CN105505964B - 一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用 - Google Patents

一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用，属于沼气发酵技术领域。本发明所提供的方法是通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。本发明方法克服了厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确监测发酵状态及检测发酵体系中的目标微生物，定量追踪微生物数量，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。

Description

一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用，属于沼气发酵技术领域。
背景技术
随着化石能源危机不断加剧，环境问题日益突出，可再生清洁能源受到越老越多的关注。而沼气发酵由于其能量产出/投入比(28:1)高，可利用底物广泛，产物清洁，具有突出的优势。目前，中国运营了上万个大中型沼气工程，但普遍存在处理效率低和运行稳定性差等问题。沼气工程是一个生物化学过程，对微生物的监测和控制至关重要。由于微生物的适应性及发酵条件的多因素互相影响，厌氧发酵过程通常在产气量下降之前很难发现问题。发酵体系对有机负荷、抑制物浓度等条件的变化十分敏感，而一旦出现发酵失败，发酵菌群失衡，活性污泥分解破坏，发酵较难恢复。这对生产、经济造成极大影响。
利用复杂有机物产生甲烷，需要大量的微生物参与。根据其代谢特性，可以分为产甲烷微生物和非产甲烷微生物两类。具体地，根据厌氧发酵4阶段理论，可以分水解微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物和产甲烷微生物4类。这些微生物进行一系列的生物化学偶联反应，存在物质、能量上的相互依赖，又互相制约的关系，整个代谢过程极为复杂。因此，对于微生物发酵情况的监测也很难进行。常用的监测方法为FISH技术、Real TimeQuantity PCR、DGGE/TGGE、16S rRNA序列比较法、T-RFLP法、宏基因组测序等。这些方法具有检测周期长、耗费大、不能准确反映细胞生物量等缺点。
绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)是由238个氨基酸组成的蛋白，最初是由Shimomure从多管水母中提取出来的。野生的GFP具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰。GFP作为分子标记物，其荧光性质特殊，具有诸多优点而备受关注。首先，GFP易于检测，灵敏度高，其荧光反应不需要外加底物和辅助因子。其次，载体构建方便，且对细胞无毒害，因此可以直接用于活细胞测定。再次，GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、动物、植物中都获得成功表达。
因此，本发明将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确的对发酵体系中目标微生物的监测，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。
发明内容
本发明的目的在于针对厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，采用GFP标记的方法，能够实现快速检测发酵状态的监测，定量追踪微生物数量。本发明提供了一种实时监测沼气发酵体系的方法，采用的技术方案如下：
本发明的目的在于提供一种实时监测沼气发酵体系的方法，该方法是通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。
优选地，所述宿主微生物，为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物。
优选地，所述宿主微生物，含有原核表达载体pET15b-gfp。
优选地，所述方法，步骤如下：
1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；
2)将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；
3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp转入宿主微生物细胞中，培养后筛选阳性克隆，获得GFP基因标记的工程菌；所述宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物；
4)将步骤3)获得的GFP基因标记的工程菌添加到沼气发酵体系中，通过测定荧光值实时监测发酵系统。
优选地，步骤1)所述PCR扩增所利用的引物含有BamH I酶切位点。
优选地，步骤3)所述宿主微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物或产甲烷微生物。
优选地，步骤3)所述转入，方式为电转化。
优选地，步骤3)所述培养，是在厌氧条件下培养。
更优选地，所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；所述PCR扩增所利用的引物含有BamHI酶切位点；
2)利用BamH I酶对pET15b质粒进行酶切处理，利用DNA连接酶将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；
3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp通过电转化转入宿主微生物细胞中，厌氧条件下进行培养；所述宿主微生物含有原核表达载体pET15b-gfp；所述宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物或产甲烷微生物；
4)在荧光显微镜下挑选具有荧光的单克隆，获得GFP基因标记的工程菌；
5)将步骤4)获得的GFP基因标记的工程菌添加至沼气发酵体系中，通过定时定点取样、测定荧光值，实时监测目标微生物在体系中的时间和空间分布，以及在有机负荷或有害物质冲击下微生物的活性。
以上所述任一方法在实施监测厌氧发酵体系、沼气发酵体系、追踪目标微生物、监测微生物空间和时间分布，以及监测在外界冲击下生物量变化中的应用。
本发明有益效果：
本发明将绿色荧光蛋白标记法引入到厌氧发酵产沼气体系中，解决了厌氧发酵难于监测的问题，从微生物层面实现对发酵体系进行实时监控。本发明方法克服了厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确监测发酵状态及检测发酵体系中的目标微生物，定量追踪微生物数量，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。
附图说明
图1为细胞密度与相对荧光密度相关性。
图2为DSM5812-GFP随发酵时间变化。
图3为原料预处理对微生物的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
本发明方法是通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；PCR扩增所利用的引物含有BamH I酶切位点；利用BamH I酶对pET15b质粒进行酶切处理，利用DNA连接酶将扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；将重组子pET15b-gfp通过电转化转入宿主微生物细胞中，厌氧条件下进行培养；所述宿主微生物含有原核表达载体pET15b-gfp；宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物和产甲烷微生物；在荧光显微镜下挑选具有荧光的单克隆，获得GFP基因标记的工程菌；将GFP基因标记的工程菌添加至沼气发酵体系中，通过定时定点取样、测定荧光值，实时监测目标微生物在体系中的时间和空间分布，以及在有机负荷或有害物质冲击下微生物的活性。
实施例1：Clostridium cellulolyticum细胞生长密度与荧光密度相关性
Clostridium cellulolyticum菌购自德国菌种保藏中心(DSM5812)。以质粒pMUTIN-gfp为模板，扩增gfp基因。
上游引物为F：5’-CGGGATCCAAGAAGATATACATATGGCT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物为R：5’-CGGGATCCCTCGAATTCATTATTTGTAG-3’(SEQ ID NO.2)，下划线为BamH I酶切位点。
扩增体系为25μL，反应程序如下：95℃模板预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸90s。共30个循环，最后延伸72℃下10min。PCR扩增产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离，利用纯化试剂盒进行纯化。PCR产物与pET15b载体分别使用BamH I限制性内切酶酶切，然后通过连接试剂盒连接得到重组子pET15b-gfp。
DSM5812菌种在严格厌氧条件下，35℃培养，取对数前期的菌体放置于冰上预冷，4℃下10000rpm离心5min，弃上清，使用超纯水将菌体重悬洗涤，4℃下10000rpm离心5min。重复两次。然后用10％无菌预冷的甘油重悬菌体，得到感受态细胞。取1μLpET15b-gfp重组质粒，与1.5mL感受态细胞混合，冰上放置10min。随后将混合物转移至电极杯中，调节电压为2.1kV，点击后立即加入培养基重悬细胞，转移到离心管中，35℃复苏培养1h。然后取菌液划平板，通过PCR法检测阳性克隆。将阳性克隆在液体培养基中厌氧培养，定时取样在空气中快速震荡30min使GFP前体成熟，能检测到荧光的菌种即为标记菌种(DSM5812-GFP)，并记录荧光值。细胞密度与相对荧光密度相关性如图1所示。
由图1可知，细胞数量与荧光量呈明显的正相关，表明利用绿色荧光蛋白标记法可以客观准确的表明厌氧微生物的生物量。
实施例2：监测GFP标记的Clostridium cellulolyticum(DAM5812-GFP)在渗漏式反应器中活性
玉米秸秆粉碎为1×1cm块状料，与活性污泥按照VS比2:1混合后，添加适量水，调节总TS含量达8％，并添加NH4Cl补充氮源，用NaHCO3调节碱度为3000mg CaCO3/L。使用2MNaOH溶液吸收H2S、CO2等酸性气体，产气量通过排碱液法测定，即为甲烷产量。厌氧条件下培养DSM5812-GPF，待OD600生长至0.45时，离心收集菌体，并用少量的培养基重悬菌体。在N2保护下，将菌液添加到渗漏式厌氧反应器中。通过渗漏液循环法使菌体均匀分布。发酵0、2、5、10、15d时取循环渗漏液20mL，空气中快速震荡30min后定时取样，测定荧光量。
结果表明，发酵初始因秸秆中有可溶性糖及易降解组分可被微生物代谢，因此细胞浓度略有上升。随后底物限制，及部分细胞吸附到秸秆表面，渗漏液中荧光强度呈下降趋势。DSM5812-GFP随发酵时间变化如图2所示。
实施例3 原料预处理对沼气发酵菌群中水解微生物的影响
玉米秸秆粉碎为1×1cm块状料，添加水调节TS至10％。添加6％NaOH(w/w)，于30℃下，100rpm，处理3d。结束后通过压榨固液分离，得到碱处理秸秆。分别以碱处理秸秆和未处理秸秆作为发酵底物，与活性厌氧污泥以VS比2:1混合，在渗漏式反应器中发酵。发酵条件、菌种添加及取样测定同实施例2所述。
结果表明，初始碱处理反应器中所检测到的DSM5812-GFP浓度较低，表明预处理后秸秆表面更易于微生物吸附。随着发酵进行，碱处理秸秆破坏了木素对纤维素的物理阻隔作用，使得纤维素更易被微生物降解，因此实验组DSM5812-GFP浓度上升速率较未处理组快，且持续高于未处理组。原料预处理对沼气发酵菌群中水解微生物的影响如图3。以上表明本发明方法可以检测原料预处理对发酵过程中微生物的影响。
以上实施例说明本发明方法将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确监测发酵状态及检测发酵体系中的目标微生物，定量追踪微生物数量，进而及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Figure IDA0000888722410000011

