CN102994552A

CN102994552A - 一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法

Info

Publication number: CN102994552A
Application number: CN2012105444353A
Authority: CN
Inventors: 张俊红; 陆玲玲; 叶永清; 苏国新
Original assignee: Shanghai Ke Laixun Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Shanghai Ke Laixun Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-03-27
Also published as: CN104059886A

Abstract

本发明涉及一种TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具体涉及一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法。TAT-凋亡素基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，蓝白斑筛选获得阳性克隆，从阳性克隆中抽提质粒DNA，用此所获得的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞BmN，获得含有TAT-凋亡素基因的重组杆状病毒，再用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，最终大量表达TAT-凋亡素融合蛋白，本发明用家蚕细胞表达的重组TAT-凋亡素融合蛋白，具有较高的表达量及生物活性，为利用家蚕生物反应器生产大量该蛋白打下基础。

Description

一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法

[技术领域]

本发明涉及一种TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具体涉及一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法。

[背景技术]

凋亡素(apoptin)是由鸡贫血病毒（CAV）VP3基因编码的蛋白质，由121个氨基酸组成，NCBI中的序列编号为NC_001427，可以特异性地诱导动物和人体肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响。凋亡素选择性诱导肿瘤细胞的凋亡是非p53依赖的bcl-2对抗机制，由于大部分肿瘤细胞具有p53突变或缺少的特性，因此，非p53依赖性凋亡素作为抗肿瘤药物具有很好的应用前景。

天然状态下的凋亡素很难透过细胞膜屏障进入肿瘤细胞内发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。现已证明，人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activatortranscription,TAT)具有蛋白转导结构域的特点，能快速有效地将与之相连的肽段或蛋白质直接跨膜转运进入细胞或组织，转导效率很高且对细胞没有损伤。TAT的编码序列为：YGRKKRRQRRR，利用TAT介导蛋白质进入细胞的有效方法是将TAT的编码基因与外源蛋白基因连接，表达融合蛋白。2004年Guelen等研制出含TAT跨膜功能域的凋亡素重组蛋白TAT-凋亡素。纯化的TAT-凋亡素不仅保留了TAT原有的穿透力，而且丝毫不影响凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的活力。

家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统由供体质粒、含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac构成，其产生重组病毒的原理是：首先将外源目的基因克隆入供体质粒中，然后将供体质粒转化入DH10BmBac感受态细胞中，通过细菌转座子的定点转位作用，将启动子和目的基因一起转入家蚕杆状病毒基因组而产生重组病毒DNA，再通过转染家蚕细胞而获得含有目的基因的重组杆状病毒。我们利用该系统快速产生重组病毒，并利用家蚕BmN细胞表达出具有活性的TAT-凋亡素融合蛋白。

[发明内容]

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种快速产生重组病毒，并利用家蚕BmN细胞表达出具有活性的TAT-凋亡素融合蛋白的Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法。

为实现上述目的，设计一种家蚕杆状病毒Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，将TAT-凋亡素基因从pUC57-TAT-apoptin中亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，使目的基因位于杆状病毒多角体启动子的下游，然后将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上过夜培养。通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，随后从阳性克隆中抽提质粒DNA，该质粒DNA即为重组病毒的基因组。用此所获得的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有TAT-APOPTIN基因的重组杆状病毒。然后再用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，最终大量表达TAT-凋亡素融合蛋白。通过Ni－NTA柱亲和层析的方法得到高纯度TAT-凋亡素融合蛋白。

TAT跨膜肽氨基酸序列（YGRKKRRQRRR）位于TAT跨膜肽-凋亡素融合蛋白序列的N-端，来自于NCBI，序列号为NP_057853。

凋亡素氨基酸序列来自于NCBI,序列号为NP_056774.1。

TAT跨膜肽-凋亡素融合蛋白序列的C-端加上一段6xHis标签。

利用基因工程技术构建供体质粒，通过双酶切将TAT跨膜肽-凋亡素基因片段克隆到pFastBacHTb载体中。

DH10BmBac细胞包含了bacmid和辅助质粒（helperplasmid）。

本发明用家蚕细胞表达的重组TAT-凋亡素融合蛋白，具有较高的表达量及生物活性，为利用家蚕生物反应器生产大量该蛋白打下基础。

[附图说明]

图1是Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb图。

图2是pFastBacHTb-TAT-apoptin的酶切鉴定琼脂糖电泳图。

图3是SDS-PAGE分析纯化后TAT-apoptin图。

图4是Western-blot分析纯化后TAT-apoptin图。

图5是MTT法检测经TAT-apoptin处理的HeLa细胞生长曲线图。

图1中的图谱详细信息如下：

f1基因间隔区（f1Intergenicregion）：bases2-475。

Apr：bases589-1449。

ori：bases1594-2267。

Tn7R：bases2511-2735。

Gmr：bases2802-3335(互补链，complementarystrand)。

启动子（Polhpromoter）：bases3904-4032。

多克隆位点（Mutiplecloningsite）：bases4119-4222。

SV40polyA转录终止序列（SV40polyadenylationsignal）：bases4240-4480。

Tn7L：bases4509-4674。

[具体实施方式]

