CN114908131A - 一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用 - Google Patents

一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子，是嗜酸性喜温硫杆菌株中ACT类型群体感应系统产生的信号分子是3‑OH‑C14‑AHL。本发明还公开了所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子在加速菌株硫氧化或在调控硫代谢和生长中的应用。通过信号分子反添加实验证实，3‑OH‑C14‑AHL能够促进和提高敲除菌株A.caldus(Δact)胞外多糖的产生、生物被膜的形成及菌株的酸耐受能力，从而提高菌株的硫氧化能力。这种通过新型信号分子提高嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化能力的策略为提高生物冶金工业中菌株浸矿效率奠定了理论基础，也为解决酸性矿水排放等环境污染问题提供了新思路，具有广阔的开发前景。

Description

一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化 中的应用
技术领域
本发明涉及一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caduls，简称A.caldus)是一类革兰氏阴性专性自养硫氧化细菌，端生鞭毛，可以氧化单质硫和含有各种不同价态硫的还原性硫化合物，从而获得电子和能量，在细菌浸矿中发挥十分重要的作用，已成为生物冶金工业中广泛应用的优势菌。其中A.caldusMTH-04是从云南腾冲温泉分离得到的一种已公开的嗜酸性喜温硫杆菌，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC 1.15711)。
生物冶金是指环境微生物通过氧化分解作用，使矿石中的难溶性金属化合物转变成易溶解的金属离子，再利用一系列工艺技术分离富集得到高纯度的有色金属的过程。由于微生物生长周期长、调控手段缺乏等缺点，导致浸矿效率较低。因此，通过提高菌株硫氧化能力，是提高浸矿效率的关键因素。
ACT类型群体密度感应系统由glyQ、glyS、gph、act四个共转录的基因组成，其中酰基转移酶ACT负责编码信号分子。通过筛选新型ACT类型群体感应系统中信号分子的类型及利用信号分子以提高菌株硫氧化能力的策略有望为提高生物冶金工业中菌株浸矿效率奠定理论基础。经检索，有关嗜酸性喜温硫杆菌中ACT类型群体感应系统产生的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用。
本发明所述的嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子，其特征在于：所述嗜酸性喜温硫杆菌株(A.caldus)中ACT类型群体感应系统产生的信号分子是3-OH-C14-AHL。
上述的嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子中：所述嗜酸性喜温硫杆菌株(A.caldus)优选是A.caldus MTH-04。
上述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的提取与鉴定方法，步骤是：
(1)利用二氯甲烷萃取法提取野生型菌株A.caldus和敲除菌株A.caldus(Δact)中产生的信号分子：方法是以常规方式将构建的敲除菌株A.caldus(Δact)和野生型A.caldus培养至对数后期，利用离心去除培养物中的菌泥及硫粉颗粒，上清液用等体积的二氯甲烷进行萃取制备AHL，再将二氯甲烷萃取液蒸干后溶于甲醇，获得的溶液即为酰基高丝氨酸内酯(AHLs)粗提液；
(2)利用液质联用LC-MS-MS技术进行鉴定：方法是以购买到的标准品AHLs为参照物，在野生型菌株A.caldus中LC-MS-MS检测鉴定出一种信号分子3-OH-C14-AHL，而在敲除菌株A.caldus(Δact)中未检测到任何类型的AHLs，由此确定，act基因编码合成的信号分子为3-OH-C14-AHL，即A.caldus中ACT类型群体密度感应系统产生的信号分子为3-OH-C14-AHL。
上述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的的提取与鉴定方法中：所述敲除菌株A.caldus(Δact)是将野生型A.caldus中ACT类型群体感应系统中负责编码信号分子合成酶的基因act敲除后得到的工程菌株；其构建方法是：
利用分子克隆技术，PCR扩增出如SEQ No.1所示1071bp核苷酸序列的act基因上游同源臂UHA和如SEQ No.2所示1203bp核苷酸序列的act基因下游同源臂DHA，并通过同源重组方法将所述片段与自杀质粒pSDUDI连接，获得重组质粒命名为pSDUDI-UHA+DHA-act，并转化至大肠杆菌S17-1中；将含有重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act的大肠杆菌S17-1为供体菌，野生型A.caldus为受体菌，通过接合转移的方式将所述重组质粒转移至A.caldus中，利用同源臂内侧引物PAF2/R2进行菌落PCR验证后获得act基因单交换菌株；以含有质粒pMSD1-I-SecI的大肠杆菌SM10为供体菌，act基因单交换菌株为受体菌，通过接合转移的方式将质粒pMSD1-I-SecI转移至act基因单交换菌株中，利用同源臂外侧引物PAF1/R1，同源臂内侧引物PAF2/R2及act基因内引物PAF3/R3进行基因组PCR验证后获得敲除菌株命名为A.caldus(Δact)；
上述敲除菌株构建所需要引物为：
UHAF：atccacgcgtccgcccatatgCCGAAGCGGTAACGGAGTC
