CN108424871B - 一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：1).构建质粒pMHS‑NrtRms；2).构建质粒pHAGE‑NrtRms；3).制备重组TM4噬菌体；4).构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100。本发明的有益效果是：通过构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌，使该菌株能够直接制备烟酸而不依赖于添加3‑氰基吡啶和酶催化，不仅避免了现有烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。

Description

一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域。
背景技术
烟酸即3-吡啶甲酸，也称作为维生素B3，一种水溶性维生素，属于维生素B族，人体必需的13种维生素之一。烟酸是机体组织中重要的递氢体和抗糙皮病的因子，有维持皮肤和神经健康，促进消化的作用。若其缺乏时，可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状。与烟酰胺统称维生素PP，用于抗糙皮病，亦可用作血扩张药。作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。现烟酸也用于粮食制品，肉品添加剂和饲料添加剂以预防糙皮病。特别是饲料中添加烟酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率，可大量节省饲料，降低饲养成本。美国曾喂养添加烟酸饲料的奶牛与对照组相比，产奶量可提高15％-20％。另外烟酸还可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料工业、感光材料工业、染发助剂、洗涤剂等方面也有一定的应用。
烟酸的生产目前工业上应用的主要为化学法，合成方法主要有液相法(高锰酸钾氧化法和硝酸氧化法)和气相法(臭氧氧化法、氨氧化法和空气氧化法)，所用原料主要为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。目前最常用的方法是以3-甲基吡啶为原料空气氧化法合成烟酸。将3-甲基吡啶、空气和氨气按比例通入流化床反应器中，在290～360℃、V2O5催化下反应生成烟腈；再于氢氧化钠水溶液中、160℃下高压水解生成烟酸钠，最后用盐酸酸化得烟酸。在这个合成过程中需要经过烟腈这一部中间产物，烟腈水解为烟酸需要高温高压、强酸强碱，对设备具有一定的要求而且也会腐蚀设备，且对环境也不友好。中国专利CN 114288A报道了用3-甲基吡啶一步催化生成烟酸，其过程为将3-甲基吡啶与硫酸反应生成甲基吡啶硫酸盐，然后在氧化剂硝酸的作用下氧化生成烟酸硫酸盐，烟酸硫酸盐加入碱溶液中和制得烟酸，原料收率为90％左右。此过程中需要硫酸、硝酸、碱溶液等强酸强碱物质，污染严重。
在烟酸化学合成过程中，必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸、强碱或化学催化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，环境污染大。相对而言，生物法制备烟酸具有底物选择性高、催化效率高、反应条件温和、环境污染小等特点。此外，生物法制备易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。目前有报道用微生物枯草芽孢杆菌、玫瑰色红球菌、诺卡氏菌、茄病镰刀菌以及恶臭假单胞菌发酵来生物催化3-氰基吡啶制备烟酸。生物催化法制备烟酸主要是依赖于微生物发酵产腈水解酶通过此酶来催化3-氰基吡啶转化为烟酸。但无报道直接用微生物菌株来制备烟酸而不依赖于添加3-氰基吡啶和酶催化。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株新的菌株直接分泌烟酸到培养基中并从培养基中分离烟酸。
本发明所采取的技术方案是：
公开了一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌。
同时还公开了该分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：
1).构建质粒pMHS-NrtRms：
1-1).以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板、SEQ ID№1～4所示的引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID№5和6所示的DNA片段，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；
1-2).将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；
1-3).将步骤1-1)与1-2)所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtRms；
2).构建质粒pHAGE-NrtRms：
2-1).分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtRms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化大肠杆菌HB101感受态细胞，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtRms；
3).制备重组TM4噬菌体：
3-1).扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10％无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10％的甘油重悬菌体，-80℃冻存备用；
3-2).将质粒pHAGE-NrtRms转入耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30℃培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；
4).构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100：
4-1)7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc2155至对数生长期，离心收集菌体，用MPbuffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc2155与滴度为1010PFU的重组TM4噬菌体1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc2100。
其中，步骤1-2)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃过夜培养。步骤1-3)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。抽提获得的质粒经核酸凝胶电泳检测验证含有如SEQ ID№5和6所示的DNA片段。
步骤2-1)中质粒pHAGE以含有氨苄抗性的LB培养基扩大培养，质粒pMHS-NrtRms以含有潮霉素B抗性的LB培养基扩大培养。连接产物转化后的大肠杆菌HB101感受态菌株经过扩大培养后再进行质粒抽提，所述扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。
步骤3-1)中的扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155是将耻垢分枝杆菌mc2155接种于7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期，OD600为0.5～1.0；培养物以1:100的比例接种于新鲜的7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6。步骤3-2)中电击转化参数为电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。