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

1.研究材料：重组质粒pUC57-TAT-apoptin为外包服务公司提供；DNAmarker、限制性内切酶、T4连接酶等均购于Takara；杆状病毒转移载体pFastBacHTb、Cellfectin和Ni-NTA树脂均为Invitrogen公司产品；胎牛血清FCS、家蚕BmN细胞培养基TC-100均为GibcoBRL的产品。

2.工作流程：

（1）由BamHⅠ和HindⅢ双酶切pUC57-TAT-apoptin，将切下的TAT-APOPTIN插入至同样由BamHⅠ和HindⅢ双酶切的pFastBacHTb，构建成转移载体pFastBacHTb-tat-apoptin。将构建好的转移载体pFastBacHTb-tat-apoptin转化DH10BmBac，涂布于含卡那霉素50μg/ml、庆大霉素30μg/ml、X-gal100μg/mL、IPTG40μg/mL的平板，48h左右挑取白色菌落重新划线，待长出白色菌落后接种于含相应抗生素的LB培养基中，提取重组BacmidDNA。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组转移载体pFastBacHTb-TAT-apoptin。电泳结果在400bp处有外源片段，表明了重组转移质粒构建成功（图2）。

（2）在六孔板中接入1×106BmN细胞，贴壁后用TC-100无血清培养基漂洗两次，然后加入2μg的重组Bacmid和6μL的Cellfectin转染试剂，5h后移去转染试剂，加入2mL含15%FCS的TC-10培养基。72h左右观察到细胞有感染迹象时，用15mL的离心管收集孔板中含重组杆状病毒的培养液，1000r/min离心5min以去除细胞及较大的碎片，收集上清即得到P1代重组杆状tat-apoptin，将P1代重组杆状病毒大量感染BmN细胞，观察到细胞感染迹象时，收集细胞。

（3）将细胞经超声破碎后离心取上清，将上清液利用Ni-NTA柱分离纯化获得相应的蛋白质，并通过SDS-PAGE以及Westernblot分析纯蛋白纯度。结果在16kD处有条带并且纯度达到了90%以上，表明了重组TAT-apoptin融合蛋白表达成功（图3和图4）。

（4）利用MTT法来检测重组TAT-凋亡素的抗肿瘤活性的方法：将对数生长期的Hela细胞接种于96孔培养板，分别加入不同浓度的TAT-凋亡素样品，空白对照组加等体积的培养液，置37℃,5%CO₂培养箱中培养24h，加入一定浓度MTT工作液于细胞，培养4h。取出培养板，每孔吸去上清加入DMSO，于酶标仪490nm处测A值。根据吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=[实验组A均值－背景组A均值]/[空白组A均值－背景组A均值]×100%。将对数生长期的Hela细胞接种100μl(2×104cell/ml)于96孔培养板，置37℃,5%CO₂培养箱中培养6h后，分别加入9个不同稀释浓度的TAT-凋亡素溶液100μl，空白对照组加100μl培养液，置37℃,5%CO₂培养箱中培养24h。吸去培养基，每孔加入MTT工作液100μl，使MTT终浓度为5μg/mL，于细胞培养条件下保温4h。取出培养板，每孔吸去培养基，加入100μlDMSO，于酶标仪490nm处测吸光度A值。实验重复3次。图5显示了重组TAT-apoptin有诱导HeLa细胞凋亡的能力。

Claims

1.一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于：

i.将TAT-凋亡素基因从pUC57-TAT-凋亡素中亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，

ii.将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上过夜培养，蓝白斑筛选获得阳性克隆，从阳性克隆中抽提质粒DNA，

iii.用此所获得的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有TAT-凋亡素基因的重组杆状病毒，

iv.再用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，最终大量表达TAT-凋亡素融合蛋白。

2.如权利要求1所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的TAT的编码序列位于TAT-凋亡素融合蛋白序列的N-端。

3.如权利要求1所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于在TAT-凋亡素融合蛋白序列的C-端加上一段6xHis标签。

4.如权利要求1所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于通过双酶切将TAT-凋亡素基因片段克隆到pFastBacHTb载体中。

5.如权利要求4所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于通过BamH I和Hind III双酶切将pUC57-TAT-凋亡素中的TAT-凋亡素基因片段克隆到由BamH I和Hind III双酶切pFastBacHTb载体中，构成转移载体pFastBacHTb-TAT-凋亡素。

6.如权利要求1所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的抗生素是卡那霉素和庆大霉素中的一种或两种。

7.如权利要求6所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的卡那霉素浓度为50ug/ml。

8.如权利要求6所述的用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于所述的庆大霉素浓度为30ug/ml。