CN103614395A - 基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，通过将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。本发明克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

Description

基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。

背景技术

亚硝酸盐还原酶是一类催化亚硝酸盐还原的酶。亚硝酸盐广泛存在于腌制食物或饲料中。食品中亚硝酸盐含量过高，会使体内血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，降低血液载氧能力，造成高铁血红蛋白血症，对人体造成严重危害。亚硝酸盐还可在人体内与仲胺、叔胺和氨基化合物反应形成强致癌物亚硝胺化合物，从而诱发消化系统癌变。鉴于土壤和食品中超标亚硝酸盐盐污染可引起环境与食品安全问题，人们正在努力寻找有效控制或降解亚硝酸盐的方法，生物酶法成为消除食品亚硝酸盐的一条切实可行的途径。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列长度为2415个碱基对，编码804个氨基酸，分子量约为88.0KD。

本发明涉及一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。

所述的测序是指：以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pMD19-T(Simple)载体上进行测序。

所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5′端分别设计了EcoR I和StuI酶切位点用于连接到表达载体，即：

正向引物Nas D-Eco R I-F：5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′，以及反向引物Nas D-Stu I-R：5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′组成。

所述的大肠杆菌表达载体为pET-41a载体。

所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述的巨大芽孢杆菌NCT-2(Bacilus megaterium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC No.4698。

所述的重组表达载体是指：重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D。

所述的转基因重组菌是指：含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明涉及上述亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的应用，将其用于表达目的蛋白产物。

技术效果

本发明与现有技术相比，具有以下优势:

1、本发明提出一种全新的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列；

2、本发明通过构建重组表达菌株，实现了目的蛋白的外源表达，可以显著提高表达量；

3、本发明采用Western Blot技术，可以对表达蛋白进行灵敏检测，可检测低至1-5ng(最低可至10-100pg)的蛋白。

附图说明

图1PCR扩增电泳示意图。

图2含有重组质粒pET-41a-Bm-Nas D的DH5α平板示意图。

图3重组表达质粒酶切电泳示意图。

图4重组菌诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE示意图。

图5重组菌诱导表达目的蛋白的Western Blot-His·Tag图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium)NCT-2的培养

巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCCNO.4698。将该菌接种于LB液体培养基中，32℃培养OD₆₀₀至1.5左右，离心收集菌体用于提取细菌的基因组DNA。

所述的LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水1L，pH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15-20g的琼脂。

实施例2

亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)序列验证

根据全基因组测序结果，设计PCR引物：

正向引物Nas D-F:5′-ATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′

反向引物Nas D-R:5′-TTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′

以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s；30个循环后72℃终延伸10min。

将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为2.4kb，结果见图1；然后将PCR产物切胶回收后连接到pMD19-T(Simple)载体上送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本发明序列表中SEQ ID No.1。

实施例3

重组表达载体的构建

根据测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列(Bm-Nas D)，设计相应引物扩增该基因并连接到pET-41a表达载体上，然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3)进行诱导表达。

设计引物如下：

正向引物Nas D-Eco R I-F:5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′

反向引物Nas D-Stu I-R:5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′

上下游引物的5′端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体pET-41a，用含有酶切位点的引物扩增亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，回收PCR产物Bm-Nas D′并连接T载。将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，挑取阳性克隆(图2)摇菌并回收其质粒，然后用EcoR I和Stu I双酶切，回收含有亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的基因片段Bm-Nas D′。用相同内切酶酶切表达载体pET-41a后与Bm-Nas D′片段混合，用T4 DNA Ligase进行过夜连接，连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞，通过菌落PCR筛选含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的阳性克隆。

实施例4

重组菌的构建及目的蛋白的表达

将含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的DH5α大肠杆菌接入到卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，过夜培养并提取其质粒。用Eco R I和Stu I酶对提取质粒37℃酶切30min，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳验证(见图3)。

将提取的重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞中，挑取阳性克隆于卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基中，在37℃震荡培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度达到0.5mM，继续培养12h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15min收集上清，上清液即含有目的蛋白。

实施例5

重组菌诱导表达目的蛋白的SDS-PAGE

制备12%SDS-PAGE胶，将细胞破碎液与5×SDS-PAGE Loading Buffer比例混合，与沸水浴5min，每个点样孔上样20μL，在160V电压下电泳60-70min，直至溴酚蓝指示条带完全跑出胶。停止电泳，用考马斯亮蓝R-250溶液染色20min，然后用脱色液进行洗涤，直至背景色完全脱去，条带清晰可见(如图4)。

