CN110029095B

CN110029095B - 一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用

Info

Publication number: CN110029095B
Application number: CN201910298924.7A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 卢丹; 徐晴; 张立慧; 冯小倩
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN110029095A

Abstract

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的酶对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力，其降解速度快，且具有较好的pH稳定性。

Description

一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是一种雌激素类真菌毒素，耐热性较强，110℃处理1h才能被完全破坏，主要污染小麦、大麦、燕麦、玉米等农作物及动物饲料。陈道付等选取86个河南省饲料样本，发现玉米赤霉烯酮的超标率为43.59％，最高含量达到了11900μg/kg(陈道付,李绍钰,徐彬,等.河南省主要饲料原料中霉菌毒素污染状况调查报告[A].第六次全国饲料营养学术研讨会论文集,2010)。玉米赤霉烯酮主要作用于生殖系统，会引起种猪或家禽早熟，繁殖机能异常甚至死亡。因此，如何有效控制和消除食品、饲料中的玉米赤霉烯酮污染，成为食品、饲料行业亟需解决的问题。

目前，玉米赤霉烯酮脱毒技术根据其作用原理可分为3类：物理脱毒法(加热法、紫外线照射法、吸附法等)；化学脱毒法(酸碱处理，氧化处理等)；生物脱毒法。热处理和吸附法对玉米赤霉烯酮的作用不大，且会破坏食品或饲料的营养价值。紫外处理效果明显但其降解后产物的组成、性质及毒理等尚缺乏研究。化学方法虽效果显著，但化学试剂(酸、碱或氧化剂等)的添加会引入许多不确定因素，生成新产物的潜在毒性也需进一步研究(Mckenzie K.S.,Sarr A.B.,Mayura K..Oxidatived degradation of detoxificationof mycotoxins using a novel soruce of ozone[J].Food and Chemical Toxicology,1997,35:807～820)。相对于物理法和化学法的种种局限性，生物降解法显示出其独有的优势，受到国内外研究者的青睐。生物降解脱毒是以微生物产生的次级代谢产物分解破坏霉菌毒素，生成无毒的降解产物。生物降解法高效、特异性强，不破坏原料中的营养成分，无二次污染产生，已成为研究热点和主要趋势。

能够降解玉米赤霉烯酮的生物酶主要有三类：漆酶、过氧化物酶和内酯水解酶。在2009年，Novozyme公司的Viksoe-nielsen等发现在氧化还原介质的存在下，来源于Streptomycescoelicolor的漆酶除了具有降解黄曲霉毒素外，还能降解玉米赤霉烯酮，37℃条件下反应24h，玉米赤霉烯酮可被完全降解(Viksoe-Nelsen A,Soerensen BH.Detoxification of Feed Products:WO2009EP52566[P].2009-03-05.)。Yu等研究发现来源于Acinetobacter sp.SM04的过氧化物酶(Prx)能催化H₂O₂氧化降解玉米赤霉烯酮。(YUY,WU H,TANG Y,et al.Cloning,expression of a peroxiredoxin gene fromAcinetobacter sp.SM04and characterization of its recombinant protein forzearalenone detoxification[J].Microbiol Res,2012,167(3):121-126.)。目前，对玉米赤霉烯酮降解酶最为关注的酶为内酯水解酶，编码基因为zdh101，是Takahashi-ando等在2002年从来源于ClonostachysroseaIFO 7063中分离获得，并将其在酿酒酵母中实现异源表达，脱毒实验表明其能够在37℃条件下反应8h或28℃条件下反应48h，实现2μg/mL玉米赤霉烯酮的完全降解(Takahashi-ando N,Kimura M,Kakeya H,et al.A NovelLactonohydrolase Responsible for the Detoxification of Zearalenone:EnzymePurification and Gene Cloning[J].Biochem J,2002,365(1):1-6.)。唐语谦等发现该酶主要通过作用于玉米赤霉烯酮的内脂键实现毒素的降解，但由于可逆反应的存在，该反应并不能完全降解玉米赤霉烯酮，降解产物为β-ZOL，仍具有一定雌激素毒性，但毒性相对较低(唐语谦,钟凤,陈艺,等.玉米赤霉烯酮生物脱毒及关键酶作用机理的研究进展[J].现代食品科技,2013(7):1742-1746.)。

