CN101381688A

CN101381688A - 一种能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂的制备方法

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Publication number: CN101381688A
Application number: CNA2008101226724A
Authority: CN
Inventors: 徐剑宏; 史建荣; 陆琼娴; 祭芳
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-06-18
Also published as: CN101381688B

Abstract

本发明涉及一种能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂的制备方法，其特征在于：该菌株的保藏号为CCTCC M 208087，其生物学特性为细胞短杆状，无芽孢，革兰氏阴性，在TSA培养基上菌落呈象牙色，好氧；接触酶阳性，氧化酶阴性，尿酶阳性，吲哚反应阴性，能水解七叶灵，不能双水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明胶，该菌株能利用葡萄糖，不能利用L－阿拉伯糖、D－甘露糖、麦芽糖；该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为EU794908，以及利用所述菌株的制备液体菌剂、固体菌剂和霉菌毒素去毒剂的方法。

Description

一种能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种能降解毒素的菌株及其制剂的制备方法，尤其是一种能对霉菌毒素降解的菌株及其应用。

背景技术

真菌毒素是由植物病原真菌侵染谷类作物后产生的一类具有广泛化学结构的有毒次级代谢产物，对人和动物具有广泛的毒性作用，能引起人和动物癌症、肝毒性等各种症状。目前已知能产生霉菌毒素的霉菌就有150余种，霉菌毒素约有300种。其中在饲料卫生上比较重要的霉菌毒素大部分来源于曲霉菌属(Aspergilus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)等。而由这些霉菌可以产生包括黄曲霉素、棕曲霉素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、T-2毒素、伏马菌素等许多霉菌毒素。据估计，每年全世界有25％的粮食作物受到霉菌毒素的污染。联合国粮农组织估算，全世界每年由此造成的经济损失可达数千亿美元。因此，农产品中霉菌毒素的污染问题己成为不可忽视的问题。

而对于那些已被毒素污染的农产品的处理主要采取的还是物理或者化学的方法，如：分离霉变的谷物，加入未污染的产品进行混合以达到稀释毒素的效果，加入吸附剂，如：硅铝酸盐、沸石、膨润土、活性炭、硅藻土等，或者是用一些碱性化合物，如氨水，氢氧化钠和氢氧化钙等来处理毒素。虽然所有的这些都在一定程度上对减轻毒素污染有一定的作用，但其最大的不足是：去毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等。因此该领域有关人士认为脱毒的最佳方法是生物脱毒，即在温和条件下，不用有害的化学药品，不会造成营养价值的丢失，也不会降低适口性，而使真菌毒素脱毒。由于微生物数量大、种类多，基因资源丰富，降解有机污染物的潜力很大，几乎所有导致环境污染的有机物都能被微生物所分解，而且干净彻底、无二次污染。因此，微生物去毒是目前消除毒素污染的最好办法。

我国是一个植物病害的重发区，而且在农产品的晾晒和储备方面的设备和技术还是比较落后，这就造成我国农产品中的毒素含量偏高，毒素的存在除了严重危害粮食的产量和品质，对人畜的健康，造成严重威胁以外，还限制着我国农产品的出口贸易。对于毒素的处理国内还没有切实可行的方法，市场上一些去毒素产品：如：天然霉菌毒素吸附剂，微生物去毒剂等也是从国外进口的。进口产品的高昂价格阻碍了这些产品的广泛应用。

上世纪八十年代开始欧美等国家就开始研究用方便、快速、灵敏的免疫检测技术来检测农产品中的毒素，而九十年代开始就研究用生物的方法对毒素进行处理，如：用微生物和酶制剂处理毒素，从而降低或者是完全去除农产品中毒素的危害。

