CN107217046A

CN107217046A - 一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶ZENdease‑N1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN107217046A
Application number: CN201710506381.4A
Authority: CN
Inventors: 孙长坡; 柴成梁; 常晓娇; 刘虎军; 王峻
Original assignee: Academy of State Administration of Grain
Current assignee: Academy of State Administration of Grain
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2017-09-29

Abstract

本发明公开一种玉米赤霉烯酮降解酶，所述玉米赤霉烯酮降解酶被命名为ZENdease‑N1，来源于杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)，为如(a)或(b)所示的蛋白质：(a)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入而衍生得到的具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白质。本发明还公开了玉米赤霉烯酮降解酶的表达方法和应用。本发明所述的玉米赤霉烯酮降解酶对玉米赤霉烯酮具有高效降解作用。

Description

一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶ZENdease-N1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及酶工程领域。更具体地，涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因与应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)主要是由镰刀菌属(Fusarium species)产生的次生代谢物，是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，易受ZEN污染的粮食作物包括玉米、大麦、小麦、高粱和黑麦等。ZEN的化学名称为6-(10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，其结构与雌性激素雌二醇(estradiol)的结构相似，ZEN能够与动物细胞膜上的雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合，引起ER的构象改变，ZEN/ER复合物被进一步转移至细胞核内，与雌激素效应元件结合，调节靶基因的转录与翻译，进而影响细胞的生长和分裂。ZEN被摄入到哺乳动物体内，可引起哺乳动物阴道炎、假发情及发情周期延长、流产、不育以及畸形等的“高雌性激素症”(hyperestrogenism)。ZEN通过食物链在人体内蓄积，可导致性早熟，甚至引起乳腺癌、食管癌等发病率增加，对人类健康造成巨大威胁。

目前，国内外ZEN的去毒方法主要有物理去除、化学处理等。对已经污染ZEN真菌毒素谷物的物理、化学处理方法主要有：冲洗和漂洗、热处理、离子辐射、无机吸附、化学试剂的处理及臭氧氧化等。但是，物理化学脱毒效率并没有预期的高，且改变了食品的品质，易造成营养物质的流失，且欧盟不允许在食品生产过程中应用化学方法消除真菌毒素。

微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代谢过程中产生的酶与ZEN作用，破坏ZEN分子的毒性基团，使其被降解或转化为无毒产物的过程。生物降解法降解ZEN特异性强、ZEN分子被转化效率高、不会引起环境污染，可科学有效的消除粮食作物中的ZEN污染，具有极好的应用前景

因此，提供一种可有效降解ZEN的酶类具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因，该酶可以降解玉米赤霉烯酮(ZEN)。

本发明的第二个目的在于提供一种表达上述玉米赤霉烯酮降解酶的方法。

本发明的第三个目的在于提供一种上述玉米赤霉烯酮降解酶的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶，被命名为ZENdease-N1，来源于杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)，所述玉米赤霉烯酮降解酶为如(a)或(b)所示的蛋白质：

(a)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(b)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代和/或缺失和/或插入而衍生得到的具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白质。

其中，所述序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列由286个氨基酸残基组成。

在本发明中上述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因也属于本发明的保护范围，所述编码基因如(a)或(b)所示：

(a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

其中，本发明中序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列由861个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第861位碱基，编码具有序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。

需要注意的是，含有本发明上述编码基因的表达载体、细胞系、工程菌及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种表达玉米赤霉烯酮降解酶的方法，是将含有上述玉米赤霉烯酮降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到玉米赤霉烯酮降解酶。

其中，所述宿主包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌等；优选为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌BL21。

用于构建所述重组大肠杆菌及重组酵母表达载体的出发载体可为在上述宿主中表达外源基因的表达载体，如可在大肠杆菌中表达的PET载体，以及在巴氏德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的pPIC9K、pPIC9、pPIC3.5K等。

上述重组表达载体均可按常规方法构建。

本发明还提供了所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

本发明的有益效果如下：

本发明得到的玉米赤霉烯酮降解酶可对粮食中真菌毒素玉米赤霉烯酮进行降解，对控制粮食污染起到有效的作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出重组质粒PET30a-ZENdease-N1的表达产物的SDS-PAGE图；

