CN103773783A - 利用重组表达核糖磷酸转移酶生产5’-肌苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突变的核糖磷酸转移酶及其编码基因，以及利用该基因生产5’-肌苷酸的方法。该突变核糖磷酸转移酶及其编码基因的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.5和6所示。经过验证，证明突变后的序列不仅能够正常表达核糖磷酸转移酶，且突变后肌苷-5’肌苷酸的摩尔转化率比原始的核糖磷酸转移酶提高了5倍。

Description

利用重组表达核糖磷酸转移酶生产5’-肌苷酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种表达核糖磷酸转移酶的基因工程菌的制备方法，且能够利用该基因工程菌进行5’-肌苷酸的生产。

背景技术

肌苷酸，英文简称IMP，又名次黄嘌呤核苷酸或次黄核苷酸，是转变为其他嘌呤核苷酸的底物，也是一种重要的风味物质。肌苷酸主要由肌肉中的ATP降解而产生。肌苷酸型鲜味剂属于芳香杂环化合物，5’-肌苷酸是重要的呈味核苷酸之一，广泛应用于食品、医药、农业以及国防等行业，增加鲜味的能力比谷氨酸钠（MSG）强几十倍。目前国际上把肌苷酸含量作为衡量肉质鲜味的一项重要指标。

现有技术中，5’-肌苷酸的生产方法包括化学合成法，微生物发酵法、酶解法和酶催化法。化学法有着各种局限，所涉及的试剂昂贵，且具有一定的毒性，生产成本偏高。微生物直接发酵法生产5’-肌苷酸，主要是利用微生物菌株的生物合成途径来生产5’-肌苷酸，一般利用产氨短杆菌或谷氨酸产生菌进行诱变。酶解法是历史最长，技术最成熟的生产方法，但此法由于反应器的膜易堵塞而且膜反应器维护费用高，不适用于大规模工业生产。酶催化法具有反应条件温和，容易控制，不需要保护基团，步骤简单，反应专一性强，副反应少，后处理容易等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供生产5’-肌苷酸的方法。

在本发明的第一方面，提供一种重组表达核糖磷酸转移酶的方法，所述方法包括：

（1）提供两个重组表达载体，其分别包含一表达盒，所述表达盒包含：6×His序列，野生型核糖磷酸转移酶优化DNA序列；突变型核糖磷酸转移酶DNA序列

（2）将（1）的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；

（3）培养（2）的重组大肠杆菌细胞，从而表达核糖磷酸转移酶；

（4）利用IPTG过夜低温诱导，使得重组大肠杆菌细胞能够大量表达核糖磷酸转移酶。

在另一优选例中，所述的核糖磷酸转移酶DNA序列如SEQ ID NO.5所示。

在另一优选例中，所述的表达盒还包括：启动子和终止子。本发明中的启动子和终止子均为载体自带的。

在另一优选例中，步骤（3）中，表达条件为：37℃，200rpm培养；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到28℃，诱导培养12±2h，离心收集菌体。

在另一优选例中，步骤（4）中，利用NaAC缓冲液洗涤重悬菌体细胞。其方法为：4℃离心收集所有培养的菌体（7000rpm，离心5～10min）；倒掉上清液，加入3mL预冷的NaAC缓冲液，缓慢吹吸，重悬菌体，离心（7000rpm，5～10min），重复洗涤2次；加入预冷的NaAC缓冲液，每0.1g湿菌体加入1mL缓冲液。重悬菌体细胞即制得的粗酶。

其中，所述的NaAC缓冲液包括：100mM NaAC,较佳的pH4.2。

在本发明的另一方面，提供一种应用权利要求1重组表达核糖磷酸转移酶进行整细胞催化生产5’-肌苷酸的方法，所述方法包括，1、以肌苷和十水合焦磷酸钠为底物，利用权利要求1重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞为催化剂进行反应，反应初期调节pH4.5±0.5,反应总时间6±1h；2、以肌苷发酵液为底物，利用权利要求1重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞为催化剂进行反映。

在一个优选例中，底物肌苷含量为10mg/mL，十水合焦磷酸钠含量为10mg/mL，重悬细胞的加入量为140mL/L,反应温度25℃-40℃。

在另一优选例中，底物肌苷含量为100mM(26.8mg/mL)，十水合焦磷酸钠含量为100mM(44.6mg/mL)，重悬细胞的加入量为140mL/L,反应温度为25℃-40℃。

