CN112779273A

CN112779273A - 人工合成的对草地贪夜蛾高毒力杀虫基因及应用

Info

Publication number: CN112779273A
Application number: CN202110008895.3A
Authority: CN
Inventors: 郎志宏; 李圣彦; 张明俊; 韩庚辰; 张�杰; 邓德芝; 李鹏程
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-01-05
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-01-05
Also published as: CN112779273B

Abstract

本发明涉及人工合成的对草地贪夜蛾高毒力杀虫基因及应用，以植物偏好的密码子优化苏云金芽胞杆菌的vip3Aa11基因，人工合成vip3Aa‑m3和vip3Aa‑m4基因，构建得到表达载体pBRI‑IRGT5901和表达载体pBRI‑IRGT5902。利用农杆菌介导法将所构建的表达载体转化玉米自交系品种，获得了抗草地贪夜蛾的玉米转化事件，Vip3Aa蛋白表达量约在0.2～7.1μg/g鲜重之间，且转vip3Aa‑m3基因玉米对草地贪夜蛾表现出高杀虫活性，外源基因和抗虫性状可以稳定遗传至下一代，获得的抗虫转基因玉米材料具有很好的应用价值，可以作为候选材料进行下一步抗草地贪夜蛾玉米的育种工作。

Description

人工合成的对草地贪夜蛾高毒力杀虫基因及应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别是涉及人工合成的对草地贪夜蛾高毒力的杀虫基因及其应用。

背景技术

虫害是世界农作物减产的一个重要因素，平均每年因此损失粮食总产量的10％左右，直接经济损失达100亿美元以上。过去几十年的防治主要依赖化学农药，在为农业生产做出巨大贡献的同时，化学农药却造成了环境污染、人畜中毒、生态失衡等严重后果。在这些巨大的代价面前，全球都在寻找和开辟新的病虫害防治策略和技术。

草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)属鳞翅目，夜蛾科，原产于美洲热带和亚热带地区的杂食性害虫，草地贪夜蛾于2016年1月首次入侵非洲(Goergen et al，2016，PLoSOne,11(10):e0165632)，2018年5月入侵印度，两年间已在多个国家暴发虫灾；2019年在中国云南监测到草地贪夜蛾入侵，国内入侵的草地贪夜蛾为玉米型，由于其较强的迁飞能力和繁殖能力，将对玉米生产和国家粮食安全产生极大威胁(郭井菲等，警惕危险性害虫草地贪夜蛾入侵中国.植物保护，2018,44(6):1-10；吴秋琳等，草地贪夜蛾缅甸虫源迁入中国的路径分析.植物保护，2019，45(2):1-6)。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，它在形成芽胞的同时，能产生蛋白性质的伴胞晶体(parasporal crystal)，对多种昆虫、线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf et al,Bacillusthuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiology and MolecularBiology Review,1998,62(3):775-806)。杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)主要由cyt和cry基因编码。苏云金芽胞杆菌在营养生长期也会产生一类杀虫蛋白，并分泌到胞外，不形成晶体，称为营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidalproteins，VIP)，营养期杀虫蛋白杀虫过程与晶体蛋白类似，即在昆虫中肠首先溶解，成为原毒素，之后被肠道蛋白酶降解为具有专一活性的毒素，与中肠上特异的受体进行结合(Pigott&Ellar,Role of receptors in Bacillus thuringiensis crystal toxinactivity.Microbiology and Molecular Biology Review,2007,71(2):255–281)，导致昆虫死亡。营养期杀虫蛋白与杀虫晶体蛋白氨基酸序列相似性不高，在中肠结合的受体蛋白也不相同(Lee et al,The mode of action of the Bacillus thuringiensisvegetative insecticidal protein Vip3A differs from that of Cry1Abδ-endotoxin.Applied and Environmental Microbiology,2003,69(8):4648-4657)。苏云金芽胞杆菌对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了广泛应用。