与其他霉菌毒素相比，已发现的ZEN的降解酶相对较少。此外，目前大多数的玉米赤霉烯酮降解酶有着活性不高和pH稳定性差的缺点，限制了其应用。为了扩展对ZEN解毒酶的理解并促进蛋白质工程的发展，进一步挖掘新的ZEN降解酶是必不可少的。

发明内容

本发明的目的在于，解决现有玉米赤霉烯酮降解酶种类较少，且存在稳定性差等问题，拓展玉米赤霉烯酮降解酶的来源，提高酶的pH稳定性，提供一种新的玉米赤霉烯酮降解酶及其应用。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：一种来源于Exophialaspinifera的玉米赤霉烯酮降解酶LD08，该酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。编码该酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明利用以玉米赤霉烯酮为唯一碳源的培养基进行玉米赤霉烯酮降解菌的筛选，以筛选获得的玉米赤霉烯酮降解菌(Exophialaspinifera)基因组为模板，设计引物进行PCR扩增，获得了上述具有玉米赤霉烯酮降解能力的蛋白基因。

本发明还提供了包含上述核苷酸序列的载体及重组菌。所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌、酵母菌或枯草芽孢杆菌，优选大肠杆菌。

本发明的另一目的在于提供玉米赤霉烯酮降解酶LD08在在玉米赤霉烯酮降解中的应用。

本发明提供了一种具体的应用方式，包括如下步骤：

(1)构建包含玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组菌；

重组菌构建方式为：PCR扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因，获得PCR产物；用NdeI和XhoI分别双酶切PCR产物和pET-30a(+)载体，将酶切后的PCR产物纯化，并用T4DNA连接酶连接到pET-30a(+)载体中，获得重组载体pET-30a(+)-LD08，将重组载体转入感受态大肠杆菌E.coLiBL21(DE3)中，涂布于固体LB培养基上培养，挑取单菌落，接种于含硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，筛选阳性转化子，即为重组菌；

(2)诱导表达重组菌，获得重组表达的玉米赤霉烯酮降解酶粗酶液；

粗酶液诱导表达方法为：用含硫酸卡那霉素的LB培养基培养重组菌，OD600值达到0.6后，添加IPTG继续培养后，将液体培养物离心，弃上清，得到重组菌沉淀物；使用磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，超声波细胞破碎仪对细胞进行破碎，离心，除去细胞残渣，收集上清液，即为重组表达的粗酶液；

(3)纯化粗酶液，获得纯酶液；

将粗酶液置于冰上，根据表达出的重组酶含有His-tag标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，缓冲液洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液

(4)将纯酶液和含玉米赤霉烯酮溶液混合，进行降解反应；反应条件为30～40℃，pH 5～10，10～20min。

本发明获得的玉米赤霉烯酮降解酶LD08是一种全新的酶，对真菌毒素玉米赤霉烯酮有较强的降解能力，其降解速度快，且具有较好的pH稳定性。

附图说明

图1是实施例4中LD08降解玉米赤霉烯酮的HPLC检测图；其中，(A)：玉米赤霉烯酮(标准品)(浓度10μg/mL)；(B)：玉米赤霉烯酮降解酶LD08+玉米赤霉烯酮，反应20min；

图2是实施例4中LD08基因在E.coli中诱导表达的SDS-PAGE电泳分析结果图；

图3是玉米赤霉烯酮浓度与液相色谱吸收峰面积关系标准曲线图；

图4是不同降解时间下玉米赤霉烯酮的转化率；

图5是不同温度下玉米赤霉烯酮降解酶的酶活；

图6是不同pH下玉米赤霉烯酮降解酶的酶活。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。

实施例1

本实施例具体说明玉米赤霉烯酮降解菌的筛选方法。

(1)菌株的富集

将样品土壤的一部分(2g)分别加入锥形瓶中，用无菌水在30℃下孵育1小时。取100μL悬浮液，加至5mL含有2μg/mL玉米赤霉烯酮的富集培养基中，37℃下在恒温摇床中(200rpm)中孵育72h。

所述含有玉米赤霉烯酮的富集培养基为：1.52g/L KH₂PO₄,2.44g/L Na₂HPO₄,0.2g/L MgSO₄.7H₂O,0.5g/L(NH₄)₂SO₄,0.05g/L CaCl₂，10.0g/L NaCl，2μg/mL玉米赤霉烯酮。