单端孢霉烯族真菌毒素(Trichothecene mycotoxins简称Ts)是由生长在植物上的半知真菌(Fungi Imperfecti)类多种产毒真菌，在特定条件下所产生的一类有相同基本化学结构的毒性代谢产物。这类毒素共包括了近100种化合物，它们的基本结构是具有四环状12，13一环氧单端孢烯族化合物骨架结构。恨据其化学结构的不同，一般将这类毒素分为A，B，C，D四类，其中主要几种毒素包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，T-2毒素，雪腐镰刀菌烯醇(NIV)，镰刀菌烯酮等毒素。Ts在自然界中污染十分广泛，对人畜健康危害较大。

在粮食作物生长的任何地区，在一定的条件下，植物会遭到多种真菌的侵害。尽管真菌的存在不是决定Ts存在的唯一指标.但由于其与Ts的产生有关，因而真菌的存在是判断毒素存在最常用的指标。另外，T-2毒素和4.15一二醋酸草镰刀菌烯醇(DAS)被认为是所谓“黄雨”化学战剂的组分，因而引起了国际间广泛的注意。在天然农产品中基本上都能检测到Ts的存在，含量大多在0～10ppm之间。这些毒素的存在会引起人和动物产生头疼，恶心，呕吐，出血，白细胞缺乏，咽炎，皮肤坏死，严重的会引起休克和死亡。Ts之所以会产生如此严重的危害主要是因为Ts对机体各组织器官具有广泛的生物效应，主要包括免疫系统、造血系统、消化系统和心血管系统。破坏分裂旺盛的组织器官，如淋巴结、胸腺、胃肠道、骨髓、脾脏、睾丸和卵巢。作用机制一般认为是抑制蛋白蛋和DNA的合成。蛋白质合成效率高的细咆，如胃肠道和淋巴细胞对Ts更为敏感。Ts的次要细咆毒性应包括引起DNA断裂，增加膜的脆性以及影响能量代谢等。Ts具有弱的致畸性和致癌性。免疫抑制和组织坏死比DNA损伤更为重要。Ts对胃肠道和淋巴器官的毒性效应类似于放射性损伤，但毒性效应范围更为广泛，心脏和胰脏也是靶器官。

综上所述，为了保障我国人们的食品安全和身体健康，并保证农产品的顺利出口，有必要分离筛选高效降解毒素的菌株，研究其生物学特性，降解特性以及对毒素的解毒机理，并且把降解菌株和适当的材料结合，选择合适的剂型，制成霉菌毒素去毒剂，进一步研究霉菌毒素去毒剂作为饲料添加剂和植物抑菌去毒剂的去毒效果。最终为解决饲料中毒素污染问题，提高粮食的使用效率，保证畜牧业的安全生产，并对粮食产量和食品质量安全控制起到很大的推动作用。

发明内容

本发明的目的在于：针对粮食生产和饲料加工和保存过程中霉菌毒素广泛污染的问题，开发研制出能对霉菌毒素降解的菌株及其制剂。

本发明的目的是这样实现的：一种能对霉菌毒素降解的菌株，其特征在于：该菌株的保藏号为CCTCC M 208087，其生物学特性为细胞短杆状，无芽孢，革兰氏阴性，在TSA培养基上菌落呈象牙色，好氧；接触酶阳性，氧化酶阴性，尿酶阳性，吲哚反应阴性，能水解七叶灵，不能双水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明胶，该菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麦芽糖；该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为EU794908。

在本发明中，所述的霉菌毒素包括单端孢霉烯族毒素，或黄曲霉毒素，或玉米赤霉烯酮。

一种利用权利要求1所述菌株的制剂的制备方法，其特征在于：

a)将菌株原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得试管种备用；

b)将试管种置于摇瓶培养基中振荡培养至对数期，获得菌种；

c)将上述培养好的菌种接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；

e)将获得的种子液接种入生产罐发酵培养，出罐形成能对霉菌毒素降解的液体菌剂。

在上述能对霉菌毒素降解的菌株的制备方法中，摇瓶、种子罐和生产罐所用的培养基为：葡萄糖1.0％，(NH₄)₂SO₄0.1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄0.02％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，蛋白胨0.05％，蒸馏水适量；培养基的pH值7.2～7.5。

