CN109251933B

CN109251933B - 一种与镰刀菌毒素及有毒醛类脱毒相关基因akr18a1及其应用

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Publication number: CN109251933B
Application number: CN201710569950.XA
Authority: CN
Inventors: 廖玉才; 何伟杰; 李和平; 袁青松; 郭茂伟; 易沭远
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN109251933A

Abstract

本发明公开了一种与镰刀菌毒素及有毒醛类化合物脱毒相关基因AKR18A1及其应用，所述基因AKR18A1的序列为SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸包含醛酮还原酶的保守的特征结构元件，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。通过原核表达基因AKR18A1获得纯化的蛋白，体外实验证实该纯化的蛋白可以氧化脱氧雪腐镰刀菌烯醇，形成3‑酮基‑脱氧雪腐镰刀菌烯醇；同时，该蛋白还可作用于玉米赤霉烯酮及其衍生物α‑玉米赤霉烯醇和β‑玉米赤霉烯醇，并能有效降解有毒醛类化合物乙二醛和甲基乙二醛。

Description

一种与镰刀菌毒素及有毒醛类脱毒相关基因AKR18A1及其应用

技术领域

本发明属于真菌毒素及有毒醛类化合物脱毒领域，具体涉及一种分离、克隆的AKR18A1基因，该基因编码的蛋白质被证实能够作用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，将其氧化形成3-酮基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-oxo-DON)，同时可将玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)还原产生α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol，α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol，β-ZOL)，此外还可以将α-ZOL和β-ZOL氧化形成ZEN。该基因编码的蛋白质还具有降解有毒醛类物质乙二醛和甲基乙二醛的作用，含基因AKR18A1的大肠杆菌对两种醛类物质的耐受性显著提高。

背景技术

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是一种广泛分布的真菌毒素，主要由镰刀菌属真菌产生。这些产毒真菌在田间侵染小麦、大麦、玉米等禾谷类作物的小花组织，并定植在发育的籽粒上，因此，这些真菌产生的毒素会直接积累在成熟的谷物中，从而进入下游产品，比如面粉、牛奶、啤酒及动物饲料等(Bai,G.,and Shaner,G.Management and resistance inwheat and barley to Fusarium head blight.2004.Annu Rev Phytopathol 42:135-161.)。DON毒素耐高温，加热不易降解，可在食物链中长期存留，严重危害人畜健康。摄食DON污染的食物会导致人的免疫力低下、贫血、头痛、恶心及腹痛等，动物摄食后可导致拒食、呕吐、生长阻滞及生殖紊乱等(Pestka,J.J.Deoxynivalenol:mechanisms of action,human exposure,and toxicological relevance.2010.Arch Toxicol 84:663-679.)。同时DON作为一种毒力因子，能够促进镰刀菌在小麦穗部的扩散从而加重赤霉病病症(Bai等,Deoxynivalenol-nonproducing fusarium graminearum causes initial infection,butdoes not cause disease spread in wheat spikes.2002.Mycopathologia.153:91-98)。由于我国农业生态环境及耕作制度引起的镰刀菌毒素污染面大，已发生多起人误食受镰刀菌毒素污染面粉而中毒的事件。

