidade do carbono inorgânico da cepa knockout bst3 conforme comparado com a cepa D66 WT. A FIG. 9A mostra o crescimento de bst3 e WT em pH 8,6 em baixo CO2 (<0,04% CO2) durante seis dias, o qual foi medido usando OD730. A FIG. 9B mostra o crescimento de bst3 e WT em pH 8,6 em pH 8,6 em baixo CO2 (<0,04% de CO2) durante seis dias, o qual foi medido usando estimativa de clorofila em comprimentos de onda 645 e 663. A FIG. 9C mostra a atividade da evolução de oxigênio medida em pH 7,4 organizada como curvas para bst3 e D66. As rodadas triplicadas foram feitas em cada concentração de Ci. A FIG. 9D mostra os valores de K0.5 (Ci) (concentração Ci necessária para a metade da evolução máxima de oxigênio) que foram calculados a partir da evolução de O2 versus as curvas Ci para bst3 e D66 em pH 7,4.
[0059] As FIGS. 10A-10D mostram os modelos estruturais da proteína para BST1, BST2 e BST3 de C. reinhardtii. A FIG. 10A mostra os modelos estruturais para BST1-3 de C. reinhardtii e bestrofina de Klebsiella pneumonia (Kpbest) como monômeros com resíduos conservados revestindo o poro seletivo mostrado como formatos em protusão e marcados. A FIG. 10B mostra a estrutura secundária de um modelo homopentâmero de BST1 sombreado com a classificação QMEAN local (uma função de classificação da avaliação da qualidade estrutural). A FIG. 10C mostra o resultado da cavidade do canal no modelo do homopentâmero de BST1 em preto. Os resíduos conservados a partir do modelo BST1 na FIG. 10A são apresentados como formatos em protusão se estendendo na cavidade do canal. A FIG. 10D mostra o potencial eletrostático calculado no modelo do homopentâmero de BST1. Os potenciais eletrostáticos são exibidos em escala potencial de -4kT/e (negativa) até +4kT/e (positiva).
[0060] A FIG. 11 mostra o modelo CCM de C. reinhardtii atual para o transporte de carbono inorgânico (Ci). BST1, BST2 e BST3 são mostrados como canais de transporte de bicarbonato (retângulos cinza claro, cinza e cinza escuro) localizados na membrana tilacoide de cloroplasto.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0061] A descrição que segue apresenta métodos exemplificadores, parâmetros e similares. Deve ser reconhecido, no entanto, que a referida descrição não pretende ser uma limitação no escopo da presente descrição, porém é provida como uma descrição de modalidades exemplificadoras. Plantas e sementes geneticamente alteradas
[0062] Certos aspectos da presente descrição se referem a uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta. Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma planta geneticamente alterada ou parte da mesma contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta. Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de cruzamento da membrana de bicarbonato é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde. Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de cruzamento da membrana de bicarbonato é o resultado da expressão de dois ou três polipeptídeos de bestrofina da alga verde. Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de cruzamento da membrana de bicarbonato é o resultado da expressão de quatro ou mais (por exemplo, cinco, seis,
sete, oito, nove, dez) polipeptídeos de bestrofina da alga verde. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é SEQ ID NO:1 (isto é, BESTROPHIN1, BST1, Cre16.g662600.t1.2), SEQ ID NO:2 (isto é, BESTROPHIN2, BST2, Cre16.g663400.t2.1), ou SEQ ID NO:3 (isto é, BESTROPHIN3, BST3, Cre16.g663450.t1.2). Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos70% de identidade sequencial. pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial. pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0063] O termo “BST1”, e suas versões em maiúscula e itálico, se referem ao gene e proteína das algas verdes, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, este termo pode se referir ao gene e proteína de C. reinhardtii, conforme descrito no presente documento. Em outras modalidades, este termo pode se referir a um ou mais homólogos ou ortólogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga que também transportam bicarbonato. Em algumas modalidades, este termo pode se referir a um ou mais parálogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga. Em algumas modalidades, a espécie de alga verde é C. reinhardtii, Chlamydomonas eustigma, Volvox carteri f. nagariensis ou Gonium pectorale. A SEQ ID NO:1 provê a proteína BST1 de C. reinhardtii. Quando indicado com letras minúsculas em itálico, a versão mutante (por exemplo, knockout) do gene/proteína é a pretendida. Em C. reinhardtii, a versão mutante pode ser um único gene/proteína. Em outras espécies de algas verdes, a versão mutante pode ser uma, algumas, ou todos os homólogos, ortólogos e/ou parálogos dos genes/proteínas.
[0064] O termo “BST2”, e suas versões em maiúscula e itálico, se referem ao gene e proteína das algas verdes, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, este termo pode se referir ao gene e proteína de C. reinhardtii, conforme descrito no presente documento. Em outras modalidades, este termo pode se referir a um ou mais homólogos ou ortólogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga que também transportam bicarbonato. Em algumas modalidades, este termo pode se referir a um ou mais parálogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga. Em algumas modalidades, a espécie de alga verde é C. reinhardtii, Chlamydomonas eustigma, Volvox carteri f. nagariensis ou Gonium pectorale. A SEQ ID NO:2 provê a proteína BST2 de C. reinhardtii. Quando indicado com letras minúsculas em itálico, a versão mutante (por exemplo, knockout) do gene/proteína é a pretendida. Em C. reinhardtii, a versão mutante pode ser um único gene/proteína. Em outras espécies de algas verdes, a versão mutante pode ser uma, algumas, ou todos os homólogos, ortólogos e/ou parálogos dos genes/proteínas.
[0065] O termo “BST3”, e suas versões em maiúscula e itálico, se referem ao gene e proteína da alga verde, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, este termo pode se referir ao gene e proteína de C. reinhardtii, conforme descrito no presente documento. Em outras modalidades, este termo pode se referir a um ou mais homólogos ou ortólogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga que também transportam bicarbonato. Em algumas modalidades, este termo pode se referir a um ou mais parálogos do gene e proteína de qualquer espécie de alga. Em algumas modalidades, a espécie de alga verde é C. reinhardtii, Chlamydomonas eustigma, Volvox carteri f. nagariensis ou Gonium pectorale. A SEQ ID NO:3 provê a proteína BST3 de C. reinhardtii. Quando indicado com letras minúsculas em itálico, a versão mutante (por exemplo, knockout) do gene/proteína é a pretendida. Em C. reinhardtii, a versão mutante pode ser um único gene/proteína. Em outras espécies de algas verdes, a versão mutante pode ser uma, algumas, ou todos os homólogos, ortólogos e/ou parálogos dos genes/proteínas.
[0066] Em algumas modalidades, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo a partir de, ou de um polipeptídeo com alto percentual de identidade com um do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36,
SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:63. As frases “alto percentual idêntico”, “alto percentual de identidade” ou “alta identidade sequencial” e variações gramaticais das mesmas no contexto de dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 80% de identidade, pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com nucleotídeo ou aminoácido, quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima, conforme medido usando um algoritmo de comparação sequencial ou através de inspeção visual.
Em uma modalidade exemplificadora, uma identidade de alto percentual existe sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 16 nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento. Em uma outra modalidade exemplificadora, uma identidade de alto percentual existe sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento. Em ainda uma outra modalidade exemplificadora, uma identidade de alto percentual existe sobre uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 100 nucleotídeos ou aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade exemplificadora, as sequências têm alto percentual de identidade sobre o comprimento total das sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas.
[0067] Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de pelo menos um cloroplasto dentro de uma célula da planta. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é capaz de mover bicarbonato (HCO3-) ao longo de uma membrana. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é capaz de mover ânions de cloro (Cl-) ao longo de uma membrana. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é capaz de mover ambos HCO3- e Cl- ao longo de uma membrana. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é capaz de mover íons carregados negativamente ao longo de uma membrana. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta. Em algumas modalidades, o polipeptídeo se oligomeriza para formar um pentâmero. Em algumas modalidades, o polipeptídeo se oligomeriza para formar um homopentâmero. Em algumas modalidades, o pentâmero ou homopentâmero tem uma porta de entrada com um potencial hidrostático predominantemente negativo e um poro seletivo com uma carga neutra/positiva. Em algumas modalidades, o homopentâmero transporta íons negativamente carregados.
[0068] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência do uso de carbono aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Conforme utilizado no presente documento, o termo “dióxido de carbono ambiente” se refere ao teor de dióxido de carbono no ar sem CO2 adicionado ou removido. Em algumas modalidades, condições de dióxido de carbono ambiente são condições de dióxido de carbono de 400-500 ppm, 400-550 ppm, 400-600 ppm, 400-650 ppm, 400-700 ppm, 450-500 ppm, 450-550 ppm, 450-600 ppm, 450-650 ppm, 450-700 ppm, 500-550 ppm, 500-600 ppm, 500-650 ppm, 500-700 ppm, 550-600 ppm, 550-650 ppm, 550-700 ppm, 600-650 ppm, 600-700 ppm ou 650-700 ppm. Conforme utilizado no presente documento, o termo “eficiência no uso de carbono” pode se referir à proporção de carbono adquirido do ambiente que está incorporado na biomassa da planta. A eficiência no uso do carbono pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, subtração da quantidade de carbono perdido através da respiração da planta, depois divisão deste valor pela quantidade total de carbono que é retirado pela planta, etc.). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0069] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência no uso da água aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Conforme utilizado no presente documento, o termo “eficiência no uso da água” se refere à razão de assimilação de carbono para consumo de água em uma planta. As medidas da eficiência no uso da água incluem, porém não se limitam à eficiência intrínseca no uso da água e a eficiência instantânea no uso da água. A eficiência instantânea no uso da água pode ser calculada pela determinação da razão entre a assimilação do carbono pela planta e a transpiração da planta. A eficiência intrínseca no uso da água pode ser calculada pela determinação da razão entre a assimilação do carbono pela planta e a condutância estomática da planta. As medidas da assimilação de carbono podem incluir, porém não se limitam a, taxa fotossintética da planta, rendimento e biomassa. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0070] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com eficiência no uso de nitrogênio aumentada contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Conforme utilizado no presente documento, o termo “eficiência no uso de nitrogênio” se refere à razão de nitrogênio que é usado por uma planta para metabolismo para nitrogênio total fornecido para a planta. A eficiência no uso do nitrogênio pode ser medida por qualquer método na técnica (por exemplo, marcação do isótopo15N, eficiência agronômica, recuperação do nitrogênio aparente). As fontes de nitrogênio fornecidas para a planta incluem, porém não se limitam ao nitrogênio contido no solo, nitrogênio fornecido por bactérias que fixam nitrogênio e nitrogênio contido em fertilizantes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0071] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a plantas ou partes das mesmas com fotoinibição reduzida contendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada com pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma, onde o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma, e onde quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa da planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente. Conforme utilizado no presente documento, o termo “fotoinibição” se refere à redução induzida pela luz da produção fotossintética em uma planta. A fotoinibição pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo,
taxa da evolução de oxigênio saturado pela luz, razão de níveis variáveis a máximos da fluorescência da clorofila). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
[0072] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima a sequência de ácido nucleico modificada é estavelmente integrada no genoma nuclear da planta. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada adicionalmente contém uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde, onde a expressão da sequência peptídica de sinalou sequência de direcionamento resulta na localização do polipeptídeo de bestrofina a um envelope de cloroplasto ou membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento é uma sequência líder. Em algumas modalidades, a sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento é qualquer sequência conhecida na técnica para resultar na expressão de polipeptídeo no envelope de cloroplasto ou membrana tilacoide de cloroplasto.
