CN112725293B - 一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法 - Google Patents

一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒双水相萃取技术领域，公开了一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒(SenecavirusA,SVA)粒子的方法，SVA繁殖；SVA的间接免疫荧光鉴定；三步双水相萃取方法的建立；SVA含量的测定；蛋白印迹试验；SVA的电子显微镜鉴定。本发明在SVA培养液中加入低浓度的聚乙二醇和无机盐后，除去细胞碎片，再加入聚乙二醇形成双水相体系即能够快速的获得浓缩纯化的猪SVA病毒粒子；通过双水相萃取技术可实现病毒粒子的快速分离，且病毒粒子回收率和纯度均较高，工艺简单、成本低；通过三步双水相萃取的方法，实现了从细胞培养液中浓缩纯化猪SVA病毒粒子的目的，并可在实验室和规模化生产中同时应用。

Description

一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法
技术领域
本发明属于病毒双水相萃取技术领域，尤其涉及一种双水相萃取浓缩纯化猪塞内卡病毒粒子的方法。
背景技术
目前，双水相萃取技术是利用物质在两种互不混溶的溶剂中的分配差异进行分离的技术，但其原理到目前还不清楚。当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，从而实现对目标物质的分离。双水相萃取技术作为一种新型的分离提纯方法在多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织及重金属分离领域广泛应用，较之超滤、层析等方法，双水相萃取技术对设备要求低，条件温和易于物质活性的保存，且操作简单，易于放大，在生物活性物质领域的分离具有广阔前景。
塞内卡病毒病是由小核糖核酸科塞内卡病毒属的塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)引起的一种主要感染猪的病毒性传染病。该病主要通过接触传播，可引起猪的蹄部、鼻吻等出现水泡病变，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等疾病在临床上难以区分。
目前，用PK-15或BHK-21细胞并采用贴壁培养的方式分离培养SVA，但由于病毒产量低，一般小于1μg/mL，而宿主细胞的蛋白产量可达1000μg/mL，如何将SVA病毒粒子从宿主蛋白中分离纯化成为技术难点。超滤和PEG沉淀是常用的浓缩纯化病毒的方法，超滤技术虽然抗原回收率很高，但浓缩作用强于纯化作用，在提高病毒含量的同时，宿主蛋白也被成倍提高，且同时需要专业的设备；PEG沉淀技术纯度很高，但病毒回收率较低，且样品浓缩纯化时间较长，且需要配合离心等技术，亦需要专业的设备。
双水相萃取技术由于条件温和，且能够很好的保留病毒活性，近年在病毒浓缩纯化方面广泛利用，如流感病毒、脊髓灰质炎病毒等。动物病毒性疫苗在预防动物病毒性疾病中发挥着重要作用，但由于动物疫苗价格低廉，且生产规模较大，如何将双水相萃取技术应用与动物疫苗的生产中面临着不小的挑战。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)超滤技术虽然抗原回收率很高，但浓缩作用强于纯化作用，在提高病毒含量的同时，宿主蛋白也被成倍提高，且同时需要专业的设备。故只能用于病毒纯化的初始阶段，目的在于减小体积。
(2)PEG沉淀病毒的纯度很高，但病毒回收率较低，且样品浓缩纯化时间较长，且需要配合离心等技术，亦需要专业的设备。PEG纯化容易造成的病毒的丢失，对于低廉的动物疫苗不利成本的降低。
解决以上问题及缺陷的难度为：超滤和PEG纯化的固有特点，不仅限制了其在动物疫苗大规模生产中的应用，同时也不利于疫苗质量的提高。
解决以上问题及缺陷的意义为：开发简单、实用、低廉的病毒浓缩纯化方法，适合我国动物疫苗行业发展的特点，利于动物疫苗质量的稳步提高。双水相萃取技术由于条件温和，能够很好的保留病毒活性，且不需要专门的设备，易于操作。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法。
本发明是这样实现的，一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括以下步骤：
步骤一，SVA繁殖；大量繁殖SVA，获得较多的SVA病毒液；
步骤二，SVA的间接免疫荧光鉴定；用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的 SVA，确定该病毒为SVA，并可初步判断SVA的含量；
步骤三，三步双水相萃取方法的建立；获得纯化的SVA病毒粒子；
步骤四，猪SVA含量的测定；测定纯化的SVA病毒粒子的含量；
步骤五，蛋白印迹试验；对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；
步骤六，SVA的电子显微镜鉴定，对纯化的病毒粒子进行电镜检测。
进一步，步骤一中，所述SVA的繁殖方法，包括：
(1)将分离SVAHN/11/2017接种于长成单层的含8％牛血清的BHK-21细胞，并在5％CO2、37℃条件下培养；
(2)待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定；
(3)将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融二次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。
进一步，步骤二中，所述SVA的间接免疫荧光鉴定，包括：