在上述能对霉菌毒素降解的菌株的制备方法中：所述的培养基需要121℃高压湿热灭菌后冷却至30～35℃使用；所述的菌种按种子罐中培养基的10％接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中培养基的10％接种量接种入生产罐。

在上述能对霉菌毒素降解的菌株的制备方法中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6～1.2，搅拌速度为180～240转/分，培养温度为30～35℃，发酵结束后菌体数量至少达到10亿个/ml。

在上述能对霉菌毒素降解的菌株的制备方法中，将获得的能对霉菌毒素降解的液体菌剂采用泥炭吸附形成固体菌剂剂型，或者将能对霉菌毒素降解的液体菌剂与粘土拌匀，制成霉菌毒素去毒剂。

本发明的优点在于：利用A16降解霉菌毒素，在解决毒素污染的过程中，不存在二次污染，从而提高农产品的质量，确保人畜的食用安全；A16具有较广的降解谱，能降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol)，镰刀菌烯酮-X(fusarenon-X)，黄曲霉毒素B1，其除毒效果均达90％以上，对玉米赤霉烯酮也有明显的除毒效果；使用A16菌株生产降解真菌毒素的各种制剂，具有生产使用成本低，使用安全的优势。

具体实施方式

实施例1

A16的获得

从江苏农科院的小麦地里采集土样，在实验室中用脱氧雪腐镰刀菌烯醇进行多次传代富集培养(30℃，每周传代一次)，得到能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的菌悬液，把菌悬液在LB培养基上进行涂布培养(30℃，7d)，在平板上挑取不同的菌落，一一验证对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的降解效果，最终获得能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇的菌株，加入甘油，在-70℃冰箱保存。对于该菌株自定义为A16。

通过测定A16的生理生化特性，克隆A16的16SrDNA序列并对该16SrDNA序列进行测序，把测序结果在Genbank进行BLAST比较，确定了A16的系统发育进化地位。通过A16的生理生化特征结果和系统发育进化地位的结果，最终把A16鉴定为德沃斯氏菌(Devosia insulae)，并于2008年6月我们首次将A16的16S rDNA登陆到Genbank，登陆号为EU794908。

2008年6月10日我们将A16寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 208087，分类命名为：Devosia insulae A16，主要生物学特性为为细胞短杆状，无芽孢，革兰氏阴性，在TSA培养基上菌落呈象牙色，好氧。接触酶阳性，氧化酶阴性，尿酶阳性，吲哚反应阴性，能水解七叶灵，不能双水解精氨酸，，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明胶，该菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麦芽糖。

实施例2

液体菌剂的制备

培养基为：葡萄糖1.0％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄ 0.02％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，蛋白胨0.05％，其余为蒸馏水；培养基的pH值7.2～7.5。

将A16菌株在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上获得试管种备用。

将试管种接种于含200mL LB的1000mL摇瓶中，30℃恒温振荡培养至对数期，获得菌种。

采用500升的种子罐，培养基投料量400升，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至35℃以下后，将上述培养好的菌种按种子罐中培养基的10％接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液，期间：搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：0.8，培养时间约48～60小时。

生产罐容量为5吨，培养基投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，将种子液按生产罐中培养基的10％接种量接种入生产罐发酵培养，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.8—1.0，搅拌速度为240转/分，培养时间约48～60小时，出罐后形成能对霉菌毒素降解的液体菌剂。