[0073] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a eficiência no uso de carbono aumentada, a eficiência no uso de água aumentada, a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, ou a fotoinibição reduzida é o resultado de expressão de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a eficiência no uso de carbono aumentada, a eficiência no uso de água aumentada, a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, ou a fotoinibição reduzida é o resultado de expressão de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0074] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de um polipeptídeo a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25,
SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:63.
[0075] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta é feijão frade (isto é, feijão fradinho, Vigna unguiculata), soja (isto é, feijão de soja, Glycine max), mandioca (isto é, mandioca, Manihot esculenta), arroz (isto é, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Zizania spp.), trigo (isto é, trigo comum, espelta, durum, Triticum aestivum, Triticum spelta, Triticum durum, Triticum spp.), cevada (isto é, Hordeum vulgare), centeio (isto é, Secale cereale), aveia (isto é, Avena sativa), batatotato (isto é, Solanum tuberosum), tomate (isto é, Solanum lycopersicum), ou uma outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades, a planta é tabaco (isto é, Nicotiana tabacum, Nicotiana edwardsonii, Nicotiana plumbagnifolia, Nicotiana longiflora) ou Arabidopsis (isto é, aubrieta, Arabidopse do tale, Arabidopsis thaliana). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta não é milho (isto é, milho, Zea mays), sorgo (isto é, sorgo, painço, milhete, Sorghum bicolor), cana de açúcar (isto é, cana de açúcar, Saccharum officinarum), millet (isto é, painço (isto é, painço ragi, painço comum, painço bajra, painço vermelho, Eleusine coracana, Panicum miliaceum, Pennisetum glaucum, Setaria italica), switchgrass (isto é, tall panic grass, thatchgrass, Panicum virganum), ou uma outra planta de cultura C4.
[0076] Em algumas modalidades, a parte da planta de qualquer uma das modalidades acima é uma folha, um caule, uma raiz, uma flor, uma semente, uma fruta, uma célula ou uma porção da mesma. Em algumas modalidades, a parte da planta é uma fruta. Em algumas modalidades, a parte da planta é um grão, uma semente, uma fava, ou um tubérculo.
[0077] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um grão de pólen ou um óvulo de qualquer uma das modalidades acima.
[0078] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um protoplasto produzido a partir de qualquer uma das modalidades acima.
[0079] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma cultura de tecido produzida a partir de protoplastos ou células de qualquer uma das modalidades acima, onde as células ou protoplastos são produzidos a partir de uma das partes da planta no grupo da folha, antera, pistilo, caule pecíolo, raiz, ponta da raiz, fruta, semente, flor, cotiledônea, hipocótilo, embrião ou célula meristemática.
[0080] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma semente geneticamente alterada contendo uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana.
Em algumas modalidades, a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em algumas modalidades, a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
Em algumas modalidades, a planta expressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é a SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação das mesmas.
Em algumas modalidades, a planta expressa um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a planta expressa um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
Em algumas modalidades, a planta expressa um polipeptídeo a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta. Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta. Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta é feijão frade (isto é, feijão fradinho, Vigna unguiculata), soja (isto é, feijão de soja, Glycine max), aipim (isto é, mandioca, Manihot esculenta), arroz (isto é, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Zizania spp.), trigo (isto é, trigo comum, espelta, durum, Triticum aestivum, Triticum spelta, Triticum durum, Triticum spp.), cevada (isto é, Hordeum vulgare), centeio (isto é, Secale cereale), aveia (isto é, Avena sativa), batatotato (isto é, Solanum tuberosum), tomate (isto é, Solanum lycopersicum), ou uma outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades, a planta é tabaco (isto é, Nicotiana tabacum, Nicotiana edwardsonii, Nicotiana plumbagnifolia, Nicotiana longiflora) ou Arabidopsis (isto é, aubrieta, Arabidopse do tale, Arabidopsis thaliana). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta não é milho (isto é, milho, Zea mays), sorgo (isto é, sorgo, painço, milhete, Sorghum bicolor), cana de açúcar (isto é, cana de açúcar, Saccharum officinarum), millet (isto é, painço (isto é, painço ragi, painço comum, painço bajra, painço vermelho, Eleusine coracana, Panicum miliaceum, Pennisetum glaucum, Setaria italica), switchgrass (isto é, tall panic grass, thatchgrass, Panicum virganum), ou uma outra planta de cultura C4.
[0081] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a expressão de anidrases carbônicas endógenas é modulada. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.
Métodos de produção e cultivo de plantas geneticamente alteradas
[0082] Certos aspectos da presente descrição se referem a um método de produção de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso do carbono da planta.
[0083] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso da água da planta.
[0084] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim a eficiência no uso do nitrogênio da planta.
[0085] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, reduzindo assim a fotoinibição da planta.
[0086] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma planta com crescimento e produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na planta resultando no aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, aumentando assim o crescimento ou produtividade da planta. As medidas de crescimento aumentado podem incluir, porém não se limitam a, taxa de crescimento mais rápido, plantas maiores, biomassa aumentada, massa seca aumentada, quantidade aumentada de brotos, e quantidade aumentada de raízes. As medidas de produtividade aumentada podem incluir, porém não se limitam a, maior rendimento da cultura, maior número de folhas e menos dias até a maturidade da cultura.
[0087] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a expressão de anidrases carbônicas endógenas é modulada. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0088] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do carbono conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0089] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso da água conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0090] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do nitrogênio conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0091] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana reduz a fotoinibição conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0092] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com crescimento ou produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) prover uma semente com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana, em que a semente produz uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou uma planta com a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; b) cultivar a planta sob condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta o crescimento ou produtividade conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0093] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do carbono conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0094] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de água aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso da água conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0095] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com a eficiência no uso de nitrogênio aumentada, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumente a eficiência no uso do nitrogênio conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0096] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com fotoinibição reduzida, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana reduza a fotoinibição conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0097] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de um cultivo de uma planta com crescimento ou produtividade aumentados, onde as etapas do método são: a) prover uma cultura de tecido ou protoplasto com uma ou mais alterações genéticas que aumentem ou provejam uma capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana; b) regenerar a cultura de tecido ou protoplasto em uma plântula; c) crescer a plântula em uma planta, em que a planta tem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta ou a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta; d) transplantar a planta em condições em que a capacidade para o bicarbonato cruzar a membrana aumenta o crescimento ou produtividade conforme comparado com uma planta desenvolvida sob as mesmas condições que carece de uma ou mais alterações genéticas.
[0098] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, a semente, cultura de tecido, ou protoplasto tem uma ou mais alterações genéticas que modulam a expressão de anidrases carbônicas endógenas. Em algumas modalidades, a expressão modulada pode ser expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0099] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. de qualquer um dos métodos acima, o aumento ou provisão da capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana é o resultado da expressão de pelo menos um polipeptídeo selecionado a partir do grupo da SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID
NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 ou SEQ ID NO:63. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta.
Em algumas modalidades, a célula da planta é uma célula mesófila da folha.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta é feijão frade (isto é, feijão fradinho, Vigna unguiculata), soja (isto é, feijão de soja, Glycine max), aipim (isto é, mandioca, Manihot esculenta), arroz (isto é, Oryza sativa, Oryza glaberrima, Zizania spp.), trigo (isto é, trigo comum, espelta, durum, Triticum aestivum, Triticum spelta, Triticum durum,
Triticum spp.), cevada (isto é, Hordeum vulgare), centeio (isto é, Secale cereale), aveia (isto é, Avena sativa), batatotato (isto é, Solanum tuberosum), tomate (isto é, Solanum lycopersicum), ou uma outra planta de cultura C3. Em algumas modalidades, a planta é tabaco (isto é, Nicotiana tabacum, Nicotiana edwardsonii, Nicotiana plumbagnifolia, Nicotiana longiflora) ou Arabidopsis (isto é, aubrieta, Arabidopse do tale, Arabidopsis thaliana). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a planta não é milho (isto é, milho, Zea mays), sorgo (isto é, sorgo, painço, milhete, Sorghum bicolor), cana de açúcar (isto é, cana de açúcar, Saccharum officinarum), painço (isto é, painço ragi, painço comum, painço bajra, painço vermelho, Eleusine coracana, Panicum miliaceum, Pennisetum glaucum, Setaria italica), switchgrass (isto é, tall panic grass, thatchgrass, Panicum virganum), ou uma outra planta de cultura C4. Algas Geneticamente Alteradas
[00100] Certos aspectos da presente descrição se referem a uma alga geneticamente alterada contendo uma ou mais alterações genéticas resultando no aumento da capacidade da alga em transportar bicarbonato em um lúmen de um cloroplasto da alga. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo está localizado em uma membrana tilacoide de cloroplasto. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é superexpressado pelo menos quando a alga está sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0.01% [v/v] de CO2 no ar).
[00101] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma alga verde ou parte da mesma com transporte de bicarbonato aumentado contendo uma sequência de ácido nucleico modificada contendo a sequência codificadora de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde; em que o polipeptídeo de bestrofina é superexpressado; em que o polipeptídeo de bestrofina está localizado em membranas tilacoides de cloroplasto; e em que quando a alga é cultivada sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar), o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma alga do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa a partir da alga WT correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar). Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00102] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a uma alga verde ou parte da mesma com crescimento aumentado sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar) contendo uma sequência de ácido nucleico modificada contendo a sequência codificadora de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde; em que o polipeptídeo de bestrofina é superexpressado; em que o polipeptídeo de bestrofina é localizado em membranas tilacoides de cloroplasto; e em que quando a alga é cultivada sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar), o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma alga do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT da mesma queque não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa a partir da alga WT correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa pelo menos um polipeptídeo de bestrofina cultivado sob condições de <100 ppm de dióxido de carbono (<0,01% [v/v] de CO2 no ar). Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ
ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00103] Em algumas modalidades de qualquer uma das algas acima, a alga verde é selecionada a partir do grupo de Chlamydomonas reinhardtii, Chlamydomonas eustigma, Volvox carteri f. nagariensis, and Gonium pectorale. Métodos de produção de algas geneticamente alteradas
[00104] Em alguns aspectos, a presente descrição se refere a um método de produção de uma alga com eficiência no uso do carbono aumentada, onde as etapas do método são: a) introduzir uma alteração genética na alga compreendendo o aumento da capacidade de transportar bicarbonato em um lúmen de um cloroplasto da alga, aumentando assim a eficiência no uso do carbono da alga. Em algumas modalidades, o ganho da capacidade de transporte é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3,
ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o aumento da capacidade de transporte do bicarbonato é o resultado da superexpressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde selecionado a partir do grupo de um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos biológicos moleculares para produzir plantas e células de plantas transgênicas
[00105] Uma modalidade da presente invenção provê uma planta ou célula de planta compreendendo um ou mais genes de plantas modificados e/ou genes introduzidos. Por exemplo, a presente descrição provê plantas transgênicas com uma capacidade aumentada ou provida para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta. Além disso, a presente descrição provê plantas transgênicas com uma capacidade aumentada ou provida para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta. Além disso, a presente descrição provê plantas transgênicas com pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada contendo pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde. A expressão modulada de outros elementos genéticos (por exemplo, anidrases carbônicas endógenas) também é contemplada e descrita no presente documento.
