CN103571781A - 一株嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌及其应用 - Google Patents

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CN103571781A CN201310600689.7A CN201310600689A CN103571781A CN 103571781 A CN103571781 A CN 103571781A CN 201310600689 A CN201310600689 A CN 201310600689A CN 103571781 A CN103571781 A CN 103571781A
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Abstract

本发明涉及一株嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌及其应用。嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO.7833。本发明所述的嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌与野生型嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04相比较，其氧化硫的能力增强，在菌体生物量、硫加氧还原酶酶活和硫氧化系统关键酶的转录水平等方面均有提高。

Description

一株嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌及其应用，尤其涉及一株具有较高硫氧化能力的基因工程菌嗜酸性喜温硫杆菌及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
生物冶金技术以提高资源利用率、降低环境污染等优点，在稀有金属回收领域展现了广阔的应用前景，然而生物冶金中使用的自养菌氧化速率低、氧化周期长一直是该技术应用的瓶颈。对自养菌进行遗传改造，构建生长速度快、氧化能力强的工程菌，提高其应用效能是目前急需解决的问题。
嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus,A.caldus)是生物浸矿过程中的优势菌之一。它主要以元素硫及多种无机硫化合物作为能源自养生长，但是该菌同其他自养菌一样，也存在硫代谢过程缓慢，菌体生长缓慢、代时较长、细胞得率低等缺点。因此，有必要对该菌种进行遗传改造，使其能够提高无机硫化合物的氧化速率，促进细胞的生长繁殖，满足工业生产上的需求。
嗜酸性喜温硫杆菌硫代谢系统的关键酶催化氧化还原反应产生的电子进入呼吸链参与产生细菌生长代谢所需的能量，细菌利用其实现了自身的生长和复制。细菌利用矿物中电子的多少决定了细菌的生长量。反过来，繁殖了的细菌进一步加强了矿物的氧化分解速度，发生正反馈循环式的自催化。因此，嗜酸性硫杆菌氧化硫的能力是衡量其浸矿能力的一项重要指标。
但目前还没有关于以转基因的方式来提高嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化能力的相关报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一株嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌及其应用，该菌株氧化硫的能力和生长速率显著提高，可以更高效地发挥生物冶金的功能。
本发明技术方案如下：
一株嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCCNO.7833。
上述嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌的培养方法，步骤如下：
将嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌按体积百分比10%的接种量接种于含有浓度为200μg/ml的卡那霉素的液体Starkey-S0培养基中，在35～40℃，100～200rpm的条件下，培养5～7d，即得。
根据本发明优选的，所述的液体Starkey-S0培养基按如下方法配制：
（1）按配制每升A组分称取（NH4)2SO42.0g、KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCl2·2H2O0.25g，溶于800ml水中，用硫酸溶液调pH至2.5，水定容至1000ml，121℃条件下灭菌20min，制得A组分；
（2）将硫粉置于密闭容器中，常压沸水蒸煮4～5h，制得B组分；
（3）将步骤（2）制得的B组分按质量体积比1:100加入步骤（1）制得的A组分中，单位g/ml，混合均匀，制得液体Starkey-S0培养基。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（1）中的硫酸溶液质量浓度为30%～50%。
上述嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理、废旧电池处理以及污泥中重金属去除中的应用。
有益效果
本发明所述的嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌与野生型嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04相比较，其氧化硫的能力增强，在菌体量的增加、硫加氧还原酶酶活的提高和硫氧化系统关键酶的转录水平等方面均有提高。这对嗜酸性喜温硫杆菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理、废旧电池处理以及污泥中重金属的去除中的应用有着重要的意义，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1、菌落PCR扩增卡那霉素（Km）基因电泳图；
其中：泳道1、DL2000DNA Marker，泳道2、A.caldus MTH-04（pJRD215）的PCR产物；泳道3和4、A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）的PCR产物；泳道5、A.caldus MTH-04（阴性对照）；