在另一优选例中，以肌苷及十水合焦磷酸钠为底物的反应体系的pH为2.2-9.0。

在另一优选例中,以肌苷发酵液为底物的催化反应体系中，pH是否调节至4.5及发酵液处理方式包括：无特殊处理、离心取上清、煮沸。

在另一优选例中，反应体系中还包括：

镁离子，浓度为20-250mM；

在另一优选例中，在最适宜条件下对phoC和AP/PTase的催化能力进行对比试验。

本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1，带有6×His的表达质粒pQE-3_图谱

具体实施方式

在生物技术领域中，尽管以大肠杆菌为宿主的相关克隆，表达技术已经非常成熟，但是异源蛋白的重组表达仍是一个重要的研究内容。为了提高重组蛋白的可溶性和表达量，需要大量时间和大量的实验室工作，经多次试验、再试验的努力才能达到最后的成功。

目前，工业化生产5’-肌苷酸的生产技术已经较成熟，但对于如何进一步提高5’-肌苷酸产量，仍有很大的发展空间。目前实际生产中，酶法催化肌苷生产5’-肌苷酸的转化率约为60%。

为了提高生产5’-肌苷酸的产量以及简化其生产过程，本发明人经过了广泛而深入的研究，试验了多种催化方法，对该酶的蛋白序列进行优化，最终发现了利用整细胞作为催化剂，过程便捷，可获得高效的核糖磷酸转移酶活性，获得较高的转化率。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽（本发明中为核糖磷酸转移酶）所需的所有必要原件的基因表达系统，通常包括了：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；这些元件是操作性相连的。

核苷酸序列优化

本发明人经过深入的研究，对原始野生型核糖磷酸转移酶序列（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）进行了优化，并在次优化后序列（核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示）的基础上，另外对4个核苷酸位点进行了突变。对突变后的片段进行反复验证，证明突变后的序列不仅能够正常表达核糖磷酸转移酶，且突变后转化率提高了5倍。

重组表达核糖磷酸转移酶的基因工程菌的制备方法

所述的重组表达核糖磷酸转移酶的基因工程均的制备方法如下：

（1）以NCBI公布的酸性磷酸酶核苷酸序列为原始序列，切除前21个蛋白涉及的核苷酸序列，得到新的序列并进行优化，在优化后的核苷酸序列基础上对其中的4个核苷酸位点进行突变；通过全基因合成的方式得到2个片段，分别为野生型优化序列phoC和突变型优化序列AP/PTase；

（2）把含有核糖磷酸转移酶的基因序列克隆到含有6×His标记的表达质粒中；

（3）把得到含有核糖磷酸转移酶的质粒转化到大肠杆菌中，即得到所述的表达核糖磷酸转移酶的基因工程大肠杆菌。

本发明的方法中，对于培养大肠杆菌的培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规使用的培养基。较佳地，表达条件为：37℃，200rpm；当OD₆₀₀达到0.6±0.1时加入IPTG诱导，并降温到28℃，诱导培养12±2h，离心收集菌体。

核糖磷酸转移酶的制备

本发明所述的催化剂为含有核糖磷酸转移酶的整细胞，即以整细胞作为粗酶进行催化反应。其方法是：4℃离心收集所有培养的菌体（7000rpm，离心5～10min）；倒掉上清液，加入3mL预冷的NaAC缓冲液，缓慢吹吸，重悬菌体，离心（7000rpm，5～10min），重复洗涤2次；加入预冷的NaAC缓冲液，每0.1g湿菌体加入1mL缓冲液。

其中，所述的NaAC缓冲液包括：100mM NaAC,较佳的pH4.2

生产5’-肌苷酸

本发明人利用重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞进行催化的反应底物的添加量为：肌苷100mM，十水合焦磷酸钠100mM。

本发明人利用重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞进行催化的反应底物为肌苷发酵液，全细胞在此发酵液环境下进行催化。

本发明人还对应用所述的重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞催化的反应条件进行了优化。所述方法包括：

以肌苷，十水合焦磷酸钠为底物的反应中，底物的浓度从50mM增加至100mM，反应的pH范围从2.2～9.0，反应总时间0～8h。

以肌苷发酵液为底物的反应体系中，是否调节pH至适宜的范围及对发酵进行如下处理：无特殊处理，离心取上清，煮沸，反应总时间0～7h。

反应控制中的pH调控是关键。核糖磷酸转移酶所催化的反应是一个可逆反应；突变后去磷酸化活性大大降低。在pH3.0-5.8，生成5’-肌苷酸的反应速度最快；所以反应pH应为酸性。想要反应速度最快，pH应设定在4.5，这也是5’-肌苷酸得率最高的pH。其次，反应的时间也是关键，反应时间不是越长越好。反应时间达到5h以后，随着反应时间的延长，5’-肌苷酸含量降低。所以最有反应的pH应控制在4.5，反应时长为3-5h。

加入的重悬细胞用量和反应的底物用量，反应时间和反应最终的5’-肌苷酸产率相关。较佳地，底物肌苷含量为50mM-100mM，十水合焦磷酸钠含量为50mM-100mM镁离子浓度为0.1mM-100mM，每升反应液中重悬细胞的加入量为100-200mL，反应pH控制在2.2-9.0，反应温度25℃-40℃,反应时间1-6h。