利用微生物靶向改变DON毒性基团的生物脱毒方法是目前毒素降解研究的热点及研究发展方向，这种方法相对于物理脱毒及化学脱毒方法，特异性强，不会影响谷物的品质和营养，也不会带来二次污染，对环境安全；同时，自然界微生物资源丰富，因此，开发利用微生物资源来进行镰刀菌毒素的生物脱毒，具有重要的意义和应用前景。目前已有几个具有生物脱毒活性的微生物菌株被分离，它们能够靶向改变DON的毒性基团从而大大降低DON的毒性(Karlovsky,P.Biological detoxification of the mycotoxin deoxynivalenoland its use in genetically engineered crops and feed additives.2011.ApplMicrobiol Biotechnol 91:491-504.)。包括Agrobacterium Rhizobium E3-39在内的一些菌株能够将DON转化为3-oxo-DON，后者的免疫抑制毒性是前者的1/10(shima等,Noveldetoxification of the trichothecene mycotoxin deoxynivalenol by a soilbacterium isolated by enrichment culture.1997.Appl Environ Microbiol 63:3825-3830.)。Devosia sp.17-2-E-8等菌株能够将DON转化为3-异构-DON(3-epi-DON)，后者的毒性是相对于DON的下降了1181倍(He等,Toxicology of 3-epi-deoxynivalenol,adeoxynivalenol-transformation product by Devosia mutans 17-2-E-8.2015.FoodChem Toxicol 84:250-259.)。sphingomonas sp.KSM1菌株能够降解DON产生16-羟基-DON(16-HDON)，后者的植物毒性是DON的1/10(Ito等，Bacterial cytochrome P450systemcatabolizing the Fusarium toxin deoxynivalenol.2013.Appl Environ Microbiol79:1619-1628.)。然而，在这些能够将DON转化形成3-oxo-DON/3-epi-DON的脱毒菌株中，是什么基因起作用至今未见报道。

玉米赤霉烯酮是一类由镰刀菌属真菌产生的非甾醇、类雌激素样真菌毒素，广泛存在于镰刀菌污染的玉米、高粱等谷物中，是世界范围内污染严重的一种镰刀菌毒素。玉米赤霉烯酮具有很强的生殖毒性，在猪，羊等其他家畜中引起生殖紊乱，给养殖业带来很大的损失(Zinedine等，Review on the toxicity,occurrence,metabolism,detoxification,regulations and intake of zearalenone:An oestrogenic mycotoxin.2007.Food ChemToxicol 45:1-18.)。乙二醛和甲基乙二醛属于含羰基化合物，体内多种代谢路径均可产生，而这些醛类在体内大量的积累对细胞具有毒害作用，GO可与蛋白质或者DNA相互作用，破坏蛋白质功能，增加基因突变频率；高水平的MG可以抑制细胞增殖，还可以引起蛋白降解等(Turóczy等，Overproduction of a rice aldo-keto reductase increases oxidativeand heat stress tolerance by malondialdehyde and methylglyoxaldetoxification.2011.Plant Mol Biol75:399-412.)。因此，开发一种能够有效控制镰刀菌毒素及有毒醛类化合物的方法，对于食品、饲料及环境安全及农业病害防治都是至关重要的。

醛酮还原酶(Aldo-keto reductases,AKRs)是一个包括17个家族190多个成员的超家族，广泛分布于原核生物、原生动物、酵母、植物、动物以及人类。不同家族成员之间的氨基酸序列同源性低于40％，而同一家族内的不同成员之间氨基酸序列同源性高于60％。大多数AKR以单聚体形式存在，分子量在34-37kDa之间。这些酶具有多种多样的功能，多种研究表明它们参与了生物体内内源和外源有毒物质的代谢过程。有报道称，几个来源于不同组织的醛酮还原酶能够有效的对一系列脂质过氧化或者糖酵解衍生的有毒醛类物质(如甲基乙二醛等)进行脱毒(Turóczy等，Overproduction of a rice aldo-keto reductaseincreases oxidative and heat stress tolerance by malondialdehyde andmethylglyoxal detoxification.2011.Plant Mol Biol 75:399-412.)。来源于人和小鼠的AKR7A相关成员参与了体内的黄曲霉代谢过程，保护机体免受黄曲霉诱导的肝脏毒性(Penning,The aldo-keto reductases(AKRs):Overview.2005.Chem Biol Interact 234:236-246.)。然而AKR超家族成员是否对镰刀菌毒素具有脱毒活性的研究还未见报道。发明人从土壤中分离获得一株具有脱毒活性的鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas sp.)的细菌菌株S3-4，对其进行基因组测序及基因组BAC文库构建，通过基因组比较以及功能筛选BAC文库得到一个醛酮还原酶基因A1，通过原核表达的融合蛋白体外转化实验表明，该基因能够转化DON产生3-oxo-DON，同时可将玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)还原产生α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol，α-ZOL)和β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol，β-ZOL)，该基因编码的蛋白质还具有降解有毒醛类物质乙二醛和甲基乙二醛的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从脱毒菌株(sphingomonas sp.)S3-4中分离克隆的基因AKR18A1，核苷酸序列如SEQ NO.1所示，长度为1032bp，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的在于提供一种基因AKR18A1的制备方法，利用所述的特异性引物进行PCR扩增，获得AKR18A1的基因序列，操作简单，产物特异。