图2、Western-blotting检测验证sor基因在嗜酸性喜温硫杆菌中表达的电泳图；
其中：泳道1、嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04，泳道2、工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215），泳道3、工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）；
图3、嗜酸性喜温硫杆菌各菌株在Starkey-S0培养基中的生长曲线；
其中：A.c MTH-04为嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04，A.c MTH-04（pJRD215）为工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215），A.c MTH-04（pTSOR）为工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）；
图4、嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04与工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）酶活检测结果的柱状图；
图5、工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）硫氧化系统相关基因表达量的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料
大肠杆菌DH5α（Escherica coli DH5α）购自原平皓(天津)生物技术有限公司；
嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04由云南腾冲地区高温温泉边酸性水样中分离得到。分离方法参见刘缨，齐放军，林建群，田克立，颜望明.一株中度嗜热嗜酸硫氧化杆菌的分离和系统发育分析.微生物学报，2004，44（3）：382-385。具体方法是将采集到的酸性水样先用Starkey-S0液体培养基在40℃富集培养一周以上。待培养基的pH下降到1.0左右，用梯度稀释法，在固体Starkey-Na2S2O3培养基上进行涂布。40℃培养5～7d后，挑选培养基上生长出的白色单菌落，继续采用梯度稀释法在固体Starkey-Na2S2O3培养基上分离纯化，直至在显微镜下镜检菌体形态一致，记作嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04；
嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌（以下简称：工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）），于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO.7833。
质粒pJRD215构建方法参见Davison J,Heusterspreute M,Chevalier N,Ha-Thi V,Brunel F.Vectors with restriction site banks.V.pJRD215,a wide-host-range cosmid vector with multiplecloning sites.Gene.1987，51(2-3):275-80；
质粒pJRD215-tac-rus构建方法参见Liu W,Lin J,Pang X,Cui S,Mi S,Lin J.Overexpression of rusticyanin in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859increased Fe2+oxidation activity.Current Microbiology,2010,62(1):320-4。
培养基
LB液体培养基，每1000ml含有如下组分：
蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，2M NaOH溶液调pH至7.0～7.5，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。
LB固体培养基为上述LB液体培养基中加入质量百分比为1.8%琼脂粉，pH7.0～7.5。
液体Starkey-S0培养基，配制方法如下：
A组分：称取（NH4)2SO42.0g、KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCl2·2H2O0.25g并溶于800ml水中，用硫酸溶液（H2SO4与H2O体积比为2：1）调pH2.5，水定容至1000ml，121℃条件下灭菌20min；
B组分：将硫粉放于干燥的试剂瓶中，用塑料膜封紧瓶口，常压沸水蒸煮4～5h；
将B组分按1g/100ml的比例与A组分混合，制得液体Starkey-S0培养基。
固体Starkey-Na2S2O3培养基，配制方法如下：
A组分：称取(NH4)2SO41.2g，KH2PO41.2g，MgSO4·7H2O0.2g，CaCl2·2H2O0.1g，加蒸馏水至200mL，pH自然，115℃高压蒸汽灭菌30min；
B组分：琼脂粉4g，蒸馏水200mL，115℃高压蒸汽灭菌30min；
C组分：Na2S2O34g，FeSO4·7H2O0.012g，蒸馏水20mL，0.22μm滤膜过滤除菌。
将A组分和B组分冷却至80℃混合，然后加入C组分混匀，制得固体Starkey-Na2S2O3培养基。
麦康凯培养基，配制方法如下：
称取麦康凯琼脂10.4g，加入200mL蒸馏水，115℃高压蒸汽灭菌30min。
PBS缓冲液，每1000ml组分如下：
NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，HCl调pH值至7.4，加H2O定容至1L，121℃，灭菌20min。
1mol/L Tris-HCl(pH7.4)配制方法如下：