UHAR：atcgagaaagGGCGCTCAGTGCCCGAGG
DHAF：actgagcgccCTTTCTCGATGCCCTCGAGG
DHAR：tattaccgcgcggccgctagcTGTTCCCTTGCCAAACCCA
PAF1：TACCTTGTGGGGATTCTT
PAR1：GCCCTCTTTCTCCAACTCCC
PAF2：GCGCTGATCCCTCTGCTTG
PAR2：GCGCATTCTCCGCCATTTT
PAF3：ATCGTCCGGTGGTACTCGTCT
PAR3：CTCCAGCAGTGCCGTGAAA 。
上述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的的提取与鉴定方法中：所述接合转移过程中，供体菌与受体菌均需震荡培养至对数中期，其中震荡培养转速不高于180rpm/min，为确保供受体菌性菌毛不受损坏，菌体离心收集时转速不高于8000rpm/min，供体菌与受体菌接合比例为体积比1:2。
本发明所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子在加速菌株硫氧化或在调控硫代谢和生长中的应用。
其中，应用方法是：向敲除菌株A.caldus(Δact)中添加5±1μM市场购买的标准品3-OH-C14-AHL，同时以不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)为对照组；以单质硫为唯一能源进行培养，测量野生型菌株A.caldus、不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)及添加5μM3-OH-C14-AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量变化。
结果显示与不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相比，添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量增加，且菌株胞外多糖及生物被膜的形成及生长代谢能力提高。
上述的应用中，所述3-OH-C14-AHL的添加时期优选为A.caldus培养初期，其添加终浓度优选为5μM。
本发明通过将ACT类型群体感应系统中负责编码信号分子合成酶的基因act敲除获得敲除菌株A.caldus(Δact)，并通过提取野生型A.caldus和敲除菌株A.caldus(Δact)中产生的信号分子，利用液质联用(LC-MS-MS)技术验证，确定菌株A.caldus中ACT类型群体感应系统产生的信号分子为3-OH-C14-AHL；发明人通过信号分子反添加实验证明，3-OH-C14-AHL能够促进和提高敲除菌株A.caldus(Δact)胞外多糖的产生、生物被膜的形成及酸耐受能力，从而提高菌株的硫氧化能力。这种通过新型信号分子提高嗜酸性喜温硫杆菌硫氧化能力的策略为提高生物冶金工业中菌株浸矿效率奠定了理论基础，同时在提高生物冶金工业浸矿效率上具有广阔的开发前景。本发明在菌株A.caldus中发现ACT类型群体密度感应系统，并鉴定出一种新型信号分子3-OH-C14-AHL，这一发现也为解决酸性矿水排放等环境污染治理问题提供了新思路。
附图说明
图1是重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act构建图。
图2是敲除菌株A.caldus(Δact)的PCR验证图；
其中：泳道M为Trans 5K DNA Maker(购买自济南雨同生物科技有限公司)；泳道1，3，5分别是敲除菌株A.caldus(Δact)利用引物PAF1/R1，PAF2/R2和PAF3/R3获得的PCR产物；泳道2，4，6分别是野生型A.caldus利用引物PAF1/R1，PAF2/R2和PAF3/R3获得的PCR产物。
图3是利用LC-MS-MS技术鉴定ACT合成的AHLs图。
其中：A是标准品3-OH-C14-AHL质谱二级结构示意图；B是野生型WT产生AHLs质谱示意图。
图4是3-OH-C14-AHL对A.caldus中胞外多糖产生、生物被膜形成及酸耐受能力调控功能鉴定图。
其中：A是添加3-OH-C14-AHL条件下胞外多糖的提取示意图；B是生物被膜形成示意图；C是酸刺激条件下添加3-OH-C14-AHL后A.caldus的相对生物量变化图。
图5是添加3-OH-C14-AHL条件下A.caldus的相对生物量变化图。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、质粒等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
其中本实施例所涉及的嗜酸性喜温硫杆菌菌株A.caldus MTH-04是申请人先前专利已公开的菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏号CGMCC 1.15711)。重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act构建公开于(Wang et al.2016)；E.coli DH5α购至济南雨同生物科技有限公司；E.coli S17-1公开于(Bilecen and Yildiz 2010)；E.coli SM10公开于(Simon et al.1983)。具体刊物信息如下：
BILECEN K AND YILDIZ FH.2010.Identification of a calcium-controllednegative regulatory system affecting Vibrio cholerae biofilmformation.Environmental Microbiology 11:2015-2029.