本发明的再一个目的在于提供基因AKR18A1或其编码的蛋白质在氧化脱氧雪腐镰刀菌烯醇、催化玉米赤霉烯酮及其衍生物、降解有毒醛类化合物乙二醛和甲基乙二醛中的应用，此为首次克隆具有氧化DON形成3-oxo-DON功能的基因，基因作用产物结构明确，毒性相对于原型毒素显著性降低，为植物中镰刀菌防治和食品/饲料中毒素脱毒提供了材料。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种与镰刀菌毒素及有毒醛类脱毒相关基因AKR18A1，通过下述方式获得：

以降解菌株S3-4的基因组DNA为模板进行PCR扩增，正向引物为5′-GGAATTCGATGCGCTACAACCGGCTCGGCCG-3′，反向引物为5′-CCCAAGCTTGCGCCGCGGCGACGGGCCG-3′，获得基因AKR18A1，其序列为SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白质的序列为SEQ ID.2所示。

基因AKR18A1或其编码的蛋白质在氧化脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用：

通过原核表达获得基因AKR18A1的编码蛋白，将已纯化的AKR18A1蛋白与DON在缓冲液中进行反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的DON含量。结果表明，蛋白AKR18A1能够在NADP⁺辅酶的作用下将DON氧化形成3-oxo-DON，反应体系的pH值为7-11，最适pH值为10.6，反应温度为10-50℃，最适温度为45℃。

基因AKR18A1或其编码的蛋白质在催化玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用：

通过原核表达获得基因AKR18A1的编码蛋白，将已纯化的AKR18A1蛋白与ZEN，α-ZOL，β-ZOL在缓冲液中进行反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的底物含量。结果表明，蛋白AKR18A1能够在NADH辅酶的作用下将ZEN还原形成α-ZOL和β-ZOL；此外，蛋白AKR18A1能够在NADP⁺辅酶的作用下分别将α-ZOL和β-ZOL氧化形成ZEN。

基因AKR18A1或其编码的蛋白质在降解有毒醛类化合物乙二醛和甲基乙二醛中的应用：

通过原核表达获得基因AKR18A1的编码蛋白，将已纯化的AKR18A1蛋白与乙二醛(GO)和甲基乙二醛(MG)在缓冲液中进行反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的底物含量。结果表明，蛋白AKR18A1能够在NADPH辅酶的作用下催化降解GO和MG，含基因AKR18A1的大肠杆菌对两种醛类物质的耐受性显著提高。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1)此为首次克隆具有氧化DON形成3-oxo-DON功能的基因。该基因克隆操作简单，产物特异，该基因编码的蛋白质在原核细胞中易于表达，融合蛋白可溶性好，适用于大规模生产；

2)该基因编码的蛋白质能够有效的作用于DON毒性基团，形成3-oxo-DON，3-oxo-DON的毒性相对于DON显著性降低，表明该基因或者蛋白在毒素脱毒方面具有较大潜力；

3)该基因编码的蛋白质能够有效的作用于玉米赤霉烯酮及其衍生物，还可作用于GO、MG等有毒醛类物质，表明该基因或者蛋白在多种真菌毒素及醛类物质脱毒方面具有较大潜力。