称量121.1g Tris，加入70mL浓HCl（质量浓度37%），调节pH为7.4，定容至1000mL。
100mmol/L PMSF配制方法如下：
溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml，分成小份并用铝箔将装液管包裹或贮存于-20℃。
实施例
（1）菌种选择：
嗜酸性喜温硫杆菌MTH-04(Acidithiobacillus caldus MTH-04)；大肠杆菌DH5α（Escherica coli DH5α）。
（2）克隆载体pUC19-sor的构建：
SOR蛋白编码基因sor克隆自嗜酸性喜温硫杆菌MTH-04染色体DNA，嗜酸性喜温硫杆菌MTH-04染色体DNA的提取方法参见天根细菌基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司）说明书，所用引物核苷酸序列如下：
sor上游引物sor Forward:
5'-CCGGAATTCTGGAGGCAATGTGGACAAAAATCCT-3'
       EcoR Ⅰ
sor下游引物sor Reverse：
5'-TGCTCTAGACTCAGTGATGATGATGATGATGCACAAGTTTGCGCCGCCAT-3'
      Xba Ⅰ          6×His tag
PCR反应体系：5×Buffer：10μl；dNTP：4μl；DNA模板：2μl；正反向引物各0.5μl；PrimeStar酶（TaKaRa公司）：0.5μl；补充ddH2O至总体积50μl。
PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。
该引物扩增的目的片段长度为946bp，包括编码硫氧化还原酶的基因sor以及编码基因上游的Shine-Dalgarno序列。其中在上游引物末端加入了EcoR Ⅰ酶切位点，前面设计了3个保护碱基；下游引物终止密码子前面加入了编码组氨酸标签（6×His tag）的核苷酸序列和Xba Ⅰ酶切位点，前面设计了3个保护碱基。6×His标签的添加是为方便检测sor基因在细胞内的表达情况。将扩增产物进行EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切，回收946bp大小的片段，然后用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切；同时，限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ对pUC19质粒进行酶切；最后用T4连接酶将sor基因酶切产物分别与pUC19质粒酶切产物连接，得到重组质粒pUC19-sor。
重组质粒pUC19-sor转化E.coli DH5α感受态细胞，在含有氨苄（浓度100μg/ml)的麦康凯培养基筛选阳性转化子，挑取阳性转化子单菌落转接到LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，收集菌体提取质粒，进行酶切验证。同时进行测序验证，构建出克隆载体pUC19-sor。
（3）含有tac强启动子的表达载体pJRD215-tac-sor的构建：提取重组质粒pUC19-sor，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切，琼脂糖凝胶电泳回收约1kb的片段；同时提取质粒pJRD215-tac-rus，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收大片段，其为pJRD215-tac。T4连接酶分别将1kb片段与pJRD215-tac连接。用连接液转化E.coliDH5ɑ，然后用含有卡那霉素（浓度100μg/ml）的麦康凯固体平板上筛选阳性转化子。挑取阳性单菌落于LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，提取质粒进行酶切验证，得到表达载体pJRD215-tac-sor，将带有表达载体pJRD215-tac-sor的大肠杆菌DH5ɑ命名为E.coli DH5ɑ（pJRD215-tac-sor），为下一步实验做准备。
（4）嗜酸性喜温硫杆菌基因工程菌的制备：
分别提取质粒pJRD215和重组质粒pJRD215-tac-sor，并分别电转到野生型嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04菌株中，得到工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215）和工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）。电转后菌株接入Starkey-S0液体培养基中，40℃、50rpm培养24h使其复苏。取喜温硫杆菌复苏培养液原液1mL，并稀释10倍，分别取原液20μL、稀释液50μL涂布含有卡那霉素（200μg/ml）的Starkey-Na2S2O3选择平板及不含抗生素的对照平板。同时在选择性平板上分别涂布受体菌A.caldus MTH-04作为对照。先40℃温箱中正放过夜，后40℃倒置培养7～10d，直至平板上形成明显菌落。
（5）转化子的鉴定：通过菌落PCR和质粒鉴定两种方式进行。
用灭菌牙签在电转化选择平板上挑取多个单菌落进行PCR鉴定，在盛有10μL无菌水的PCR管中搅匀，取1μL作为菌落PCR扩增的模板。PCR反应条件为95℃10min；95℃30s、55℃30s、72℃45s，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳检测（如图1所示），筛选阳性转化子。
经过菌落PCR验证为阳性的转化子，把进行菌落PCR剩余的菌液转接至30mLStarkey-S0液体培养基中，40℃静止培养5-6d作为种子液，再转接含相应抗生素的200mLStarkey-S0液体培养基40℃静置培养6d进行扩大培养，提取质粒鉴定。阳性的转化子能提取出分子量大小正确的质粒，而从作为对照的A.caldus MTH-04中则未能提取出质粒。
结果表明，重组质粒通过电转化的方式成功地从转移至了嗜酸性喜温硫杆菌中，提示已成功获得了嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04基因工程菌（工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）），并于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCC NO.7833。
