CN111850006A - 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用 - Google Patents

Abstract

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865为一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述对接蛋白突变体适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑4M的条件与黏连蛋白相互作用；进一步的适用于低钙离子浓度为10^‑7M‑10^‑6M的条件与黏连蛋白相互作用；适用于细胞内环境中与黏连蛋白相互作用；解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下无法自组装的问题。

Description

一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体 36865及应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用。

背景技术

纤维小体是厌氧生物产生的能够高效彻底的降解天然纤维素的一种胞外多酶复合体，包含纤维素酶、半纤维素酶等酶类以及相关的辅助因子，这些辅助因子依靠特定的折叠亚单位与酶相连[侯爱华,吴斌辉.细菌纤维小体的结构和功能[J].纤维素科学与技术,2002(01):50-56.]。纤维小体主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白(dockerin，Doc)和含有结构蛋白的粘连蛋白(cohesin，Coh)。

现有技术研究发现纤维小体元件Doc中存在一段富含亲水性氨基酸的序列D¹ D/N³D/N⁵ D/N⁹ D¹²，并且通过突变其中的S688–T689和S720–T721之间的序列可以改变来自于不同产生物种的Doc和Coh相互之间的亲和能力，参见文献[Page`s.PROTEINS:Structure,Function, and Genetics,1997,29:517–527；Mechaly.PROTEINS:Structure,Function,and Genetics,2000, 39:170–177]；现有技术中Coh与Doc之间的结合需要大量的钙离子(浓度为0.5mM～2mM)，参见文献[Bule,Journal of Biological Chemistry,2018,293(11)；Xu,Biotechnol Biofuels,2013, 6(1):126]；甚至更高的钙离子浓度(2mM～10mM)，参见文献[Mechaly.PROTEINS:Structure, Function,and Genetics,2000,39:170–177]。

由于代谢的需求，静息状态下微生物细胞内的钙离子浓度一般仅为10^-7M～10^-6M，远低于胞外的浓度(1mM)，参见文献[张倩,中国热带医学,2014,14(11):1309-1313]，因此纤维小体在现有技术下只能在高钙离子浓度下(≥1mM)发挥作用，现有技术无法提供能够在10^-7M ～10^-6M条件下能够有效组装的纤维小体元件，也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度 10^-7M～2mM)中都能发挥作用的纤维小体元件，更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10^-6M)组装的纤维小体元件。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用。

本发明提供一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白突变体及应用，解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下(如细胞内)无法自组装的问题，提供了一种在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10^-7M～2×10^-3M)发挥作用的纤维小体对接蛋白突变体。

本发明涉及的技术方案

一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种纤维小体对接蛋白DocA，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述对接蛋白DocA来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(GenBank:2CCL_B) 中，DocA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，DocA氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述氨基酸序列中D₆VNGDGTINSTD₁₇突变为D₆VNGSGTINSTD₁₇； D₄₀VDKNGSINAAD₅₁突变为D₄₀VSKDGSINAAD₅₁。

上述纤维小体对接蛋白组合突变体36865的制备方法，包括如下步骤：

以上述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，设计定点突变引物，以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板，进行PCR，构建重组突变质粒，并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的，所述制备方法中，由对接蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变为对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，上述制备方法中，发酵结束后离心收集菌体，对菌体进行超声破碎，经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

根据本发明优选的，所述制备方法，对接蛋白组合突变体36865的PCR扩增，将质粒分为AB段和BA段，AB段扩增引物为F1和R2，BA段扩增引物为F2和R1，使用所述扩增引物分别对AB段和BA段进行扩增；所述PCR扩增引物核苷酸序列如下：

F1：AATGGT agc GGTACCATTAATAGCA SEQ ID NO.9；

R1：GTACC gct ACCATTCACGTCACCCAG SEQ ID NO.10；

F2：ATGTG agc AAA gat GGCAGCATTAATGCCGCCGAT SEQ ID NO.11；

R2：TGCC atc TTT gct CACATCGGCACGGGCTTTGGCA SEQ ID NO.12。

所述引物核苷酸序列中的小写字母为突变位点。

进一步优选的，所述制备方法中，PCR反应体系：

质粒DocA-pET28a载体模板1μL，正向突变引物F1/F2 2μL，反向突变引物R2/R1 2μL， 2×Max Buffer25μL，dNTP 4μL，DNA Polymerase 1μL，ddH₂O15μL。