步骤3)中收集菌体的离心条件为4℃，5000rpm离心10min；步骤4)中收集菌体的离心条件为6000rpm离心10min。
步骤4-1)后还包括步骤：
4-2)挑取平板上长出来的单克隆子，接种到含有150μg/mL潮霉素B的7H9液体培养基中培养2-3天至对数生长期，离心收集菌体并提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用如SEQ ID№7和8所示的引物对进行PCR扩增，同时以野生型耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为对照，验证nrtRms基因缺失。
本发明的有益效果是：通过构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌，使该菌株能够直接制备烟酸而不依赖于添加3-氰基吡啶和酶催化，不仅避免了现有烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。
附图说明
图1是实施例1的步骤1-1)的电泳图；图中泳道M：DNA marker；泳道1：如SEQ ID№6所示的DNA片段；泳道2：如SEQ ID№5所示的DNA片段；
图2是实施例1的步骤1-2)的电泳图；图中泳道M：DNA marker；泳道1：箭头所指的是pMHS质粒酶切后1600bp和3600bp的DNA片段；
图3是实施例4的步骤4-2)的电泳图；图中泳道M：DNA marker；泳道1：耻垢分枝杆菌mc2155对照；泳道2：耻垢分枝杆菌mc2100；箭头所示为目的扩增DNA片段条带；
图4是耻垢分枝杆菌mc2100分泌烟酸的HPLC结果图；A为对照菌株耻垢分枝杆菌mc2155培养液滤液检测结果；B为耻垢分枝杆菌mc2100培养液滤液检测结果；C为烟酸标准品检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：构建质粒pMHS-NrtRms
1)以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板、SEQ ID№1～4所示的引物对进行PCR扩增。如图1所示，PCR产物核酸凝胶电泳分离目的DNA片段，使用Omega公司胶回试剂盒回收如SEQ ID№5和6所示的目的DNA片段。回收后的DNA均使用Van91I限制性内切酶酶切并通过Omega公司Cycle-pure回收试剂盒回收酶切后的DNA备用；
2)含pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株接种LB液体培养基(添加150μg/mL潮霉素B)37℃过夜培养，然后收集菌体使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的pMHS质粒经Van91I限制性内切酶酶切后进行核酸凝胶电泳并使用Omega公司胶回收试剂盒回收1600bp和3600bp左右的两条DNA片段(如图2中箭头所示)；
3)步骤1)和2)分别获得的四条DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布LB固体平板(含150μg/mL潮霉素B)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜后挑取平板上长出的单克隆菌落接种LB液体培养基(含150μg/mL潮霉素B)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，然后使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的质粒使Van91I限制性内切酶酶切后经核酸凝胶电泳检测验证如SEQ ID№5和6所示的目的DNA片段连接到pMHS载体上获得阳性质粒pMHS-NrtRms。
同时验证正确的质粒pMHS-NrtRms经擎科公司测序验证序列无突变。
实施例2：构建质粒pHAGE-NrtRms
1)LB分别培养含pHAGE(氨苄抗性)和pMHS-NrtRms(潮霉素B抗性)质粒的大肠杆菌DH5α菌株并使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，获得的两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜。连接产物使用包装试剂盒(EPICENTREBiotechnologies:MaxPlax Lambda Packaging Extracts)包装并转化大肠杆菌HB101感受态细胞，然后涂布在LB固体平板上(含有150μg/mL潮霉素B)，平板放置37℃恒温培养箱培养过夜后挑取平板上长出来的单克隆子，接种LB液体培养基(含150μg/mL潮霉素B)37℃摇床200rpm震荡过夜培养，使用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒并使用PacI限制性内切酶酶切验证，阳性质粒pHAGE-NrtRms保存于-20℃冰箱。
实施例3：制备重组TM4噬菌体
1)制备耻垢分枝杆菌mc2155感受态细胞：耻垢分枝杆菌mc2155接种于5ml 7H9液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至对数生长期(OD0.5-1.0)；培养物以1:100的比例接种于新鲜的100mL 7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6左右，于4℃，5000rpm离心10min收集菌体，将菌体用预冷的10％无菌甘油至少洗涤两次，最后加入10mL(适量)预冷的10％的甘油，重悬菌体后，分装置-80℃冻存备用；
2)将构建正确的阳性质粒pHAGE-NrtRms DNA加入200μL的耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后转入2mm BTX电转杯中，擦净电转杯外壁上的水，然后使用BTX ECM630电转化仪电击，电击参数是：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。电击完后，立即加入1mL 7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有4mLtop agar(Top Agar 100mL：Middlebrook 7H9 broth 0.47g，Agar 0.75g)的5mL EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上。平板置30℃培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体。
实施例4：构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100
1)7H9液体培养基培养10-100mL的耻垢分枝杆菌mc2155至对数生长期(OD 0.5-1.0)，6000rpm，10min离心收集菌体，然后用MP buffer洗涤2次离心获得的菌体，最后用MPbuffer重悬菌体至109CFU/mL(Colony Forming Units，CFU)。将1mL MP buffer重悬的耻垢分枝杆菌mc2155与1mL滴度为1010PFU(multiplicity of infection)的重组TM4噬菌体混合后置于37℃培养箱孵育24h，然后6000rpm，10min离心收集菌体弃上清后用10mL 7H9液体培养基重悬，置于37℃培养箱孵育过夜，然后6000rpm，10min离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板(含有150μg/mL潮霉素B)后置37℃培养箱培养3-5天；
2)挑取平板上长出来的单克隆子，接种到5mL 7H9液体培养基(含有150μg/mL潮霉素B)中培养2-3天至对数生长期，离心收集菌体并使用微生物基因组提取试剂盒(Omega)提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，SEQ ID№7和8所示的引物对进行PCR扩增，同时以野生型耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为对照，PCR验证nrtRms基因缺失，如图3所示。将验证正确的nrtRms基因缺失菌株命名为耻垢分枝杆菌mc2100。