(2)平板法筛选玉米赤霉烯酮降解菌

分别吸取100μL培养3天的富集液，3,000rpm离心5min后弃上清，用100μL含2μg/mL玉米赤霉烯酮的筛选培养基悬浮沉淀，涂布于平板上，37℃下培养24h，挑选单菌落进行划线纯化。最后筛选获得五株能够以玉米赤霉烯酮为唯一碳源进行生长的菌株，说明其可能具有玉米赤霉烯酮的降解能力。

所述的平板筛选培养基为：1.52g/L KH₂PO₄,2.44g/L Na₂HPO₄,0.2g/LMgSO₄.7H₂O,0.5g/L(NH₄)₂SO₄,0.05g/L CaCl₂，10.0g/L NaCl，2μg/mL玉米赤霉烯酮。

(3)液体培养法筛选玉米赤霉烯酮降解菌

取1mL过夜培养的上述5株菌株，接种至玉米赤霉烯酮降解培养基，培养72h，取1mL培养液进行玉米赤霉烯酮含量测定，通过比较残余的玉米赤霉烯酮含量，筛选出1株具有玉米赤霉烯酮降解能力的菌株。通过16s rDNA等鉴定，其为Exophialaspinifera。

玉米赤霉烯酮降解培养基为：1.52g/L KH₂PO₄,2.44g/L Na₂HPO₄,0.2g/LMgSO₄.7H₂O,0.5g/L(NH₄)₂SO₄,0.05g/L CaCl₂，10.0g/L NaCl。待培养基灭菌后，将玉米赤霉烯酮标准溶液过0.22μm微孔滤膜后加入培养基中，使玉米赤霉烯酮终浓度为2μg/mL。

实施例2

本实施例具体说明利用玉米赤霉烯酮降解菌制备玉米赤霉烯酮降解酶浓缩酶液的方法。

1.培养：将接种有2％(v/v)菌体悬液(OD600＝0.8)的培养物(YPD培养基)在30℃的恒温摇床中培养(200rpm)36h至对数生长末期，将液体培养物离心12min(5000rpm，4℃)，离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤，滤液在50℃使用真空旋转蒸发仪浓缩9倍成为粗酶液；

所用培养基的配方如下：

YPD培养基：配制方法：称取酵母粉10g，蛋白胨20g，溶解于900mL超纯水中，高压121度20min，加入100ml 20g/L葡萄糖(葡萄糖在115℃下灭菌20min)。

2.将步骤1中的粗酶液加入阴离子型葡聚糖凝胶柱DEAESephadexA-50柱(2.0cm×15cm)中，用pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的磷酸钠盐缓冲液进行梯度洗脱，分段收集(每管5mL)，高效液相色谱测定各管的玉米赤霉烯酮降解能力，合并玉米赤霉烯酮降解酶活力高于30％的各管；

3.将步骤2获得的玉米赤霉烯酮降解酶液在50℃下浓缩9倍，加入到阳离子型葡聚糖凝胶柱SephadexG-50柱(2.0cm×30cm)中，用20mMTris-HCl缓冲液洗脱，分段收集(每管5mL)，高效液相色谱测定各管的玉米赤霉烯酮降解能力，合并玉米赤霉烯酮降解酶活力高于30％的各管；

4.将步骤3获得的玉米赤霉烯酮降解酶组分在50℃下浓缩9倍，重新加入到阴离子型葡聚糖凝胶柱DEAESephadexA-50柱(2.0cm×15cm)中，用pH7.0、6.5、6.0、5.5、5.0的磷酸钠盐缓冲液进行梯度洗脱，分段收集(每管5mL)，高效液相色谱各管的玉米赤霉烯酮降解能力，合并玉米赤霉烯酮降解活力高于50％的各管；

5.将步骤4所得的玉米赤霉烯酮降解酶组分在50℃下浓缩9倍，即为最终的浓缩酶液。

实施例3

本实施例说明玉米赤霉烯酮降解酶LD08基因的克隆方法。

采用SDS-PAGE分离实施例2获取的浓缩酶液，切取相应蛋白条带，进行MALDI-TOF/TOF/MS分析和鉴定，经鉴定其为内脂水解酶。结合Exophialaspinifera的基因组信息，获得该酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

实施例4

玉米赤霉烯酮降解酶LD08基因在大肠杆菌中的表达和功能鉴定。

(1)构建表达载体

根据实施例3得到的玉米赤霉烯酮降解酶LD08编码基因设计引物，引物包含酶切位点(NdeI、XhoI)，引物如下：

引物1：5'-GGGAATTCCATATGACCACCCGTACCCGCAA-3'