(1)将SVA HN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的 BHK-21细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清；
(2)经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS洗涤3次后用含5％BSA的PBS 封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清，37℃孵育1h；
(3)PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3 次后置荧光显微镜下观察并拍照。
进一步，步骤三中，所述三步双水相萃取方法的建立，包括：
(1)双水相萃取体系成相盐的选择
按照以前报道的双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，成相体系的pH值均为8.0。后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系。
(2)第一步双水相萃取
在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min；在4℃条件下，以8000rpm/min 离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min 后，在4℃条件下，以8000rpm/min离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液。
(3)第二步双水相萃取
在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵 /聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以 2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上相聚乙二醇相，并确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。
(4)第三步双水相萃取
取出硫酸氨相，加入不同浓度的磷酸盐缓冲液，并加入0.3％的氯化钾，形成磷酸盐/聚乙二醇的双水相萃取体系，振荡混匀，后在10℃条件下，以 2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。
进一步，步骤(2)中，所述双水相萃取成相物质为聚乙二醇和硫酸铵溶液。
进一步，步骤(3)中，所述确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布，包括：
将双水相萃取体系的pH值分别调整为7.5和8.0，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。
进一步，步骤四中，所述猪SVA含量的测定，包括：
(1)用蔗糖密度梯度离心的方法定量SVA的含量；
(2)将经三步双水相萃取体系纯化的SVA置于15％到40％的蔗糖密度梯度上，在10℃条件下，用超速离心机以35000rpm/min离心3h；
(3)采用连续流进样的方法，在液相色谱仪上绘制蔗糖密度梯度图谱，确定SVA抗原的出峰位置，根据峰面积确定SVA含量。
进一步，步骤五中，所述蛋白印迹试验，包括：
(1)收集蔗糖密度梯度离心出峰处的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 SDS-PAGE，然后将分离的蛋白条带转印至硝酸纤维NC膜，用TBST缓冲液漂洗3次NC膜，5min/次；
(2)用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2h，同上漂洗3次NC膜，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释表达抗体至工作浓度5μg/mL，4℃孵育过夜；
(3)同上漂洗3次NC膜，然后加入HRP标记山羊抗猪的酶标二抗(1： 5000)，室温孵育1h；同上漂洗3次NC膜后，加入ECL化学发光底物，暗室中压X光片进行曝光成像。
进一步，步骤六中，所述SVA的电子显微镜鉴定，包括：
将经蔗糖纯化过的病毒样颗粒做10倍稀释，以35000rpm/min离心3h，除去蔗糖；加入0.2mL PBS缓冲液重悬病毒，利用磷钨酸负染法进行透射电镜样品制样。
进一步，所述样品制备及观察方法，包括：
(1)将10μL样品滴于200目铜网上，已有碳膜，室温吸附5min，然后用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉；
(2)用10μL 2％的磷钨酸对铜网进行染色，室温作用5min，亦用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉，然后将铜网放于滤纸上让自然干燥；
(3)在电压80KV下，用透射电镜观察病毒粒子的形态。
本发明的各个参数在纯化病毒粒子的过程中发挥重要作用，如果参数改变可导致病毒粒子的纯化失败或纯化率低。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，首先是向SVA细胞培养澄清液中加入低浓度的聚乙二醇和无极盐，用缓冲液调节体系pH值为8.0，5000rpm/min，10℃条件下离心5分钟去除细胞碎片，后补加聚乙二醇形成双水相体系， 2000rpm/min，10℃条件下离心5分钟取目标相即得到浓缩纯化的SVA，后利用 45％～15％的蔗糖对纯化病毒进行进一步纯化及含量测定，Western-blotting确定为SVA的结构蛋白，电子显微镜下可观察到大量完整的病毒粒子。同时，本发明通过双水相萃取技术可实现病毒的快速分离，且病毒回收率和纯度均较高，工艺简单、成本低、不受设备限制；通过三步双水相萃取的方法，实现了从细胞培养液中浓缩纯化猪SVA的目的，并可在实验室和规模化生产中同时应用。