Claims (6)

1.一种实时监测沼气发酵体系的方法，其特征在于，步骤如下：
1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；
2)将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；
3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp转入宿主微生物细胞中，培养后筛选阳性克隆，获得GFP基因标记的工程菌；所述宿主微生物为外源添加微生物DSM5812；
4)将步骤3)获得的GFP基因标记的工程菌添加到沼气发酵体系中，通过测定荧光值实时监测发酵系统。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增所利用的引物含有BamHI酶切位点。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述转入，方式为电转化。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)所述培养，是在厌氧条件下培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；所述PCR扩增所利用的引物含有BamH I酶切位点；
2)利用BamH I酶对pET15b质粒进行酶切处理，利用DNA连接酶将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；
3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp通过电转化转入宿主微生物细胞中，厌氧条件下进行培养；所述宿主微生物含有原核表达载体pET15b-gfp；所述宿主微生物为外源添加微生物DSM5812；
4)在荧光显微镜下挑选具有荧光的单克隆，获得GFP基因标记的工程菌；
5)将步骤4)获得的GFP基因标记的工程菌添加至沼气发酵体系中，通过定时定点取样、测定荧光值，实时监测目标微生物在体系中的时间和空间分布，以及在有机负荷或有害物质冲击下微生物的活性。
6.权利要求1-5所述任一方法在实时监测厌氧发酵体系、追踪目标微生物、监测微生物空间和时间分布，以及监测在外界冲击下生物量变化中的应用。
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