到目前为止克隆的编码Vip蛋白的基因有147个，分属于vip1、vip2、vip3和vip4四类(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html),vip1和vip2基因形成双元毒素行使功能，vip3类基因单独具有杀虫活性，1996年，Estruch等人首次克隆了vip3A(a)基因和vip3A(b)基因，并证明vip3A基因对小地老虎(Agrotisipsilon),草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda),甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),烟芽叶蛾(Heliothis virescens)具有杀虫毒性(Estruch et al,Vip3A,a novel Bacillusthuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum ofactivities against lepidopteran insects.Proceedings of National Academy ofSciences of United States of America,1996,93(11):5389-5394)，同时申请了发明专利(Class of proteins for the control of plant pests,US Patent No.5877012)，之后不同国家的科学家相继克隆了不同的vip3Aa基因：vip3Aa1到vip3Aa66，vip3Aa1～vip3Aa66不同基因氨基酸序列相似性在95％-100％之间，只存在个别氨基酸的差异。Vip3Aa类基因虽然在氨基酸序列上只有个别氨基酸的变化，但是在杀虫特异性和杀虫活性上表现出很大不同。Gayen等人对vip3ABR基因的N端和C端进行了不同长度的缺失，vip3ABR基因与vip3Aa、vip3Ab等基因只有个别氨基酸差别，结果N-端缺失200个氨基酸残基的Ndv200蛋白对棉铃虫、小地老虎、海灰翅夜蛾和三化螟的杀虫活性提高了2-3倍，而C-端缺失200个氨基酸的Cdv200蛋白活性丧失(Gayen et al,Identification of the bioactivecore component of the insecticidal Vip3A toxin peptide of Bacillusthuringiensis.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology,2012，21(S1):S128-S135)，雒国兴等对Vip3Aa11蛋白C端9个位点进行了点突变，不同突变蛋白对不同的目标害虫表现了不同的杀虫活性，三个突变体蛋白S543N、I544L和S686R对甜菜夜蛾活性明显升高，其活性分别提高了5倍、2.65倍和8.98倍，但三个突变体对棉铃虫和小地老虎的杀虫活性有不同程度的降低，Y784N突变蛋白对三种害虫杀虫活性完全丧失(雒国兴，BtVip3Aa11蛋白羧基端点突变对其杀虫活性和敏感性的影响，2017，东北农业大学硕士学位论文；对甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa11蛋白突变体，高继国等，中国专利ZL201610835482.1)，vip3Aa基因对不同害虫的杀虫活性差异的机理未见报道，更多的研究是对不同目标害虫的抗虫性检测。

1987年，Vaeck等人首次将Bt杀虫晶体蛋白基因转入烟草，开创了人类利用转基因技术防治害虫的先河(Vaeck et al,Transgenic plants protected from insectattack.1987，Nature,328:33-37)。但是在转基因研究中人们发现将来源于Bt的杀虫蛋白基因直接转入植物，存在着表达产物不稳定、表达量少的缺陷(van Aarssen et al,cry IA(b)transcript formation in tobacco is inefficient.1995,Plant MolecularBiology,28:513-524)。具体问题包括：1)天然Bt基因高含AT，超过60％，在植物体内这样的基因表达的mRNA极易被植物降解；2)天然Bt基因中存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，从而造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密码子与植物存在较大差异，会造成蛋白翻译效率降低；4)天然Bt基因作为原核生物来源的基因，其结构与植物等真核生物差异显著，如真核生物含有5’-UTR序列，3’末端的polyA尾序列。因此，这些关键问题的解决是实现Bt基因在植物中高效、稳定表达的重要保证。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明将来源于苏云金芽胞杆菌的vip3Aa11基因在氨基酸序列不变的情况下利用植物偏好密码子优化，人工合成了vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因，构建植物表达载体，转化单子叶植物玉米，获得的转vip3Aa-m3基因玉米对草地贪夜蛾具有高杀虫活性，vip3Aa-m3基因对草地贪夜蛾的杀虫活性显著高于vip3Aa-m4基因。

一种用于植物转化的Bt vip3Aa-m3的人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

一种用于植物转化的Bt vip3Aa-m4的人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

一种植物表达载体，其特征是该植物表达载体含有上述的人工合成序列和在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。