进一步优选的，所述制备方法中，PCR反应条件：

95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃3min，18个循环；补充延伸72℃7min。

根据本发明优选的，PCR反应完成后，需要用Dnp I酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化，消化反应体系混匀后，将其于37℃条件下消化2h。

进一步优选的，所述消化体系：

PCR扩增产物40μL，Dnp I酶1μL。

进一步优选的，将消化产物进行DNA凝胶电泳检测，检测后分别将AB段与BA段利用胶回收试剂盒进行回收。

根据本发明优选的，将回收后的AB段与BA段利用Exnase II进行重组，反应产物为待转化载体，重组反应体系如下：

ddH₂O 10μL，5×CE II Buffer 4μL，AB段回收产物2μL，BA段回收产物2μL，ExnaseII 2μL。

进一步优选的，突变载体的转化，将上述待转化载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取单菌落，并进行测序验证，筛选阳性突变体，获得重组大肠杆菌36865-BL21。

进一步优选的，突变体的表达、纯化，将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50 μg·mL-1)的液体LB培养基中，37℃过夜培养，然后转接至液体LB培养基中37℃培养至OD600≈1时加入至终浓度为1μm·mL^-1的IPTG，于26℃、200rpm条件下诱导8h，收集诱导后的菌体，然后将菌体利用2ⅹPBS缓冲液重悬，利用超声波破碎，10000rpm离心10 min，离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化，并使用PBS-EP+缓冲液透析除盐，获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36865。

上述纤维小体对接蛋白组合突变体36865在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。

根据本发明优选的，所述对接蛋白组合突变体36865与黏连蛋白在低钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用。

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-3M；

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-4M；

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-6M。

根据本发明优选的，所述对接蛋白组合突变体36865与黏连蛋白在细胞内相互作用构建蛋白复合体中的应用。

本发明的有益技术效果

1、本发明涉及的纤维小体对接蛋白组合突变体36865降低纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求，实现在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10^-7M～2×10^-3M)下对纤维小体黏连蛋白的有效结合，并且实现了钙离子浓度在10^-7M～10^-6M条件下能够与纤维小体黏连蛋白有效组装。

2、本发明涉及的纤维小体对接蛋白突变体实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装。

3、本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中质粒分为AB段和BA段的示意图；

图2为实施例4对应的纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在细胞内相互作用分析柱状图；

图3为实施例5对应的纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析折线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但保护范围不限于此。

材料来源

载体DocA-pET28a和CohA-pET28a提取或保存自大肠杆菌DH5α中，由齐鲁工业大学山东省微生物工程重点实验室提供，本领域技术人可以根据现有技术构建，也可由该重点实验室购买获得。

实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。

实施例1

突变引物设计及突变载体构建

以分别连接在pET28a(+)载体中的对接蛋白DocA(载体为DocA-pET28a，核苷酸序列如 SEQ ID NO.13所示)为模板，进行对接蛋白突变体的引物设计(见表一)。其中对接蛋白DocA 来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(GenBank:2CCL_B)，并按照大肠杆菌密码子偏好进行了核苷酸序列的优化，DocA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，DocA氨基酸序列如 SEQ ID NO.4所示。

表一双位点突变引物表

注：小写字母为突变位点。

以待突变位点A和待突变位点B为界，将质粒分为AB段和BA段见图1。

使用Phanta酶对AB段和BA段分别进行扩增。

AB段扩增引物为F1和R2，BA段扩增引物为F2和R1，扩增后先对模板质粒进行Dpn I消化，消化后对AB段和BA段分别进行回收。PCR流程、Dpn I消化流程和胶回收流程具体如下：

(1)PCR反应——准确按表二中各组分的加入量分别添加质粒DocA-pET28a、所设计的突变引物及PCR所需的酶与buffer，进行实验组(即双位点突变组)PCR反应液的配置，并按照表三PCR反应程序进行PCR反应。