[00106] A transformação e a geração de células de plantas monocotolidedôneas e dicotiledôneas geneticamente alteradas é bem conhecida na técnica. Vide, por exemplo, Weising, et al., Ann. Rev.
Genet. 22:421-477 (1988); Patente Norte-americana 5,679,558; Agrobacterium Protocols, ed: Gartland, Humana Press Inc. (1995); and Wang, et al. Acta Hort. 461:401-408 (1998). A escolha de métodos varia com o tipo de planta a ser transformada, a aplicação específica e/ou o resultado desejado. A técnica de transformação apropriada é prontamente escolhida pelo versado na técnica.
[00107] Qualquer metodologia conhecida na técnica para deletar, inserir ou de outra forma modificar o DNA celular (por exemplo, DNA genômico e organela de DNA) pode ser usada na prática das invenções divulgadas no presente documento. Por exemplo, um plasmídeo Ti desarmado, contendo um construto genético para deleção ou inserção de um gene alvo, em Agrobacterium tumefaciens pode ser usado para transformar uma célula de planta e depois disso, uma célula de planta transformada pode ser regenerada a partir da célula de planta transformada usando procedimentos descritos na técnica, por exemplo, em EP 0116718, EP 0270822, publicação PCT WO 84/02913 e pedido de patente Europeu publicado ("EP") 0242246. Os vetores do plasmídeo Ti cada um contém o gene entre as sequências delineadoras, ou pelo menos localizados à esquerda da sequência delineadora direita, do T- DNA do plasmídeo Ti. Certamente, outros tipos de vetores podem ser usados para transformar a célula da planta, usando procedimentos tais como transferência direta de genes (conforme descrito, por exemplo em EP 0233247), transformação mediada por pólen (conforme descrito, por exemplo em EP 0270356, publicação PCT WO 85/01856, e Patente Norte-americana 4,684,611), transformação mediada pelo vírus do RNA da planta (conforme descrito, por exemplo em EP 0 067 553 e Patente Norte-americana 4,407,956), transformação mediada por lipossomos (conforme descrito, por exemplo na Patente Norte-americana 4,536,475), e outros métodos tais como os métodos para transformar certas linhagens de milho (por exemplo, Patente Norte-americana
6,140,553; Fromm et al., Bio/Technology (1990) 8, 833 839); Gordon- Kamm et al., The Plant Cell, (1990) 2, 603 618) e arroz (Shimamoto et al., Nature, (1989) 338, 274 276; Datta et al., Bio/Technology, (1990) 8, 736 740) e o método para transformar monocots em geral (publicação PCT WO 92/09696). Para a transformação do algodão, o método descrito na publicação do pedido de patente PCT WO 00/71733 pode ser usado. Para a transformação da soja, se faz referência a métodos conhecidos na técnica, por exemplo, Hinchee et al. (Bio/Technology, (1988) 6, 915) e Christou et al. (Trends Biotech, (1990) 8, 145) ou o método da publicação internacional WO 00/42207.
[00108] As plantas transgênicas da presente invenção podem ser usadas em um esquema de melhoramento de plantas convencional para produzir mais plantas transgênicas com as mesmas características, ou para introduzir a(s) alteração(ões) genética(s) em outras variedades da mesma ou de espécies de plantas relacionadas. As sementes, que são obtidas das plantas transformadas, preferivelmente contêm a(s) alteração(ões) genética(s) como uma inserção estável em DNA cromossômico ou de organela. As plantas compreendendo a(s) alteração(ões) genética(s) de acordo com a invenção incluem plantas compreendendo, ou derivadas de, rizomas de plantas compreendendo a(s) alteração(ões) genética(s) da invenção, por exemplo, árvores frutíferas ou plantas ornamentais. Consequentemente, qualquer parte de planta enxertada não transgênica inserida em uma planta transformada ou parte de planta é incluída na invenção.
[00109] Elementos genéticos introduzidos, seja em um vetor de expressão ou cassete de expressão, que resultam na expressão de um gene introduzido utilizarão tipicamente um promotor expressível de planta. Um ‘promotor expressível de planta’ conforme utilizado no presente documento se refere a um promotor que assegura a expressão de alteração(ões) genética(s) da invenção em uma célula de planta. Exemplos de promotores direcionando expressão constitutiva em plantas são conhecidos na técnica e incluem: os promotores 35S constitutivos fortes (os "promotores 35S") do vírus mosaico da couve- flor (CaMV), por exemplo, de isolados de CM 1841 (Gardner et al., Nucleic Acids Res, (1981) 9, 2871 2887), CabbB S (Franck et al., Cell (1980) 21, 285 294) e CabbB JI (Hull and Howell, Virology, (1987) 86, 482 493); promotores da família ubiquitina (por exemplo, o promotor ubiquitina do milho de Christensen et al., Plant Mol Biol, (1992) 18, 675- 689), o promotor gos2 (de Pater et al., The Plant J (1992) 2, 834-844), o promotor emu (Last et al., Theor Appl Genet, (1990) 81, 581-588), promotores actina tal como o promotor descrito por An et al. (The Plant J, (1996) 10, 107), o promotor actina do arroz descrito por Zhang et al. (The Plant Cell, (1991) 3, 1155-1165); promotores do vírus mosaico da veia da mandioca (WO 97/48819, Verdaguer et al. (Plant Mol Biol, (1998) 37, 1055-1067) , a série pPLEX de promotores do vírus do trevo- subterrâneo (WO 96/06932, particularmente o promotor S4 ou S7), um promotor de álcool desidrogenase, por exemplo, pAdh1S (números de acesso GenBank X04049, X00581), e o promotor TR1' e o promotor TR2' (o promotor ‘TR1' e promotor "TR2'”, respectivamente) que dirigem a expressão dos genes 1' e 2', respectivamente, do T DNA (Velten et al., EMBO J, (1984) 3, 2723 2730).
[00110] Alternativamente, um promotor expressível de planta pode ser um promotor específico de tecido, isto é, um promotor que direciona um nível maior de expressão em algumas células ou tecidos da planta, por exemplo, em tecidos verdes (tal como o promotor da PEP carboxilase). O promotor da PEP carboxilase da planta (Pathirana et al., Plant J, (1997) 12:293-304) foi descrito por ser um forte promotor para expressão em tecido vascular e é útil em uma modalidade da presente invenção. Alternativamente, um promotor expressível de planta também pode ser um promotor induzível de lesão, tal como o promotor do gene invertase da parede celular da ervilha (Zhang et al., Plant Physiol, (1996) 112:1111-1117). Um promotor ‘induzível da lesão’ conforme utilizado no presente documento significa que mediante o lesionamento da planta, seja de forma mecânica ou através da infestação pelo inseto, uma expressão da sequência codificadora sob o controle do promotor é significativamente aumentada na referida planta. Esses promotores expressíveis de planta podem ser combinados com elementos melhoradores, eles podem ser combinados com elementos promotores mínimos, ou podem compreender elementos repetidos para assegurar o perfil desejado de expressão.
[00111] Em algumas modalidades, os elementos genéticos para aumentar a expressão em células de planta podem ser utilizados. Por exemplo, um íntron na extremidade 5’ ou extremidade 3’ de um gene introduzido, ou na sequência codificadora do gene introduzido, por exemplo, o íntron hsp70. Outros referidos elementos genéticos podem incluir, porém não se limitam a, elementos melhoradores promotores, regiões promotoras duplicadas ou triplicadas, sequências líder 5’ diferentes de um outro transgene ou diferentes de uma sequência líder genética endógena (hospedeira da planta), sequências trailer 3’ diferentes de um outro transgene usado na mesma planta ou diferentes de uma sequência trailer endógena (hospedeira da planta).
[00112] Um gene introduzido da presente invenção pode ser inserido no DNA da célula hospedeira de forma que a parte do gene inserido esteja a montante (isto é, 5') dos sinais de regulação da transcrição da extremidade 3' (isto é, sinais de formação de transcrito e poliadenilação). Isto é preferivelmente conseguido ao se inserir o gene em um genoma da célula da planta (nuclear ou cloroplasto). Os sinais de poliadenilação e formação de transcrito preferidos incluem aqueles do gene de nopalina sintase (Depicker et al., J. Molec Appl Gen, (1982)
1, 561-573), gene de octopina sintase (Gielen et al., EMBO J, (1984) 3:835 845), o SCSV ou os terminadores da enzima málica (Schunmann et al., Plant Funct Biol, (2003) 30:453-460), e o T DNA do gene 7 (Velten and Schell, Nucleic Acids Res, (1985) 13, 6981 6998), o qual age como sequências de DNA 3' não traduzidas em células de planta transformadas. Em algumas modalidades, um ou mais dos genes introduzidos são estavelmente integrados no genoma nuclear. A integração estável está presente quando a sequência de ácido nucleico permanece integrada no genoma nuclear e continua a ser expressada (isto é, transcrito de mRNA detectável ou proteína é produzido) ao longo de gerações de planta subsequentes. A integração estável no genoma nuclear pode ser alcançada por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, bombardeamento de micropartículas, transformação mediada por Agrobacterium, CRISPR/Cas9, eletroporação de protoplastos, microinjeção, etc.).
[00113] O termo ácidos nucleicos recombinantes ou modificados se refere aos polinucleotídeos que são feitos pela combinação de dois segmentos separados da sequência alcançados pela manipulação artificial de segmentos isolados de polinucleotídeos pelas técnicas de engenharia genética ou através da síntese química. Ao se fazer isso, pode-se unir segmentos de polinucleotídeo de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções.
[00114] Conforme utilizado no presente documento, os termos “superexpressão” e “suprarregulação” se referem à expressão aumentada (por exemplo, de mRNA, polipeptídeos, etc.) relativa à expressão em um organismo do tipo selvagem (por exemplo, planta, alga) como um resultado de modificação genética. Em algumas modalidades, o aumento na expressão é um leve aumento de cerca de 10% mais do que a expressão em tipo selvagem. Em algumas modalidades, o aumento na expressão é um aumento de 50% ou mais
(por exemplo, 60%, 70%, 80%, 100%, etc.) relativa à expressão em tipo selvagem. Em algumas modalidades, um gene endógeno é superexpressado. Em algumas modalidades, um gene exógeno é superexpressado em virtude de ser expressado. A superexpressão de um gene em plantas ou algas pode ser alcançada por qualquer método conhecido na técnica, porém não limitado ao uso de promotores constitutivos, promotores induzíveis, promotores de alta expressão (por exemplo, promotor PsaD), melhoradores, sequências reguladoras transcricionais e/ou translacionais, otimização de códon, fatores de transcrição modificados, e/ou genes mutantes ou modificados que controlam a expressão genética do gene a ser superexpressado.
