CN113943746A - 一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种腈水合酶基因表达的基因工程菌，具体涉及一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用，重组表达载体含有一段腈水合酶基因，该腈水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示；基因工程菌为携带该重组表达载体的宿主微生物；培养方法为将宿主微生物在LB培养基中培养得到种子液，之后将种子液接种到发酵培养基中进行培养，得到基因工程菌。与现有技术相比，本发明的腈水合酶基因能够在工程菌中实现高效表达并且其酶活性极好，经测定比酶活可达50U/mg以上，在优选条件下可以达到100U/mg，因而催化合成烟酰胺效率高，转化率可达99％以上，生产效率达到720g/(L·h)。

Description

一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用

技术领域

本发明涉及一种腈水合酶基因表达的基因工程菌，具体涉及一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用。

背景技术

烟酰胺又称尼克酰胺，维生素B3，英文Nicotinamide，是烟酸的酰胺化合物，为白色的结晶性粉末，无臭或几乎无臭，味苦，略有引湿性。易溶于水、乙醇和甘油。临床上主要用于防治糙皮病、口炎、舌炎、病态窦房结综合征、房室传导阻滞等问题。工业上主要作为饲料的营养性添加剂，也用于食品、医药、染料的中间体，同时用作电镀液的添加剂和生化试剂。此外，烟酰胺在皮肤科相关产业也有较多应用，是近年来护肤和美白产品的热门成分。

工业上烟酰胺主要是以吡啶类化合物为原料生产的，世界上烟酰胺的生产主要集中在西欧和美国，日本也有少量生产。目前生产烟酰胺的工艺分为两大类，一种是化学合成法，另外一种是生物合成法。化学法生产工艺比较成熟，但该方法所用的原料和催化剂价格昂贵，消耗量大，加之其生产成本高，产品收率低，对环境的污染很大，因此需要寻找一种能够克服上述缺陷的方法进行烟酰胺的生产。生物合成法就是利用微生物发酵产酶，再用生物酶催化反应的方法。微生物法生产烟酰胺相较于化学法，反应条件温和，产物产率和纯度高，价格便宜，消耗量小，成本低，环境友好等。因此，越来越多的学者对微生物法进行了研究。

腈水合酶(Nitrile Hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)是一类将腈类物质转化为酰胺类物质的金属酶，可以转化烟腈生成烟酰胺。目前，腈水合酶在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经得到大规模应用，逐渐的，烟酰胺和5-氰基戊酰胺等其它酰胺类物质的生产也开始依赖于腈水合酶的催化。

中国专利CN111039861A公开了一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存。本专利的生产工艺较为简便，但是生产过程中所用到的马红球菌的发酵成本较高，不适合用于工业应用。

中国专利CN112195117A公开了一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用，所述的大肠杆菌M910001，保藏编号为CGMCC NO.20430，以大肠杆菌M910001作为宿主细胞接入编码腈水合酶的质粒后进行生物催化生产烟酰胺；优选的，是以大肠杆菌M910001作为宿主细胞接入pNh1229质粒后形成大肠杆菌X，大肠杆菌X以3-氰基吡啶为底物进行生物催化产生烟酰胺。该专利在转化过程中需要添加大量的菌体，使得生产效率低。

中国专利CN106755166B公开了高分子量腈水合酶工程菌催化合成烟酰胺的方法，包括以下步骤：(1)接种：向装液量为40％～42％的发酵罐中，以接种量6～8％接入E.coliBL21(DE3)/pET-24a(+)-nhhB(rbs)A(rbs)G的种子培养液，设置初始pH为6.8～7.2，培养温度为36～37℃，初始转速180～200r/min，通气量为4.8～5L/min；接入种子液后将发酵罐的溶氧与转速相偶联，控制罐内溶氧维持在28～30％；(2)补料：在接种5～6h后溶氧反弹，此时以比生长速率μ＝0.18～0.2h^-1进行指数流加补料培养基；(3)诱导：当OD₆₀₀达到58～62时，调整温度为28～30℃，以0.20～0.22g/(L·h)的恒速流加140～150mL的诱导剂；(4)合成烟酰胺：调整温度为25～28℃，烟腈以0.4mol/L的终浓度加入到OD₆₀₀＝150～160.0的发酵液中，并不断搅拌，当批底物反应完毕后再加入下一批底物。该专利得到的工程菌的底物耐受性较低，仅能适应少数环境，实用性较差。