其中，泳道1，表达产物；泳道M，蛋白分子量标准(97KD，66KD，45KD，31KD，21.5KD，14.4KD，6.5KD)。

图2示出玉米赤霉烯酮降解酶能力测定图。

图3示出不同pH值条件下ZENdease-N1对ZEN分子的降解情况。

图4示出了不同温度条件下ZENdease-N1对ZEN分子的降解情况。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N1的获得及表达

1、玉米赤霉烯酮降解酶编码基因的获得

通过化学合成方法得到ZENdease-N1全长基因，以此合成的基因为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应，扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因的序列。

引物1：5'-GAAATTCATATGCCTTCTTCACTT-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.3所示，划线部分碱基为NdeI识别位点)

引物2：5'-CCCGTCGACAGCCCCATCCTT-3'(其核苷酸序列如序列表SED ID NO.4所示，划线部分碱基为SalI识别位点)

在PCR反应中，PCR反应条件为：94℃，保持5分钟，接着按以下的温度变化程序循环30次：升温至94℃，保持1分钟，降温至54℃，保持1分钟，升温至68℃，保持2分钟；然后于68℃，保持10分钟，最后于4℃保温10分钟，结束扩增反应。通过琼脂糖电泳分析获得约0.8kb的单一带，扩增之后的PCR产物检测之后将目的带大小的扩增产物用DNA凝胶回收试剂盒进行回收，并检测其浓度。回收PCR产物连接PET30a Vector，转化大肠杆菌BL21，获得重组质粒PET30a-ZENdease-N1测序鉴定。该玉米赤霉烯酮降解酶基因DNA序列如序列表SED IDNO.2所示，其对应的氨基酸序列如序列表SED ID NO.1所示。

2、含有玉米赤霉烯酮降解酶编码基因序列的重组表达载体的构建

上述所获得的PCR产物两端具有NdeI和SalI限制性内切酶位点，用(NdeI)和(SalI)限制性内切酶对PCR产物和质粒PET30a同时进行双酶切反应，酶切体系50μL：目的片段或质粒20μL，10×K Buffer 5μL，NdeI 2μL，SalI 2μL，ddH₂O 21μL，酶切条件是37℃反应3h。酶切产物经柱回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取阳性菌落培养，重组表达载体经PCR鉴定、酶切鉴定，测序验证。经琼脂糖电泳后载体。回收的目的片段和载体片段定量并按摩尔比为3:1的比例用T4DNA连接酶进行体外连接，连接反应体系10μL：目的片段5μL，PET30a载体2μL 10×T4DNA连接缓冲液1μL，T4DNA连接酶(350U/μL)1μL,ddH₂O 1μL。16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌BL21，经卡那霉素抗性筛选，挑取菌落37℃振荡培养6-8h，分别进行PCR鉴定和重组质粒的酶切鉴定。获得的重组表达载体命名为后PET30a-ZENdease-N1。

超声波破碎，离心收集上清，取15μL上清用SDS-PAGE电泳进行检测。对PET30a-ZENdease-N1进行测序，结果证明融合连接入载体PET30a的DNA序列与序列表SED ID NO.2所示序列相同，构建含有玉米赤霉烯酮降解酶基因序列的重组表达载体PET30a-ZENdease-N1正确。

3、玉米赤霉烯酮降解酶在大肠杆菌中的表达纯化

将重组表达载体PET30a-ZENdease-N1转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性LB平板。挑取平板平板上的单菌落到1L LB培养基中培养，待细菌生长到OD值为1左右时，加入0.5mL浓度为0.6mol/L的IPTG诱导表达过夜，次日收菌纯化蛋白。将过夜表达的菌体离心收集，弃上清，加入30mL重悬缓冲液，将细菌沉淀悬起后超声破碎细菌，将破碎的细胞悬液转入高速离心管中，高速离心后把上清加入到Ni-NTA亲和柱中，让其流过亲和介质。用10倍柱体积的漂洗缓冲液漂洗亲和介质，洗掉非特异性结合的杂蛋白，用5mL洗脱缓冲液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行ZENdease-N1蛋白的表达纯化分析。用SDS-PAGE电泳进行检测。结果如图1所示：泳道1为表达产物，箭头表示目的条带，这表明重组菌株表达的蛋白质的分子量约31.5KD，与从氨基酸推段出的理论分子量(31.5KD)大小一致。