附图说明

图1：采用PROMALS3D多序列结构比对服务(公开使用网站)对AKR18A1基因与其他不同家族代表性AKR基因序列比对分析结果

表明AKR18A1基因含有醛酮还原酶的保守结构域。h代表保守结构域α-螺旋，e代表保守结构域β-折叠。灰色背景标注的是四元氨基酸催化位点(Asp-57,Tyr-62,Lys-90,andHis-131)。AKR3F1(NCBI No.F72218)来自海栖热袍菌(Thermotoga maritime)；AKR5B1(NCBI No.Q02198)来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；AKR9C1(NCBI No.AAB71807)来自沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)；AKR10A1(NCBI No.AAD28516)来自布鲁链霉菌(Streptomyces bluensis)；AKR11A1(NCBI No.P46336)来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；AKR12A1(NCBI No.AAD41821)来自弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)；AKR13B1(NCBI No.AAF84538)来自苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)；AKR14A1(NCBINo.AAA69168)来自埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)；AKR15A1(NCBI No.BAC97800)来自浅黄细杆菌(Microbacterium luteolum)；AKR18A1(NCBI No.KY575150)来自鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)。

图2：采用MEGA 6.0(公开使用软件)分析AKR18A1基因与其他已分类的细菌AKR基因之间的亲缘关系。

图3：原核表达载体pET22b-AKR18A1的构建示意图。将AKR18A1全长基因经酶切连接反应插入多克隆位点后的情况。

图4：原核表达和纯化的AKR18A1蛋白SDS-PAGE检测结果

M：分子量标记，1：IPTG诱导表达之后的大肠杆菌菌体破碎液；2：IPTG诱导表达之后的大肠杆菌菌体破碎液中可溶性蛋白部分；3：纯化的AKR18A1蛋白。

图5：AKR18A1蛋白对DON的催化作用

A：纯化的AKR18A1蛋白与辅酶NADP⁺在体外催化DON形成3-oxo-DON的HPLC色谱图；B：pH值对AKR18A1蛋白催化DON活性的影响；C：温度对AKR18A1蛋白催化DON活性的影响；D：纯化的AKR18A1蛋白催化的DON的动力学参数。

图6：AKR18A1蛋白对ZEN、α-ZOL、β-ZOL的催化作用

虚线代表添加了纯化的AKR18A1蛋白，实线为不添加蛋白的对照。A：AKR18A1蛋白与辅酶NADH催化ZEN形成α-ZOL和β-ZOL的HPLC色谱图；B：AKR18A1蛋白与辅酶NADP⁺催化α-ZOL形成ZEN的HPLC色谱图；C：AKR18A1蛋白与辅酶NADP⁺催化β-ZOL形成ZEN的HPLC色谱图。

图7：AKR18A1蛋白对GO、MG的催化作用

虚线代表添加了纯化的AKR18A1蛋白，实线为不添加蛋白的对照。A：纯化的AKR18A1蛋白催化GO的HPLC色谱图；B：纯化的AKR18A1蛋白催化MG的HPLC色谱图。

图8：AKR18A1蛋白提高了E.coli BL21对GO和MG的耐受性

虚线代表包含pET22b-AKR18A1质粒的E.coli BL21，实线代表包含pET22b质粒的E.coli BL21。A：pET22b-AKR18A1质粒提高了E.coli BL21对GO的耐受性；B：pET22b-AKR18A1质粒提高了E.coli BL21对MG的耐受性。