表二双位点突变的PCR反应体系

表三PCR反应条件

(2)扩增产物的消化——PCR反应完成后，为防止模板质粒DocA-pET28a在转化后形成假阳性转化子的干扰，在重组环化实验前对被大肠杆菌DH5α甲基化的质粒模板DocA-pET28a进行消化，，消化用酶为Dpn I酶，消化反应体系如表四，体系配置好充分混匀后，将其于37℃条件下消化2h。

表四消化体系

(3)AB段与BA段的胶回收——消化产物进行DNA凝胶电泳检测，检测后分别将 AB段与BA段利用胶回收试剂盒进行回收。

(4)将回收后的AB段与BA段利用Exnase II进行重组反应，于冰浴中按表五中各组分的加入比例，在无菌的200μL离心管中进行各组分的添加，添加完成后用移液枪轻轻吹打混匀，为避免试管壁上残留组分造成的重组效率低下，使用小离心机短暂离心，离心后置于37℃金属水浴中准确反应30min，反应完成后立即放入冰盒内，冰水浴5min。反应产物直接转化至感受态BL21(DE3)中或-20℃冰箱中冷藏。

表五重组反应体系

突变载体转化宿主菌——从-80℃冰箱中取出合适数量的DH5α感受态细胞，迅速置于冰上解冻，解冻后，按照DH5α感受态转化说明书进行操作，注意在加入重组产物时应挑选感受态细胞刚刚解冻的时刻，除热激外其余均在冰上进行，由于感受态细胞容易失活，因而实验动作应当轻柔，冰浴后于超净工作台中加入400μL液体LB培养基(1％蛋白胨、1％酵母浸粉、0.5％NaCl，余量水)，在37℃摇床中复苏1h左右，复苏结束后4000rpm离心5分钟，去除400μL上清后，将剩余的200μL直接涂布至含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的固体培养基上(1％蛋白胨、1％酵母浸粉、0.5％NaCl、2％琼脂，余量水)，过夜培养后挑取单菌落培养并进行送测序公司测序验证DocA中氨基酸序列D₆VNGDGTINSTD₁₇突变为 D₆VNGSGTINSTD₁₇；D₄₀VDKNGSINAAD₅₁突变为D₄₀VSKDGSINAAD₅₁；筛选出阳性克隆，获得重组大肠杆菌36865-BL21。

实施例2

突变蛋白的诱导表达和纯化

将验证正确的菌株接种至含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的50mL液体LB培养基中37℃过夜培养，后按体积百分数为2％量转接至新的50mL液体LB培养基37℃培养，培养至OD₆₀₀≈1 时加入至终浓度为1μm·mL^-1的IPTG，放入26℃、200rpm摇床中诱导8h，收集获得诱导后的菌体。将诱导后的菌体用10mL 2ⅹPBS缓冲液重悬，利用超声破碎仪进行破碎，10000 rpm离心10min，离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化，并使用PBS-EP+缓冲液(购自GE公司)透析除盐。获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36865。

实施例3

纤维小体黏连蛋白表达载体构建及诱导表达

以连接有纤维小体黏连蛋白CohA的pET28a(+)载体，按照实施例1中的方式进行CohA-pET28a载体的转化，同理制备DocA-pET28a载体的转化，获得重组大肠杆菌DocA-BL21和CohA-BL21，按照实施例2中的方式进行基因的诱导表达和纯化。获得纯化的纤维小体黏连蛋白CohA，纤维小体对接蛋白DocA。其中纤维小体黏连蛋白CohA来源于热纤梭菌(Clostridium thermocellum)scaf基因(GenBank:MH049738.1)中，CohA核苷酸序列如SEQID NO.5所示，CohA氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例4

纤维小体对接蛋白与黏连蛋白在细胞内相互作用分析

利用双分子荧光互补(BIFC)对胞内纤维小体对接蛋白与黏连蛋白相互作用进行表征。 BIFC使用的是荧光蛋白eYFP，eYFP核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，eYFP氨基酸序列如 SEQ ID NO.8所示。以大肠杆菌双表达质粒pETDuet-1为载体，将荧光蛋白eYFP从155位氨基酸拆分成两段多肽，即eYN(1-155)和eYC(156-238)。