（6）重组质粒pJRD215-tac-sor在A.caldus MTH-04中的稳定性测定：在含适当抗生素的Starkey-Na2S2O3固体平板上挑取单个喜温硫杆菌转化子，接种到液体Starkey-S0培养基，在无选择压力条件下静置培养7d，按1:100(v/v)的比例转接。如此连续转接5次，收集适量的菌体，用液体Starkey-S0培养基洗涤一次，然后用液体Starkey-S0培养基稀释后，涂布不含筛选标记的固体平板上，40℃培养7d。长出菌落后，取100个菌落点种在含抗生素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，根据抗性菌落与敏感菌落的比例，测出质粒在喜温硫杆菌中的稳定性。质粒pJRD215和pJRD215-tac-sor在嗜酸性喜温硫杆菌中的保存率在80%以上，说明稳定性良好，可以进行稳定遗传，工程菌的构建具有价值，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0000420096210000061
（7）A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）中重组质粒所携带sor基因在嗜酸性喜温硫杆菌中的表达：
将工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）及野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04在Starkey-S0液体培养基中保存的菌种，以10%体积比的接种量，将两株菌接种于200mL Starkey-S0液体培养基中，40℃条件下，振荡培养至稳定期（约6d）；
在冰浴条件下，将上述培养液13,000rpm离心10min，收集菌体，用冰预冷的PBS缓冲液洗涤菌体两次，除去硫粉，细胞重悬于2mL1mol/L Tris-HCl(pH7.4)中，加入2μL100mmol/LPMSF，超声破碎处理细胞，循环：超声5s；间隔10s；全程30min。13,000rpm离心10min去除细胞碎片。使用BCATM Protein Assay Kit测定工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）及野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04蛋白样品的浓度后，取相同量的蛋白以质量百分比为12%的变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
将聚丙烯酰胺凝胶中得到有效分离的嗜酸性喜温硫杆菌总蛋白转印至PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，分别进行一抗（Anti-His Antibody）及二抗(Poly Rabbit Anti-mouseimmunoglobulins/HRP)孵育后，进行ECL发光检测；
经Western-blotting检测验证，质粒pJRD215-tac-sor上所携带的sor基因在嗜酸性喜温硫杆菌中得到了有效的表达，结果如图2所示。由图2可以看出硫氧化还原酶已经成功在工程菌株A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）中表达，野生菌株A.caldus MTH-04和空载质粒的菌株A.caldus MTH-04（pJRD215）的阴性结果也与预期结果相符。
（8）基因工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）硫氧化活性测定：该部分从细菌生长量的测定、硫加氧还原酶酶活测定和硫氧化系统关键酶的转录水平3方面来评价。
测定了野生菌和基因工程菌在以单质硫为唯一能源条件下的生长状况。收集对数中期的菌体，利用液体Starkey-S0培养基A组分洗涤除硫粉，用1ml液体Starkey-S0培养基A组分稀释，显微镜下计数，调整菌体浓度，按体积百分比10%菌液接种量接种到200ml液体Starkey-S0培养基中，40℃、150rpm振荡培养，每隔12h取样，取样时先将三角瓶静置一段时间，用移液枪取200μL菌液到96孔板中，到微量分光光度计600nm下测定吸光值，该值反映了菌体生长量的大小，结果如图3所示。由图3可以看出：在36h之前，野生菌株生长占优势，因为没有转入质粒的负担，生长较快，能很快进入对数期，相反地，转入重组质粒的菌株因为需要多余的DNA合成和代谢合成，增加了菌体负担，生长并不占优势；进入对数期后，因为工程菌株A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）中增加了催化单质硫代谢的硫氧化还原酶基因，其能加快菌株在Starkey-S0培养基中的生长，其菌体量大于野生菌。空载质粒菌株A.caldus MTH-04（pJRD215）生长弱于野生菌株，也与预期结果一致。因为，一方面重组质粒增加了其生长负担；一方面它没有引入利于嗜酸性喜温硫杆菌生长的酶。
基因工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）硫氧化活性测定
将工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor），野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04及工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215）在液体Starkey-S0培养基中保存的菌种，以10%的体积比的接种量，将三株菌接种于200mL液体Starkey-S0培养基中，40℃条件下，振荡培养至稳定期（约6d）；
细菌生长量的测定：
收集对数中期的菌体，利用液体Starkey-S0培养基A组分洗涤除硫粉，用1ml液体Starkey-S0培养基A组分稀释，显微镜下计数，调整菌体浓度，按体积百分比10%菌液接种量接种到200ml液体Starkey-S0培养基中，40℃、150rpm振荡培养，每隔12h取样，取样时先将三角瓶静置一段时间，用移液枪取200μL菌液到96孔板中，到微量分光光度计600nm下测定吸光值，该值反映了菌体生长量的大小，结果如图3所示。