实施例3

固体菌剂的制备

将实施例2生产出来的A16液体菌剂与晒干的泥炭混匀成固体状，从而制成A16的固体菌剂。所述的泥炭由黑龙江桦美泥炭有限公司提供。

实施例4

霉菌毒素去毒剂的制备

将实施例2 获得的液体菌剂与市场上购买的粘土按照1：5的重量比混合制成霉菌毒素去毒剂。

实施例5

A16制剂对部分单端孢霉烯族毒素降解效果

培养基为：(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄0.02g/L，NaCl 0.5g/L，毒素：10mg/L，蒸馏水适量；培养基的pH值7.0。在培养基中分别加入的毒素是：DON、3-AcDON、nivalenol和fusarenon-X(在本试验中使用的DON、3-AcDON、nivalenol和fusarenon-X均从Sigma公司购买)

将含有毒素的培养基分成对照组和试验组，将实施例2获得的液体菌剂按照5％的接种量分别接入加入试验组中含有不同种毒素的培养基中，对照组和试验组置于30℃，180r/min，摇床培养48小时后分别取样，采用高效液相色谱法进行毒素含量的检测，并计算得出A16对不同毒素的降解率，结果如表1。

表1：Devosia insulae A16对不同单端孢霉烯族毒素的降解性

实施例6

A16制剂对部分霉菌毒素降解效果

将饲料分成对照组和试验组，将实施方案4制成的霉菌毒素去毒剂按照5％的比例加入到试验组饲料中，混匀，将对照组和试验组均按1：1的比例加入蒸馏水，37℃作用2小时后，分别过滤，取上清液，用液相色谱方法检测上清液中DON毒素，黄曲霉毒素B1，玉米赤霉烯酮的含量，并进行计算得出A16制剂对不同种毒素的去毒效果，结果如表2。

表2：霉菌毒素去毒剂对霉菌毒素的去毒效果

Claims

1、一种能对霉菌毒素降解的菌株，其特征在于：该菌株的保藏号为CCTCC M 208087，其生物学特性为细胞短杆状，无芽孢，革兰氏阴性，在TSA培养基上菌落呈象牙色，好氧；接触酶阳性，氧化酶阴性，尿酶阳性，吲哚反应阴性，能水解七叶灵，不能双水解精氨酸，不能水解酪素，不能水解淀粉，不能分解酪氨酸，不能液化明胶，该菌株能利用葡萄糖，不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露糖、麦芽糖；该菌株16SrDNA的Genbank登陆号为EU794908。

2、根据权利要求1所述的能对霉菌毒素降解的菌株，其特征在于：所述的霉菌毒素包括单端孢霉烯族毒素，或黄曲霉毒素，或玉米赤霉烯酮。

3、一种利用权利要求1所述菌株的制剂的制备方法，其特征在于：

b)将试管种置于含有培养基的摇瓶中振荡培养至对数期，获得菌种；

e)将获得的种子液接入生产罐发酵培养，出罐形成能对霉菌毒素降解的液体菌剂。

4、根据权利要求3所述制剂的制备方法，其特征在于：摇瓶培养基、种子罐和生产罐所用的培养基为：葡萄糖1.0％，(NH₄)₂SO₄ 0.1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄ 0.02％，NaCl 0.01％，CaCO₃ 0.3％，蛋白胨0.05％，蒸馏水适量；培养基的pH值7.2～7.5。

5、根据权利要求4所述制剂的制备方法，其特征在于：所述的培养基需要121℃高压湿热灭菌后冷却至30～35℃使用；所述的菌种按种子罐中培养基的10％接种量接种入种子罐；所述的种子液按生产罐中培养基的10％接种量接种入生产罐。

6、根据权利要求3或4或5所述制剂的制备方法，其特征在于：在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6～1.2，搅拌速度为180～240转/分，培养温度为30～35℃，发酵结束后菌体数量至少达到10亿个/ml。

7、根据权利要求6所述制剂的制备方法，其特征在于：将获得的能对霉菌毒素降解的液体菌剂采用泥炭吸附，形成固体菌剂。

8、根据权利要求6所述制剂的制备方法，其特征在于：将获得的能对霉菌毒素降解的液体菌剂与吸附剂拌匀，制成霉菌毒素去毒剂。