所述双元载体为pPZP200载体或pCAMBIA3300载体。

所述植物表达载体为pBRI-IRGT5901和pBRI-IRGT5902，其结构分别如图1、图2所示。

上述植物表达载体在转化单子叶植物使之产生抗鳞翅目害虫特性方面的应用。

所述转化的方法为农杆菌介导法，所述单子叶植物为玉米。

所述鳞翅目害虫为草地贪夜蛾。

本发明对Bt vip3Aa11基因的核苷酸序列进行了密码子优化，并通过人工合成的方式合成了新基因vip3Aa-m3和vip3Aa-m4，构建植物表达载体转化植物，获得了高抗草地贪夜蛾的转基因植物，提高了在转基因植物中的蛋白Bt vip3Aa11表达量和稳定表达的特性。与转vip3Aa-m4(SEQ ID NO.4)基因植物相比，转vip3Aa-m3(SEQ ID NO：3)基因的植物表现出对草地贪夜蛾的高毒力，所以vip3Aa-m3基因是用于防治草地贪夜蛾的重要候选基因，有很好的应用潜力。

本申请中密码子优化的基因vip3Aa-m3和vip3Aa-m4在转基因玉米中表达稳定，杀虫蛋白表达量稳定，但是在对草地贪夜蛾的杀虫活性上表现出不同，转vip3Aa-m3基因玉米比转vip3Aa-m4基因玉米对草地贪夜蛾的杀虫活性更高，所以vip3Aa-m3基因是培育抗草地贪夜蛾的重要候选基因，获得的转vip3Aa-m3基因玉米可以用于抗草地贪夜蛾玉米育种，培育高抗草地贪夜蛾的玉米品种满足生产需求。

附图说明

图1植物表达载体pBRI-IRGT5901构建示意图，

图2植物表达载体pBRI-IRGT5902构建示意图，

图3转vip3Aa-m3基因玉米的PCR检测，

其中M为DNA分子量Marker，由8条DNA片段组成，条带大小自上而下分别为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、800bp、500bp和300bp；CK+以pBRI-IRGT5901质粒为模板的PCR扩增；CK-以非转基因玉米基因组DNA为模板的PCR扩增；1～8以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；0以H₂O为模板的空白对照，

图4转vip3Aa-m4基因玉米的PCR检测，

其中M为DNA分子量Marker，由8条DNA片段组成，条带大小自上而下分别为5,000bp、3,000bp、2,000bp、1,500bp、1,000bp、800bp、500bp和300bp；CK+以pBRI-IRGT5902质粒为模板的PCR扩增；CK-以非转基因玉米基因组DNA为模板的PCR扩增；1～10以转化植株基因组DNA为模板的PCR扩增；0以H₂O为模板的空白对照

图5ELISA分析转pBRI-IRGT5901载体的转基因玉米中Vip3Aa蛋白表达量，

图6ELISA分析转pBRI-IRGT5902载体的转基因玉米中Vip3Aa蛋白表达量，

图7转vip3Aa-m3基因玉米和转vip3Aa-m4基因玉米对草地贪夜蛾抗虫性鉴定，

其中：A、B玉米植株接草地贪夜蛾初孵幼虫(接虫第1天)；C转pBRI-IRGT5901载体的转基因玉米对草地贪夜蛾抗虫性鉴定(接虫第3天)；D转pBRI-IRGT5902载体的转基因玉米对草地贪夜蛾抗虫性鉴定(接虫第3天)；E非转基因玉米对草地贪夜蛾抗虫性鉴定(接虫第3天)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