优选反应条件如下：底物肌苷含量100mM；十水合焦磷酸钠为100mM；镁离子浓度10mM；重悬细胞添加量为140mL/L；反应温度30℃；反应pH控制在4.5-5.0之间；最佳反应时间为4h。

在以肌苷发酵液为底物的催化反应中，发酵液的预处理方式及反应体系的pH对细胞的催化能力很重要。优选反应条件如下：发酵液预处理方式为煮沸，十水合焦磷酸钠调为100mM，调节反应体系的pH至4.5。

在phoC和AP/PTase的催化能力对比试验中，AP/PTase的催化能力远远强于phoC，以肌苷-5’肌苷酸的摩尔转化率为标准，AP/PTase的转化率为phoC的4-5倍，可达90%～98%。

采用本发明的构建的表达系统和方法，在简单合成培养基中可以实现高密度培养，操作简单。

质粒的构建

分别用BamHI和PstI对pUC57进行双酶切，酶切产物在1.0%琼脂糖电泳后纯化，用切胶回收试剂盒纯化。同时，对pQE30质粒进行双酶切，进行切胶回收。然后在含有Solution I的连接体系中16℃进行连接反应12h；连接后的反应产物转化宿主菌DH5ɑ感受态细胞，挑选阳性克隆菌，在LB培养基中37℃过夜培养后提取小量质粒进行测序验证，得到含有核糖磷酸转移酶phoC基因的质粒pQE-phoC-2和核糖磷酸转移酶AP/PTase基因的质粒pQE-AP-1。

构建大肠杆菌重组表达核糖磷酸转移酶基因工程菌

质粒pQE-phoC-2、pQE-AP-1转化宿主菌XL1-Blue感受态细胞，挑选阳性克隆，并保种。菌种命名为Blue-phoC、Blue-AP。

摇瓶表达SDS-PAGE分析

培养条件：挑取单克隆菌株接种到含氨苄青霉素（100微克/毫升）的30mLLB液体培养基，37℃,200rpm。当OD₆₀₀达到0.6时加入IPTG（终浓度0.1mM）诱导，并降温到28℃，诱导培养12h，离心收集菌体。

0.1g菌体用1mL的100mM NaAC pH4.5溶液悬浮。80μl的样品分别加入20μl 5×上样缓冲液，沸水浴5min。冷却离心后点样，电泳。分析电泳条带，以不含质粒的宿主菌及不加IPTG诱导的工程菌分别为对照，对蛋白的表达情况进行分析。

用核糖磷酸转移酶生产5’-肌苷酸

培养Blue-phoC、Blue-AP工程菌，用上述培养方法得到重悬菌体。

1、10mL溶液含有肌苷100mM，十水合焦磷酸钠100mM，镁离子10mM，重悬菌液2.5mL。反应温度30℃，转速150rpm，反应pH控制在4.5-5.0之间，反应时间为4h。

2、10mL煮沸的肌苷发酵液，十水合焦磷酸钠100mM，重悬菌液2.5mL。调节pH4.5。反应温度30℃，转速150rpm，反应时间3.5h。

反应结束后，HPLC检测，分别得5’-肌苷酸8.9g/L-9.5g/L、4.17g/L-4.22g/L，相对已消耗的肌苷的摩尔得率分别为89%-96%；98-99%。

Claims (8)

1.一种突变的核糖磷酸转移酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种突变的核糖磷酸转移酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种重组表达核糖磷酸转移酶的方法，所述方法包括：

（1）构建包含如SEQ ID NO.5所示核苷酸分子和6×His序列的重组表达载体；

（2）将（1）中的重组表达载体转化大肠杆菌，获得重组大肠杆菌细胞；

（3）培养（2）中的重组大肠杆菌细胞，从而表达核糖磷酸转移酶；

（4）利用IPTG过夜低温诱导，使得重组大肠杆菌细胞能够大量表达核糖磷酸转移酶。

4.一种生产5’-肌苷酸的方法，其特征在于，以肌苷和十水合焦磷酸钠为底物，利用权利要求2所述方法生产的重组表达核糖磷酸转移酶的整细胞为催化剂进行反应，反应初期调节pH4.5±0.5,反应总时间6±1h。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，底物肌苷含量为10mg/mL，十水合焦磷酸钠含量为10mg/mL，重悬细胞的加入量为140mL/L,反应温度25℃-40℃。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，底物肌苷含量为100mM，十水合焦磷酸钠含量为100mM，重悬细胞的加入量为140mL/L,反应温度为25℃-40℃。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应体系中还包括浓度为20-250mM镁离子。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，反应底物为肌苷发酵液，全细胞在此发酵液环境下进行催化。