将这两个荧光互补片段通过柔性连接肽SGGGSGGGSGGS分别与对接蛋白与黏连蛋白连接，按照一定次序与蛋白相融合，作为两个独立的编码蛋白同时在pETDuet-1上表达。构建获得pETDuet-1-eYN(1-155)-CohA-DocA-eYC(156-238)质粒，按实施例1所述的转化方法进行转化。对接蛋白与黏连蛋白相互作用会使与之融合的eYN(1-155)和eYC(156-238)片段空间距离上接近，彼此靠近会重新将两个不发荧光的片段结合在一起，重新形成荧光蛋白eYFP，此时，该蛋白在488nm光源下被激发，所述融合序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

同理构建对接蛋白组合突变体36865和黏连蛋白CohA对对应的重组质粒；按照实施例1 中的方式进行pETDuet-1载体的转化。

最终获得共表达重组BL21::pETDuet-1-eYN(1-155)-CohA-DocA-eYC(156-238)和BL21:: pETDuet-1-eYN(1-155)-CohA-36865-eYC(156-238)，空白对照为大肠杆菌BL21，按照实施例 2中的方式进行基因的诱导表达。利用酶标仪进行荧光蛋白定量分析Abs值(即荧光强度值)，结果如图2所示。

由图2显示可知，融合有BIFC蛋白的DocA与对照菌的荧光激发值接近，表明未突变的 DocA与CohA在细胞内低钙离子环境中均无法发挥有效的相互作用。而融合有BIFC蛋白的对接蛋白组合突变体36865的荧光激发值则明显高于DocA与对照菌，这表明通过对纤维小体对接蛋白中具有钙离子结合功能的序列进行突变，降低了纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求，促进对接蛋白在细胞内低钙离子浓度下(钙离子浓度≤10^-6M)与黏连蛋白进行组装，为纤维小体在胞内组装奠定基础。

实施例5

纤维小体对接蛋白与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

使用生物大分子相互作用仪对不同钙离子浓度纤维小体对接蛋白突变体与黏连蛋白间的结合能力进行分析，选取适宜的CM5芯片作为锚定芯片，根据上述公式计算蛋白CohA大致所需浓度，再将不同pH乙酸-乙酸钠缓冲液根据大致蛋白浓度分别做梯度稀释，作为待锚定蛋白，根据锚定情况确定最优锚定浓度和pH，后根据《Biacore小分子应用操作手册》中的进行黏连蛋白CohA锚定。将锚定好的芯片装入分子互作仪内，缓冲液为1×PBS-HP+溶液 (购自GE公司)，将对接蛋白及突变体稀释至与蛋白CohA锚定浓度几乎一致，并结合不同浓度的CaCl₂，置于4℃静止30min后上机测定，根据AbsResp值(即结合相互作用强度值)判断结合情况，结果如图3(表六)所示。该结果表明，相对于未突变对接蛋白DocA，对接蛋白组合突变体36865在钙离子浓度＞10^-4M时与黏连蛋白CohA的结合能力明显增强，结果同时发现，对接蛋白组合突变体36865在钙离子浓度≤10^-4M时与黏连蛋白CohA依然具有较强的结合能力，这表明对接蛋白组合突变体36865能够在宽范围钙离子环境(钙离子浓度 10^-7M～2×10^-3)中发挥作用。此外，虽然未突变对接蛋白DocA在钙离子浓度≤10^-6M与黏连蛋白CohA有一定的结合信号，AbsResP值为200左右，但结合实施例4结果表明此时的结合无法持续稳定存在，是一种无效结合，而突变蛋白与黏连蛋白AbsResP值超过400时则表明两种蛋白可以稳定的结合在一起。研究发现对接蛋白组合突变体36865在钙离子浓度超过10^-3M时活性有了一定的降低，这表明钙离子浓度过高时可能会改变突变位点区域结构，影响突变蛋白对接能力的发挥。

表六突变体与黏连蛋白在不同钙离子浓度下结合能力分析

本发明涉及的纤维小体对接蛋白组合突变体36865降低纤维小体关键元件对接蛋白对于钙离子的需求，实现在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10^-7M～2×10^-3M)下对纤维小体黏连蛋白的有效结合，并且实现了钙离子浓度在10^-7M～10^-6M条件下能够与纤维小体黏连蛋白有效组装；实现了在细胞内与纤维小体黏连蛋白的有效组装；本发明为细胞内多酶复合体的组装提供了新的方法和途径，具有广泛的应用前景。