硫加氧还原酶酶活测定：
收集对数中期的野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04和工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor），制备蛋白粗提液并进行定量。以野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04作为对照，测定工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）蛋白粗提液中硫氧化还原酶（SOR）的相对活性。通过测定亚硫酸盐、硫代硫酸盐生成来测定硫氧化还原酶（SOR）的活性。单位活性为每分钟亚硫酸盐、硫代硫酸盐生成的微摩尔数，结果如图4所示。由图2可以看出：野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04和工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）的酶活分别为0.18U/mg和0.22U/mg，与野生菌株相比，工程菌A.caldusMTH-04（pJRD215-tac-sor）硫氧化活性提高了约22.2%。
硫氧化系统关键酶的转录水平：
用荧光定量RT-PCR方法研究硫氧化系统关键酶的转录水平。设计并合成嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化系统的14个关键酶基因的荧光定量引物，用于荧光定量RT-PCR实验。引物序列如表1所示：
表1
以单质硫为唯一能源培养待测菌至对数生长期，收集对数中期的野生嗜酸性喜温硫杆菌（A.caldus）MTH-04和工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor），提取RNA并反转录成cDNA，取等量的cDNA作为模板分别进行荧光定量PCR。反应结束后，由熔解曲线判断反应的特异性，根据标准曲线以及荧光定量各样品得Ct值计算定量结果，管家基因rrs作为内标，分析各基因的相对表达量。对荧光定量RT-PCR检测数据的处理采用比较Ct值法，即2-△△Ct法。以工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215）作为对照，计算工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）中各硫氧化系统关键酶基因的表达水平的改变倍数，结果如图5所示。由图5可以看出，工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）中硫氧化相关的基因相对对照菌株表达上调，从而促进对硫的利用，利于菌株的生长，这也与生长状况结果一致。
上述A.caldus(pJRD-215-tac-sor)和A.caldus MTH-04（pJRD215）在进行培养时，培养基中均加入浓度为200μg/ml的卡那霉素。
结果分析
由上述实验对比发现，工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）较野生型A.caldusMTH-04，硫氧化能力得到了提高，菌体生长量大于野生菌；野生型A.caldus MTH-04细胞粗提液和工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）的酶活分别为0.18U/mg和0.22U/mg。与野生菌株相比，工程菌A.caldus MTH-04（pJRD215-tac-sor）硫氧化活性提高了约22.2%；单质硫为唯一能源条件下培养时，工程菌株A.caldus(pJRD-215-tac-sor)中硫氧化相关的基因相对A.caldus MTH-04（pJRD215）表达上调，从而促进对硫的利用，利于菌株的生长，这也与生长状况结果一致。
Figure IDA0000420096300000011

Claims (5)

1.一株嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌，于2013年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号：CGMCCNO.7833。
2.权利要求1所述嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌的培养方法，步骤如下：
将嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌按体积百分比10%的接种量接种于含有浓度为200μg/ml的卡那霉素的液体Starkey-S0培养基中，在35～40℃，100～200rpm的条件下，培养5～7d，即得。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的液体Starkey-S0培养基按如下方法配制：
（1）按配制每升A组分称取（NH4)2SO42.0g、KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、CaCl2·2H2O0.25g，溶于800ml水中，用硫酸溶液调pH至2.5，水定容至1000ml，121℃条件下灭菌20min，制得A组分；
（2）将硫粉置于密闭容器中，常压沸水蒸煮4～5h，制得B组分；
（3）将步骤（2）制得的B组分按质量体积比1:100加入步骤（1）制得的A组分中，单位g/ml，混合均匀，制得液体Starkey-S0培养基。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的硫酸溶液质量浓度为30%～50%。
5.权利要求1所述嗜酸性喜温硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）MTH-04（pJRD215-tac-sor）基因工程菌在生物浸出、烟气脱硫、酸性矿井水的处理、废旧电池处理以及污泥中重金属去除中的应用。
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