另外，本发明首次建立了一种双水相萃取浓缩纯化猪SVA的方法。主要是在SVA培养液中加入低浓度的聚乙二醇和无机盐后，除去细胞碎片，然后再加入聚乙二醇形成双水相体系既能够快速的获得浓缩纯化的猪SVA病毒。相比类似口蹄疫病毒的浓缩纯化方法该方法工艺简单快速，且相对成本较低。这为该病毒的病毒浓缩纯化以及在疫苗开发中提供了重要的技术工艺。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法流程图。
图2(a)是本发明实施例提供的正常细胞示意图。
图2(b)是本发明实施例提供的SVA感染BHK-21的接毒细胞病变图。
图3是本发明实施例提供的SVA感染BHK-21细胞的间接免疫荧光鉴定示意图。
图4是本发明实施例提供的双水相萃取体系成相盐的选择示意图。
图5是本发明实施例提供的蔗糖密度梯度离心病毒的免疫印迹鉴定示意图。
图6是本发明实施例提供的病毒电镜观察示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括以下步骤：
S101，SVA繁殖；
S102，SVA的间接免疫荧光鉴定；
S103，三步双水相萃取方法的建立；
S104，猪SVA含量的测定；
S105，蛋白印迹试验；
S106，SVA的电子显微镜鉴定。
本发明提供的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1、材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒、细胞、试剂
SVA HN/11/2017株由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队保存；BHK-21细胞和PK-15细胞由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队保存；SVA猪阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队制备保存；胎牛血清(fetal bovineserum,FBS)、胰酶、opti-MEM购自Gibico公司；羊抗猪IgG-FITC购自北京索莱宝科技有限公司；蔗糖、聚乙二醇、硫酸铵购自Sigma-Aldrich公司；氯化钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自国药集团。
1.2方法
1.2.1 SVA的繁殖
将SVA HN/11/2017接种于长成单层的BHK-21细胞，并在5％CO2、37℃条件下培养，待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定，之后将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融二次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。
1.2.2 SVA的间接免疫荧光鉴定
将SVA HN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的BHK-21 细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清，经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS 洗涤3次后用含5％BSA的PBS封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清， 37℃孵育1h，PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS 洗涤3次后置荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.3三步双水相萃取方法的建立
1.2.3.1双水相萃取体系成相盐的选择
按照以前报道的双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，病毒液的浓度为78％，成相体系的pH值均为8.0。将成相体系各物质按比例加入并充分混匀，然后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系。
1.2.3.2第一步双水相萃取
在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min，后在4℃条件下，以 8000rpm/min离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质(聚乙二醇和硫酸铵溶液)，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min后，在4℃条件下，以8000rpm/min 离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液。
1.2.3.3第二步双水相萃取
在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵 /聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以 2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上相(聚乙二醇相)。
为了确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布，将双水相萃取体系的 pH值分别调整为7.5和8.0，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。
1.2.3.4第三步双水相萃取