实施例2玉米赤霉烯酮降解酶的活性检测

取纯化的ZENdease-N1蛋白50μL，加入到含ZEN浓度为10μg/mL的eppendorf管中，以不加ZENdease-N1蛋白的同浓度ZEN溶液作对照，37℃反应6h，100℃加热10min终止反应，用旋转蒸发仪蒸干反应体系，加入1mL甲醇，超声萃取，经0.22μm滤膜过滤后，用高效液相色谱检测，根据ZEN浓度的变化来分析ZENdease-N1蛋白对ZEN是否具有降解活性。高效液相色谱检测ZEN的色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm，xbridge)；流动相：超纯水/色谱级乙腈＝50/50(V/V)；流动相流速：1.0mL/min；色谱柱温度设定：25℃；进样量：10μL；荧光检测器：激发波长(Ex)274nm，发射波长(Em)440nm；采集时间：13min。在上述色谱条件下，对照组样品在保留时间RT＝10.715min处有强吸收峰，而反应组样品基本无ZEN目标峰检出，经吸收峰面积计算，已有98％的ZEN分子被降解，如图2所示，可以表明，ZENdease-N1基因克隆表达出的降解酶具有降解玉米赤霉烯酮的活性。

实施例3玉米赤霉烯酮降解酶的反应条件检测

本发明探索ZENdease-N1降解ZEN分子的最佳反应条件，测试了不同温度、pH值等条件下ZENdease-N1对ZEN分子降解活性的影响。

首先，测试不同pH值条件下ZENdease-N1对ZEN分子的降解率。取纯化后的ZENdease-N1降解酶2mL，用PBS缓冲液稀释100倍，备用；取8只50mL离心管，每支加入稀释后的降解酶5mL，以盐酸和氨水调pH分别至2、3、4、5、6、7、8、9，4℃放置12h后，分别吸取500μL到8支含10μg ZEN的EP管中，37℃反应30min终止反应，以不加ZENdease-N1降解酶的同浓度ZEN溶液作对照，用高效液相色谱检测不同pH值条件下ZENdease-N1对ZEN分子的降解活性影响。结果如图3所示，结果表明，在pH＝7的中性条件下，ZENdease-N1对ZEN的降解活性最高，而在pH＝4的酸性条件下，ZENdease-N1对ZEN分子仍然有较高的降解活性，说明ZENdease-N1降解酶具有较好的耐酸性。

同样方法，在pH＝7的条件下，测试4℃、20℃、37℃、45℃、60℃、70℃不同温度条件下ZENdease-N1对ZEN分子的降解活性影响，结果如图4所示，表明当温度为20-37℃时，ZENdease-N1对ZEN均具有较好的降解效果，37℃时效果最佳。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家粮食局科学研究院