下面所涉及的生物材料在本申请人的实验室均有保藏，可以对外发放。

1、vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因的人工合成

根据Bt基因命名网站(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_ Crickmore/Bt/vip.html)列出的所有vip3Aa序列信息，通过https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站下载vip3Aa基因序列，其中Vip3Aa7、Vip3Aa10、Vip3Aa11、Vip3Aa12、Vip3Aa21和Vip3Aa22氨基酸序列相似性为100％，选取vip3Aa11基因序列，包括2370个核苷酸，编码789个氨基酸，核苷酸序列见SEQ ID NO 1，氨基酸序列见SEQID NO 2，按照植物密码子使用偏好性并兼顾玉米中表达特性，对vip3Aa11基因的核苷酸序列进行了人工合成，由于密码子优化无统一的标准并存在不确定性，人工合成了2个基因序列，分别为vip3Aa-m3和vip3Aa-m4，vip3Aa-m3基因合成序列长度为2373bp，序列见SEQ IDNO 3，编码789个氨基酸和2个终止密码子，vip3Aa-m4基因合成序列长度为2370bp，序列见SEQ ID NO 4，编码789个氨基酸和1个终止密码子。两个合成基因在密码子使用频率和GC含量有所差异，表1列出了两个合成基因的密码子使用偏好性百分率，vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因与vip3Aa11原始基因的相似性分别是69.83％和66.96％，vip3Aa11原始基因GC％是30.8％，vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因GC％分别是52.5％和58.6％，vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因核苷酸序列相似性是85％。

表1 vip3Aa-m3和vip3Aa-m4基因密码子使用及偏好性分析

2、植物表达载体的构建

人工合成的vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因的两端分别增加了多克隆位点，vip3Aa-m3基因5’端含有Spe I酶切位点，3’端含有Kpn I酶切位点，vip3Aa-m4基因5’端含有Bam HI酶切位点，3’端含有Kpn I酶切位点，vip3Aa-m3基因合成序列构建到pUC57载体，称为pUV11N,vip3Aa-m4基因合成序列构建到pUC57载体，称为pUV11mN(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)。将人工合成的vip3Aa-m3基因和vip3Aa-m4基因分别构建到玉米ubiquitin启动子下游和NOS终止子上游，获得ubiquitin启动子驱动的vip3Aa基因和NOS终止子的表达盒，vip3Aa-m3基因表达盒利用同源重组的方法插入到含有cp4-epsps基因的载体上，获得含有抗虫基因vip3Aa-m3和耐草甘膦基因cp4-epsps基因的表达盒,利用同源重组的方法将两个表达盒连接到具有pPZP200骨架的gateway双元表达载体(载体为常用的用于植物转化的商业载体)，构建获得的载体为pBRI-IRGT5901(载体示意图见图1)；vip3Aa-m4基因表达盒用HindⅢ和Eco RⅠ回收约4.9Kb的片段，连接到用同样酶切的pCAMBIA3300(质粒保存在中国农业科学院生物技术研究所郎志宏课题组，可以向公众提供)，构建获得的载体称为pBRI-IRGT5902(载体示意图见图2)。

3、玉米转化

用农杆菌转化法将构建的pBRI-IRGT5901和pBRI-IRGT5902转化玉米幼胚，转化方法是将剥离的玉米幼胚用侵染培养液冲洗2次之后，加入1ml农杆菌悬液，静置15min。将幼胚转移到共培养基(N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4D，0.7g/L脯氨酸，68.4g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH 5.2)上，盾片向上，20℃暗培养3天。3天后将幼胚转移到恢复培养基(N6盐和N6维生素，1.5mg/L 2,4D，0.7g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，0.5g/L MES，4g/L植物凝胶，pH 5.8)上，28℃暗培养7天。恢复培养7天后，将幼胚转移到筛选培养基(恢复培养基+筛选剂)中，28℃黑暗培养，每两周继代一次。筛选6周后将生长良好的愈伤组织转移到再生培养基Ⅰ(MS盐和MS维生素，60g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶，pH 5.8)上，28℃暗培养三周。将愈伤组织转移到再生培养基Ⅱ(MS盐和MS维生素，30g/L蔗糖，100mg/L肌醇，3g/L植物凝胶，pH 5.8)上，光周期为光/暗＝16/8，28℃培养，每两周继代一次。当再生植株长到1-2cm时，转移至玻璃瓶中继续培养。待长出较发达的根系时，将生根状态良好的植株在温室炼苗1～2d后，移入营养钵中，保湿，待苗子成活后移到大花盆生长，获得抗性植株。