实施例5：检测耻垢分枝杆菌mc2100分泌烟酸
1)nrtR基因敲除成功后的耻垢分枝杆菌mc2100接种7H9液体培养基，37℃培养至对数生长期，使用Millipore 0.22μm无菌滤器过滤培养液并收集过滤的滤液，然后使用Millipore 3kDa超滤浓缩管去除滤液中的蛋白质等大分子并收集过滤后滤液。获取的滤液使用高效液相色谱仪(HPLC)分离并分析烟酸。
HPLC具体的条件：
设备型号：Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000ultrahigh-performanceliquid chromatography；
色谱柱：Thermo Fisher，Hypersil Gold aQ，150×4.6mm，3μm，柱温：30℃；
流动相：A液(水相)：去离子水(含0.1％甲酸)；
B液(有机相)：甲醇；
梯度洗脱：0min时，95％A液+5％B液；
30min时，5％A液+95％B液；
流速：0.3mL/min；
进样量：10μL；
波长：284nm。
HPLC结果如图4所示，显示耻垢分枝杆菌mc2100培养液中含有烟酸。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法
<130> 2018
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gtgctgcggc tggcgcgcaa ggacatggac gacctggtcg acctgccgct cgaacagatc 1020
ctcgacagcc ccgaggtcac cgaggtcttc gacgacatca aactcggtgt ggcgacaccg 1080
aatccacccg tgctgctga 1099
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gacgaggcac cgcagcaa 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgaggagac cgagatcagc 20

Claims (10)

1.一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：
1).构建质粒pMHS-NrtRms：
1-1).以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板、SEQ ID No.1～4所示的引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID No.5和6所示的DNA片段，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；
1-2).将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；
1-3).将步骤1-1)与1-2)所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtRms；
2).构建质粒pHAGE-NrtRms：
2-1).分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtRms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化大肠杆菌HB101感受态细胞，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtRms；
3).制备重组TM4噬菌体：
3-1).扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10％无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10％的甘油重悬菌体，-80℃冻存备用；
3-2).将质粒pHAGE-NrtRms转入耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30℃培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；
4).构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100：
4-1)7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc2155至对数生长期，离心收集菌体，用MPbuffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc2155与滴度为1010PFU的重组TM4噬菌体1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc2100。
2.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤3)中收集菌体的离心条件为4℃，5000rpm离心10min；步骤4)中收集菌体的离心条件为6000rpm离心10min。
3.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤1-2)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃过夜培养。
4.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤1-3)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。
5.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤2-1)中质粒pHAGE以含有氨苄抗性的LB培养基扩大培养，质粒pMHS-NrtRms以含有潮霉素B抗性的LB培养基扩大培养。
6.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤2-1)中连接产物转化后的大肠杆菌HB101感受态菌株经过扩大培养后再进行质粒抽提，所述扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。
7.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤3-1)中的扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155是将耻垢分枝杆菌mc2155接种于7H9液体培养基中，37℃ 200rpm振荡培养至对数生长期，OD600为0.5～1.0；培养物以1:100的比例接种于新鲜的7H9液体培养基中，37℃过夜培养至OD600到0.6。
8.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤3-2)中电击转化参数为电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。
9.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤4-1)后还包括步骤：
4-2)挑取平板上长出来的单克隆子，接种到含有150μg/mL潮霉素B的7H9液体培养基中培养2-3天至对数生长期，离心收集菌体并提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，使用如SEQ ID No.7和8所示的引物对进行PCR扩增，同时以野生型耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为对照，验证nrtRms基因缺失。
10.一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌，其特征在于由权利要求1～9任一项所述的构建方法制得。
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