[00115] Onde um ácido nucleico recombinante é destinado a expressão, clonagem ou replicação de uma sequência particular, as construções de DNA preparadas para introdução em uma célula hospedeira compreenderão tipicamente um sistema de replicação (isto é, vetor) reconhecido pelo hospedeiro, incluindo o fragmento de DNA desejado que codifica um polipeptídeo desejado, e também pode incluir sequências reguladoras de iniciação de transcrição e tradução operacionalmente ligadas ao segmento que codifica o polipeptídeo. Adicionalmente, os referidos construtos podem incluir sinais de localização celular (por exemplo, sinais de localização de cloroplasto). Em modalidades preferidas, os referidos construtos de DNA são introduzidos em um DNA genômico da célula do hospedeiro, DNA de cloroplasto ou DNA mitocondrial.
[00116] Em algumas modalidades, um sistema de expressão não integrado pode ser usado para induzir a expressão de um ou mais genes introduzidos. Sistemas de expressão (vetores de expressão) podem incluir, por exemplo, uma origem de replicação ou sequência de replicação autónoma (ARS) e sequências de controle de expressão, um promotor, um melhorador e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossomo, sítios de ligação de RNA, sítios de poliadenilação, sequências terminadoras transcricionais e sequências de estabilização de mRNA. Peptídeos de sinal também podem ser incluídos, onde apropriado a partir de polipeptídeos secretados da mesma espécie ou espécies relacionadas, que permitem que a proteína se cruze e/ou acumule em membranas celulares, parede celular, ou seja secretada a partir da célula.
[00117] Os marcadores selecionáveis úteis na prática das metodologias da invenção aqui descritas podem ser marcadores selecionáveis positivos. Tipicamente, a seleção positiva se refere ao caso em que uma célula geneticamente alterada pode sobreviver na presença de uma substância tóxica somente se o polinucleotídeo recombinante de interesse estiver presente dentro da célula. Os marcadores selecionáveis negativos e marcadores rastreáveis são também bem conhecidos na técnica e são contemplados pela presente invenção. Um versado na técnica reconhecerá que quaisquer marcadores relevantes disponíveis podem ser utilizados na prática das invenções aqui descritas.
[00118] O rastreio e a análise molecular das cepas recombinantes da presente invenção podem ser realizados utilizando-se técnicas de hibridização de ácido nucleico. Os procedimentos de hibridização são úteis para identificar polinucleotídeos, tais como aqueles modificados utilizando as técnicas aqui descritas, com homologia suficiente às sequências reguladoras em questão para serem úteis conforme mostrado neste documento. As técnicas de hibridização específicas não são essenciais para a presente invenção. Como melhorias são feitas em técnicas de hibridização, elas podem ser facilmente aplicadas por uma pessoa versada na técnica. As sondas de hibridização podem ser rotuladas com qualquer marcador apropriado conhecido por aqueles versados na técnica. As condições de hibridização e condições de lavagem, por exemplo, temperatura e concentração de sal, podem ser alteradas para alterar a estringência do limite de detecção. Vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989) vide infra or Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, N.Y., para orientação adicional nas condições de hibridização.
[00119] Adicionalmente, o rastreio e a análise molecular de cepas geneticamente alteradas, assim como a criação de ácidos nucleicos isolados desejados podem ser realizados usando reação em cadeia polimerase (PCR). PCR é uma síntese preparada, repetitiva enzimática de uma sequência de ácido nucleico. Este procedimento é bem conhecido e comumente usado pelos versados na técnica (vide Mullis, Patentes Norte-americanas Nos. 4,683,195, 4,683,202 e 4,800,159; Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354). PCR é baseada na amplificação enzimática de um fragmento de DNA de interesse que é flanqueado por dois iniciadores oligonucleotídicos que se hibridizam em filamentos opostos da sequência alvo. Os iniciadores são orientados com as extremidades 3′ apontando umas em direção às outras. Ciclos repetidos de desnaturação térmica do modelo, anelamento dos iniciadores nas suas sequências complementares, e a extensão dos iniciadores anelados com um resultado de DNA polimerase na amplificação do segmento definido pelas extremidades 5’ dos iniciadores de PCR. Devido ao produto de extensão de cada iniciador poder servir como um modelo para o outro iniciador, cada ciclo essencialmente dobra a quantidade de modelo de DNA produzido no ciclo anterior. Isto resulta no acúmulo exponencial do fragmento alvo específico, até várias milhões de vezes em algumas horas. Ao usar uma DNA polimerase termoestável tal como Taq polimerase, que é isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus, o processo de amplificação pode ser completamente automatizado. Outras enzimas que podem ser usadas são conhecidas daqueles versados na técnica.
[00120] Ácidos nucleicos e proteínas da presente invenção também podem abranger homólogos das sequências especificamente divulgadas. A homologia (por exemplo, de identidade sequencial) pode ser de 50%-100%. Em alguns casos, a referida homologia é maior do que 80%, maior do que 85%, maior do que 90% ou maior do que 95%. O grau de homologia ou identidade necessário para qualquer uso pretendido da(s) sequência(s) é prontamente identificado por um versado na técnica. Conforme utilizado no presente documento, o percentual de identidade sequencial de dois ácidos nucleicos é determinado usando um algoritmo conhecido na técnica, como aquele divulgado por Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Um referido algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:402-410. As pesquisas por nucleotídeo BLAST são realizadas com o programa NBLAST, score=100, wordlength=12, para obter sequências nucleotídicas com o percentual desejado de identidade sequencial. Para obter alinhamentos gapped para finalidade de comparação, Gapped BLAST é usado conforme descrito em Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:3389-3402. Quando se utilizam programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (NBLAST e XBLAST) são usados. Vide www.ncbi.nih.gov.
[00121] As células hospedeiras preferidas são células de plantas ou células de algas. As células hospedeiras recombinantes, no presente contexto, são aquelas que foram geneticamente modificadas para conter uma molécula de ácido nucleico isolada, conter um ou mais genes deletados ou de outra forma não funcionais normalmente presentes e funcionais na célula hospedeira, ou conter um ou mais genes para produzir pelo menos uma proteína recombinante. O(s)
ácido(s) nucleico(s) que codificam a(s) proteína(s) da presente invenção podem ser introduzidos por qualquer meio conhecido na técnica o qual é apropriado para o tipo específico de célula, incluindo sem limitação, transformação, lipofecção, eletroporação ou qualquer outra metodologia conhecida daqueles versados na técnica.
[00122] Tendo descrito genericamente esta invenção, a mesma será melhor compreendida por referência a certos exemplos específicos, que são aqui incluídos para ilustrar ainda mais a invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção conforme definido pelas reivindicações.
EXEMPLOS
[00123] A presente descrição descrita em maiores detalhes nos exemplos a seguir que não se destinam a limitar o escopo da invenção como reivindicado. Pretende-se que as figuras anexas sejam consideradas como partes integrais do relatório descritivo e da descrição da invenção. Os exemplos que seguem são apresentados para ilustrar, mas não limitar a descrição reivindicada. Exemplo 1: Materiais e métodos gerais usados para cultura e desenvolvimento celular
[00124] O exemplo que segue descreve as condições de cultura e crescimento de células usadas em todos os exemplos a seguir. As células de Chlamydomonas reinhardtii foram mantidas tanto em meio de tris-acetato-fosfato (TAP) ou meio de levedura-acetato (YA) em placas de petri. Antes de um experimento, as células foram inoculadas em meio mínimo (isto é, não contendo uma fonte de carbono) e desenvolvidas em alto CO2 (>5% de CO2 no ar) até uma densidade de 2-3 x 106 células mL-1. Essas células foram então diluídas em meio mínimo e desenvolvidas nas concentrações de pH e CO2 indicadas.
[00125] As condições de cultura de Chlamydomonas reinhardtii eram as mesmas que as descritas em Ma et al., Plant Physiol 156:884-896,
2011. A cepa D66 (nit2-, cw15, mt+) foi obtida do Dr. Rogene Schnell
(University of Arkansas, Little Rock). CMJ030 (CC-4533; cw15, mt-) e bst3 (BST3 knockout LMJ.RY0402.089365) foram obtidas da coleção CLiP na coleção de cultura de Chlamydomonas (Zhang et al., Plant Cell 26(4):1398-1409, 2014). O meio de tris-acetato-fosfato (TAP), meio de levedura-acetato (YA) e meio mínimo (MIN; sem acetato, isto é, sem uma fonte de carbono) foram preparados de acordo com Sueoka, PNAS 46:83-91, 1960. Ambas as placas de petri TAP e YA foram preparadas com a adição de 1,2% (p/v) de ágar, e as células de C. reinhardtii foram mantidas em qualquer tipo de placa de petri. As culturas celulares foram iniciadas pela inoculação de colônias a partir de placas TAP em 100mL de meio líquido TAP em frascos Erlenmeyer para crescimento mixotrófico. As culturas foram desenvolvidas até fase log inicial em iluminação contínua (100 µmol m-2 s-1) e agitação por 48 h. As culturas desenvolvidas em TAP de fase log inicial foram coletadas e lavadas com meio MIN, depois ressuspensas em meio MIN e borbulhadas com alto CO2 (5% [v/v] de CO2 no ar) para atingir OD730 entre 0,2 e 0,3 (~2-3 x106 células mL-1). Para a indução CCM, as células foram transferidas para borbulhamento com baixo CO2 (<0,01% [v/v] de CO2 no ar) por 12 h ou CO2 ambiente (0,04% - 0,045% [v/v] de CO2 no ar). Exemplo 2: Árvore filogenética dos genes da família de bestrofina
[00126] O exemplo que segue descreve a construção da árvore filogenética apresentando a relação evolucionária dos genes da família de bestrofina em uma variedade de organismos fotossintéticos. Nos mamíferos, as proteínas bestrofina são conhecidas por conduzir cloro e bicarbonato. Nas plantas, a maioria das proteínas bestrofina ainda não foi caracterizada. Materiais e métodos
[00127] Os três genes de C. reinhardtii BESTROPHIN1 (BST1), BESTROPHIN2 (BST2) e BESTROPHIN3 (BST3) foram escolhidos para serem usados nesta árvore por múltiplas razões. Para uma, os genes BST1, BST2 e BST3 compartilham uma região comum (vide as FIGS. 1A-1B). Para outra, as sequências de aminoácido das proteínas BST1 (SEQ ID NO:1), BST2 (SEQ ID NO:2) e BST3 (SEQ ID NO:3) são >80% idênticas umas com as outras (vide FIG. 1C). C. reinhardtii contém sete outras bestrofinas previstas, porém nenhuma dessas outras bestrofinas tinham mais do que uma identidade de 45% com essas três proteínas. Finalmente, as três bestrofinas escolhidas foram todas previstas como alvo para o cloroplasto.