4、转化玉米的PCR检测

(1)转vip3Aa-m3基因玉米的PCR检测

提取转化pBRI-IRGT5901载体的玉米植株的基因组DNA，按照vip3Aa-m3基因序列设计引物，引物序列为：

vip3Aa-m3F1:5'AAATCACTCCCGCCTACCAA 3'

vip3Aa-m3R1:5'TGATTGGGGTCAGGAAGGTC 3'

目的片段大小：966bp

PCR反应体系(20μl)：

反应条件：

94℃5min；94℃20s，56℃20s，72℃1min，34cycles；72℃10min，4℃pause。，取PCR产物5μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物电泳结果图见图3。

(2)转vip3Aa-m4基因玉米的PCR检测

提取转化pBRI-IRGT5902载体的玉米转化植株基因组DNA，根据vip3Aa-m4基因序列设计引物：

Vip3Aa-m4F1:5'CGTGTTCCCCAACGAGT 3'

Vip3Aa-m4R1:5'TGCTTCAGGATGCCCC 3'

目的片段大小：885bp

PCR反应体系(20μl)：

PCR反应条件：94℃5min94℃5min；94℃20s，55℃20s，72℃1min，34cycles；72℃10min，4℃pause。，取PCR产物5μl进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物电泳结果图见图4。

5、转基因玉米的ELISA检测

使用Vip3A酶联免疫定量检测试剂盒(上海佑隆生物科技有限公司)进行ELISA检测。取0.1g玉米幼嫩叶片，加入1ml样品提取液进行提取，提取液稀释50倍用于分析。取100μl样品稀释液加入酶标孔中，轻微震荡混匀，25℃避光反应45min；洗涤工作液250μl/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s；加入抗体工作液100μl/孔，轻微震荡混匀，25℃避光反应30min；重复洗板工作；加入酶标工作液100μl/孔，轻微震荡混匀，25℃避光反应30min；重复洗板工作；加入显色剂100μl/孔，25℃避光反应15min；加入终止液100μl/孔，轻微震荡混匀，450nm测定样品OD值。根据标准曲线计算样品中Vip3Aa蛋白的含量。

在检测的24个转pBRI-IPGT5901载体的转基因玉米植株中，Vip3Aa蛋白的最大表达量为2657.19ng/g鲜重，其中有4个转基因株系的Vip3Aa蛋白的表达量大于2000ng/g鲜重，表达量最低的IPGT5901-108株系中Vip3Aa蛋白为247.96ng/g鲜重(图5)。

检测了24个转pBRI-IPGT5902载体的转基因玉米植株，Vip3Aa蛋白的最大表达量为7190.30ng/g鲜重，Vip3Aa蛋白的表达量大于2000ng/g鲜重的转基因玉米有17个株系，表达量最低的株系是IPGT5902-12，表达量为222.17ng/g鲜重(图6)。

6、转基因玉米的草地贪夜蛾抗虫性鉴定

草地贪夜蛾初孵幼虫用于转基因玉米的抗虫性鉴定，每个转基因玉米株系取40粒玉米种子种于含有营养土的营养钵中，待玉米长至10天，将PCR检测阳性植株取出插入含有2％琼脂的玻璃瓶中(直径9cm x高20cm)，每瓶5株玉米，接5头草地贪夜蛾初孵幼虫，重复3次，置于温度为(26±1)℃，湿度为60％±10％，光周期为L//D＝16h//8h的培养室内，每天观察玉米为害状和统计幼虫的死亡数。饲喂3d后，转基因植株对草地贪夜蛾幼虫表现出明显的抗虫性，转pBRI-IPGT5901载体的玉米其叶片仅被取食几个小孔后，幼虫成黑色中毒状态死亡，少数未死亡幼虫，呈现一种僵化状态，对叶片不再有损害(图7中C)，转pBRI-IPGT5902载体玉米叶片有少量为害，有部分幼虫存活，但生长缓慢(图7中D)，而非转基因植株(WT)被草地贪夜蛾危害严重，叶片被大量取食(图7中E)。比较转pBRI-IPGT5901载体和转pBRI-IPGT5902载体的转基因玉米植株对草地贪夜蛾的抗虫性发现，在Vip3Aa蛋白表达量一致的情况下，转pBRI-IPGT5901载体的玉米植株比pBRI-IPGT5902载体的玉米植株表现出高抗虫性，比较两个载体可以看出，两个不同密码子优化的vip3Aa11基因，选用了相同的启动子ubiquitin，氨基酸序列相同，不同的是密码子优化的核苷酸序列，本申请发现利用vip3Aa-m3基因转化玉米获得了高抗草地贪夜蛾的转基因玉米株系，转vip3Aa-m4基因玉米对草地贪夜蛾的抗性低于转vip3Aa-m3基因玉米。vip3Aa-m3基因在防治草地贪夜蛾中可用于单子叶植物的转化，可以获得高抗草地贪夜蛾的转基因植物，是有应用前景的杀虫基因。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 人工合成的对草地贪夜蛾高毒力杀虫基因及应用

