CN1818072A - 家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法 - Google Patents

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本发明公开了一种家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法。该质粒的构建是基于目前已有的供体质粒pFastBacHTa，b，c和杆状病毒转移载体pAcGP67－B，采用基因重组原理构建而成，具有强的蛋白质分泌能力为特征。该分泌型供体质粒的构建为能获得分泌的重组蛋白质创造了条件。

Description

家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术、杆状病毒基因表达系统、蛋白质的纯化与活性分析，尤其涉及一种家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法。
背景技术
家蚕杆状病毒基因表达系统是目前高效的真核表达系统之一，但目前的技术在重组病毒构建和纯化过程中存在着重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长的缺点。为了较好地解决这个问题，我们借鉴国外AcNPV快速基因表达系统工作原理，利用细菌转座子的基因定位转移作用，在大肠杆菌内实现基因的转移重组，快速获得重组病毒，构建了可利用我国特色资源昆虫-家蚕的快速基因表达系统(专利已授权，名称：利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法授权公告日：2005-10-11，专利号：2003101087818)。该系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是：首先将外源目的基因克隆入供体质粒，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一并转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA，最后转染家蚕培养细胞而获得含有目的基因重组病毒。供体质粒是决定目的基因是如何进行表达的重要工具，目前美国Invitrogen公司已有产品出售，名称为pFastBacHTa，b，c(产品目录号：10584-027)，但该质粒不含有蛋白质信号肽分泌信号，致使表达的重组表达无法分泌出细胞外。而杆状病毒转移质粒pAcGP67-B(BD Biosciences公司：目录号：21223P)含有一个能够指导蛋白质分泌的强的信号肽序列，名称为GP67 Signal Sequence。利用基因重组原理，通过基因操作技术，将该信号肽序列重组入pFastBacHTa，b，c供体质粒。这样获得的分泌型供体质粒，能够用于家蚕快速杆状病毒表达系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕快速杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法。该质粒的构建是基于目前已有的供体质粒pFastBacHTa，b，c和杆状病毒转移载体pAcGP67-B，采用基因重组原理构建而成，具有强的蛋白质分泌能力为特征。该分泌型供体质粒的构建为能获得分泌的重组蛋白质创造了条件。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下：
杆状病毒转移质粒pAcGP67-B在多角体启动子Ph下游带有强分泌信号肽gp67序列，该序列赋予重组蛋白具有很强的分泌胞外的能力，将pAcGP67-B质粒分别转化人大肠杆菌DH5感受态细胞，随后进行质粒抽提，并进行EcoRV和HindIII双酶切处理，分离获得带有多角体启动子Ph启动子、gp67信号肽序列和多克隆位点的基因片段，大小为377bp；并对现有供体质粒pFastBacHTa，b，c进行SnaBI和HindIII酶切处理，切除原有的多角体启动子Ph启动子及其多克隆位点，由于EcoRV和SnaBI均为平末端，因此可以将上述377bp的片段与上述片段相连，产生一个新的供体质粒。
本发明具有的有益的效果是：该质粒的构建是基于目前已有的供体质粒pFastBacHTa，b，c和杆状病毒转移载体pAcGP67-B，采用基因重组原理构建而成，具有强的蛋白质分泌能力为特征。该分泌型供体质粒的构建为能获得分泌的重组蛋白质创造了条件。
附图说明
图1是杆状病毒转移载体pAcGP-B图；
图2是供体质粒pFastBacHTa，b，c图；
图3是分泌型供体质粒构建示意图；
a.杆状病毒转移载体pAcGP67-B酶切位点示意图；
b.供体质粒pFastBacHTa，b，c(invitrogen)，图中MCS(Multiple Cloning Sites)表示多克隆位点。
具体实施方式
为了使重组蛋白能有效地分泌出胞外，构建了具有强分泌能力特性的供体质粒。杆状病毒转移质粒pAcGP67-B(BD Biosciences公司：目录号：21223P，图1)在多角体启动子Ph下游带有强分泌信号肽gp67序列，该序列赋予重组蛋白具有很强的分泌胞外的能力，将pAcGP67-B质粒分泌转化人大肠杆菌DH5感受态细胞，随后进行质粒抽提，并进行EcoRV和HindIII双酶切处理，分离获得带有Ph启动子、gp67信号肽序列和多克隆位点的基因片段，大小为377bp；并对现有供体质粒pFastBacHTa，b，c(美国Invitrogen公司产品，目录号：10584-027，图2)进行SnaBI和HindIII酶切处理，切除原有的Ph启动子及其多克隆位点，由于EcoRV和SnaBI均为平末端，因此可以将上述377bp的片段与上述片段相连，产生一个新的供体质粒，将其命名为pBmBacGP67a，b，c。操作过程详见图3。
1、研究材料：家蚕快速杆状病毒表达系统由本研究室构建(专利已授权，名称：利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法授权公告日：2005-10-11，专利号：2003101087818)由本申请人自行构建。DH5α、DH10β菌株、供体质粒pFastBacHTa，b，c均购自美国Invitrogen。杆状病毒转移载体pAcGP67-B购自BD公司。各种限制性内切酶、连接酶等分子生物学操作试剂购自日本Takara公司。
2、工作流程：
将pAcGP67-B质粒分泌转化人大肠杆菌DH5感受态细胞，随后进行质粒抽提，并进行EcoRV和HindIII双酶切处理，分离获得带有Ph启动子、gp67信号肽序列和多克隆位点的基因片段，大小为377bp；并对现有供体质粒pFastBacHTa，b，c(美国Invitrogen公司产品，目录号：10584-027，图2)进行SnaBI和HindIII酶切处理，切除原有的Ph启动子及其多克隆位点，由于EcoRV和SnaBI均为平末端，因此可以将上述377bp的片段与上述片段相连，产生一个新的供体质粒，将其命名为pBmBacGP67a，b，c。操作过程详见图3。

Claims (1)

1、家蚕杆状病毒表达系统的分泌型供体质粒的构建方法，其特征在于：杆状病毒转移质粒pAcGP67-B在多角体启动子Ph下游带有强分泌信号肽gp67序列，该序列赋予重组蛋白具有很强的分泌胞外的能力，将pAcGP67-B质粒分别转化人大肠杆菌DH5感受态细胞，随后进行质粒抽提，并进行EcoRV和HindIII双酶切处理，分离获得带有多角体启动子Ph启动子、gp67信号肽序列和多克隆位点的基因片段，大小为377bp；并对现有供体质粒pFastBacHTa，b，c进行SnaBI和HindIII酶切处理，切除原有的多角体启动子Ph启动子及其多克隆位点，由于EcoRV和SnaBI均为平末端，因此可以将上述377bp的片段与上述片段相连，产生一个新的供体质粒。
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