具体实施方式

实施例1：目的基因AKR18A1的克隆和原核表达载体的构建及转化

目的序列克隆：以鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas sp.)降解菌S3-4(由课题组实验室提供)基因组DNA为模板，高保真酶KOD plus(购自Toyobo公司，日本)扩增目的基因片段。引物两端添加EcoR I and HindⅢ酶切位点，正向引物：5′-GGAATTCGATGCGCTACAACCGGCTCGGCCG-3′，反向引物：5′-CCCAAGCTTGCGCCGC GGCGACGGGCCG-3′。50μL反应体系：10×KOD buffer 5μL，25mmol/L MgSO₄ 2μL，2mmol/L dNTPs 5μL，10μmol/L primer各1.5μL，KOD plus(1U/μL)1μL，模板cDNA 1μL，甜菜碱：5μL，补ddH₂O至总体积50μL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃30s，68℃2min，35个循环；68℃延伸10min。对目的片段进行测序后进行序列比对，比对结果显示该序列含有醛酮还原酶特有的保守结构域(α/β)8-barrel元件及四元催化位点(图1)，说明该基因为醛酮还原酶基因，然而它与其他已分类的醛酮还原酶基因的同源性均低于40％，根据命名原则，这是一个新的家族，因此命名为AKR18A1。对所有细菌中已分类的醛酮还原酶基因进行进化关系分析，发现AKR18A1同AKR12家族的三个基因亲缘关系最近(图2)。

载体构建的测序：用EcoR I和HindⅢ(购自Takara公司，中国)对扩增的基因片段和原核表达载体PET-22b(购自Novagen公司，美国)进行双酶切。50μL反应体系：10×Mbuffer 5μL，质粒DNA或基因片段2-3μg，EcoR I 2μL，HindⅢ2μL，补ddH₂O至总体积50μL。37℃酶切6h。凝胶电泳检测酶切效果并回收所需的片段。用T4DNA连接酶(购自Transgen公司，中国)连接回收的pET-22b载体和基因片段。测序表明载体pET-22b-AKR18A1构建正确(图3)。

转化大肠杆菌：测序正确的pET-22b-AKR18A1载体通过热击转化法转化大肠杆菌BL21感受态细胞(购自Invitrogen公司，中国)(Sambrook等，分子克隆实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，用于AKR18A1蛋白表达。

实施例2：表达和纯化AKR18A1蛋白

蛋白的诱导表达：于LB液体培养基中培养含有pET-22b-AKR18A1载体的大肠杆菌BL21菌株，37℃摇床中(200r/min)至OD₆₀₀达到0.6左右；加入终浓度为0.4mM的IPTG(购自Sigma公司，美国)，置于16℃摇床中(140r/min)诱导培养12h。

蛋白的纯化：离心收集菌体，用适量的裂解缓冲液重悬菌体(按照1:20-1:40的比例)。剧烈涡旋振荡，充分溶解菌体。菌体破碎前按照1:100(v:v)加入100μM蛋白酶抑制剂PMSF，用高压细胞破碎仪将大肠杆菌细胞破碎。菌体破碎液16000r/min，离心30min，收集上清，全部通过Ni-NTA基质填充的蛋白纯化柱。加入20mL清洗缓冲液淋洗纯化柱，去除结合松弛的非目的蛋白。加入500μL洗脱缓冲液淋洗纯化柱3次，得到含有目的蛋白的组分。SDS-PAGE检测蛋白，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后分析蛋白条带。结果表明：AKR18A1蛋白在大肠杆菌BL21细胞中被IPTG诱导表达了，同时诱导表达的蛋白有一部分是可溶性的，将可溶性部分过柱纯化后得到条带单一的目的蛋白(图4)。

实施例3：纯化AKR18A1蛋白对DON的催化作用

将已纯化的AKR18A1蛋白与DON在缓冲液中进行反应，以反应体系中DON含量的变化计算纯化蛋白对DON的催化活性。在50μL反应体系中，包括6μg纯化蛋白，100μM DON，2mMNADP⁺，加缓冲液至总体积50μL。反应完成后加入等体积的甲醇结束反应，利用高效液相色谱(HPLC)检测溶液中的DON含量，HPLC分析系统组成：Agilent 1200半制备高效液相色谱主要组成：四元泵(1260Quat Pump VL)，自动进样器(1260ALS)，柱温箱(1260FCC)，紫外检测器(1260VWD)，馏分自动收集器(1260FC-AS)，分析色谱柱(Eclipse XDB-C18，4.6×150mm,5μm)，半制备色谱柱(Eclipse XDB-C18，9.4×250mm,5μm)，操作系统(AgilentChemStation，B.04.03)。HPLC分析条件：进样量10μL，用甲醇-水(25:75，V/V)作为流动相，使用梯度洗脱的方法，运行时间30min，0-15min，甲醇25％-75％，15-20min，甲醇75％-80％，保持3min，23-26min，甲醇80％-25％，保持4min。流速1mL/min，柱温30℃，紫外检测波长218nm。HPLC检测结果显示，随着DON色谱峰高的降低，在保留时间更加晚的位置出现了一个新的色谱峰，该色谱峰已被鉴定为3-oxo-DON的峰。说明蛋白AKR18A1能够在NADP⁺辅酶的作用下将DON氧化形成3-oxo-DON(图5A)。