<141> 2021-01-05

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2370

<212> DNA

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 1

atgaacaaga ataatactaa attaagcaca agagccttac caagttttat tgattatttt 60

aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaacatgat ttttaaaacg 120

gatacaggtg gtgatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgat 180

atttctggta aattggatgg ggtgaatgga agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240

ttaaatacag aattatctaa ggaaatatta aaaattgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300

aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcgggtata tctacctaaa 360

attacctcta tgttgagtga tgtaatgaaa caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420

tacttaagta aacaattgca agagatttct gataagttgg atattattaa tgtaaatgta 480

cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcgtatc aaaggattaa atatgtgaac 540

gaaaaatttg aggaattaac ttttgctaca gaaactagtt caaaagtaaa aaaggatggc 600

tctcctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aactagcgaa aagtgtaaca 660

aaaaatgatg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720

aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcatcgg aattaattac taaagaaaat 780

gtgaaaacaa gtggcagtga ggtcggaaat gtttataact tcttaattgt attaacagct 840

ctgcaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900

attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960

aacatcctcc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga 1020

agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt gattgggttt 1080

gaaattagta atgattcaat tacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat 1140

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tgcccagatc aatctgaaca aatctattat acaaataaca tagtatttcc aaatgaatat 1260

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aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt 1380

gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatgggg tgtatatgcc gttaggtgtc 1440

atcagtgaaa catttttgac tccgattaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca 1500

agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta 1560

agcaataaag aaactaaatt gatcgtcccg ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag 1620

aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat 1680

gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga 1740

atttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact 1800

gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa 1860

gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattaata aacgttttac tacaggaact 1920

gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat 1980

aactttatta ttttggaaat tagtccttct gaaaagttat taagtccaga attaattaat 2040

acaaataatt ggacgagtac gggatcaact aatattagcg gtaatacact cactctttat 2100

cagggaggac gagggattct aaaacaaaac cttcaattag atagtttttc aacttataga 2160

gtgtattttt ctgtgtccgg agatgctaat gtaaggatta gaaattctag ggaagtgtta 2220

tttgaaaaaa gatatatgag cggtgctaaa gatgtttctg aaatgttcac tacaaaattt 2280

gagaaagata acttttatat agagctttct caagggaata atttatatgg tggtcctatt 2340

gtacattttt acgatgtctc tattaagtag 2370

<210> 2

<211> 789

<212> PRT

<213> 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)