引物2：5'-CCGCTCGAGGGTATATTTCTGACAAGTTT-3'

PCR反应体系(50μL)为：2×phantamax-mix 25μL，引物1(10μM)2μL,引物2(10μM)2μL，模板DNA 2μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性3min，随后28个循环(变性95℃15s，退火68℃40s，延伸72℃4min)，冷却至4℃。

LD08基因片段经过PCR扩增后，用NdeI和XhoI分别双酶切PCR产物和pET-30a(+)载体，将酶切后的PCR产物纯化，并用T4DNA连接酶连接到pET-30a(+)载体中，转入感受态E.coLiBL21(DE3)中，涂布于固体LB(含50μg/mL硫酸卡那霉素)上培养，挑取单菌落，接种于LB液体培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，使用双酶切和测序的方法来检测转化结果。成功转入pET-30a(+)-LD08质粒的大肠杆菌为阳性转化子，即为E.coLiBL21(DE3)/pET-30a(+)-LD08。

(2)诱导表达

将E.coLiBL21(DE3)/pET-30a(+)-LD08转化后的菌体培养于LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中(37℃，200rpm)，OD600值达到0.6后，添加1.0mmol/L IPTG，20℃继续培养14h后，将液体培养物离心10min(5000rpm，4℃)，弃上清，得到重组大肠杆菌沉淀物。使用15mL磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，超声波细胞破碎仪对细胞进行破碎(频率300Hz，超声两秒，停两秒，共超声10min，冰浴)。离心30min(12000rpm，4℃)，除去细胞残渣，收集上清液，即为重组表达的LD08粗酶液。

将粗酶液置于冰上，根据表达出的重组酶含有His-tag标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，1mL/min平衡Ni柱后，以流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样；继续使用缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，含10mM咪唑)1mL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；以缓冲液(pH 7.4，50mM NaCl，500mM咪唑)洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。纯化后的酶液用nanodrop 2000测定浓度。

(3)重组LD08粗酶液以及纯化后的酶液SDS-PAGE电泳分析

取步骤(2)中得到的重组LD08酶粗酶液2mL和纯化后的酶液2mL，用12.5％(w/v)SDS-PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色。

SDS-PAGE蛋白电泳液：10％(w/v)十二烷基苯磺酸钠(SDS)溶液；1％(v/v)四甲基乙二胺(TEMED)；10％(w/v)过硫酸铵(AP)；

样品溶解液：2％(w/v)SDS，5％(v/v)巯基乙醇，10％(v/v)甘油，0.02％(w/v)溴酚蓝，0.01mol/LpH8.5Tris-HCl缓冲液；

凝胶贮液：30g丙烯酰胺(Acr)+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用去离子水定容至100ml，过滤，避光，4℃可保存一个月。

分离胶配方：6.22mL单体(30％(w/v)丙烯酰胺，0.8％(w/v)交联剂)，5.0mLbuffer(3MTris，0.3％(w/v)SDS，pH8.45)，2.38mL蒸馏水，2.0mL甘油，50μL10％(w/v)AP，10μLTEMED；

浓缩胶配方：1.62mL单体，3.10mLbuffer，7.78mL蒸馏水，45μL 10％(w/v)AP，15μLTEMED；

凝胶缓冲液：分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液(3.0mol/L0.3％(w/v)pH8.45 Tris-HCI缓冲液)；

电极缓冲液(PH 8.3)：Tris 30.3g+甘氨酸188g+SDS10g定容至1000mL，使用时10倍稀释。

脱色液：冰醋酸80mL，乙醇250mL，加入蒸馏水定容至1000mL。

染色液：考马斯亮蓝R250 0.29g，加250mL脱色液。

电泳结果如图2所示，玉米赤霉烯酮降解酶LD08能在E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-ld08菌株中大量的诱导表达，出现一条明显的蛋白条带(29kDa位置)。从SDS-PAGE电泳染色图片的条带的浓度上可以推算，重组表达蛋白占细胞总蛋白的80％左右。