SIMON R,PRIEFER U AND PUHLER A.1983.A broad host mobilization systemfor in vivo genetic engineering:Transposon mutagenesis in Gram-negativebacteria.Bio/Technolgy 1:37-45.
WANG ZB,LI YQ,LIN JQ,XIN P AND CHEN LX.2016.The Two-Component SystemRsrS-RsrR Regulates the Tetrathionate Intermediate Pathway for ThiosulfateOxidation in Acidithiobacillus caldus.Frontiers in Microbiology 7.
实施例1敲除菌株A.caldus(Δact)的构建
1、重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act的构建
(1)基因组的提取：利用基因组提取试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)提取野生型A.caldus基因组，备用。
(2)质粒的提取：利用质粒提取试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)提取自杀质粒pSDUDI，备用。
(3)act基因上游同源臂片段UHA和下游同源臂片段DHA的获取
以野生型A.caldus基因组为模板，设计与UHA和自杀质粒pSDUDI有同源臂的引物，PCR扩增获得UHA片段；所用引物如下：
UHAF：atccacgcgtccgcccatatgCCGAAGCGGTAACGGAGTC
(小写部分为自杀质粒pSDUDI同源臂，加粗部分为NdeⅠ酶切位点)
UHAR：atcgagaaagGGCGCTCAGTGCCCGAGG
(小写部分为片段DHA同源臂)
以A.caldus基因组为模板，设计与DHA和自杀质粒pSDUDI有同源臂的引物，PCR扩增获得DHA基因片段；所用引物如下：
DHAF：actgagcgccCTTTCTCGATGCCCTCGAGG
(小写部分为片段UHA同源臂)
DHAR：tattaccgcgcggccgctagcTGTTCCCTTGCCAAACCCA
(小写部分为自杀质粒pSDUDI同源臂，加粗部分为NheⅠ酶切位点)
上述PCR扩增条件是：预变性94℃2min；98℃10sec；退火59℃15sec；延伸72℃1min/1kb；30个循环；72℃延伸10min；12℃保温。
PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。
UHA序列大小为1071bp(核苷酸序列如SEQ No.1所示)，DHA基因片段为1203bp(核苷酸序列如SEQ No.2所示)。利用DNA纯化回收试剂盒(购买于天根生化科技(北京)有限公司)对目的基因产物进行回收，具体操作方法参考试剂盒操作手册。
(4)重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act的构建
利用限制性内切酶NdeⅠ/NheⅠ将自杀质粒pSDUDI进行双酶切，使其线性化，利用DNA纯化回收试剂盒将酶切产物回收，测定浓度。根据同源重组酶说明书，将UHA和DHA和线性化质粒进行连接，具体酶切和连接步骤，参考操作说明书。
(5)测序分析：将(4)中的连接液转化大肠杆菌(E.coli DH5α)，获得的阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析，经测序无误的阳性克隆表达质粒命名为重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act，构建过程如图1所示。
2、敲除菌株A.caldus(Δact)的构建
将测序正确的重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act，转化至大肠杆菌S17-1中，将含有重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act的大肠杆菌S17-1为供体菌，野生型A.caldus为受体菌，通过接合转移的方式将重组质粒转移至A.caldus中，利用同源臂内侧引物PAF2/R2进行菌落PCR验证，若自杀质粒能成功整合到A.caldus基因组上，则可扩增出一大(2127bp)一小(1347bp)两个片段，即act基因单交换菌株；以含有质粒pMSD1-I-SecI的大肠杆菌SM10为供体菌，act基因单交换菌株为受体菌，通过接合转移的方式将质粒pMSD1-I-SecI转移至act基因单交换菌株中，利用同源臂外侧引物PAF1/R1，同源臂内侧引物PAF2/R2及act基因内引物PAF3/R3进行基因组PCR验证，获得敲除菌株命名为A.caldus(Δact)。其中验证引物设计如下：