<120> 一种玉米赤霉烯酮毒素降解酶ZENdease-N1及其编码基因与应用

<130> JLC17I0311E

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 286

<212> PRT

<213> 玉米赤霉烯酮降解酶ZENdease-N1氨基酸序列

<400> 1

Met Pro Ser Ser Leu Ser Pro Thr Val Asp Val Tyr Ser Lys Val Met

1 5 10 15

Leu Glu Leu Pro Pro Lys Ile Lys Ser Leu Pro Thr Pro Thr Val Arg

20 25 30

Lys Val Asn Thr Asn Asp Gly Met Ser Trp His Val Lys Gln Thr Gly

35 40 45

Met Gly Arg Asp Leu Ile Leu Ile Pro Ala Cys Glu Gly Asp Ser Ser

50 55 60

Thr Tyr Asp His Leu Gly Asp Leu Leu Ser Ser Ser Phe Arg Ile Thr

65 70 75 80

Thr Phe Asp Met Pro Gly Phe Ser Arg Thr Ile Ala Pro Pro Phe Ser

85 90 95

Met Glu Asp Leu Thr Val Gln Ile Leu Ala Thr Gln Val Val Thr Leu

100 105 110

Met Asp Glu Leu Ala Ile Pro Thr Ala Thr Phe Phe Ser Val Ala Ala

115 120 125

Gly Ser Leu Val Ala Met Gly Leu Val Thr Tyr Tyr Pro Asp Arg Val

130 135 140

Glu Arg Ile Ile Ile His Glu Ala Pro Leu His Val Pro Gln Gly Phe

145 150 155 160

Arg Leu Leu Lys Leu Lys Asp Asp Ala His Val Met His Gln Cys Arg

165 170 175

Glu Met Phe Pro Ala Leu Leu Met Glu Ser Arg Thr Ala Trp Glu Ala

180 185 190

Met Gly Ala Glu Tyr His Ala Arg Met Glu Lys Asn Tyr Val Thr Trp

195 200 205

Leu Arg Lys Tyr Ile Gly Gln Leu Glu Cys His His Trp Asp Glu Gly

210 215 220

Leu Leu Gln Arg Pro Val Tyr Trp Ser Val Gly Ser Leu Asn Val Met

225 230 235 240

Gly Gly Phe Tyr Asp Asn Ile Ile Leu Ala Thr Lys Leu Gly Leu Glu

245 250 255

Val Glu Ile Leu Pro Cys Lys His Tyr Pro Gln Leu Thr Ile Pro Glu

260 265 270

Ile Leu Ala Ala His Ile Arg Cys Cys Val Lys Asp Gly Ala

275 280 285

<210> 2

<211> 861

<212> DNA

<213> 玉米赤霉烯酮毒素降解酶ZENdease-N1编码基因序列

<400> 2

atgccttctt cactttctcc cacggtagat gtgtacagca aggtcatgtt ggaattaccc 60

ccgaaaatca aatcactgcc gacgccgacg gtccggaagg tcaacaccaa cgatgggatg 120

tcatggcacg tgaaacagac gggcatggga cgagatctta ttctgatacc tgcctgcgaa 180

ggcgacagct ctacctatga tcacctcggc gatctcctct cctcctcatt cagaataacc 240

acattcgaca tgcctggctt ctccaggacg atcgcgccgc ccttctcgat ggaagacctc 300

acggtacaga ttttggcgac tcaggtcgtc acgttgatgg acgaacttgc gataccgaca 360

gcgaccttct tctcagtcgc cgccgggagc ttagtggcga tgggcttggt aacatactac 420

ccggaccggg tcgagcgaat catcatccac gaggcccctc tccacgttcc ccaaggattc 480

agactcttga agctcaagga cgacgctcat gtgatgcacc aatgtcgcga aatgtttccc 540

gcactcctga tggagagtag aacggcgtgg gaagctatgg gagccgagta ccatgctcgg 600

atggagaaga actatgtcac ctggctcagg aagtacatcg gccagctgga atgtcaccat 660

tgggacgagg gattgctgca gagacctgtg tattggagcg ttggatcgtt gaatgtgatg 720

ggaggcttct acgacaacat tattttggcg acgaaattag gcctcgaggt cgagatactt 780

ccgtgcaagc actatccaca gctaacgata ccggaaatac tcgcggcaca tattcgatgt 840

tgtgtgaagg atggggcttg a 861

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成引物1

<400> 3

gaaattcata tgccttcttc actt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成引物2

<400> 4

cccgtcgaca gccccatcct t 21

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶为如(a)或(b)所示的蛋白质：

(a)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表SED ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入而衍生得到的具有降解玉米赤霉烯酮活性的蛋白质。

2.权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因。

3.一种如权利要求2所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如(a)或(b)所示：

(a)如序列表SED ID NO.2所示的核苷酸序列；

(b)编码如序列表SED ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因的表达载体、细胞系、工程菌或宿主菌。

5.权利要求1所述玉米赤霉烯酮降解酶在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

6.权利要求2或3所述玉米赤霉烯酮降解酶编码基因在降解玉米赤霉烯酮中的应用。

7.一种表达权利要求1所述的玉米赤霉烯酮降解酶的方法，其特征在于：将含有权利要求2或3所述的玉米赤霉烯酮降解酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到玉米赤霉烯酮降解酶。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：用于构建所述重组表达载体的出发载体为PET、pPIC9K、pPIC9、pPIC3.5k。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、芽孢杆菌或乳杆菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌，优选的，为大肠杆菌BL21。