综上所述，目前虽然也有通过微生物转化法生产烟酰胺的研究，但是通常存在活性低，稳定性差，成本高的问题，因此构建高表达腈水合酶、高产物浓度耐受的菌株，提高腈水合酶的稳定性和活性，对提高生产效率、降低生产成本具有重要工业应用意义和价值。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题至少其一而提供一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用，通过构建高效表达重组腈水合酶的基因工程菌株，用于烟腈的水合反应，实现了烟酰胺制备过程中生物催化剂的成本降低以及烟酰胺生产过程中的经济性提高。该工程菌具有较强的腈水合酶生产能力，产腈水合酶生产成本低，活性高。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明第一方面公开了一种重组表达载体，所述的重组表达载体含有一段腈水合酶基因，该腈水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述的重组表达载体的表达载体为pET24a(+)质粒。

优选地，本发明中腈水合酶基因nhtABC具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，共1567个碱基对；所述的腈水合酶基因来自于Comamonas sp.；所述的腈水合酶基因包含有3段编码基因：nhtA位于核苷酸序列的第1-633位碱基处，nhtB位于核苷酸序列的第644-1300位碱基处，nhtC位于核苷酸序列的第1352-1567位碱基处；所述的nhtA、nhtB和nhtC分别表达腈水合酶的α亚基NHtA、β亚基NHtB及P7K调控蛋白NHtC。

优选地，所述的腈水合酶基因连接在pET24a(+)质粒的限制性酶切位点上，即一段腈水合酶nhtABC基因连接于pET24a(+)质粒上的两个限制性酶切位点之间。

优选地，将全基因合成好的重组质粒pET24a(+)-nhtABC转化到大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆子，经质粒提取获得大量重组质粒pET24a(+)-nhtABC。

本发明第二方面公开了一种基因工程菌，所述的基因工程菌为携带上述重组表达载体的宿主微生物。

优选地，所述的基因工程菌通过将上述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。

优选地，所述的宿主微生物可以为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自我复制，且所携带的腈水合酶基因能被有效表达即可，优选为大肠埃希氏菌(E.coli)，进一步优选为大肠埃希氏菌BL21(DE3)。

优选地，将上述的重组质粒pET24a(+)-nhtABC转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET24a(+)-nhtABC。

优选地，所述转化方法为本领域常规转化方法，包括化学转化法、热激法或电转化法。

本发明第三方面公开了一种培养上述基因工程菌的培养方法，将宿主微生物在LB培养基中培养得到种子液，之后将种子液接种到发酵培养基中进行培养，得到所述的基因工程菌。

优选地，所述的LB培养基包括10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl和50μg/mL卡那霉素，所述的LB培养基初始pH为7.0。

优选地，所述的将宿主微生物在LB培养基中培养为将单菌落接种至含有30mL的LB培养基中，然后在37℃，200rpm下振荡培养过夜。

优选地，所述的发酵培养基包括16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L乳糖和50μg/mL卡那霉素，所述的发酵培养基的初始pH为7.0。

优选地，所述的将种子液接种到发酵培养基中进行培养为将种子液按1％的接种量接种至发酵培养基中，加入终浓度为0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于22～35℃进行诱导表达12h，优选将种子液按1％的接种量接种至发酵培养基中，在37℃，200rpm下振荡培养2h后，加入终浓度0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于28℃进行诱导表达12h。

本发明第四方面公开了一种上述基因工程菌的应用，其特征在于，所述的基因工程菌在烟酰胺生产中作为催化剂的应用。

优选地，在pH为7.5的磷酸钾缓冲液中或水中，加入上述基因工程菌或其经细胞破碎后的酶液以及底物烟腈，进行水合反应后形成烟酰胺；反应终止后，可以通过对反应液进行冷却结晶、过滤、干燥等步骤得到99％纯度的烟酰胺成品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的腈水合酶基因能够在工程菌中实现高效表达并且其酶活性极好，经测定比酶活可达50U/mg以上，在优选条件下可以达到100U/mg，因而催化合成烟酰胺效率高，转化率可达99％以上，生产效率达到720g/(L·h)。