[00128] Construção da árvore filogenética: As sequências de aminoácido para BST1 (Cre16.g662600.t1.2), BST2 (Cre16.g663400.t2.1) e BST3 (Cre16.g663450.t1.2) foram BLASTED em oposição a NCBI Genbank (Benson et al., Nucleic Acids Res, 21(13):2963-2965, 1993) e Phytozome v12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html; Goodstein et al., Nucleic Acids Res 40(Database issue):D1178-1186, 2012). Os acessos principais identificados usando essas bases de dados foram baixados. Adicionalmente, as sequências de aminoácido codificando BEST1 de Homo sapiens (SJM31533.1) e bestrofina Klebsiella pneumoniae (pdb_4WD8_A) foram baixadas do NCBI Genbank para serem incluídas como o grupo externo da análise filogenética. Um total de 63 sequências iniciais foram alinhadas em Geneious 11.1.4 (Kearse et al., Bioinformatics 28(12):1647-1649, 2012) usando um algoritmo ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res 22(22):4673-4680, 1994) com a matriz de substituição de aminoácido BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, PNAS 89(22):10915-10919, 1992). As sequências duplicadas a partir das duas bases de dados (NCBI e Phytozome) e sequências com uma identidade positiva de porcentagem pareada (BLOSUM62) de menos de 70% foram removidas. O alinhamento final incluiu 30 sequências e foi manualmente cortado para remover extremidades de comprimento variável das sequências. A análise filogenética foi completada em
MEGA X (Kumar et al., Comput Appl Biosci 10(2):189-191, 1994). O melhor modelo de probabilidade máxima (ML) para a análise filogenética foi calculado usando a função de seleção do modelo em MEGA X. Uma árvore ML foi construída usando o modelo de substituição LG (Le & Gascuel, Mol Biol Evol 25(7):1307-1320, 2008) com distribuição Gamma (5 categorias discretas) e 500 réplicas bootstrap (vide FIG. 1D). O Adobe Illustrator CC foi usado para formatar e sombrear a árvore. A árvore filogenética das sequências de proteína dos homólogos de BST1, BST2 e BST3 de C. reinhardtii foi construída usando a probabilidade máxima (ML). Resultados
[00129] A FIG. 1A mostra uma representação esquemática dos genes BST1, BST2 e BST3. Os quadrados cinza-claros representam exons, as linhas cinza finas representam íntrons, as linhas cinza grossas representam regiões não traduzidas (UTRs), e as linhas sobrepostas (sobrepostas em exons e íntrons) indicam a região comum compartilhada pelos três genes. Além disso, os comprimentos de cada um dos três genes de bestrofina são mostrados, com BST1 sendo o mais curto abaixo de 3000 kb, e BST2 sendo o mais longo acima de 5000 kb. Na FIG. 1B, a localização e a orientação dos genes BST1, BST2 e BST3 no genoma de C. reinhardtii é mostrada. BST1 (Cre16.g662600), BST2 (Cre16.g663400) e BST3 (Cre16.g663450) são genes parálogos localizados dentro de uma região de 130 kbp no 16º cromossomo de C. reinhardtii. Além disso, esta imagem apresenta a localização de BST1, BST2 e BST3 uma relativa a outra. A FIG. 1C apresenta o alinhamento de aminoácido das proteínas de BST1, BST2 e BST3, onde os asteriscos na fileira inferior indicam aminoácidos que são idênticos em todas as três proteínas. As proteínas de BST1, BST2 e BST3 são >80% idênticas umas com as outras.
[00130] A FIG. 1D mostra a árvore filogenética representando a relação entre as sequências de proteína dos homólogos BST1, BST2 e BST3 de C. reinhardtii em uma variedade de organismos fotossintéticos.
Esses organismos incluem plantas vasculares (grupo segundo a partir de cima), plantas não vasculares (grupo terceiro a partir de cima), diátomos (grupo quarto a partir de cima), e algas verdes (grupo na parte inferior). As proteínas bestrofina de C. reinhardtii são mostradas em negrito dentro do grupo de algas verdes.
Um grupo externo, consistindo em proteínas a partir dos organismos não fotossintéticos humanos (Homo sapiens) e bactérias (Klebsiella pneumoniae), também é mostrado (grupo na parte superior). O alinhamento sequencial de BST1, BST2 e BST3 de C. reinhardtii com bestrofina 1 humana (BEST1) mostrou baixa identidade sequencial entre BEST1 e BST1-3 (21 - 23%). As proteínas de bestrofina de C. reinhardtii mostram similaridade sequencial considerável uma com a outra, e com as outras proteínas bestrofina de algas verdes, que são apresentadas pela sua localização proximal dentro da árvore e o padrão de ramificação mais raso que conecta estas proteínas.
Em particular, V. carteri e Chlamydomonas eustigma são muito intimamente relacionadas com C. reinhardtii, enquanto Dunaliella salina está mais distantemente relacionada a C. reinhardtii.
As espécies diatomáceas (destacadas em azul-petróleo) estão muito distantemente relacionadas a C. reinhardtii, e de fato surgiram de um evento endossimbiótico diferente; esta relação distante é claramente apresentada pelo padrão de ramificação mais profundo conectando essas proteínas.
As proteínas de plantas vasculares e não vasculares mostradas na FIG. 1D têm uma baixa similaridade sequencial de apenas 30-35% com as proteínas bestrofina de C. reinhardtii, que são apresentadas por sua localização mais distante e pelo padrão de ramificação mais profundo conectando essas proteínas.
Por exemplo, a proteína VCCN1 de Arabidopsis localizada em tilacoide tem cerca de 30% de identidade sequencial com BST1-3. Embora as outras proteínas usadas para construir esta árvore também sejam genes da família bestrofina, elas estão apenas distantemente relacionadas com as bestrofinas de C. reinhardtii. No nível de aminoácido, as bestrofinas de C. reinhardtii têm menos do que 50% de identidade com as proteínas bestrofina encontradas em plantas maiores ou mamíferos. Além disso, a proteína bestrofina humana é suficientemente diferente das bestrofinas de C. reinhardtii de forma que ela pode ser usada como um grupo externo, junto com a proteína bestrofina bacteriana K. pneumoniae, para ancorar a árvore filogenética. Exemplo 3: Bestrofinas são suprarreguladas sob baixo CO2 e a sua expressão é controlada por CIA5
[00131] CIA5 é um fator de transcrição que controla muitos genes CCM. Em particular, CIA5 controla todos os transportadores conhecidos de CCM. O exemplo que segue descreve a análise da expressão de bestrofina em uma cepa de C. reinhardtii D66 do tipo selvagem (WT), e uma cepa de C. reinhardtii mutante cia5 sob condições de alto CO2 ou baixo CO2. Materiais e métodos
[00132] As condições de cultura e desenvolvimento celular para as células de C. reinhardtii foram as descritas como no Exemplo 1. Para o experimento, uma cepa WT D66 de C. reinhardtii e uma cepa cia5 mutante de C. reinhardtii foram cultivadas sob condições de alto CO2 (5% [v/v] CO2 no ar) ou baixo CO2 (<0,04% [v/v] de CO2 no ar, isto é, condições de CO2 no ambiente).
[00133] As amostras de RNA foram obtidas a partir de culturas de ambas as cepas de C. reinhardtii aclimatadas em alto CO2 e baixo CO2. A extração do RNA foi realizada usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 1ug de RNA por amostra foi usado como modelo para cDNA, o qual foi feito usando ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB) conforme as instruções do fabricante. 100 ng de RNA por amostra foram usados para conduzir qRTPCR usando o Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit da NEB conforme as instruções do fabricante usando QuantStudio 6. RT-PCR semiquantitativo foi realizado usando iniciadores específicos para BST1, BST2 ou BST3, e os iniciadores Actina como um controle (listados na Tabela 1). Os produtos de PCR foram analisados usando eletroforese em gel. O experimento foi replicado duas vezes. Tabela 1. Iniciadores usados para análise RT-PCR. Gene alvo Nome do iniciador Sequência do iniciador BST1 BST1 RT-F GACACCAAGACCATCCTGGC (SEQ ID NO:112) BST1 RT-R AACAGAACTGCAGAGGTCCCG (SEQ ID NO:113) BST2 BST2 RT-F CGGTGCCCATGAGCTCC (SEQ ID NO:114) BST2 RT-R GCCACTAACCGGCCCAA (SEQ ID NO:115) BST3 BST3 RT-F AATCCCGTCCATGTCGCT (SEQ ID NO:116) BST3 RT-R CGGCTTGTGAGGACCTCG (SEQ ID NO:117) Actina Actin RT-F GCCAGAAGGACTCGTACGTT (SEQ ID NO:118) Actin RT-R CGCCAGAGTCCAGCACGATA (SEQ ID NO:119)
[00134] Uma análise de intervalo de tempo da expressão de BST1, BST2 e BST3 também foi realizada. Para esta análise, as células desenvolvidas sob alto CO2 foram transferidas para baixo CO2 por 2 a 12 horas, e depois o RNA foi extraído e cDNA foi produzido conforme descrito acima. Esta análise foi replicada duas vezes. Resultados
[00135] Conforme mostrado na FIG. 2A, em D66 (WT), os níveis de expressão de todos os três genes de bestrofina foram suprarregulados sob condições de baixo CO2, conforme comparado com as condições de alto CO2. Em particular, a expressão de BST3 foi muito baixa em células desenvolvidas sob condições de alto CO2, e muito mais altas em células sob condições de baixo CO2. A intensidade aumentada das faixas a partir das células D66 desenvolvidas em condições de baixo CO2 conforme comparado com as células D66 desenvolvidas em condições de alto CO2 mostra claramente que todos os três genes são suprarregulados sob condições de baixo CO2. Em contraste com D66, a condição de baixo CO2 não induziu a expressão aumentada de BST1, BST2, ou BST3 em mutantes cia5. Além do mais, BST1 e BST3 não foram expressados no mutante cia5 sob nenhuma condição, o que é um padrão transcricional similar aos outros genes CCM no cia5 mutante (Xiang et al., PNAS 98(9):5341-5346, 2001; Fukuzawa et al., PNAS 98(9):5347-5352, 2001; Moroney et al., Plant Physiol 89(3):897-903, 1989). Os níveis transcritos de BST2 em células cia5 foram os mesmos em ambas as condições de alto CO2 e baixo CO2, e não mostraram nenhuma indução notável em baixo CO2. Isto é em contraste com as células D66, onde os níveis transcritos de BST2 aumentam em condições de baixo CO2.
