CN103589739A

CN103589739A - 基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法

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Publication number: CN103589739A
Application number: CN201310566617.5A
Authority: CN
Inventors: 周培; 冯海玮; 孙玉静; 支月娥; 刘群录; 陆伟; 时唯伟; 卫星; 初少华
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-02-19

Abstract

一种基因工程技术领域的基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。本发明克服现有技术中由于谷氨酰胺合成酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的谷氨酰胺合成酶基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

Description

基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种谷氨酰胺合成酶基因序列、含有该基因的重组载体、重组载体转化表达菌株以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。

背景技术

氮元素是生物体必需也是需求量最大的矿物元素，主要用于合成生物所必需的氨基酸和核苷酸及其其他含氮化合物。氮元素的利用在农业生产中占据非常重要的位置。我国目前已成为世界第一氮肥生产与消费国，其氮肥使用量仍呈逐年递增的态势。然而，目前氮肥利用率低且过量使用造成的环境污染问题已成为世界性难题。因此，如何降低氮肥的使用量，提高利用率便成为工作的重中之重。

生物体对氮元素的同化是十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体吸收利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是氮同化途径的关键酶，它与谷氨酸合成酶共同作用，催化NH₄+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合成酶的催化下，将其酰胺转移到α-酮戊二酸上，从而生成两分子谷氨酸。谷氨酰胺在生物体含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界无机氮也必须通过这个途径才能进入生物体内的氮循环。因此GS在生物体氮同化过程中起到十分重要的作用。

土壤中含有十分丰富的细菌群体。细菌谷氨酰胺合成酶涵盖目前发现的三大类谷氨酰胺合成酶GSⅠ、GSⅡ和GSⅢ，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有种类多、易克隆等优势。巨大芽孢杆(Bacilus megaterium)是一种常见的土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于鉴定氮高效基因并应用于逆境条件下土壤理化性质的改善具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，克服现有技术中由于谷氨酰胺合成酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的谷氨酰胺合成酶基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种谷氨酰胺合成酶基因序列Bm-Gln A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其长度为1335个碱基对，编码444个氨基酸，分子量约为50.3KD。

本发明涉及一种基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列(Bm-Gln A)通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。

所述的测序是指：以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pET-41a载体上进行测序。

所述的PCR扩增采用的引物由：

正向引物Gln A-F:5'-ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3'，以及

反向引物Gln A-R:5'-TTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3'所组成。

所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5'端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即：

正向引物GlnA-Eco R I-F:5'-CGGAATTCATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3'，以及反向引物Gln A-Stu I-R:5'-AAGGCCTTTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3'组成。

所述的表达载体为pET-41a质粒。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2(Bacilus megaterium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC No.4698。

所述的重组表达载体是指：重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas A。

所述的转基因重组菌是指：含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas A的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明涉及上述转基因重组菌的应用，将其发酵后量产谷氨酰胺合成酶。

所述的应用进一步是指：通过将该重组菌进行液体发酵，通过加入IPTG的方式，可以诱导其体内谷氨酰胺合成酶基因大量表达进而产生大量谷氨酰胺合成酶，再通过优化发酵条件及酶工程的方法，最终获得高纯度的谷氨酰胺合成酶。

本发明涉及上述谷氨酰胺合成酶基因序列的应用，将其用于表达目的蛋白产物。

技术效果

本发明与现有技术相比，通过构建重组表达菌株，实现了谷氨酰胺合成酶基因的外源表达，并显著提高表达量；本发明采用Western Blot技术，可以对表达蛋白进行灵敏检测，可检测低至1-5ng(最低可至10-100pg)的表达蛋白。

附图说明

图1菌落PCR验证示意图。

图2重组表达质粒酶切电泳示意图。

图3重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的SDS-PAGE示意图。

图4重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的Western Blot-His·Tag示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium)NCT-2的培养

巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCC NO.4698。将该菌接种于LB液体培养基中，32℃培养OD₆₀₀至1.5左右，离心收集菌体并提取细菌的基因组DNA。

所述的LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水1L，pH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15-20g的琼脂。

实施例2

巨大芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因(Bm-Gln A)序列验证

根据全基因组测序结果，设计PCR引物：

正向引物Gln A-F:5'-ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3'

反向引物Gln A-R:5'-TTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3'

以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环后72℃终延伸10min。

将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为1.3Kb(见图1)；然后将PCR产物切胶回收后连接到pET-41a载体后送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本发明序列表中SEQ ID No.1

实施例3

重组表达载体的构建

根据测序得到的谷氨酰胺合成酶序列(Bm-Gln A)，设计引物扩增该基因并连接到pET-41a表达载体上，然后倒入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。