PAF1：TACCTTGTGGGGATTCTT
PAR1：GCCCTCTTTCTCCAACTCCC
PAF2：GCGCTGATCCCTCTGCTTG
PAR2：GCGCATTCTCCGCCATTTT
PAF3：ATCGTCCGGTGGTACTCGTCT
PAR3：CTCCAGCAGTGCCGTGAAA
上述接合转移过程中，供体菌与受体菌均需要震荡培养至对数中期，震荡培养转速不可高于180rpm/min，为确保供受体菌性菌毛不受损坏，菌体离心收集时使用较低的转速，应不高于8000rpm/min，供受体与受体菌接合比例为体积比1:2。敲除菌株PCR验证如图2。
实施例2 A.caldus中ACT类型群体密度感应系统信号分子的提取与鉴定
ACT类型群体密度感应系统由glyQ、glyS、gph、act四个共转录的基因组成，其中酰基转移酶ACT负责编码信号分子。
为了鉴定A.caldus中ACT类型群体密度感应系统产生的信号分子的类型，首先，利用二氯甲烷萃取法提取野生型菌株A.caldus和敲除菌株A.caldus(Δact)中产生的信号分子，得到酰基高丝氨酸内酯(AHLs)粗提液；然后利用LC-MS-MS技术进行鉴定。
以购买到的标准品AHLs为参照物，检测发现在野生型菌株A.caldus中鉴定出一种信号分子3-OH-C14-AHL，而在敲除菌株A.caldus(Δact)中未检测到任何类型的AHLs，结果如图3所示。由此可知，act基因编码合成的信号分子为3-OH-C14-AHL，即确定A.caldus中ACT类型群体密度感应系统产生的信号分子为3-OH-C14-AHL。
实施例3新型信号分子3-OH-C14-AHL功能鉴定及在硫氧化中的应用
1、新型信号分子3-OH-C14-AHL功能鉴定
验证新型信号分子3-OH-C14-AHL的调控功能，通过向敲除菌株A.caldus(Δact)中添加5μM市场购买的标准品3-OH-C14-AHL，以不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)为对照组。
通过提取野生型菌株A.caldus、不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)及添加5μM3-OH-C14-AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)中产生的胞外多糖和形成的生物被膜以及在酸刺激条件下菌株的相对生物量变化，发现与不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相比，添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)的胞外多糖及生物被膜的形成有所提高，而且在酸刺激条件下，添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)与不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相比，相对生物量增加了16％，结果如图4所示。由此可知，新型信号分子3-OH-C14-AHL对菌株胞外多糖的产生、生物被膜的形成及菌株的酸耐受能力具有正向调控功能。
上述菌株胞外多糖的提取方法为：
(1)将菌株利用单质硫为唯一能源，150rpm，40℃，振荡培养至对数中期，10000rpm，离心5min,收集菌泥；然后利用ddH2O将菌泥清洗至少3遍，并去除硫粉；将菌液浓度调至OD600nm＝1，取1mL菌液，12000rpm，离心1min，弃上清；
(2)向收集好的菌泥中加入1.5mL的TNE buffer，12000rpm，4℃，离心10min，弃上清；
(3)向EP管内加入1.5mL现配的TNE+0.1％SDS溶液，小心的吹洗菌泥，置于冰上反应5min，然后12000rpm，4℃，离心10min，弃上清；
(4)重复步骤(3)与(4)
(5)利用1mL TNE buffer重悬菌体，12000rpm离心1min，洗涤三遍，此时可观察到管内具有粘附性物质，即EPS；
(6)向EP管内加入1mL Tris,12000rpm离心1min，洗涤一遍；
(7)再向EP管内加入1mL Tris，在振荡仪上充分振荡15sec，使EPS中的多糖及蛋白质溶解在Tris中；
(8)多糖测定：将300μL样品与900μL硫酸蒽酮于EP管中混匀，放于恒温水浴锅中，98℃，反应20min后，测OD625nm，数据处理参考标准曲线y＝3.692x+0.0437单位：μg/mL/OD；
(9)蛋白质测定：20μL样品与200μL Modified Bradford reagent溶液混匀，测定OD600nm，数据处理参考标准曲线y＝0.1842x+0.3194单位：μg/mL/OD。
上述菌株生物被膜的检测(利用结晶紫染色法测量菌株生物被膜的形成)：
(1)将制作好的硫试片放入玻璃平皿中，与菌株共培养，40℃恒温培养箱培养至对数中期；
(2)用镊子小心夹出玻璃平皿中的硫试片，利用ddH2O将硫试片表面的培养基冲洗干净；放置60℃烘箱中烘干；