为了测定AKR18A1蛋白对DON的催化活性的最适pH值，多种不同pH值的缓冲液(50mM)被选择，包括磷酸钠盐缓冲液(pH 6.0-7.0)，Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0-9.0)，及甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.5-11.0)，温度选择37℃，辅酶为NADP⁺。催化活性以每毫克蛋白每分钟催化反应的DON摩尔数来计算(单位nmol·min^-1·mg^-1)。结果显示AKR18A1蛋白在pH值7-11的范围都表现出对DON的催化活性，其中pH值为10.6时催化活性最高(图5B)。

为了测定AKR18A1蛋白对DON的催化活性的最适温度，选择在50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.6)中测定，温度范围设定10℃到60℃，辅酶为NADP⁺。催化活性计算方法同上述。结果显示AKR18A1蛋白在温度10℃到50℃的范围都表现出对DON的催化活性，其中温度为45℃时催化活性最高(图5C)。

AKR18A1蛋白催化DON的酶活动力学常数，选择在最适pH值和最适温度的条件下进行测定，因此，选择在50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.6)中，45℃反应30min，DON浓度范围10-1500μM，辅酶为NADP⁺。米氏方程常数(Km和Vmax)的计算由软件Origin 8(公开使用软件)完成。结果显示米氏常数Km＝1214.4±73.3μM，最大反应速率Vmax＝25.7±0.8nmol·min^-1·mg^-1(图5D)。

实施例4：纯化AKR18A1蛋白对ZEN、α-ZOL、β-ZOL的催化作用

将已纯化的AKR18A1蛋白与ZEN，α-ZOL，β-ZOL在缓冲液中进行反应。催化ZEN的反应体系包括，6μg纯化蛋白，100μM ZEN，0.2mM NADH，加缓冲液至总体积50μL。反应完成后加入等体积的甲醇终止反应，利用HPLC检测溶液中ZEN含量。HPLC仪器组成和检测条件同实施例3，除了检测波长选择236nm。HPLC检测结果显示，随着ZEN色谱峰高的降低，出现了两个新的色谱峰，这两个峰分别是α-ZOL和β-ZOL的色谱峰。说明蛋白AKR18A1能够在NADH辅酶的作用下催化ZEN形成α-ZOL和β-ZOL(图6A)。催化α-ZOL的反应体系包括，6μg纯化蛋白，100μMα-ZOL，2mM NADP⁺，加缓冲液至总体积50μL。HPLC检测方法同上述，结果显示，随着α-ZOL色谱峰高的降低，出现了一个新的色谱峰，这个峰是ZEN的色谱峰。说明蛋白AKR18A1能够在NADP⁺辅酶的作用下催化α-ZOL形成ZEN(图6B)。催化β-ZOL的反应体系包括，6μg纯化蛋白，100μMβ-ZOL，2mM NADP⁺，加缓冲液至总体积50μL。HPLC检测方法同上述，结果显示，随着β-ZOL色谱峰高的降低，出现了一个新的色谱峰，这个峰是ZEN的色谱峰。说明蛋白AKR18A1能够在NADP⁺辅酶的作用下催化β-ZOL形成ZEN(图6C)。