[00136] A FIG. 2B mostra a expressão dos três genes BST em D66 em momentos diferentes depois da transferência de condições de alto CO2 para condições de baixo CO2. Todos os três genes tiveram níveis transcritos aumentados dentro de 2 horas depois mudaram para baixo CO2 e esses níveis de expressão foram mantidos até pelo menos 12 horas depois da indução. Esses resultados demonstram que todos os três genes BST foram suprarregulados sob condições de baixo CO2 conhecidas por induzir CCM. Além disso, essa suprarregulação não foi observada em mutantes cia5, o que sugere que a expressão dos genes bestrofina é regulada por CIA5. Em conjunto, esses resultados indicam um papel possível no CCM para os genes bestrofina. Exemplo 4: Localização de bestrofinas no cloroplasto
[00137] O modelo CCM atual indica que os transportadores de bicarbonato na membrana tilacoide de cloroplasto são necessários para a captação de bicarbonato, mas esses transportadores ainda não foram identificados. O exemplo que segue descreve a localização de proteínas bestrofina-Venus quiméricas dentro da célula de C. reinhardtii. Uma abordagem com produção de imagens em fluorescência foi escolhida para identificar a localização específica dentro do cloroplasto, uma vez que a análise computacional previu a marcação de cloroplasto com base nas sequências líder das três proteínas bestrofinas, mas não uma localização específica dentro do cloroplasto. Materiais e métodos
[00138] Marcação de proteína em fluorescência: Para esse experimento, as sequências codificadoras de BST1, BST2 ou BST3 foram fundidas com as sequências codificadoras de Venus de modo a gerar proteínas de fusão BST1-Venus, BST2-Venus e BST3-Venus. Os genes BST1-3 foram clonados e transformados em cepa de Chlamydomonas CC-4533 como em Mackinder et al., Cell 171(1):133- 147 e114, 2017. Em resumo, as fases de leitura aberta dos genes BST1- 3 foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico (iniciadores listados na Tabela 2) e clonados em pLM005 com C-terminal Venus- 3xFLAG e um promotor PSAD através da configuração Gibson. Três construtos separados foram gerados, um para cada BST. PSAD é um promotor de alta expressão que conduz um gene nuclear codificando uma proteína de cloroplasto abundante localizada no lado estromal do fotossistema em C. reinhardtii (Fischer and Rochaix, 2001). Para transformação, culturas do tipo selvagem foram desenvolvidas até a fase mid-log e concentradas em 2x108 células mL-1. A suspensão foi misturada com o plasmídeo construído linearizado por EcoRV antes da eletroporação. Depois, a suspensão foi colocada em placas em paranomicina TAP (20µg mL-1) para seleção. As três cepas separadas foram geradas: uma expressando BST1-Venus, uma expressando BST2-Venus, e uma expressando BST3-Venus. As colônias fluorescentes foram identificadas usando um Typhoon 8610 scanner. As configurações do laser para Venus foram de 532 nm para excitação e 555/20 para emissão, e autofluorescência da clorofila foi excitada em 633 nm com 670/30 de emissão. Tabela 2. Iniciadores usados para gerar proteínas BST1-3 fluorescentes marcadas por Venus. Nome do iniciador Sequência do iniciador BST1F GCTACTCACAACAAGCCCAGTT ATGCAGATGCAAGCAAACCGTTCGTC (SEQ ID NO:120) BST1R GAGCCACCCAGATCTCCGTTCT TGCGCTCCCCACCCATGG (SEQ ID NO:121) BST2F GCTACTCACAACAAGCCCAGTT ATGGCCACTGGTCAGACC (SEQ ID NO:122) BST2R GAGCCACCCAGATCTCCGTTTC TCCTTGTCTCCGCAC (SEQ ID NO:123) BST3F GCTACTCACAACAAGCCCAGTT ATGCAAGTCAGCAAGGTTCCCTCG (SEQ ID NO:124) BST3R GAGCCACCCAGATCTCCGTT CCGGGGCGAGATGCGCAC (SEQ ID NO:125)
[00139] Microscopia confocal: as imagens fluorescentes das três cepas geradas foram então tomadas usando um microscópio confocal de modo a determinar a localização de proteína bestrofina. As colônias fluorescentes identificadas foram desenvolvidas heterotroficamente em meio TAP até alcançar a fase mid-log. As culturas foram então coletadas e ressuspensas em meio Tris-mínimo de um dia para o outro antes da produção das imagens. As imagens foram capturadas com microscópio de varredura a laser LSM880 (Zeiss) equipado com um módulo Airyscan usando uma objetiva x63 com lasers de argônio 1.4 NA. em 514nm e 561nm foram usadas para excitação de Venus e clorofila, respectivamente. Os filtros foram configurados em 525 – 550nm para a emissão de Venus e 620 – 670nm para emissão da clorofila. A fluorescência da clorofila foi usada para localizar as pilhas de tilacoide de cloroplasto nessas cepas, e uma sobreposição de fluorescência Venus e clorofila foi usada para identificar a localização das proteínas bestrofina em relação às pilhas de tilacoide de cloroplasto. Foram feitas imagens das múltiplas réplicas. Resultados
[00140] Conforme mostrado na FIG. 3A, todas as três proteínas de fusão de bestrofina apresentaram sinais não homogêneos dentro do cloroplasto, indicado pelos sinais de Venus (mostrados na coluna esquerda). Quando os sinais de Venus e os sinais de clorofila (mostrados na coluna do meio) foram fundidos, uma sobreposição poderia ser observada entre os sinais de Venus e as pilhas de tilacoide no cloroplasto. Todas as três proteínas de fusão BST-Venus localizadas nas membranas de tilacoide do cloroplasto. Além disso, os túbulos de tilacoide do pirenoide mostram a mesma sobreposição entre os sinais de Venus e os sinais de clorofila. Isso é apresentado claramente na FIG. 3B, que mostra imagens ampliadas pirenoides da cepa BST1-Venus. As setas indicam onde a fluorescência de BST1-Venus pode ser vista dentro do pirenoide nos túbulos tilacoides que penetram o pirenoide. Ambos esses resultados confirmam a previsão computacional que as bestrofinas são direcionadas no cloroplasto (baseado nas sequências líder de bestrofina), e fortemente indicam uma localização de tilacoide para as proteínas bestrofina. Exemplo 5: Bestrofinas são necessárias para o crescimento de C. reinhardtii sob baixo CO2
[00141] O exemplo que segue descreve o efeito da redução da expressão das três bestrofinas BST1, BST2 e BST3 no crescimento de C. reinhardtii. O fenótipo de crescimento da tripla cepa knockdown de RNAi da bestrofina bsti-1 foi comparado com a da cepa D66 WT assim como as cepas mutantes cia3 e pmp1 sob condições de crescimento variadas em concentração de CO2 e pH. As duas cepas mutantes têm mutações em componentes CCM conhecidos; a cepa cia3 tem uma mutação em CAH3, a qual é uma anidrase carbônica tilacoide, enquanto a cepa pmp1 tem uma mutação em LCIB/LCIC, que são anidrases teta carbônicas estromais. Materiais e métodos
[00142] Knockdown de BST1, BST2 e BST3 usando RNAi: A abordagem de knockdown de RNAi foi escolhida de modo a direcionar todos os três genes bestrofina simultaneamente. Atualmente, apenas uma cepa knockout bst3 está disponível da coleção de cultura Chlamydomonas; as cepas knockout bst1 e bst2 não estão disponíveis. Além do mais, conforme descrito em maiores detalhes no Exemplo 7, uma cepa knockout bst3 foi testada sob condições de baixo CO2, e se observou que crescem normalmente. Isto significa simultaneamente que apenas a cepa knockout bst3 foi testada, e que o material para gerar uma cepa de triplo knockout não está disponível atualmente. A abordagem de knockdown de RNAi foi então considerada a melhor opção.
[00143] O construto artificial de microRNA para o knockdown das proteínas BST foi produzido usando o protocolo de Molnar, et al. Plant J 58(1):165-174, 2009. Em resumo, o website Web MicroRNA Designer (WMD3) (http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi) foi usado para projetar dois conjuntos de oligos complementares a diferentes localizações na “região comum” das três sequências codificadoras de BST. Dois construtos independentes foram projetados e clonados no plasmídeo pChlamyRNA3int obtido a partir do centro de recursos de Chlamydomonas. Os oligos projetados para direcionar as três bestrofinas que foram usados para o knockdown de RNAi são mostrados na Tabela 3. Duas linhagens de knockdown triplas (linhagens BST-RNAi 1 e 2 ou bsti-1 e bsti-2) foram isoladas a partir de 400 transformantes. Os oligos B1 Forwards e Reverse foram usados para gerar bsti-1 e os oligos B2 Forwards e Reverse foram usados para gerar bsti-2. Tabela 3. Oligos projetados para direcionar as três bestrofinas. Nome do Sequência Oligo Oligo B1 CTAGTGGGAGCGAGTTGCAAGGCATATCTCGCTGATCGGCAC Forwards CATGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATATGTTTTGCAACTCG
CTCCCG (SEQ ID NO:126) B1 Reverse CTAGCGGGAGCGAGTTGCAAAACATATAGCGCTGATCACCAC
CACCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATATGCCTTGCAACTCG
CTCCCA (SEQ ID NO:127) B2 CTAGTGAGAGCGTGTTGCAAGGCATATCTCGCTGATCGGCAC Forwards CATGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATATGTTTTGCAACACG CTCTCG (SEQ ID NO:128) B2 Reverse CTAGCGAGAGCGTGTTGCAAAACATATAGCGCTGATCACCAC
CACCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATATGCCTTGCAACACG CTCTCA (SEQ ID NO:129)
[00144] O plasmídeo pChlamyRNA3int que carrega o gene AphVIII que confere resistência à paranomicina (paraR) foi transformado em D66 através de eletroporação (Shimogawara et al., Genetics 148(4):1821- 1828, 1998). Os transformantes foram selecionados em meio de ágar TAP contendo o antibiótico paromomicina (4 µg mL-1; Invitrogen). As cepas resistentes foram então rastreadas quanto ao fenótipo “doentes em baixo CO2” ao colocar as réplicas delas em placas MIN. Essas foram então colocadas em uma câmara de alto CO2 (5% [v/v]) de CO2 no ar e uma câmara de baixo CO2 (0,01% [v/v] de CO2 no ar) com iluminação contínua (100 µmol m-2 s-1) por 7 dias. Os testes spot foram feitos ao se suspender o crescimento de células em meio MIN líquido até a mesma densidade celular (OD730 =0,1; 0,05 e 0,025) e 15µL foram colocados em placas de MIN. Essas placas foram colocadas em câmaras de alto, ambiente e baixo CO2 por 7 dias. A concentração de CO2 foi medida usando um monitor de gás ambiental (EGM-4, PP systems, Massachusetts).
[00145] RT-PCR quantitativo (qRT-PCR;qPCR): A extração de RNA foi realizada usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 1ug de RNA por amostra foi usado como modelo para cDNA, o qual foi feito usando ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB) de acordo com as instruções do fabricante. 100 ng de RNA por amostra foram usados para conduzir qRTPCR usando o Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit da NEB de acordo com as instruções do fabricante usando QuantStudio 6. Os iniciadores usados para qPCR são listados na Tabela 4; os iniciadores CBLP foram usados como um controle. Tabela 4. Iniciadores usados para análise de qPCR. Gene alvo Nome do Sequência do iniciador iniciador BST1 qBST1F GCTGTGTGGCATTGAGGAGA (SEQ ID NO:130) qBST1R GGATGAGGCTGATGAGTCCG (SEQ ID NO:131) BST2 qBST2F ACGGTCTACGACTTCCCTCA (SEQ ID NO:132) qBST2R TTGGATCACGTGGGATTGGG (SEQ ID NO:133) BST3 qBST3F AAGTCAGCAAGGTTCCCTCG (SEQ ID NO:134) qBST3R TGAATGAGCCTAGCGGGTTG (SEQ ID NO:135) CBLP qCBLPF ATGTGCTGTCCGTGGCTTTC (SEQ ID NO:136) qCBLPR CAGACCTTGACCATCTTGTCCC (SEQ ID NO:137)
[00146] Fenotipagem de crescimento sob diferentes níveis de pH e CO2: a cepa WT D66, a cepa mutante cia3 (CAH3 knockout), a cepa mutante pmp1 (LCIB/LCIC knockout) e bsti-1 foram desenvolvidas sob muito baixo CO2 (0,01% de CO2 (v/v) no ar), baixo (ou ambiente) CO2 (0,04% - 0,045% de CO2 (v/v) no ar) e alto CO2 (5% de CO2 (v/v) no ar). O crescimento em cada uma dessas três condições de CO2 foi testada em ambos pH 7 e pH 8,4. Para inocular as placas, três diferentes concentrações celulares foram usadas; a maior concentração foi de 10,000 células, a concentração média foi de 5,000 células, e a concentração mais baixa foi de 2,500 células. Três spots nas três diferentes concentrações foram aplicados em cada placa de teste para todas as quatro cepas. O experimento de fenotipagem de crescimento foi replicado três vezes. Resultados
[00147] Para examinar o papel das bestrofinas no crescimento de C. reinhardtii sob condições de baixo CO2, uma abordagem de RNAi foi adotada para reduzir a expressão de todos os três genes bestrofina de uma vez. RNAi direcionando BST1, BST2 e BST3 foi usado para gerar duas linhagens knockdown de RNAi, bsti-1 e bsti-2. Os níveis de expressão de BST1, BST2 e BST3 em bsti-1, bsti-2, e em uma cepa de controle WT D66 foram medidos usando RT-PCR quantitativo. Conforme mostrado na FIG. 4, os níveis de expressão de todos os três genes bestrofina eram menores nas linhagens knockdown de RNAi bsti- 1 e bsti-2 conforme comparado com a cepa de controle WT D66 (as barras de erro indicam o erro padrão para três réplicas biológicas). Em particular, bsti-1 e bsti-2 (linhagens 1 e 2 BST-RNAi) mostraram quase um knockdown de 60-90% na expressão de BST1, BST2 e BST3 comparado com D66. Esse resultado indica que a expressão de todos os três genes bestrofina nas linhagens knockdown de RNAi bsti-1 e bsti- 2 foram efetivamente reduzidas usando a abordagem de RNAi.