取出硫酸氨相(下相)，加入不同浓度的磷酸盐缓冲液，并加入0.3％的氯化钾，形成磷酸盐/聚乙二醇的双水相萃取体系，振荡混匀，后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。
1.2.4猪SVA病毒粒子含量的测定
用蔗糖密度梯度离心的方法定量SVA病毒粒子的含量。将经三步双水相萃取体系纯化的SVA病毒粒子置于15％到40％的蔗糖密度梯度上，在10℃条件下，用超速离心机以35000rpm/min离心3h。然后采用连续流进样的方法，在液相色谱仪上绘制蔗糖密度梯度图谱，确定SVA抗原的出峰位置，根据峰面积确定SVA含量。
1.2.5蛋白印迹(Western Blot,WB)试验
收集蔗糖密度梯度离心出峰处的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (SDS-PAGE)，然后将分离的蛋白条带转印至硝酸纤维(NC)膜，用TBST 缓冲液漂洗3次NC膜，5min/次，然后用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭 2h；再同上漂洗3次NC膜，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释表达抗体至工作浓度(5μg/mL)，4℃孵育过夜；同上漂洗3次NC膜，然后加入HRP标记山羊抗猪的酶标二抗(1:5000)室温孵育1h；同上漂洗3次NC膜后，加入 ECL化学发光底物，暗室中压X光片进行曝光成像。
1.2.6 SVA的电子显微镜鉴定
将经蔗糖纯化过的病毒样颗粒做10倍稀释，然后以35000rpm/min离心3h，除去蔗糖，然后加入0.2mL PBS缓冲液重悬病毒，利用磷钨酸负染法进行透射电镜样品制样，具体制备及观察步骤如下：
(1)将10μL样品滴于200目铜网上(已有碳膜)，室温吸附5min，然后用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉。
(2)用10μL 2％的磷钨酸对铜网进行染色，室温作用5min，亦用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉，然后将铜网放于滤纸上让自然干燥。
(3)在电压80KV下，用透射电镜观察病毒样颗粒的形态。
2、结果
2.1 SVA感染BHK-21细胞
将猪SVA接种于BHK-21细胞后在8h后开始出现细胞病变，表现为细胞变圆，并成积聚状态，慢慢开始脱落。
SVA感染BHK-21细胞病变图如图2所示。
2.2免疫荧光检测结果
将SVA HN/11/2017毒株接种BHK-21细胞后，用SVA猪阳性血清进行间接免疫荧光染色，以检测病毒蛋白的表达。结果显示，BHK-21细胞中产生明亮的绿色荧光(见图3)，表明细胞感染了SVA。
2.3双水相萃取体系的建立
2.3.1成相盐的选择
由图4结果可以看出，在PEG6000和三种成相盐组成的体系中病毒更倾向于分布于上相(富含聚乙二醇)和中间相，且病毒回收率均高于80％，但回收率最高的是出现在硫酸铵/PEG6000组成的双水相萃取体系。
2.3.2 pH值对成相体系的影响
为了确定pH值对病毒在不同相分布的影响，将成相体系的pH值分别调为7.5 和8.0，测定病毒在两项的分布，结果显示在pH值7.5的条件下，病毒更倾向于分布于上相，且K值也明显变大(见表1)。
表1 pH值对SVA分布的影响
Figure BDA0002946943110000111
2.3.3磷酸盐浓度对三次成相的影响
在二次成相的过程中病毒分布于上相和中间相，为了进一步提高病毒的纯度及浓缩倍数，我们进行三次成相，使病毒分布于下相，这样不仅提高病毒的纯度和浓度，还利于病毒的回收。结果显示，当加入低浓度的磷酸盐后即可再次形成双水相体系，病毒回收率要高于高浓度盐的加入，且浓缩倍数也进一步提高(见表2)。
表2磷酸盐浓度值对二次成相SVA分布的影响
Figure BDA0002946943110000112
2.3.4三步双水相萃取体系的建立
在经过以上参数优化后，成功建立了硫酸铵/PEG6000的三步双水相萃取体系，第一步加入低浓度的PEG6000和硫酸铵形成单相体系，目的是为了进一步澄清病毒液；第二步补加PEG6000形成双水相萃取体系，使病毒进入上相；然后去掉下相，加入磷酸盐，再次形成双水相萃取体系，使病毒进入下相。经过三步萃取后，病毒纯度提高了30倍，病毒浓度提高了6.5倍(见表3)。
表3三阶段双水相萃取技术浓缩纯化SVA分布的效果表
Figure BDA0002946943110000121
2.4蔗糖密度梯度离心病毒的免疫印迹鉴定(见图5)
收集蔗糖密度梯度离心的出峰样品，然后进行SDS-PAGE和Western-Blotting 分析，结果显示可看到清晰特异的SVA目的条带，结构蛋白VP1、VP2、VP3的大小约为29kd、32kd、26kd。
2.5纯化的SVA HN/11/2017毒株抗原后负染，透射电镜观察到了直径 20～30nm，正六边形的粒子，结果如图6所示。说明利用双水相萃取浓缩纯化SVA 的方法是高效可行的。
3、本发明首次建立了一种双水相萃取浓缩纯化猪SVA病毒粒子的方法。主要是在SVA培养液中加入低浓度的聚乙二醇和无机盐后，除去细胞碎片，然后再加入聚乙二醇形成双水相体系既能够快速的获得浓缩纯化的猪SVA病毒粒子。相比类似口蹄疫病毒的浓缩纯化方法该方法工艺简单快速，且相对成本较低。这为该病毒的病毒浓缩纯化以及在疫苗开发中提供了重要的技术工艺。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法包括：
SVA繁殖：繁殖SVA，获得SVA病毒液；
SVA的间接免疫荧光鉴定：用间接免疫荧光的方法鉴定大量繁殖的SVA，确定该病毒为SVA，并初步判断SVA的含量；
三步双水相萃取方法的建立：获得纯化的SVA病毒粒子；
SVA含量的测定：测定纯化的SVA病毒粒子的含量；
