CN105779396B

CN105779396B - 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用

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Publication number: CN105779396B
Application number: CN201410785153.1A
Authority: CN
Inventors: 张家龙; 张国庆; 刘淑清; 徐冉; 王贵华; 赵亚荣
Original assignee: Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd; Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co Ltd
Current assignee: Beijing Biomedical Technology Center Of Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd; Beijing Kemufeng Biological Pharmaceutical Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Fuzhou Co ltd; Zhaofenghua Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN105779396A

Abstract

本发明涉及一株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus,PRRSV），疫苗及其应用。本发明从猪临床肺脏组织中用Marc‑145细胞分离到一株PRRSV，该分离株能在Marc‑145细胞上增殖并能致其产生典型的细胞病变，用Marc‑145测得分离株效价为10^7.0 TCID50/mL，于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9819；本发明新毒株人工接种断奶仔猪以后，仔猪仅有微弱体温反应，无明显临床症状，对生长情况也没有不良影响。本发明新毒株人工接种猪以后，能诱导猪产生良好的免疫反应，产生高水平的PRRSV抗体。

Description

低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是造成养猪国家经济损失较为严重的猪病之一，又称“猪蓝耳病”，主要引起仔猪和育成猪呼吸道疾病以及母猪的繁殖障碍（Hopper, et al., 1992; 杨汉春等，2006）。该病的原发性病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus, RRSV），与马动脉炎病毒（Equine arteritis virus, EAV）、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（Lactate dehydrogenase-elevating virus, LDV）和猴出血热病毒（Simian hemorrhagic fever virus, SHFV）同属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属（Arterivirus）（Dea, et al., 2000; Snijder, et al., 1998）。

该病1987年首次在美国发生，1991年分离到病原（Wensvoort, et al.,1991 ;Collins, et al.,1992），此后在全球蔓延的速度非常快，造成了极其严重的经济损失。1996年我国郭宝清首次分离到PRRSV（郭宝清等，1996），证实了我国存在PRRS疾病。而在此后的一段时间内，该病在我国大部分地区的发生和流行呈上升趋势。目前，PRRS呈世界性分布，在世界各主要养猪国家如美国、英国、中国、荷兰、德国、日本等都有流行（Gate, etal., 1997）。PRRS是危害养猪业的主要疫病之一，该病传播迅猛，仅1991年在欧洲和美洲的一次大流行就造成100万头猪的死亡，被形象的称为“流产风暴”。PRRSV具有较强的传染性，能够在短期内感染猪场内所有的猪，且能够引起猪体持续性感染和免疫抑制，使猪群免疫力下降，容易继发其他细菌和病毒病的感染。自从被发现以来，PRRS已给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。由PRRS造成的经济损失仅在美国每年就可达到5.6亿美元（Neumann,et al., 2005）。1992年世界动物卫生组织（OIE）将该病列为B类传染病。

依据遗传特性、抗原性和致病性的相似性，将PRRS病毒分为北美型（NorthAmerican type）和欧洲型（European type）（Allende, et al., 1999; Meng, 2000 ;Meulenberg, et al., 1993）。当前，PRRSV已传遍了世界主要养猪国家，我国流行的PRRSV毒株几乎都为北美型（郭宝清等，1996；杨汉春等，2001；Jiang, et al., 2000）。2006年5月，在我国江西省暴发了“猪高热病”，主要表现为高热、高发病率（50%～100%）和高死亡率（20%～100%）。该病自首次暴发后便在我国主要养猪省份迅速传播，导致超过100万头猪死亡，给我国养猪业造成了极大的经济损失。经研究证实，引起此次疫病的主要病原是变异的北美型PRRSV，称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus, HP-PRRSV）（Tian, et al., 2007;Tong, et al., 2007 ; Li, et al., 2007）。由其引起的疾病被称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome）。

CN96194954A公开了一种低毒的给猪施用活体或改性活体PRRS疫苗，能有效地免疫以抵御PRRS。具体公开了：疫苗包括平均空斑直径低于约2毫米和低致病性的病毒分离物。该疫苗选用的毒株分离于1995年前的美国，并于1995年被保藏在美国典型培养物保藏中心，ATCC保藏号VR2509。PRRS的预防与控制一直是世界难题，其中一个重要原因就是PRRSV的遗传变异度大。现有疫苗对同源性较高毒株表现出较好的保护作用，但随着与疫苗毒株同源性的降低，疫苗的保护作用也下降。因此，使用当前流行毒株研制的疫苗具有更优秀的保护性。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一株当前流行的低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用。

首先，本发明提供一株低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV）新毒株，该株病毒从猪临床肺脏组织中用Marc-145细胞分离到，经过Marc-145细胞传代和蚀斑克隆纯化，增殖性能稳定，将该毒株命名为HB2014001，已于2014年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9819，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供含有本发明低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的活疫苗。