[00148] A seguir, a linhagem knockdown de RNAi bsti-1, a cepa D66 do tipo selvagem, junto com a cepa mutante cia3 CAH3 e a cepa mutante pmp1 LCIB/LCIC foram testadas quanto as suas capacidades de se desenvolverem sob diferentes níveis de pH e CO2. As culturas foram desenvolvidas em um pH de 7 ou 8,4, e sob condições de muito baixo CO2, baixo CO2, ou alto CO2. Em muito baixo CO2 bsti-1 mostrou crescimento severamente reduzido que foi ainda mais exacerbado em alto pH, se assemelhando ao crescimento dos mutantes CCM, cia3 e pmp1 (FIG. 5A). Em pH 7, o crescimento de bsti-1 foi um pouco melhor do que em pH 8,4. Em baixo CO2, bsti-1, cia3 e pmp1 todos mostraram crescimento reduzido quando comparado à cepa D66 do tipo selvagem (FIG. 5B). Novamente, todas as quatro cepas mostraram crescimento levemente melhor sob pH 7 quando comparado com o pH 8.4. Em alto CO2, no entanto, o crescimento de bsti-1 se mostrou comparável a cia3 e pmp1 do tipo selvagem (FIG. 5C). Em conjunto, esses resultados mostram que o knockdown de RNAi de todas as três bestrofinas (bsti-1) mostram um claro fenótipo doente em baixo CO2 quando comparado com ambos WT (D66) e outros mutantes com fenótipos conhecidos doentes em baixo CO2 (cia3, pmp1). Além do mais, CAH3 (cia3 é o CAH3 knockout) é a anidrase carbônica encontrada dentro do lúmen tilacoide de C. reinhardtii, e é necessária para o funcionamento de CCM. As três proteínas bestrofina podem ser as proteínas que liberam bicarbonato a CAH3 dentro dos tilacoides. Sendo assim, esses resultados mostram que todos as três BSTs são necessárias para o crescimento do tipo selvagem de C. reinhardtii sob condições de baixo CO2. Exemplo 6: Triplas cepas de knockdown de RNAi de bestrofina têm uma capacidade reduzida para acumular carbono inorgânico (Ci)
[00149] O exemplo que segue descreve a testagem de afinidade do carbono inorgânico das triplas cepas de knockdown de RNAi de bestrofina bsti-1 e bsti-2 (descritas no Exemplo 5) conforme comparado com a cepa WT D66. Materiais e métodos
[00150] Afinidade pelo carbono inorgânico: Para esse ensaio, a taxa de fotossíntese (como evolução de O2) foi medida em vários níveis de carbono inorgânico (carbono inorgânico = CO2 & HCO3-). A afinidade por Ci externo (K1/2 [DIC]) (carbono inorgânico dissolvido) foi estimada de acordo com Ma et al., Plant Physiol 156:884-896, 2011. Especificamente, as células com um equivalente de 100µg de clorofila foram suspensas em tampão HEPES-NaOH (pH 7,4), tampão HEPES- NaOH (pH 7,8), ou tampão EPPS-NaOH 25 mM (pH 8,4) borbulhados com gás nitrogênio, isto é, livres de CO2. As células foram transferidas para uma câmara de eletrodos O2 (Rank Brothers, Cambridge UK) iluminada em 300 µmol m-2s-1, e deixada depletar qualquer DIC restante no tampão e espaços intracelulares. Mediante a depleção de CO2 endógeno, nenhuma evolução de O2 foi observada. Concentrações conhecidas de NaHCO3 foram injetadas na câmara e a taxa de evolução de O2 foi medida. Nesse experimento, o nível de carbono inorgânico foi variado de 25 M a 2 mM. O K1/2 [DIC] foi calculado como a concentração de DIC necessária para as taxas da metade de evolução máxima (50%) do oxigênio (isto é, fotossíntese) (Badger, 1985). O teor da clorofila foi medido ao se combinar clorofila a e b. A clorofila foi extraída em 100% de metanol e medida usando o espectrofotômetro. O K1/2 (CO2) é tomado como a concentração de CO2 necessária para alcançar a metade da evolução máxima Vmax de O2.
[00151] A afinidade Ci foi estimada para bsti-1 e D66 aclimatada até baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 8,4 (FIG. 6A). Os valores de K0.5 (Ci) (Ci concentração necessária para metade da evolução máxima do oxigênio) mostrados na FIG. 6A foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas de Ci mostradas na FIG. 6B. Além disso, a afinidade Ci foi estimada para bsti-1, bsti-2 e D66 aclimatada para baixo CO2 (<0,04% de CO2) por 12 horas em pH 7,8 (FIG. 6C). Os valores de K0.5 (Ci) (Ci concentração necessária para metade da evolução máxima do oxigênio) mostrados na FIG. 6C foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas de Ci mostradas na FIG. 6D. Além disso, a afinidade Ci foi estimada para bsti-1, bsti-2 e D66 aclimatada para alto CO2 (>5%de CO2) por 12 horas em pH 7,8 (FIG. 6E). Os valores de K0.5 (Ci) (Ci concentração necessária para metade da evolução máxima do oxigênio) mostrada na FIG. 6E foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas de Ci mostradas na na FIG. 6F. As rodadas triplicadas foram feitas em cada concentração de Ci. O símbolo “*”indica que as diferenças em K0.5(Ci) foram significativas (P < 0,05 pelo teste t de student). Em pH 7,8 e baixa aclimatação de CO2, o Vmax de D66 é 121 µmol O2 mg-1 Chl hr-1, o Vmax de bsti-1 é 105 µmol O2 mg-1 Chl hr-1, e o Vmax de bsti-2 é 95 µmol O2 mg-1 Chl hr-1. Em pH 7,8 e aclimatação em alto CO2, o Vmax de D66 é 121 µmol O2 mg-1 Chl hr-1 e o Vmax de bsti-1 é 120 µmol O2 mg-1 Chl hr-1. Em pH 8,4 e aclimatação de baixo CO2, o Vmax de D66 é 124 µmol O2 mg-1 Chl hr-1 e o Vmax de bsti-1 é 85.5 µmol O2 mg-1 Chl hr-1. O Vmax de todas as cepas foi acertado para 100% de atividade de evolução do oxigênio.
[00152] Captação do carbono inorgânico: a centrifugação em óleo de silicone foi usada para medir a concentração intracelular de Ci dissolvido como em Moroney et al., Plant Physiol 79(1):177-183, 1985. Em resumo, as células foram centrifugadas e suspensas em 25µg Chl mL-1 de densidade em EPPS-NaOH Ci depletado 25 mM (pH 7,8 ou 8,4) e incubadas na luz até que a evolução pura de O2 fosse zero. As células foram mantidas no claro até 300 µL de células depletadas de Ci fossem então centrifugadas em tubos contendo 25 µL de glicina 1 M (pH 10) com 0,75% (p/v) de SDS sobreposto com 75 µL de óleo de silicone Dow Corning AR 20. Os ensaios foram realizados em 25°C em 200 µmol m-2 s-1 de luz em uma microcentrífuga B Beckman. A captação de Ci foi iniciada com a adição tanto de 3 µl de 25 mM (para uma concentração adicionada de 25 µM) em pH 7,8 ou 50 mM ((para uma concentração adicionada de 50 µM) em pH 8,4 de NaH14CO3 seguido pelo tempo de iluminação indicado (entre 15 e 120 seg em 150 µmol m-2 s-1 de luz). As amostras triplicadas foram executadas para cada intervalo de tempo. A reação foi terminada por uma centrifugação de 15 segundos em uma microcentrífuga B (Beckman). O Ci interno foi calculado usando a 14 14 diferença entre C total e C ácido estável no pélete e corrigido para volume celular conforme descrito (Machingura et al., J Exp Bot 68(14):3879-3890, 2017). Resultados
[00153] Duas características das células de algas com um CCM são primeiro, a sua afinidade muito alta por carbono inorgânico (Ci), e segundo a sua capacidade de acumular Ci em níveis maiores do que aqueles que podem ser obtidos por difusão. Consequentemente, a atividade de evolução de oxigênio fotossintética das linhagens knockdown de RNAi bsti-1 e bsti-2, e a cepa WT D66 foram testadas. As linhagens knockdown de RNAi bsti-1 e bsti-2 aclimatadas para baixo CO2 exibiram uma afinidade três a dez vezes menor para Ci em pH 7,8, respectivamente, conforme julgado pelo seu K0.5(Ci) medido (FIG. 6A e FIG. 6C). Quando aclimatado em alto CO2, bsti-1 também teve uma redução na afinidade de Ci comparado com D66 (FIG. 6E). Isso indica que a redução da expressão de todos os três genes BST causou uma redução na afinidade das células por Ci. Em pH 8,4, o K0.5(Ci) para bsti- 1 é 95 μM, em nítido contraste com um K0.5(Ci) baixo de 35 μM por D66. No maior pH de 8,4, a espécie predominante de Ci no meio seria bicarbonato, assim a maior afinidade das células D66 (WT) por Ci reflete a sua capacidade em ativamente tomar e utilizar bicarbonato. Esses resultados, que mostram que bsti-1 e bsti-2 têm uma maior necessidade por carbono inorgânico para evolução fotossintética de O2, são forte evidência para um papel das bestrofinas no CCM.