<400> 2

Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe

1 5 10 15

Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp

20 25 30

Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys

50 55 60

Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn

65 70 75 80

Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln

85 90 95

Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr

100 105 110

Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val

115 120 125

Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys

130 135 140

Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val

145 150 155 160

Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile

165 170 175

Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu

195 200 205

Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val

210 215 220

Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly

225 230 235 240

Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile

245 250 255

Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr

260 265 270

Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr

275 280 285

Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr

290 295 300

Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val

305 310 315 320

Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys

340 345 350

Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr

355 360 365

Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp

370 375 380

Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu

385 390 395 400

Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe

405 410 415

Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys

420 425 430

Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly

435 440 445

Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr

450 455 460

Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val

465 470 475 480

Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gln Ala

485 490 495

Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg

500 505 510

Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile

515 520 525

Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile

530 535 540

Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr

545 550 555 560

Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His

565 570 575

Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys

580 585 590

Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His

595 600 605

Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn

610 615 620

Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr

625 630 635 640

Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu

645 650 655

Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys

660 665 670

Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly

675 680 685

Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gln Gly Gly Arg

690 695 700

Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg

705 710 715 720

Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser

725 730 735

Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val

740 745 750

Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu

755 760 765

Leu Ser Gln Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr

770 775 780

Asp Val Ser Ile Lys

785

<210> 3

<211> 2373

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaacaaga acaacaccaa gctgagcacc cgcgcccttc catctttcat tgattacttc 60

aacggcatct acggcttcgc caccggcatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacc 120

gacaccggcg gtgaccttac cctcgatgag atcctgaaga atcaacagct ccttaacgac 180

atcagcggta agctggacgg cgtcaacggt agcctgaacg acctcattgc tcagggcaat 240

ctgaacacgg aactgagcaa ggagatcctc aagattgcta acgagcaaaa ccaggtgctg 300

aacgacgtga acaacaagct ggatgccatc aacactatgc tgagggttta tctccccaag 360

attacctcca tgctgagcga cgtgatgaag cagaactatg ccctctcttt gcagatcgag 420

tacctgtcca aacaattgca agaaatctct gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtg 480

ctgattaact caactctgac cgaaatcact cccgcctacc aacgtatcaa gtacgttaac 540

gaaaagtttg aggaactgac tttcgctacc gagacctcgt ccaaagtcaa gaaggatggc 600

agcccagccg acatcctgga tgaactgacc gagctgaccg agcttgctaa gagcgtgact 660

aagaatgacg tggacggctt cgagttctac ctgaacactt ttcacgacgt gatggtgggc 720

aacaacctgt tcggcagatc cgccctcaag actgcctcag agctgatcac caaggaaaac 780

gtgaagacca gcggcagcga ggtcggcaac gtgtacaact tcttgatcgt gctgaccgcc 840

ctccaggcca aggctttctt gactctgacc acctgcagga agctgctggg tttggccgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaatgagcac ctgaacaagg aaaaagagga gtttcgcgtg 960

aacatcctgc ccaccctgtc caacaccttc agcaacccga actacgctaa ggtgaagggt 1020

tcagatgagg atgccaagat gattgttgag gccaagcctg gtcacgccct gatcggcttt 1080

gagatttcca acgatagcat caccgtgctc aaggtctatg aagccaagct caagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggacag cttgtccgag gtgatttacg gtgacatgga caagctcctc 1200

tgccccgacc agagcgagca aatctactac actaataata tcgtcttccc aaatgagtac 1260

gtgatcacca agatcgactt caccaagaaa atgaagacgc tgaggtacga ggtcaccgcc 1320

aatttctacg actcatccac cggcgagatc gatcttaata aaaagaaggt cgagagctcc 1380

gaggctgaat accgcactct ctctgccaac gacgacggtg tttacatgcc tctgggcgtg 1440

atcagcgaga ccttcctgac cccaatcaac ggctttggcc tgcaggccga cgagaatagc 1500

aggctgatca ccctcacgtg caagtcttac ctccgtgaac tccttctggc tactgacctg 1560

tccaacaagg agactaagct gatcgtcccc ccatcgggct tcatctcaaa tatcgtggag 1620

aacggcagca ttgaggaaga caacctcgag ccctggaagg ctaacaacaa gaacgcctat 1680

gttgaccaca cgggcggcgt caacggtact aaggctcttt acgtgcataa ggacggcggc 1740

atcagccaat tcattggcga taagctcaag cctaaaactg agtatgtgat ccaatacacc 1800

gtgaagggca agccaagcat ccatttgaag gacgagaaca ccggctacat ccactacgag 1860

gacaccaaca ataacttgga ggactaccag acgatcaaca agcgcttcac cacgggcacc 1920

gatctcaagg gcgtgtacct catcctcaag tctcagaacg gtgacgaggc ctggggtgac 1980

aacttcatta tcctcgagat cagcccgtct gagaagctgc tctctccgga gctgatcaac 2040

accaacaact ggaccagcac cggctcgacc aacatcagcg gcaacaccct gaccctttac 2100

cagggcggcc gcggcatcct gaagcaaaat cttcagctcg atagcttctc cacctacagg 2160

gtctatttct ccgtttccgg cgacgctaac gtgaggatca ggaacagcag ggaagtgctg 2220

ttcgagaaga gatacatgtc cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac caccaagttc 2280