2、本发明的酶生产成本低，制备条件温和，过程简单，可在水系条件下完成转化，无需添加大量有机溶剂，降低生产成本并减少对环境的污染，有利于进一步的工业化生产，在烟酰胺合成中有很好地工业开发前景。

附图说明

图1为腈水合酶催化烟腈生成烟酰胺的反应式；

图2为实施例2的重组大肠杆菌腈水合酶基因蛋白表达的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中，M为蛋白标准分子量，1代表细胞破碎上清液，2代表细胞破碎后沉淀。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中未做特殊说明均采用本领域技术人员所用的常规方法或根据商品说明书进行。

以下实施例中基因工程菌株E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α均从商业途径购买，重组质粒pET24a(+)-nhtABC由全基因合成得到。

质粒提取均采用商业化质粒抽提试剂盒，按说明书步骤进行提取。

本发明各实施例中所用的试剂皆为分析纯或者HPLC纯规格。

图1是腈水合酶催化烟腈生成烟酰胺的反应式，由图1可知，生物合成法只需将腈水合酶与烟腈混合即可反应制得烟酰胺，十分便利。

实施例1

重组质粒pET24a(+)-nhtABC由全基因合成得到，之后将其转化到大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆子，经质粒提取即可获得大量重组质粒pET24a(+)-nhtABC，其含有一段腈水合酶基因，所述腈水合酶基因序列为SEQ ID NO.1。

取100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞置于预冷的灭菌EP管中，冰浴化开，使细胞均匀悬浮。加入10μL重组质粒pET24a(+)-nhtABC，轻轻混匀，冰浴30min，同时打开恒温仪预热。将EP管转移至42℃的干式恒温仪上热休克90s后迅速转移至冰浴中，让细胞冷却15min。加入900μL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃，250rpm下振荡培养1h。之后吸取400uL菌液涂布于含抗生素的LB琼脂平板上，待凝胶表面没有液体流动时，在37℃温箱中倒置培养12h后即可出现重组大肠杆菌的单菌落，得到的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24a(+)-nhtABC用于后续诱导表达。所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET24a(+)-nhtABC为携带重组质粒pET24a(+)-nhtABC的大肠埃希氏菌BL21(DE3)。

实施例2

种子液培养：自平板上挑取转化后的单菌落接种至含有30mL种子液培养基(含有卡那霉素50μg/mL)即LB培养基的摇瓶中，在37℃，200rpm下振荡培养12h。其中种子液培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物10g/L和NaCl 5g/L，初始pH为7.0。

摇瓶发酵：将培养好的种子液按1％的接种量接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，在37℃，200rpm下培养2h后加入终浓度0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于22℃进行诱导表达12h，测定最终的OD₆₀₀。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。其中发酵培养基配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，乳糖10g/L，培养基的初始pH为7.0。发酵后的蛋白表达量如图2所示，其中1代表细胞破碎上清液，2代表细胞破碎后沉淀。

酶活力测定：

一个酶活单位被定义为在标准条件下每分钟催化生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。

向400μL 125mM烟腈中加入100μL OD₆₀₀＝1的细胞悬液，于26℃下恒温混匀仪反应10min，之后进行离心并取上清稀释后，用微孔滤膜过滤后，通过HPLC进行分析。HPLC分析条件：流动相为水(pH＝2.5)：乙腈＝2:1(v：v)，流速为0.8mL/min，检测波长为210nm。经测定发酵所得湿菌体的比酶活为70U/mg。

实施例3

种子液培养：自平板上挑取转化后的单菌落接种至含有30mL种子液培养基(含有卡那霉素50μg/mL)即LB培养基的摇瓶中，在37℃，200rpm下振荡培养12h。其中种子液培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，初始pH为7.0。

摇瓶发酵：将培养好的种子液按1％的接种量接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，在37℃，200rpm下培养2h后加入终浓度0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于28℃进行诱导表达12h，测定最终的OD₆₀₀。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。其中发酵培养基配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，乳糖10g/L，培养基的初始pH为7.0。