所述的12%SDS-PAGE是由浓缩胶与分离胶构成的，其组分分别为：

分离胶：蒸馏水1.6mL，30%丙烯酰胺溶液2.0mL，1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.3mL，10%过硫酸铵(APS)0.05mL，10%SDS溶液0.05mL，TEMED0.002mL；

浓缩胶：蒸馏水0.68mL，30%丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0M Tris-HCl(pH6.8)0.13mL，10%过硫酸铵(APS)0.01mL，10%SDS溶液0.01mL，TEMED 0.001mL。

所述的5×SDS-PAGE Loading Buffer组分为：1M Tris-HCl(pH6.8)1.25mL，SDS0.5g，溴酚蓝25mg，甘油2.5mL，去离子水定容至5mL。小份分装(500μL)后与室温保存，使用前每小份加入β-巯基乙醇25μL。

所述的考马斯亮蓝R-250溶液组分为：考马斯亮蓝R-250 1g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，去离子水650mL。

所述的脱色液组分为：冰醋酸100mL，无水乙醇50mL，去离子水850mL。

实施例6

重组菌诱导表达目的蛋白的His·Tag-Western Blot

Western Blot详细步骤如下：

按顺序组装转膜装置：正电极、海绵、三张滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶、三张滤纸、海绵和负电极。其中PVDF膜使用前先用甲醇泡10min，滤纸用电转液浸泡。将装好的转膜装置放入电转槽，4℃100V转60-70min。

所述的SDS-PAGE胶是指：实施例5中已完成电泳、未染色的胶块；所述电转液的组分为：甘氨酸2.9g/L，Tris5.8g/L，SDS0.37g，甲醇200mL，去离子水800mL，配好之后4℃预冷。

封闭：将转好的PVDF膜置于封闭液中，并置于水平振荡器上室温封闭1h。

所述封闭液组分为：5.0g脱脂奶粉溶解于100mL TBST缓冲液；所述的TBST缓冲液组分为：NaCl8.8g，1M Tris-HCl(pH8.0)20mL，吐温-200.5mL，去离子水980mL。

一抗杂交：将封闭完的PVDF膜转入一抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。

所述的一抗溶液组分为：将抗His-兔多克隆抗体以1：5000溶在封闭液中。

洗膜：将一抗孵育完的PVDF膜转入TBST缓冲液中，在摇床上震荡清洗3次，每次10min；之后再在TBS缓冲液中清洗1次，10min。

所述TBS缓冲液是指不含吐温-20组分的TBST缓冲液。

二抗杂交：将冲洗干净的PVDF膜放入二抗溶液中，置于滚动摇床37℃、150rpm孵育1h。

所述的二抗溶液组分为：将羊抗兔IgG-HRP以1：5000溶在封闭液中。

洗膜：同前。

染色：将染色液均匀涂抹于PVDF膜上，静置1min。通保鲜膜包好PVDF膜，置于X-光片盒中，并用透明胶带固定。

所述的染色液组分是将EasySee Western Blot Kit(北京全式金，DW101)中500μL溶液A、500μL溶液B与1μL溶液C混合。

显影：于暗室中压片洗膜显影，结果如图5。

Claims (8)

1.一种亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基于巨大芽孢杆菌的亚硝酸盐还原酶大亚基外源表达方法，其特征在于，将测序得到的亚硝酸盐还原酶大亚基的基因序列通过引物序列扩增并连接到大肠杆菌表达载体中，从而获得重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的测序是指：以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pMD19-T(Simple)载体上进行测序。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5′端分别设计了EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即：正向引物NasD-Eco R I-F:5′-CGGAATTCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3′，以及反向引物Nas D-Stu I-R:5′-AAGGCCTTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′组成。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达载体为pET-41a载体；所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；所述的巨大芽孢杆菌NCT-2(Bacilus megaterium)保藏编号为CGMCC No.4698。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的重组表达载体是指：重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的转基因重组菌是指：含有重组表达质粒pET-41a-Bm-Nas D的大肠杆菌BL21(DE3)。

8.一种根据上述任一权利要求所述的亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列的应用，其特征在于，将其用于表达目的蛋白产物。

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