实施例5：纯化AKR18A1蛋白对GO、MG的催化作用

将已纯化的AKR18A1蛋白与GO，MG在缓冲液中进行反应。50μL的反应体系包括，6μg纯化蛋白，100μM GO或者MG，0.2mM NADPH，加缓冲液至总体积50μL。反应完成后加入邻苯二胺水溶液进行衍化反应，然后利用HPLC检测溶液的GO和MG，HPLC仪器组成和检测条件同实施例3，除了检测波长选择320nm。HPLC检测结果显示，添加AKR18A1蛋白的反应组中，GO和MG的色谱峰值均发生了降低。说明蛋白AKR18A1能够在NADPH辅酶的作用下催化降解GO和MG(图7)。

实施例6：AKR18A1蛋白提高了E.coli BL21对GO和MG的耐受性

在含有氨苄青霉素的固体LB培养基中，分别活化含质粒pET-22b-AKR18A1和pET-22b的大肠杆菌BL21(DE-3)菌株；分别挑取单克隆到液体LB培养基中，过夜摇培；取过夜摇培液按照1:100比例扩大培养，于37℃摇床中(200r/min)培养至OD₆₀₀达到0.2，加入终浓度为0.2mM的IPTG，置于37℃摇床中(200r/min)诱导培养1h；将诱导之后的菌液分装至50mL三角瓶中，每份20mL，分别添加GO和MG这两种有毒醛类物质，至终浓度2mM，同时以不添加这两种化合物的样品作为对照。每组设置3次生物重复，37℃摇床中(200r/min)培养，每30min取1mL菌液测定OD₆₀₀值。实验结果表明，无论在GO还是MG处理组中，含质粒pET-22b-AKR18A1的大肠杆菌BL21(DE-3)菌株处理组OD₆₀₀值/对照组OD₆₀₀值比率明显高于含质粒pET-22b的大肠杆菌BL21(DE-3)菌株(图8)，说明蛋白AKR18A1能够显著性提高大肠杆菌对GO和MG的耐受性。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种与镰刀菌毒素及有毒醛类化合物脱毒相关基因AKR18A1及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> 鞘氨醇单胞菌属（sphingomonas sp.）降解菌S3-4

<400> 1

atgcgctaca accggctcgg ccgctccggc ctgatcgtct cggaactctg cctcggcacc 60

atgaccttcg gcggcgacga gggcatatgg ggccggatcg gccagctgca gcaggaagaa 120

gccgacggac tggtcaaggc cgcgctggat gccggcatca atttcttcga cacggcgaac 180

atctatgccg agggtcgttc ggagcggatc ctgggccagg cgctccggaa cctgggcgtc 240

gcgcgcgatg aagtggtggt cgccaccaag gtggtcggcc gcatgcacgc aggccccaac 300

ggcgccggtg cgtcgcgcgg gcacatcctg gcccaggtcg agaagagcct cgatcggctc 360

ggcaccggcc atatcgatct ctaccagatc cacggcttcg acgcgacgac gccgatcgag 420

gagacgctcc aggcgctcga cagcctcgtg cggcgcggga cggtgcggta catcggcctc 480

tccaactggg cggcctggca agtgatgaag gcggtcggca tcgcggcggc ccgcgactat 540

gccccgatcg cctcgctcca ggcctattac acgatcgccg ggcgcgacct ggagcgcgag 600

gtgataccga tgctcgaatc cgagggtgtg ggcctgatgg tgtggagccc gctcgccggc 660

ggcttcctgt cggggaaata tacacgcgag ggcgatggcg acggccgccg cgccggcttc 720

gacttcccgc cggtggacaa ggcgcgcggc tatgacgtgg tcgacgtgct gcgcgaactg 780

gccgaagcca agggccgctc ggtggcccaa ctggcgctgg cctggctgct ccatcaacgc 840

gcggtctcca gcgtcatcat cggcgccaag cggcccgagc aactggccga caatctcgcc 900

gcggtggacg tagagttcac gcccgaggag cgcgcccggc tcgatgcggt gagcaagctg 960

ccggcggaat atcccggctg gatgctcgag cgccagggcg gctatcgcgg cggcccgtcg 1020

ccgcggcgct ga 1032

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> 鞘氨醇单胞菌属（sphingomonas sp.）降解菌S3-4