按照实施例2所述的酶活力测定及分析方法对本实施例中发酵所得湿菌体进行活力分析：比酶活为100U/mg。

实施例4

种子液培养：自平板上挑取转化后的单菌落接种至含有30mL种子液培养基(含有卡那霉素50μg/mL)即LB培养基的摇瓶中，在37℃，200rpm下振荡培养12h。其中种子液培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，初始pH为7.0。

摇瓶发酵：将培养好的种子液按1％的接种量接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，在37℃，200rpm下培养2h后加入终浓度0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于35℃进行诱导表达12h，测定最终的OD₆₀₀。并将培养液离心，细胞沉淀用生理盐水洗涤两次，得到湿菌体。其中发酵培养基配方为：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L，乳糖10g/L，培养基的初始pH为7.0。

按照实施例2所述的酶活力测定及分析方法对本实施例中发酵所得湿菌体进行活力分析：比酶活为50U/mg。

实施例5

在2mL的ep管里，加入终浓度为0.5M的烟腈液体(溶于100mM，pH＝7.5磷酸钾缓冲液)，预热后加入实施例3中所得菌体，使反应体系中菌浓度为1g_dcw/L(悬浮于100mM，pH＝7.5磷酸钾缓冲液)，在26℃恒温震荡仪中反应，反应结束加入1mL乙腈终止反应。之后离心并取上清液稀释合适倍数以进行HPLC检测。结果发现反应10min即可实现底物99％的转化率。

实施例6

在2mL的ep管里，加入终浓度为0.5M的烟腈液体(溶于蒸馏水)，预热后加入实施例3中所得菌体，使反应体系中菌浓度为1g_dcw/L(悬浮于蒸馏水)，在26℃恒温震荡仪中反应，反应结束加入1mL乙腈终止反应。之后离心并取反应上清液稀释合适倍数以进行HPLC检测。结果发现反应10min即可实现底物99％的转化率。

实施例7

在锥形瓶中加入实施例3中获得的菌体制成30mL 5g_dcw/L菌悬液(悬浮于蒸馏水)，之后添加终浓度为2M的烟腈液体(溶于蒸馏水)，在30℃摇床中，180rpm下震荡反应。之后取反应液进行HPLC检测，观察反应进程。结果发现反应20min即可实现底物烟腈99％的转化率。

实施例8

在锥形瓶中加入实施例3中获得的菌体制成30mL 5g_dcw/L菌悬液(悬浮于蒸馏水)，之后添加终浓度为2M的烟腈液体(溶于蒸馏水)，在30℃摇床中，180rpm下震荡反应，之后取反应液进行HPLC检测，待当批底物反应完毕继续添加下一批底物，并定期取样测定产物积累量。结果发现反应1h时即可达到720g/L的产量，烟酰胺生产效率达到720g/(L·h)。

实施例9

在1L的摇瓶中，依次添加200mL蒸馏水，50g的烟腈，之后添加实施例3中获得的菌体4g作为生物催化剂，在30℃摇床中，180rpm下震荡反应，每隔1小时检测一次反应液中的烟腈浓度，当底物浓度低于1g/L后开始补加烟腈使终浓度为2M，共补料8次。补加物料完成后检测反应液中的烟酰胺的浓度，当底物浓度趋向于零时终止反应。反应结束后，先对反应液进行除菌过滤，然后对其进行冷却结晶、过滤、干燥，重复步骤，最终得到纯度在99％的烟酰胺成品。最终该实验得到烟酰胺成品为405g，收率为91.85％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海应用技术大学