在本发明一个实施方案中，所述的活疫苗还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。

其中，疫苗的抗原含量为10⁴~10⁸TCID₅₀。

其中，所述活疫苗可为本领域常规剂型，优选为肌肉注射剂，滴鼻剂或口服剂。

本发明还提供含有本发明低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的灭活疫苗。

在本发明一个实施方案中，所述灭活疫苗还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。

其中，疫苗的抗原含量为10⁴~10⁸TCID₅₀。

其中，所述灭活疫苗可为本领域常规剂型，优选为肌肉注射剂，滴鼻剂或口服剂。

本发明还提供本发明低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒所述毒株在制备治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的疾病的药物中的应用。

本发明新毒株能在Marc-145细胞上增殖并能致其产生典型的细胞病变，用Marc-145测得分离株效价为10^7.0 TCID₅₀/mL。本发明新毒株人工接种断奶仔猪以后，仔猪仅有微弱体温反应，无明显临床症状，对生长情况也没有不良影响。本发明新毒株人工接种猪以后，能诱导猪产生良好的免疫反应，产生高水平的PRRSV抗体。

附图说明

图1 PRRSV HB2014001分离株在MARC-145细胞产生的细胞病变（CPE）.A, MARC-145细胞接种PRRSV HB2014001毒株72 h产生的CPE；B, 未接种病毒的对照MARC-145细胞。

图2 PRRSV HB2014001分离株的PCR鉴定。1, 临床肺脏样品的研磨液；2, PRRSVHB2014001分离毒株第4代病毒；3, PCR水对照；4, PCR阳性对照；5, DL2000 DNA marker

图3 PRRSV HB2014001毒株攻毒后仔猪体温反应。

图4 PRRSV HB2014001毒株攻毒后仔猪存活曲线。

图5 PRRSV HB2014001毒株攻毒后血清抗体产生情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 PRRS病毒的分离鉴定

一、猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离

河北猪场送检的猪肺脏样品，研磨后，用RT-PCR方法进行检测，结果为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性。

取适量送检肺脏研磨，研磨液为PBS，按照1：5的比例（重量：体积）加入。研磨物反复冻融3次，12000 r/min低温离心10 min，取上清，0.22 μm滤膜过滤。

按常规方法接种长满的Marc-145细胞（接种前用pH7.4 的PBS洗三次），按照10%的比例接种病毒，37℃吸附30分钟，补足细胞维持液，37℃温箱培养。每天观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。

培养3天后细胞出现明显、稳定的细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）变化，特征性病变表现为细胞变圆，聚集，固缩，最终从培养瓶上脱落等（图1）。

二、分离病毒进行RT-PCR及序列测序鉴定

按照北京全式金生物技术有限公司病毒RNA提取试剂盒的操作说明书提取第4代细胞毒RNA。参考GenBank发表的PRRSV的序列（EF635006），采用Primer Premier 5软件设计引物。扩增PRRSV相对保守的N基因。检测引物序列为：

PR-F：5’—CAGATGCCGTTTGTGCTTGCT—3’；

PR-R：5’—GGCACAGCTGATTGACTGGCT—3’；

临床样品和第4代分离病毒液均可扩增出294 bp的特异性片段（图2），扩增片段经测序分析为PRRSV基因(SEQ ID No.3所示所示)。

三、分离病毒含量测定

将PRRSV HB2014001毒株第4代病毒用DMEM维持液进行10倍比系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、及10^-8，共6个稀释度分别接种长满Marc-145单层细胞的96孔细胞板，每个稀释度接种10孔，100μl/孔，同时设10孔阴性对照细胞，37℃ 5% CO₂培养箱培养72～120小时，观察细胞病变。细胞出现聚集，固缩等现象判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID₅₀。经测定，PRRSV HB2014001毒株第4代病毒的含量为10^7.0 TCID₅₀/ml。

实施例2 PRRS病毒的蚀斑纯化

取PRRSV HB2014001毒株第4代病毒用2% DMEM培养液进行10倍比稀释，稀释度为10^-1到10^-8，取10^-3到10^-8稀释液500 μl加入到长满MARC-145细胞的6孔细胞板中，放在37℃培养箱中孵育1 h，吸弃病毒液后用PBS洗涤1次，并加入4 ml 1%低熔点琼脂糖覆盖细胞，待琼脂糖冷却后放入细胞培养箱，37℃培养3-5 d，待形成明显蚀斑时，挑取单克隆蚀斑接种到长满的单层MARC-145细胞，进行扩繁。扩繁的病毒按照如上方法再次进行2轮蚀斑纯化。进过3轮蚀斑纯化后的HB2014001毒株用MARC-145细胞进行扩大培养，分装后于-80℃保存备用。