[00154] A atividade de captação de Ci também foi medida em D66 e bsti-1 para avaliar a importância de BST1-3 no acúmulo e fixação de Ci. bst-1 aclimatado em baixo teve acúmulo e fixação significativamente menores de 14Ci comparado com D66 em ambos pH 7,8 assim como pH 14 8,4 (FIG. 7A-7D). Em ambos pH 7,8 e 8,4, bsti-1 acumulou Ci em apenas 20 e 25% dos níveis observados em células D66. Essa diferença foi vista em ambos o intervalo de tempo inicial (15 segundos) e no intervalo de tempo final (até dois minutos no claro) onde as células D66 14 tinham usado a maior parte do Ci adicionado. Esses resultados indicam que BST1-3 têm um papel importante na captação de Ci em condições de baixo CO2 em C. reinhardtii, e novamente proveem forte evidência para um papel das bestrofinas no CCM. Exemplo 7: A cepa knockout bst3 tem crescimento normal sob condições de baixo CO2 e a afinidade similar do carbono inorgânico quando comparado com WT
[00155] O exemplo que segue descreve o crescimento sob condições de baixo CO2 e testagem de afinidade de Ci da cepa knockout bst3 de C. reinhardtii quando comparado com a cepa WT D66. Materiais e métodos
[00156] Cepas knockout de C. reinhardtii: As cepas knockout são criadas usando mutagênese insercional aleatória, e são parte do projeto de biblioteca de Chlamydomonas (CLiP). As cepas podem ser requisitadas do Chlamydomonas Resource Center (https://www.chlamycollection.org/). Atualmente, apenas uma cepa knockout bst3 está disponível; as cepas knockout bst1 e bst2 não estão disponíveis. De modo a confirmar a posição de inserção na cepa knockout bst3, PCR foi realizado usando iniciadores específicos para o gene BST3 e para a inserção (vide Tabela 5). Os iniciadores específicos de inserção (CIB1F e CIB1R) e a informação para a região flanqueadora foram obtidos do website CLiP (https://www.chlamylibrary.org/allMutants).
Tabela 5. Iniciadores usados para analisar a inserção de bst3. nome do iniciador Sequência do iniciador BST3F TGCCCCTTCTCAGCACGT (SEQ ID NO:138) BST3R ACTGCCTCACACTCCCCT (SEQ ID NO:139) CIB1F GCACCAATCATGTCAAGCCT (SEQ ID NO:140) CIB1R GACGTTACAGCACACCCTTG (SEQ ID NO:141)
[00157] A análise semiquantitativa de RT-PCR foi realizada como no Exemplo 3.
[00158] Medição do crescimento: a cepa WT D66 e a cepa knockout bst3 foram desenvolvidas em pH 8,6, usando métodos descritos nos exemplos acima. O crescimento foi medido usando OD730, e a estimativa de clorofila foi feita em comprimentos de onda 645 e 663. As medições foram feitas em baixo CO2 (<0,04% de CO2) por seis dias. As células for am desenvolvidas em TAP por 48 horas antes de transferi-las para MIN em um OD730 de 0,01.
[00159] Afinidade por carbono inorgânico: isto foi feito usando métodos descritos no Exemplo 6. A atividade de evolução do oxigênio foi medida em pH 7,4 e os valores de K0.5(Ci) (Ci concentração necessária para metade da evolução máxima do oxigênio) foram calculados a partir da evolução de O2 versus curvas de Ci. As rodadas triplicadas foram feitas em cada concentração de Ci. Resultados
[00160] Um BST3 knockout (bst3) foi obtido da coleção mutante CLiP com uma inserção de paromomicina no primeiro exon do gene bst3 (FIG. 8A). A localização da inserção foi confirmada usando PCR (FIG. 8B). Além disso, a expressão de BST1-3 foi analisada na cepa knockout bst3 sob condições de alto e baixo CO2, e comparadas com a cepa WT D66. A expressão de BST3 não foi detectada em bst3 sob ambas as condições, enquanto a expressão de BST1 e BST2 se mostraram comparáveis entre a cepa knockout bst3 e a cepa WT D66 sob ambas as condições (FIG. 8C).
[00161] Nenhuma diferença de crescimento significativa para a cepa bst3 foi observada quando comparado com as células do tipo selvagem sob baixo (<0,04% de CO2) (FIGS. 9A-9B), muito baixo (0,02% de CO2) ou alto CO2 (5% de CO2) (v/v) no ar (dados não mostrados). Não houve também diferença notável na afinidade de Ci entre WT e bst3 (FIG. 9C). Na linhagem knockdown bsti-1 de RNAi, onde a expressão de todos os três genes BST é reduzida, há uma afinidade por Ci reduzida em ambos o pH 7,8 e pH 8,4. Este é um nítido contraste com bst3, a cepa knockout que apenas carece da expressão de BST3, a qual não tem diferença em afinidade por Ci com WT (FIG. 9C-9D). Esses resultados sustentam a hipótese de que a função das três BSTs é redundante, e que a expressão de todos os três genes deve ser reduzida para observar efeitos fisiológicos. Exemplo 8: caracterização estrutural de BST1, BST2 e BST3 e modelo CCM de C. reinhardtii atual
[00162] O exemplo que segue descreve a caracterização estrutural das proteínas BST1, BST2 e BST3 de C. reinhardtii. O exemplo também descreve o modelo CCM de C. reinhardtii atual. Materiais e métodos
[00163] As sequências peptídicas de BST1, BST2 e BST3 foram obtidas de Phytozome v12.1. A modelagem de homologia foi feita usando bestrofina de Klebsiella pneumonia (Kpbest; PDB: 4DW8) como um modelo e gerada com webserver Swiss-Model (Yang, et al., Science 346(6216):1498-1501, 2014). Kpbest foi escolhido porque foi identificado como o modelo melhor para BST1-3 pelo Swiss-Model. As estruturas obtidas e aquelas de Kpbest são exibidas como monômeros com resíduos conservados revestindo o poro seletivo mostrado como formatos em protusão e marcados na FIG. 10A. O modelo homopentâmero obtido de BST1 foi submetido à minimização energética com campo de força gromos 43B1 e o potencial eletrostático foi calculado usando carga parcial atômica usando Swiss-PDBviewer (V4.01). Depois, o campo elétrico foi exibido no modelo homopentâmero de BST1 para gerar a FIG. 10D. Os potenciais eletrostáticos foram exibidos em escala potencial de -4kT/e (negativa) a +4kT/e (positiva), e a cavidade foi destacada. A qualidade da estrutura do homopentâmero de BST1 (FIG. 10B) foi obtida usando o QMEAN score (Benkert et al., Proteins 71(1):261-277, 2008). Resultados
[00164] Para prever se BST1-3 pode funcionar como bestrofinas de transporte de íons negativos, a modelagem de homologia de BST1-3 usando bestrofina de Klebsiella pneumonia foi feita. BST1-3 contém resíduos não polares ao longo de seu poro seletivo que são conservados em proteínas da família da bestrofina (FIG. 10A; Qu et al., J Neurosci 26(20):5411-5419, 2006). Os estudos estruturais mostram que as bestrofinas humanas e de K. pneumonia são pentaméricas, e a modelagem de BST1 em uma configuração pentamérica é de alta confiança (FIG. 10B). A porta de entrada tem um potencial eletrostático predominantemente negativo e o poro seletivo é neutro/positivamente carregado sustentando a hipótese de que BST1-3 transportam íons negativamente carregados (FIGS. 10C-10D; Yang, et al., Science 346(6216):1498-1501, 2014; Kane et al., Nature 516(7530):213-218, 2014). Esses resultados sugerem que as bestrofinas de C. reinhardtii podem ser transportadores iônicos.
[00165] Os resultados descritos nos Exemplos 2 – 8 demonstram um papel importante para as três proteínas bestrofina no contexto de C. reinhardtii CCM. Em conjunto, esses resultados indicam que as três proteínas bestrofinas são canais de transporte de bicarbonato localizados em tilacoide. A FIG. 11 mostra a integração de BST1, BST2 e BST3 no modelo atual de C. reinhardtii CCM para transporte de Ci.

Claims (20)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta geneticamente alterada ou parte da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um citoplasma da célula da planta em um estroma de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta, ou que compreende uma ou mais alterações genéticas que aumentam ou proveem a capacidade para o bicarbonato cruzar uma membrana a partir de um estroma em um lúmen de pelo menos uma porção dos cloroplastos da planta.
2. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ganho da capacidade de cruzamento da membrana de bicarbonato compreende a expressão de pelo menos um polipeptídeo de bestrofina da alga verde.
3. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo consistindo em um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, e qualquer combinação dos mesmos.
4. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo consistindo em um primeiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, e qualquer combinação dos mesmos.
5. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80,
SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 e SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63.
6. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de pelo menos um cloroplasto dentro de uma célula da planta.
7. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a célula da planta é uma célula mesófila da folha.
8. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
9. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que ainda compreende expressão modulada de anidrases carbônicas endógenas.
10. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a expressão modulada é selecionada a partir do grupo consistindo em expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, e qualquer combinação dos mesmos.
11. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo consistindo em feijão frade, soja, mandioca, arroz, soja, trigo e outra planta de cultura C3, e em que a planta não é selecionada a partir do grupo consistindo em milho, sorgo e outras plantas de cultura C4.
12. Planta ou parte da mesma com eficiência no uso do carbono aumentada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada compreendendo pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde na planta ou parte da mesma; em que o polipeptídeo de bestrofina é expressado na planta ou parte da mesma; e em que quando a planta é cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente, o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é maior do que de uma planta do tipo selvagem (WT) correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina ou o rendimento, taxa de crescimento ou biomassa é substancialmente similar ao rendimento, taxa de crescimento ou biomassa a partir da planta WT correspondente ou parte WT correspondente da mesma que não superexpressa o polipeptídeo de bestrofina cultivada sob condições de dióxido de carbono ambiente.
13. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina está localizado em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta, em que a célula da planta é uma célula mesófila da folha, e em que o polipeptídeo é expressado em pelo menos 70% das células mesófilas da folha da planta.
14. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico modificada é estavelmente integrada no genoma nuclear da planta.
15. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de ácido nucleico modificada ainda compreende uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência codificadora de um polipeptídeo de bestrofina da alga verde, em que a expressão da sequência peptídica de sinal ou sequência de direcionamento resulta na localização do polipeptídeo de bestrofina em um envelope de cloroplasto ou uma membrana tilacoide de cloroplasto de pelo menos um cloroplasto de uma célula de planta.
16. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo consistindo em um primeiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:1, um segundo polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:2, um terceiro polipeptídeo com pelo menos 70% de identidade sequencial, pelo menos 75% de identidade sequencial, pelo menos 80% de identidade sequencial, pelo menos 85% de identidade sequencial, pelo menos 90% de identidade sequencial, ou pelo menos 95% de identidade sequencial com a SEQ ID NO:3, e qualquer combinação dos mesmos.
17. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de bestrofina da alga verde é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 ou SEQ ID NO:111, preferivelmente selecionada a partir do grupo consistindo em
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63.
18. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que ainda compreende expressão modulada de anidrases carbônicas endógenas.
19. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a expressão modulada é selecionada a partir do grupo consistindo em expressão aumentada, expressão reduzida, expressão em um local diferente, e qualquer combinação dos mesmos.
20. Planta ou parte da mesma de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada a partir do grupo consistindo em feijão frade, soja, mandioca, arroz, soja, trigo e outras plantas de cultura C3, e em que a planta não é selecionada a partir do grupo consistindo em milho, sorgo e outras plantas de cultura C4.
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