<120> 一种重组表达载体、基因工程菌及菌的培养方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggggcaat cacacacgca tgaccaccat cacgacgggt accaggcacc gcccgaagac 60

atcgcgctgc gggtcaaggc cttggagtct ctgctgatcg agaaaggtct tgtcgaccca 120

gcggccatgg acttggtcgt ccaaacgtat gaacacaagg taggcccccg aaacggcgcc 180

aaagtcgtgg ccaaggcctg ggtggaccct gcctacaagg cccgtctgct ggcagacggc 240

actgccggca ttgccgagct gggcttctcc ggggtacagg gcgaggacat ggtcattctg 300

gaaaacaccc ccgccgtcca caacgtcgtc gtttgcacct tgtgctcttg ctacccatgg 360

ccgacgctgg gcttgccccc tgcctggtac aaggccccgc cctaccggtc ccgcatggtg 420

agcgacccgc gtggggttct cgcggagttc ggcctggtga tccccgcgaa ggaaatccgc 480

gtctgggaca ccacggccga attgcgctac atggtgctgc cggaacggcc cgcgggaact 540

gaagcctaca gcgaagaaca actggccgaa ctcgttaccc gcgattcgat gatcggcacc 600

ggcctgccca tccaacccac cccatctcat taaggagttc gtcatgaatg gcattcacga 660

tactggggga gcacatggtt atgggccggt ttacagagaa ccgaacgaac ccgtctttcg 720

ctacgactgg gaaaaaacgg tcatgtccct gttcccggcg ctgttcgcca acggcaactt 780

caacctcgat gagtttcgac acggcatcga gcgcatgaac cccatcgact acctgaaggg 840

aacctactac gaacactgga tccattccat cgaaaccttg ctggtcgaaa agggtgtgct 900

cacggcaacg gaactcgcga ccggcaaggc atctggcaag acagcgacac cggtgctgac 960

gccggccatc gtggacggac tgctcagcac cggggcttct gccgcccggg aggagggtgc 1020

gcgggcgcgg ttcgctgtgg gggacaaggt tcgcgtcctc aacaagaacc cggtgggcca 1080

tacccgcatg ccgcgctaca cgcggggcaa agtggggaca gtggtcatcg accatggtgt 1140

gttcgtgacg ccggacaccg cggcacacgg aaagggcgag cacccccagc acgtttacac 1200

cgtgagtttc acgtcggtcg aactgtgggg gcaagacgcc tcctcgccga aggacacgat 1260

tcgcgtcgac ttgtgggatg actacctgga gccagcgtga tcatgaaaga cgaacggttt 1320

ccattgccag agggttcgct gaaggacctc gatggccctg tgtttgacga gccttggcag 1380

tcccaggcgt ttgccttggt ggtcagcatg cacaaggccg gtctctttca gtggaaagac 1440

tgggccgaga ccttcaccgc cgaaatcgac gcttccccgg ctctgcccgg cgaaagcgtc 1500

aacgacacct actaccggca atgggtgtcg gcgctggaaa agttggtggc gtcgctgggg 1560

cttgtga 1567

Claims (10)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体含有一段腈水合酶基因，该腈水合酶基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述的腈水合酶基因连接在pET24a(+)质粒的限制性酶切位点上。

3.一种基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为携带如权利要求1或2所述的重组表达载体的宿主微生物。

4.根据权利要求3所述的一种基因工程菌，其特征在于，所述的宿主微生物为大肠埃希氏菌BL21(DE3)。

5.一种培养如权利要求3或4的基因工程菌的培养方法，其特征在于，将宿主微生物在LB培养基中培养得到种子液，之后将种子液接种到发酵培养基中进行培养，得到所述的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的培养方法，其特征在于，所述的LB培养基包括10g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl和50μg/mL卡那霉素，所述的LB培养基初始pH为7.0。

7.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的培养方法，其特征在于，所述的将宿主微生物在LB培养基中培养为将单菌落接种至含有30mL的LB培养基中，然后在37℃，200rpm下振荡培养过夜。

8.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl、10g/L乳糖和50μg/mL卡那霉素，所述的发酵培养基的初始pH为7.0。

9.根据权利要求5所述的一种基因工程菌的培养方法，其特征在于，所述的将种子液接种到发酵培养基中进行培养为将种子液按1％的接种量接种至发酵培养基中，在37℃，200rpm下振荡培养2h后，加入终浓度为0.6mM的IPTG，终浓度为0.1g/L氯化钴，然后于22～35℃进行诱导表达12h。

10.一种如权利要求3或4的基因工程菌的应用，其特征在于，所述的基因工程菌在烟酰胺生产中作为催化剂的应用。

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