(3)将烘干后的硫试片分别放入干净的玻璃平皿中，倒入适量结晶紫染液，使其恰好没过硫试片，避光染色15min；染色完成后，利用ddH2O将硫试片表面多余的染料冲洗掉，放置60℃烘箱中烘干；
(4)向玻璃平皿中加入2mL 30％乙酸，利用移液枪将硫试片上的结晶紫染液冲洗下来，并设置空白对照，然后吸取液体，测OD595nm。
上述菌株在酸刺激条件下相对生物量的测量方法为：
(1)在菌株接种后的第二天，利用ddH2O稀释后的浓硫酸(ddH2O:H2SO4＝1:1)，将菌株培养基调至pH＝0.5；
(2)以单质硫为唯一能源进行培养，测量野生型菌株A.caldus、不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)及添加5μM 3-OH-C14-AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)在酸刺激条件下的相对生物量变化，
2、新型信号分子3-OH-C14-AHL在硫氧化中的应用
向敲除菌株A.caldus(Δact)中添加5μM市场购买的标准品3-OH-C14-AHL，以不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)为对照组。以单质硫为唯一能源进行培养，通过测量野生型菌株A.caldus、不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)及添加5μM 3-OH-C14-AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量变化，发现与不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相比，添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量增加了4％，如图5所示。由此可知，新型信号分子3-OH-C14-AHL可以促进菌株对单质硫的利用，加速菌株硫氧化过程，从而提高菌株的生长代谢能力。
综上所述，首次在菌株A.caldus中发现ACT类型群体密度感应系统，并鉴定出一种新型信号分子3-OH-C14-AHL，通过信号分子反添加实验，发现3-OH-C14-AHL的添加促使菌株胞外多糖的产生和生物被膜的形成以及菌株的酸耐受能力有所提高，加速菌株硫氧化过程。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> 一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子及其在加速菌株硫氧化中的应用
<141> 2022-05-11
<160> 2
<210> 1
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> act基因上游同源臂UHA的核苷酸序列
<222> （1）…（1071）
<400> 1
ccgaagcggt aacggagtcg gcgtgggcct tcgtgcagga acgtctgcgg gtactgctgc 60
gcgacgaggg tttcgccgcc gaccagattc aggccgtcct cgccgttgcc ggcgacgatc 120
ccatcgccgc ccggcggcgc ctcgagagcc ttgccgaatt cctgcgcctg cacgagtccg 180
ccgatgccct cgcggccttg atcaagcgca tcaacaacct cttgcgcaag gaagatcttg 240
gcagcctgcc gcagtgcaac cccgatcgtc ttcaggagcc ggccgagatt gccctgtggc 300
gcgagtattc ggcactgcag gaggcgctga tccctctgct tgccgccggg gattttgccg 360
ccagcctgga cctgctggcc ggtctgcggt cggcggtgga ccgtttcttc caggagatcc 420
tcgtcctctg tgaggatgcc cgcctgcgcg ccaatcgtct ggccctgctc gcgcagatcc 480
agaaaagctt cctacagatc gccgatttct ccctgttgca gggccgttcg tgagtcagct 540
catcgtcctc gatcgcgacg gcgtcatcaa cgaggacagc gacgcctaca tcaaatcgcc 600
ggcggagtgg cgtcccatac ccggcagcct cgaggccatc gcccgcctca agcgtgccgg 660
ctacctggta gccgtcgcca gcaatcagtc gggcatcggt cggcgactct tcgacatccg 720