(4)表达产物降解玉米赤霉烯酮的测试

用步骤(2)得到的LD08纯酶液进行降解玉米赤霉烯酮的测试，对于分离纯化的酶，我们直接将其用于ZEN的催化降解反应来测定其酶活力。用于活力测定的酶被稀释成1mg/mL的酶溶液备用。用于反应的体系含有10μL的1mg/mL ZEN乙腈溶液，2μL酶溶液(1mg/mL)，和488μL的PBS。反应在37℃下进行20min，随后加入500μL的甲醇终止反应(关于反应时间的选择，将在反应速率的结果中进行讨论)。反应后的溶液用HPLC测定ZEN浓度。

HPLC分析条件如下：检测器为戴安紫外检测器，色谱柱为C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，紫外吸收波长为254nm，柱温30℃，流动相为60％vol的乙腈水溶液(超纯水)，流速1.0mL/min，进样量10μL。此外还将绘制玉米赤霉烯酮含量-峰面积的标准曲线。通过配制不同浓度梯度的玉米赤霉烯酮标准品，经过0.45μm孔径的滤膜过滤处理后上样进行玉米赤霉烯酮残余量的检测。结果表明原核重组表达的LD08纯酶液可在20min左右降解100％的玉米赤霉烯酮，如图1、4中所示。

实施例5玉米赤霉烯酮降解酶的特性测定

取实施例4步骤(2)得到的LD08纯酶液2μL(1mg/mL)置于1.5mL离心管中，加入10μL(1mg/mL，溶解于乙腈)的ZEN溶液，并添加磷酸盐缓冲液488μL，混合均匀，得到混合液。

①反应时间对酶活性的影响

将上述混合液于37℃、pH 7的条件下进行反应，分别在反应5min、10min、20min时取反应的样品20μL并添加20μL的甲醇终止反应，后将混合液进行高效液相色谱检测ZEN的残留。结果如图4所示。

通过图4的结果可知，反应10min，ZEN的降解率达60％以上。因此，后续实验中以10min作为反应时间。

②温度对酶活性的影响

将5份上述混合液分别于30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，pH值为7的条件下反应10min后，加入500μL甲醇终止反应，取反应后的样品20μL进行高效液相色谱检测ZEN的残留。结果如图5所示，随着温度的升高，LD08的降解能力减弱。

③pH对酶活性的影响

将7份上述混合液分别于37℃下，pH值为4、5、6、7、8、9和10的条件下反应10min，加入500μL甲醇终止反应，取反应后的样品20μL进行高效液相色谱检测ZEN的残留。结果如图6所示，LD08酶在pH6-9均具有较好的降解稳定性，而研究最为普遍的ZHD101在pH8以下降解活性即受到较大的影响。

④金属离子对酶活性的影响

将7份上述混合液分别于37℃下，其中6份分别添加终浓度为1mM的Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺条件下反应10min，加入500μL甲醇终止反应，取反应后的样品20μL进行高效液相色谱检测ZEN的残留。结果如表1所示，Ca²⁺对LD08的降解活性无影响，Mn²⁺、Mg²⁺对LD08的影响较小，而Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺对LD08的降解活性具有较强的抑制作用。

表1金属离子对酶活性的影响

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种玉米赤霉烯酮降解酶及其应用

<130> xb19041502

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(801)

<400> 1

cat atg acc acc cgt acc cgc aaa gtt gtg gcc acc cgc gaa ggc atc 48

His Met Thr Thr Arg Thr Arg Lys Val Val Ala Thr Arg Glu Gly Ile

1 5 10 15

aaa tgg cat gtg gag caa gaa gga agc ggc ccg gat atc gtt ctg gtg 96

Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Val

20 25 30

ccg gat ggt tta ggc gaa tgc cag atg ccc gac aaa cag ctg agc atg 144

Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Pro Asp Lys Gln Leu Ser Met

35 40 45

att gcc gcc agc ggc ttc cgc gtg acc acc ttt gat atg ccg ggc atg 192

Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

agt cgc agc aaa gtt gcc ccg ccg gag acc tat caa gaa atc acc ggc 240

Ser Arg Ser Lys Val Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Glu Ile Thr Gly

65 70 75 80

cac aaa ctg gcc acc ttt gtg gat ggt tta ctg gaa gag ctg aat atc 288

His Lys Leu Ala Thr Phe Val Asp Gly Leu Leu Glu Glu Leu Asn Ile

85 90 95

tgg atg gcc agc ttt tgg ggg tgc agc agc ggt gga agc acc gtt ctg 336

Trp Met Ala Ser Phe Trp Gly Cys Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Leu