蛋白印迹试验：对纯化的SVA病毒粒子进行WB验证；
SVA的电子显微镜鉴定：对纯化的病毒粒子进行电镜检测；
所述三步双水相萃取方法的建立，包括：
(1)双水相萃取体系成相盐的选择，按照双水相萃取体系的相图，选用硫酸铵、硫酸钠、磷酸钠作为成相盐并和PEG6000组成双水相萃取体系，盐和聚乙二醇的浓度分别为16％和6％，成相体系的pH值均为8.0；在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，计算病毒回收率，确定双水相萃取体系；
(2)第一步双水相萃取，在病毒悬液中加入2％的氯仿，并振荡10min；在4℃条件下，以8000rpm/min离心10min，弃沉淀，取上清，得到澄清的病毒液；在澄清病毒液中加入双水相萃取成相物质，但并不使溶液分相，用氨水将体系的pH值调整为8.0，振荡10min后，在4℃条件下，以8000rpm/min离心5min，弃沉淀，取上清，进一步澄清病毒液；所述双水相萃取成相物质为聚乙二醇和硫酸铵溶液；
(3)第二步双水相萃取，在第一步双水相萃取体系中补加聚乙二醇使其终浓度达到6％，形成硫酸铵/聚乙二醇双水相体系，并加入0.5％的氯化钠，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，使双水相体系彻底分相，病毒进入中间相和上相聚乙二醇相，并确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布；
(4)第三步双水相萃取，取出硫酸氨相，加入不同浓度的磷酸盐缓冲液，并加入0.3％的氯化钾，形成磷酸盐/聚乙二醇的双水相萃取体系，振荡混匀，后在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量。
2.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的繁殖方法，包括：
(1)将分离的SVAHN/11/2017接种于长成单层的BHK-21细胞，并在5％CO2、37℃条件下培养；
(2)待细胞病变达到80％以上时收毒，并用间接免疫荧光的方法进行鉴定；
(3)将细胞病毒液放于-20℃以下反复冻融2次，使病毒从细胞内完全释放出来，得到病毒悬液。
3.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的间接免疫荧光鉴定，包括：
(1)将SVAHN/11/2017毒株以1MOI的量接种于生长至50％以上满的BHK-21细胞的6孔板，37℃条件下孵育8h后弃上清；
(2)经PBS漂洗3次后，用4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次后用含0.2％TritonX-100的PBS通透15min，PBS洗涤3次后用含5％BSA的PBS封闭1h，PBS洗涤3次后加SVA猪阳性血清，37℃孵育1h；
(3)PBS漂洗3次后加FITC标记的羊抗猪二抗37℃孵育1h，PBS洗涤3次后置荧光显微镜下观察并拍照。
4.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布，包括：将双水相萃取体系的pH值分别调整为7.5和8.0，振荡混匀后，在10℃条件下，以2000rpm/min离心5min，分别取上相和下相测定蛋白含量和病毒含量，确定pH值对SVA在双水相萃取体系中的分布。
5.如权利要求1所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA含量的测定，包括：
用蔗糖密度梯度离心的方法定量SVA的含量：
(1)将经三步双水相萃取体系纯化的SVA置于15％到40％的蔗糖密度梯度上，在10℃条件下，用超速离心机以35000rpm/min离心3h；
(2)采用连续流进样的方法，在液相色谱仪上绘制蔗糖密度梯度图谱，确定SVA抗原的出峰位置，根据峰面积确定SVA含量。
6.如权利要求5所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述蛋白印迹试验，包括：
(1)收集蔗糖密度梯度离心出峰处的样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析SDS-PAGE，然后将分离的蛋白条带转印至硝酸纤维NC膜，用TBST缓冲液漂洗3次NC膜，5min/次；
(2)用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2h，同上漂洗3次NC膜，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释表达抗体至工作浓度5μg/mL，4℃孵育过夜；
(3)同上漂洗3次NC膜，然后加入HRP标记山羊抗猪的酶标二抗1：5000，室温孵育1h；同上漂洗3次NC膜后，加入ECL化学发光底物，暗室中压X光片进行曝光成像。
7.如权利要求5所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述SVA的电子显微镜鉴定，包括：将经蔗糖纯化过的病毒样颗粒做10倍稀释，以35000rpm/min离心3h，除去蔗糖；加入0.2mLPBS缓冲液重悬病毒，利用磷钨酸负染法进行透射电镜样品制样。
8.如权利要求7所述的双水相萃取浓缩纯化SVA粒子的方法，其特征在于，所述样品制样及观察方法，包括：
(1)将10μL样品滴于200目铜网上，已有碳膜，室温吸附5min，然后用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉；
(2)用10μL2％的磷钨酸对铜网进行染色，室温作用5min，亦用滤纸小心的将未吸附的溶液吸掉，然后将铜网放于滤纸上让自然干燥；
(3)在电压80KV下，用透射电镜观察病毒样颗粒的形态。
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