tgccctcaat gccattcacg cccgcatgcg acgtgaactg gctgcggtgg gagggcgcat 780
agacgccatc ttctattgtc cccaccaccc cgaagccggc tgcagctgcc gcaagcccct 840
gccgggactt tttctggaaa ttgccgagcg cttccagatc tcgctgagtc aggtgcccgc 900
tgtgggcgac agcctgcgcg atctgcacgc cgcccgcgcc gccggggccc gtcccctgct 960
ggtccttacg ggcaaggggc aaggggcccg gagcgaggcc gaggccatgg gcgtacccgt 1020
gtatgccaat cttgccgagg ccgtcgagtc gatcctcggg cactgagcgc c 1071
<210> 2
<211> 1203
<212> DNA
<213>人工序列
<221> act基因下游同源臂DHA的核苷酸序列
<222> （1）…（1203）
<400> 2
ctttctcgat gccctcgagg ctcggtaccg ggttcacctc cagtacccgc agactaccgt 60
cagcggcacg catcagatcc accccggcaa agtcgagatc cagggcggcg ctggcacgcc 120
gggagagctc ctgtacctgc gcgtccagaa cccccagatc ccaggcgcgc gcctgaccgc 180
cgcagtggag gttactgcgg aagtcctgcg cagacgcccg gcgctccatg gcggccaata 240
cccgatcgcc caggacgatg acccgcagat cgctgcgccc cggcaggaac tcctgcacca 300
tggcctcgtg ctgcaggtgc aacagggtat ccaggagcgc gctggccacc tctcgcgact 360
ccgcgaggtt tactccaacc ccctgcgaac ccgacaggag ctttacgacc accggcggcg 420
ctagggtatc gagcagcgct tccttctggc tggcgtgggc aaaataggcg gttctgggca 480
ccggtagacc agccgcctgc aggatctgca gagagccgaa cttgtcccgg gccgccagca 540
gggcatcggc atcgttcaga cagtacctgc cctgggccgc aaaatggcgg agaatgcgcg 600
cgccgagctg cgtcagggga ctgcctaccc gcggcaggac cgctgccacc tcgaccacgc 660
cgacgtcgcg gtggcgccag gtaaattccc catcgagacc aaggatgaac tcctcggggg 720
cgagtcggag caccgcaaaa ccacggtcct ccagggcctg ctgcagccgc cgcgtcgagt 780
acagctccgg ctgacgcgac agcagcgcga cggtatccac cccgctcacg cagaaggact 840
gggagccgca cgaaagcgta gcagcggcaa ctcaccgtgg gcgatggaac gacgaatgaa 900
ggccgctcga ccaggctctc gtcgctccaa ggctgcctct ccctccgcgg cgcagcccag 960
cagagcgctg aacaacacct ccagctccag cgcatccacc cgcaaggact ccggctcaag 1020
ccccggactg cgccaaaaga gattgctcgc ccagcccttg gcgcggatgg cgggctccgc 1080
gtaccagcgg gcacagcgat gcgctatggc ggcaaaatcg gcgggatcct cgatggccat 1140
ggacgtacct cgtgcgtatg cagacgtgga cgagcataga gcattgggtt tggcaaggga 1200
aca 1203

Claims (8)

1.一种嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子，其特征在于：所述嗜酸性喜温硫杆菌株(A.caldus)中ACT类型群体感应系统产生的信号分子是3-OH-C14-AHL。
2.根据权利要求1所述的嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子，其特征在于：所述嗜酸性喜温硫杆菌株(A.caldus)是A.caldus MTH-04。
3.权利要求1或2所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的提取与鉴定方法，步骤是：