现有技术中的纤维小体对接蛋白含有钙离子结合位点，其活性结构的形成需要钙离子的支持，与钙离子发生相互作用，需要高钙离子浓度，进而使得纤维小体对接蛋白形成特定构象，并与纤维小体黏连蛋白发生相互作用，进而完成整个纤维小体的组装。本发明通过多位点定点突变获得的对接蛋白组合突变体36865，在低钙离子浓度条件下，也可以形成特定构象，并与纤维小体黏连蛋白发生相互作用，完成整个纤维小体的组装；并且在可以在细胞内实现相互作用组装；是本领域技术人员预料不到的。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865及应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtgctgc tgggtgacgt gaatggtagc ggtaccatta atagcaccga tctgaccatg 60

ctgaaacgtt ctgttctgcg tgccattacc ctgaccgatg atgccaaagc ccgtgccgat 120

gtgagcaaag atggcagcat taatgccgcc gatgttctgc tgctgtctcg ctatctgctg 180

cgtgttattg ataaaggagg aggcggctcg ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg 240

catcatcatc atcatcatta a 261

<210> 2

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Val Leu Leu Gly Asp Val Asn Gly Ser Gly Thr Ile Asn Ser Thr

1 5 10 15

Asp Leu Thr Met Leu Lys Arg Ser Val Leu Arg Ala Ile Thr Leu Thr

20 25 30

Asp Asp Ala Lys Ala Arg Ala Asp Val Ser Lys Asp Gly Ser Ile Asn

35 40 45

Ala Ala Asp Val Leu Leu Leu Ser Arg Tyr Leu Leu Arg Val Ile Asp

50 55 60

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

His His His His His His

85

<210> 3

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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ctgaaacgtt ctgttctgcg tgccattacc ctgaccgatg atgccaaagc ccgtgccgat 120

gtggataaaa atggcagcat taatgccgcc gatgttctgc tgctgtctcg ctatctgctg 180

cgtgttattg ataaaggagg aggcggctcg ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg 240

catcatcatc atcatcatta a 261

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<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

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Met Val Leu Leu Gly Asp Val Asn Gly Asp Gly Thr Ile Asn Ser Thr

1 5 10 15

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Asp Asp Ala Lys Ala Arg Ala Asp Val Asp Lys Asn Gly Ser Ile Asn

35 40 45

Ala Ala Asp Val Leu Leu Leu Ser Arg Tyr Leu Leu Arg Val Ile Asp

50 55 60

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

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gacccgaatc cgaccaagag cttcgatacc gccatttacc cggaccgcaa aatcattgtg 240

ttcctgttcg cagaggatag cggtaccggt gcctatgcca tcaccaaaga tggcgtgttc 300

gcaaagattc gcgcaaccgt gaaaagtagc gcaccgggct acattacctt tgacgaggtg 360

ggtggctttg ccgataacga tctggtggaa cagaaggtga gcttcattga cggtggcgtt 420

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<213> 人工序列

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1 5 10 15

Gly Thr Thr Val Glu Ile Pro Val Tyr Phe Arg Gly Val Pro Ser Lys

20 25 30

Gly Ile Ala Asn Cys Asp Phe Val Phe Arg Tyr Asp Pro Asn Val Leu

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Glu Ile Ile Gly Ile Asp Pro Gly Asp Ile Ile Val Asp Pro Asn Pro

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65 70 75 80

Phe Leu Phe Ala Glu Asp Ser Gly Thr Gly Ala Tyr Ala Ile Thr Lys

85 90 95

Asp Gly Val Phe Ala Lys Ile Arg Ala Thr Val Lys Ser Ser Ala Pro

100 105 110

Gly Tyr Ile Thr Phe Asp Glu Val Gly Gly Phe Ala Asp Asn Asp Leu

115 120 125

Val Glu Gln Lys Val Ser Phe Ile Asp Gly Gly Val Asn Val Gly Asn

130 135 140

Ala Thr Pro Thr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

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165 170

<210> 7

<211> 717

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aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

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cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagctacc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 717

<210> 8

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

50 55 60

Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Leu

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aatggtagcg gtaccattaa tagca 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtaccgctac cattcacgtc acccag 26

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgtgagcaa agatggcagc attaatgccg ccgat 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgccatcttt gctcacatcg gcacgggctt tggca 35