实施例3 PRRSV HB2014001毒株的动物致病性试验

一、PRRSV HB2014001毒株的动物致病性试验

筛选PRRSV抗原、抗体双阴性的4周龄仔猪6头，随机分为2组，一组每头颈后肌肉注射1 ml共10⁵ TCID₅₀病毒液，另外一组仔猪在相同部位注射1 ml 2% MDEM培养液作为对照。

实验猪攻毒后每天检查临床症状，监测直肠体温。体温监测结果表明，攻毒前后，对照组仔猪体温一直在正常范围内波动；仔猪接种PRRSV HB2014001毒株后第2天体温开始体温稍微升高，体温均升高到40℃左右，最高40.1℃，之后6-7天体温一直维持低烧状态（见图3）。临床症状观察表明，仔猪接种HB2014001毒株后，实验仔猪食欲正常，无咳嗽等临床症状，整个试验期间3头仔猪全部存活，并生长良好。攻毒后仔猪存活曲线见图4。综合以上数据可知，PRRSV HB2014001毒株为低致病性毒株，仔猪在感染该毒株后有微弱体温反应，但无临床症状，并生长良好。

攻毒前及攻毒后1、7、14、21天采集前腔静脉血，分离血清。血清样品检测PRRSV N蛋白抗体（ELISA试剂盒S/P值）及病毒血症（RT-PCR）。检测结果表明，对照组仔猪攻毒前及攻毒后血清抗体一直为阴性，病毒血症检测也为阴性。HB2014001毒株攻毒组仔猪攻毒前血清抗体、抗原均为阴性，攻毒后第1天血清抗体阴性，第7天转阳，第14天时PRRSV抗体水平达到最顶峰，S/P最高值可达3以上，随后抗体水平有所下降（图5）。实验猪病毒血症的核酸检测结果见表1。病毒血症检测结果显示，攻毒后1天感染组血清中就可检测到明显的病毒血症，攻毒后7天有2头仔猪血清能病毒血症，14天时有1头仔猪能检测到病毒血症，而对照组仔猪整个试验期间检测均为阴性。

表1 仔猪攻毒前后病毒血症动态

攻毒后天数（d）	0	1	7	14	21
						HB2014001	0/3	3/3	2/3	1/3	0/3
对照组	0/3	0/3	0/3	0/3	0/3

综合以上动物攻毒实验结果，PRRSV HB2014001是低致病性毒株，断奶仔猪感染该毒株以后仅有微弱体温反应，无明显临床症状，感染猪生长良好，而且能产生高水平的PRRSV抗体。以上数据表明，PRRSV HB2014001毒株是良好的疫苗候选毒株，可以用于PRRSV疫苗研制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心

福州大北农生物技术有限公司

北京大北农动物保健科技有限责任公司

北京大北农科技集团股份有限公司

<120> 低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、疫苗及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cagatgccgt ttgtgcttgc t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagatgccgt ttgtgcttgc t 21

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> PRRSV

<400> 3

cagatgccgt ttgtgcttgc taggccgcaa gtacattctg gcccctgccc accacgtcga 60

aagtgccgcg ggctttcatc cgattgcggc aaatgataac cacgcatttg tcgtccggcg 120

tcccggctcc actacggtca acggcacatt ggtgcccggg ttgaaaagcc tcgtgttggg 180

tggcagaaaa gctgttaagc agggagtggt aaaccttgtt aaatatgcca aataacaacg 240

gcaagcagca aaagaaaaag aaggggaatg gccagccagt caatcagctg tgcc 294

Claims

1.一株低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndromevirus,PRRSV）毒株，其保藏号为CGMCCNo.9819。

2.含有权利要求1所述毒株的活疫苗。

3.如权利要求2所述的活疫苗，其特征在于，还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。

4.如权利要求2或3所述的活疫苗，其特征在于，抗原含量为10⁴~10⁸TCID₅₀。

5.如权利要求2或3所述的活疫苗，其特征在于，其为肌肉注射剂，滴鼻剂或口服剂。

6.含有权利要求1所述毒株的灭活疫苗。

7.如权利要求6所述的灭活疫苗，其特征在于，还含有佐剂、免疫增强剂和/或防腐剂。

8.权利要求6或7所述的灭活疫苗，其特征在于，抗原含量为10⁴~10⁸TCID₅₀。

9.如权利要求6或7所述的灭活疫苗，其特征在于，其为肌肉注射剂，滴鼻剂或口服剂。

10.权利要求1所述毒株在制备预防猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的疾病的药物中的应用。