<400> 2

Met Arg Tyr Asn Arg Leu Gly Arg Ser Gly Leu Ile Val Ser Glu Leu

1 5 10 15

Cys Leu Gly Thr Met Thr Phe Gly Gly Asp Glu Gly Ile Trp Gly Arg

20 25 30

Ile Gly Gln Leu Gln Gln Glu Glu Ala Asp Gly Leu Val Lys Ala Ala

35 40 45

Leu Asp Ala Gly Ile Asn Phe Phe Asp Thr Ala Asn Ile Tyr Ala Glu

50 55 60

Gly Arg Ser Glu Arg Ile Leu Gly Gln Ala Leu Arg Asn Leu Gly Val

65 70 75 80

Ala Arg Asp Glu Val Val Val Ala Thr Lys Val Val Gly Arg Met His

85 90 95

Ala Gly Pro Asn Gly Ala Gly Ala Ser Arg Gly His Ile Leu Ala Gln

100 105 110

Val Glu Lys Ser Leu Asp Arg Leu Gly Thr Gly His Ile Asp Leu Tyr

115 120 125

Gln Ile His Gly Phe Asp Ala Thr Thr Pro Ile Glu Glu Thr Leu Gln

130 135 140

Ala Leu Asp Ser Leu Val Arg Arg Gly Thr Val Arg Tyr Ile Gly Leu

145 150 155 160

Ser Asn Trp Ala Ala Trp Gln Val Met Lys Ala Val Gly Ile Ala Ala

165 170 175

Ala Arg Asp Tyr Ala Pro Ile Ala Ser Leu Gln Ala Tyr Tyr Thr Ile

180 185 190

Ala Gly Arg Asp Leu Glu Arg Glu Val Ile Pro Met Leu Glu Ser Glu

195 200 205

Gly Val Gly Leu Met Val Trp Ser Pro Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser

210 215 220

Gly Lys Tyr Thr Arg Glu Gly Asp Gly Asp Gly Arg Arg Ala Gly Phe

225 230 235 240

Asp Phe Pro Pro Val Asp Lys Ala Arg Gly Tyr Asp Val Val Asp Val

245 250 255

Leu Arg Glu Leu Ala Glu Ala Lys Gly Arg Ser Val Ala Gln Leu Ala

260 265 270

Leu Ala Trp Leu Leu His Gln Arg Ala Val Ser Ser Val Ile Ile Gly

275 280 285

Ala Lys Arg Pro Glu Gln Leu Ala Asp Asn Leu Ala Ala Val Asp Val

290 295 300

Glu Phe Thr Pro Glu Glu Arg Ala Arg Leu Asp Ala Val Ser Lys Leu

305 310 315 320

Pro Ala Glu Tyr Pro Gly Trp Met Leu Glu Arg Gln Gly Gly Tyr Arg

325 330 335

Gly Gly Pro Ser Pro Arg Arg

340

Claims

1.一种与镰刀菌毒素及有毒醛类化合物脱毒相关基因AKR18A1，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述的基因AKR18A1的扩增引物，其特征在于，所述的正向引物为5′-GGAATTCGATGCGCTACAACCGGCTCGGCCG-3′，反向引物为5′-CCCAAGCTTGCGCCGCGGCGACGGGCCG-3′。

4.权利要求1所述的基因AKR18A1或权利要求2所述的蛋白质在氧化脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。

5.权利要求1所述的基因AKR18A1或权利要求2所述的蛋白质在催化玉米赤霉烯酮及其衍生物α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇中的应用。

6.权利要求1所述的基因AKR18A1或权利要求2所述的蛋白质在降解有毒醛类化合物乙二醛和甲基乙二醛中的应用。