<210> 13

<211> 5528

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggtgctgc tgggtgacgt gaatggtgac 5100

ggtaccatta atagcaccga tctgaccatg ctgaaacgtt ctgttctgcg tgccattacc 5160

ctgaccgatg atgccaaagc ccgtgccgat gtggataaaa atggcagcat taatgccgcc 5220

gatgttctgc tgctgtctcg ctatctgctg cgtgttattg ataaaggagg aggcggctcg 5280

ggaggaggcg gctcgggagg aggcggctcg catcatcatc atcatcatta agaattcgag 5340

ctccgtcgac aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc 5400

tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc 5460

ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat 5520

atccggat 5528

Claims (10)

1.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白DocA，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种适用于低钙离子浓度的纤维小体对接蛋白组合突变体36865，其特征在于，一种纤维小体对接蛋白DocA，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，进行定点突变，获得适用于低钙离子浓度的对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1-2任一项所述突变体36865的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

以上述对接蛋白中的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，进行定点突变，获得对接蛋白组合突变体36865，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示为基础，设计定点突变引物，以携带纤维小体对接蛋白基因的pET28a(+)载体为模板，进行PCR，构建重组突变质粒，并将突变质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵，发酵结束后收集菌体，对菌体进行破碎，纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

4.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，由对接蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，突变为对接蛋白组合突变体36865，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

5.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，发酵结束后离心收集菌体，对菌体进行超声破碎，经亲和色谱纯化获得纤维小体对接蛋白突变体。

6.如权利要求3所述突变体36865的制备方法，其特征在于，对接蛋白组合突变体36865的PCR扩增，将质粒分为AB段和BA段，AB段扩增引物为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12，BA段扩增引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，使用所述扩增引物分别对AB段和BA段进行扩增。

7.如权利要求6所述突变体36865的制备方法，其特征在于，PCR反应体系：

质粒DocA-pET28a载体模板1μL，正向突变引物F1/F2 2μL，反向突变引物R2/R1 2μL，2×Max Buffer25μL，dNTP 4μL，DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 15μL；

优选的，所述制备方法中，PCR反应条件：

95℃预变性3min；95℃15sec，60℃15sec，72℃3min，18个循环；补充延伸72℃7min；

优选的，PCR反应完成后，需要用Dnp I酶对PCR扩增产物中的原有模板进行消化，消化反应体系混匀后，将其于37℃条件下消化2h；

优选的，所述消化体系：

PCR扩增产物40μL，Dnp I酶1μL；

优选的，将消化产物进行DNA凝胶电泳检测，检测后分别将AB段与BA段利用胶回收试剂盒进行回收

优选的，将回收后的AB段与BA段利用Exnase II进行重组，反应产物为待转化载体，重组反应体系如下：

ddH₂O 10μL，5×CE II Buffer 4μL，AB段回收产物2μL，BA段回收产物2μL，Exnase II 2μL；

优选的，突变载体的转化，将上述待转化载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，将转化子涂布于含有卡那霉素(50μg·mL^-1)的LB固体培养基上，37℃过夜培养后，挑取单菌落，并进行测序验证，筛选阳性突变体，获得重组大肠杆菌36865-BL21；

优选的，突变体的表达、纯化，将上述验证正确的菌种接种于含有卡那霉素(50μg·mL-1)的液体LB培养基中，37℃过夜培养，然后转接至液体LB培养基中37℃培养至OD600≈1时加入至终浓度为1μm·mL-1的IPTG，于26℃、200rpm条件下诱导8h，收集诱导后的菌体，然后将菌体利用2ⅹPBS缓冲液重悬，利用超声波破碎，10000rpm离心10min，离心后上清中的蛋白使用镍离子亲和柱纯化，并使用PBS-EP+缓冲液透析除盐，获得纯化的纤维小体对接蛋白组合突变体36865。

8.权利要求1-2任一项所述突变体36865在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述对接蛋白组合突变体36865与黏连蛋白在低钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用；

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-3M；

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-4M；

进一步优选的，所述低钙离子浓度为10^-7M-10^-6M。

10.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述对接蛋白组合突变体36865与黏连蛋白在细胞内相互作用构建蛋白复合体中的应用。

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