设计引物如下：

正向引物GlnA-Eco R I-F:

5'-CGGAATTCATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3'

反向引物Gln A-Stu I-R:

5'-AAGGCCTTTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3'

上下游引物的5'端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体

pET-41a，用含有酶切位点的引物扩增谷氨酰胺合成酶基因，回收PCR产物Bm-Gln A'并连接T载。将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，挑取阳性克隆摇菌并回收其质粒，然后用EcoR I和Stu I双酶切，回收含有谷氨酰胺合成酶的基因片段Bm-Gln A'。用相同内切酶酶切表达载体pET-41a后与Bm-Gln A'片段混合，用T4DNA Ligase进行过夜连接，连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，通过菌落PCR筛选含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Gln A的阳性克隆。

实施例4

重组表达菌株的构建

将含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Gln A的DH5α大肠杆菌接入到卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，过夜培养并提取其质粒。用EcoR I和Stu I酶对提取质粒37℃酶切30min，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳验证(见图2)。

将提取的重组表达质粒pET-41a-Bm-Gln A转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中，即得重组表达菌株。

实施例5

谷氨酰胺合成酶的外源表达

挑取阳性克隆于卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，在37℃震荡培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG溶液使培养液IPTG浓度达到0.5mM，继续培养8小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15min收集上清，上清液即为谷氨酰胺合成酶的粗酶液。

实施例6

重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的SDS-PAGE

制备12%SDS-PAGE胶，将粗酶液与5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20μL，在160V电压下电泳60-70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见(如图4)。

所述的12%SDS-PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为：

分离胶：蒸馏水1.6mL，30%丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.3mL，10%过硫酸铵(APS)0.05mL，10%SDS溶液0.05mL，TEMED0.002mL；

浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30%丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL， 10%过硫酸铵(APS)0.01mL，10%SDS溶液0.01mL，TEMED0.001mL；

所述的5×SDS-PAGE Loading Buffer组分为：1M Tris-HCl(pH6.8)1.25mL，SDS0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL。小份分装(500μL)后与室温保存，使用前每小份加入β-巯基乙醇25μL。

所述的考马斯亮蓝R-250溶液组分为：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。

所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。

实施例7

重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的Western Blot-His·Tag

Western Blot详细步骤如下：

按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶、三张滤纸、海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜装置放入电转槽，4℃100V转60-70min。

所述的SDS-PAGE胶是指：实施例5中已完成电泳、未染色的胶块；所述电转液的组分为：甘氨酸2.9g/L，Tris5.8g/L，SDS0.37g，甲醇200mL，去离子水800mL，配好之后4℃预冷。

封闭：将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭1h。

所述封闭液组分为：5.0g脱脂奶粉溶解于100mL TBST缓冲液；所述的TBST缓冲液组分为：NaCl8.8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20mL，吐温-200.5mL，去离子水980mL。

一抗杂交：将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。

所述的一抗溶液组分为：将抗His-兔多克隆抗体以1：5000溶在封闭液中。

洗膜：将一抗孵育完的PVDF膜转入TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次10min；之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min。

所述TBS缓冲液是指不含吐温-20组分的TBST缓冲液。

二抗杂交：将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。

所述的二抗溶液组分为：将羊抗兔IgG-HRP以1：5000溶在封闭液中。

洗膜：同前。

染色：将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置1min。通保鲜膜包好PVDF膜，置于X-光片盒中，并用透明胶带固定。

所述的染色液组分是将EasySee Western Blot Kit(北京全式金，DW101)中500μL溶液A、 500μL溶液B与1μL溶液C混合。

显影：于暗室中压片洗膜显影。

Claims

1.一种谷氨酰胺合成酶基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，其特征在于，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的测序是指：以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pET-41a载体上进行测序。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增采用的引物由：

正向引物Gln A-F:5'-ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3'，以及

反向引物Gln A-R:5'-TTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3'所组成。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5'端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即：

正向引物Nas E-Eco R I-F:

5'-CGGAATTCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'以及

反向引物Nas E-Stu I-R:

5'-AAGGCCTTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'组成。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的表达载体为pET-41a质粒；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述的巨大芽孢杆菌NCT-2(Bacilus megaterium)保藏编号为CGMCC No.4698。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的重组表达载体是指：重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas A。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的转基因重组菌是指：含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas A的大肠杆菌BL21(DE3)。

9.一种根据权利要求2-8中任一所述的转基因重组菌的应用，其特征在于，将其发酵后量产谷氨酰胺合成酶。

10.一种根据权利要求1-8中任一所述的谷氨酰胺合成酶基因序列的应用，其特征在于，将其用于表达目的蛋白产物。