100 105 110

gca ctg tgc gcc gca ttt ccc gat cgc gtg cgt aat gca atg ccg cat 384

Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Asp Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

gag ctg ccg acc aag aat ccg gaa gcc atc acc gac atc cat gag aag 432

Glu Leu Pro Thr Lys Asn Pro Glu Ala Ile Thr Asp Ile His Glu Lys

130 135 140

gat ccg gcc gaa att acc cgt gat atg gaa gcc acc acc aaa gcc atg 480

Asp Pro Ala Glu Ile Thr Arg Asp Met Glu Ala Thr Thr Lys Ala Met

145 150 155 160

agc ggt agt gtg gaa gct tgg gat gca ctg ggt ccc gaa gtg cat gcc 528

Ser Gly Ser Val Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala

165 170 175

cgt tta cgc gat aac tac gtt cgc tgg gcc tat ggt tac ccg gca aca 576

Arg Leu Arg Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro Ala Thr

180 185 190

atc ccg gcc agc gcc ccg aga aaa ccc gaa gat ctg cat aaa cgc ccg 624

Ile Pro Ala Ser Ala Pro Arg Lys Pro Glu Asp Leu His Lys Arg Pro

195 200 205

gtg gat tgg acc gtt ggt ggc ggt acc cct acc gca ttc ttt ttt gat 672

Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Phe Phe Asp

210 215 220

aac att gtg att gcc gtg aag gaa ggt tta aac att ggt ctg ctg ccg 720

Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

ggc agc cat ttt ccg tat gtg agc cac ccc gaa gtg ttc gcc aaa cac 768

Gly Ser His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Val Phe Ala Lys His

245 250 255

gtg gtg gaa act tgc cag aaa tat acc ctc gag 801

Val Val Glu Thr Cys Gln Lys Tyr Thr Leu Glu

260 265

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

His Met Thr Thr Arg Thr Arg Lys Val Val Ala Thr Arg Glu Gly Ile

1 5 10 15

Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Val

20 25 30

Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Pro Asp Lys Gln Leu Ser Met

35 40 45

Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Val Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Glu Ile Thr Gly

65 70 75 80

His Lys Leu Ala Thr Phe Val Asp Gly Leu Leu Glu Glu Leu Asn Ile

85 90 95

Trp Met Ala Ser Phe Trp Gly Cys Ser Ser Gly Gly Ser Thr Val Leu

100 105 110

Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Asp Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

Glu Leu Pro Thr Lys Asn Pro Glu Ala Ile Thr Asp Ile His Glu Lys

130 135 140

Asp Pro Ala Glu Ile Thr Arg Asp Met Glu Ala Thr Thr Lys Ala Met

145 150 155 160

Ser Gly Ser Val Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala

165 170 175

Arg Leu Arg Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro Ala Thr

180 185 190

Ile Pro Ala Ser Ala Pro Arg Lys Pro Glu Asp Leu His Lys Arg Pro

195 200 205

Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Phe Phe Phe Asp

210 215 220

Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro

225 230 235 240

Gly Ser His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Val Phe Ala Lys His

245 250 255

Val Val Glu Thr Cys Gln Lys Tyr Thr Leu Glu

260 265

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶在玉米赤霉烯酮降解中的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述玉米赤霉烯酮降解酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建包含玉米赤霉烯酮降解酶基因的重组菌；

(3)纯化粗酶液，获得纯酶液；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，重组菌构建方式为：PCR扩增玉米赤霉烯酮降解酶基因，获得PCR产物；用NdeI和XhoI分别双酶切PCR产物和pET-30a(+)载体，将酶切后的PCR产物纯化，并用T4DNA连接酶连接到pET-30a(+)载体中，获得重组载体pET-30a(+)-LD08，将重组载体转入感受态大肠杆菌E.coLiBL21(DE3)中，涂布于固体LB培养基上培养，挑取单菌落，接种于含硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，筛选阳性转化子，即为重组菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，粗酶液诱导表达方法为：用含硫酸卡那霉素的LB培养基培养重组菌，OD600值达到0.6后，添加IPTG继续培养后，将液体培养物离心，弃上清，得到重组菌沉淀物；使用磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，超声波细胞破碎仪对细胞进行破碎，离心，除去细胞残渣，收集上清液，即为重组表达的粗酶液。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，将粗酶液置于冰上，根据表达出的重组酶含有His-tag标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化，缓冲液洗脱收集目的蛋白，以获得纯化的酶液。