(1)利用二氯甲烷萃取法提取野生型菌株A.caldus和敲除菌株A.caldus(Δact)中产生的信号分子：方法是以常规方式将构建的敲除菌株A.caldus(Δact)和野生型A.caldus培养至对数后期，利用离心去除培养物中的菌泥及硫粉颗粒，上清液用等体积的二氯甲烷进行萃取制备AHL，再将二氯甲烷萃取液蒸干后溶于甲醇，获得的溶液即为酰基高丝氨酸内酯(AHLs)粗提液；
(2)利用液质联用LC-MS-MS技术进行鉴定：方法是以购买到的标准品AHLs为参照物，在野生型菌株A.caldus中LC-MS-MS检测鉴定出一种信号分子3-OH-C14-AHL，而在敲除菌株A.caldus(Δact)中未检测到任何类型的AHLs，由此确定，act基因编码合成的信号分子为3-OH-C14-AHL，即A.caldus中ACT类型群体密度感应系统产生的信号分子为3-OH-C14-AHL。
4.根据权利要求3所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的的提取与鉴定方法，其特征在于：所述敲除菌株A.caldus(Δact)是将野生型A.caldus中ACT类型群体感应系统中负责编码信号分子合成酶的基因act敲除后得到的工程菌株；其构建方法是：
利用分子克隆技术，PCR扩增出如SEQ No.1所示1071bp核苷酸序列的act基因上游同源臂UHA和如SEQ No.2所示1203bp核苷酸序列的act基因下游同源臂DHA，并通过同源重组方法将所述片段与自杀质粒pSDUDI连接，获得重组质粒命名为pSDUDI-UHA+DHA-act，并转化至大肠杆菌S17-1中；将含有重组质粒pSDUDI-UHA+DHA-act的大肠杆菌S17-1为供体菌，野生型A.caldus为受体菌，通过接合转移的方式将所述重组质粒转移至A.caldus中，利用同源臂内侧引物PAF2/R2进行菌落PCR验证后获得act基因单交换菌株；以含有质粒pMSD1-I-SecI的大肠杆菌SM10为供体菌，act基因单交换菌株为受体菌，通过接合转移的方式将质粒pMSD1-I-SecI转移至act基因单交换菌株中，利用同源臂外侧引物PAF1/R1，同源臂内侧引物PAF2/R2及act基因内引物PAF3/R3进行基因组PCR验证后获得敲除菌株命名为A.caldus(Δact)；
上述敲除菌株构建所需要引物为：
UHAF：atccacgcgtccgcccatatgCCGAAGCGGTAACGGAGTC
UHAR：atcgagaaagGGCGCTCAGTGCCCGAGG
DHAF：actgagcgccCTTTCTCGATGCCCTCGAGG
DHAR：tattaccgcgcggccgctagcTGTTCCCTTGCCAAACCCA
PAF1：TACCTTGTGGGGATTCTT
PAR1：GCCCTCTTTCTCCAACTCCC
PAF2：GCGCTGATCCCTCTGCTTG
PAR2：GCGCATTCTCCGCCATTTT
PAF3：ATCGTCCGGTGGTACTCGTCT
PAR3：CTCCAGCAGTGCCGTGAAA。
5.根据权利要求4所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子的的提取与鉴定方法，其特征在于：所述接合转移过程中，供体菌与受体菌均需震荡培养至对数中期，其中震荡培养转速不高于180rpm/min，为确保供受体菌性菌毛不受损坏，菌体离心收集时转速不高于8000rpm/min，供体菌与受体菌接合比例为体积比1:2。
6.权利要求1或2所述嗜酸性喜温硫杆菌中的信号分子在加速菌株硫氧化或在调控硫代谢和生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法是：向敲除菌株A.caldus(Δact)中添加5±1μM市场购买的标准品3-OH-C14-AHL，同时以不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)为对照组；以单质硫为唯一能源进行培养，测量野生型菌株A.caldus、不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)及添加5μM 3-OH-C14-AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量变化；结果显示与不添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相比，添加AHL的敲除菌株A.caldus(Δact)相对生物量增加，且菌株胞外多糖及生物被膜的形成及生长代谢能力提高。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述3-OH-C14-AHL的添加时期为A.caldus培养初期，其添加终浓度为5μM。
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