gagaaggaca acttctacat cgagctgagc cagggcaaca acctgtacgg cggcccaatc 2340

gttcactttt acgacgttag cattaagtga tga 2373

<210> 4

<211> 2370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaataaga ataacacaaa gctgtctacc agggctctcc catccttcat cgactacttc 60

aacggcatct acgggttcgc tacggggatc aaggacatca tgaacatgat cttcaagacg 120

gacacgggcg gcgacctgac cctggacgag atcctcaaga accagcagct cctgaacgac 180

atctcgggca agctggacgg cgtgaacggc tccctgaacg acctcatcgc ccagggcaac 240

ctcaacaccg agctgagcaa ggagatcctc aagatcgcga acgagcagaa ccaggtgctg 300

aacgacgtca acaacaagct cgacgccatc aacaccatgc tccgcgtgta cctgccgaag 360

atcacgtcca tgctcagcga cgtcatgaag cagaactacg ccctgtccct ccagatcgag 420

tacctcagca agcagctgca ggagatctcc gacaagctgg acatcatcaa cgtgaacgtc 480

ctcatcaact ccaccctgac ggagatcacc ccggcgtacc agcgcatcaa gtatgtgaac 540

gagaagttcg aggagctcac gttcgccacc gagacgtcca gcaaggtcaa gaaggacggc 600

agccccgcgg acatcctgga cgagctcacc gagctgacgg agctcgcgaa gtccgtgacc 660

aagaacgacg tcgacggctt cgagttctac ctgaacacgt tccacgacgt gatggtcggc 720

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ctgcaggcta aggcgttcct gaccctgacg acctgccgca agctcctggg cctcgctgac 900

atcgactaca ccagcatcat gaacgagcac ctgaacaagg agaaggagga gttcagggtg 960

aacatcctcc cgaccctgtc caacacgttc agcaacccca actacgccaa ggtgaagggc 1020

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gagatctcca acgacagcat caccgtgctg aaggtctacg aggcgaagct caagcagaac 1140

taccaggtgg acaaggactc cctgagcgag gtcatctacg gcgacatgga caagctcctg 1200

tgcccggacc agagcgagca gatctactac accaacaaca tcgtgttccc caacgagtat 1260

gtgatcacca agatcgactt cacgaagaag atgaagaccc tgcgctacga ggtgaccgcc 1320

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accaacaact ggaccagtac gggctccacg aacatcagcg gcaacacgct gaccctctac 2100

cagggcggca ggggcatcct gaagcagaac ctgcagctcg actccttcag cacctacagg 2160

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ttcgagaaga ggtacatgtc cggcgccaag gacgtgagcg agatgttcac cacgaagttc 2280

gagaaggaca acttctacat cgagctgtcc caggggaata acctctacgg cgggccaatc 2340

gttcatttct acgacgtgtc catcaagtga 2370

Claims

1.一种用于植物转化的Bt vip3Aa-m3的人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种用于植物转化的Bt vip3Aa-m4的人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种植物表达载体，其特征是含有权利要求1或2所述的人工合成序列和在大肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭的双元载体。

4.根据权利要求3所述的植物表达载体，所述双元载体为pPZP200载体或pCAMBIA3300载体。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体，命名为pBRI-IRGT5901和pBRI-IRGT5902，其结构分别如图1、图2所示。

6.根据权利要求3-5任一所述的植物表达载体在转化单子叶植物使之产生抗鳞翅目害虫特性方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中转化的方法为农杆菌介导法。

8.根据权利要求6所述的应用，所述单子叶植物为玉米。

9.根据权利要求6所述的应用，所述鳞翅目害虫为草地贪夜蛾。