CN114250202A

CN114250202A - 一种稳定表达cd163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114250202A
Application number: CN202111528039.7A
Authority: CN
Inventors: 王晓虎; 张翩; 王艳云; 向华; 黄元; 黄忠; 王刚
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2022-03-29

Abstract

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用，本发明的猪肾细胞系PK15‑CD163于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053。本发明是通过将目的基因CD163导入到猪基因组的ROSA26安全位点，从而构建得到的，所得细胞系可以将外源基因整合入基因组内已知的安全位点，实现转入基因的正常表达而又不影响细胞的正常生理功能。其构建过程简单，可重复性好，效率高，克隆准确度高，能高效确保正确克隆的获取，可以为蓝耳病毒的分离及病毒与宿主的致病机制研究等提供参考。

Description

一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于细胞重组与蛋白表达技术领域，具体涉及一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种危害大、控制难的传染性免疫抑制性疾病，以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。该病是目前主要引起猪繁殖障碍和呼吸系统疾病的主要疫病之一。 PRRS现已遍布于全世界主要养猪国家和地区，其中高致病性蓝耳病属于农业部规定的“一类动物疫病”，已经严重威胁养猪业健康发展。

清道夫蛋白(CD163)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。有研究表明，CD163在确定PRRSV感染中具有关键性的作用，PRRSV必须通过特异性受体诱导才能入侵宿主细胞，而CD163就是其中一个关键受体，CD163的转基因表达导致多种细胞变得易感PRRSV。因此，构建稳定表达CD163的细胞系，有利于病毒增殖和疫苗生产以及探讨CD163在病毒感染中的作用机制。

将外源基因引入细胞或者动物中对于生物学及药学研究具有重要的意义，而这些都取决于转入基因功能的可靠性和可预测性，这需要在转入基因的同时不扰乱内源基因和/或其他调控因子的功能，而且还要求将基因整合到宿主基因组后，宿主可以稳定表达和传代，且无副作用。

因此，为了克服上述问题，亟需一种稳定表达CD163蛋白的细胞株，以实现CD163的稳定高效表达，为病毒增殖、疫苗生产和致病机理研究提供平台。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系。

本发明的第二个目的是提供上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：

一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163，所述PK15-CD163细胞于于2021 年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053。

CD163作为富半胱氨酸清道夫受体(scavebger receptor cysterine-richdomain，SRCR)超家族的主要成员之一，在单核细胞/巨噬细胞表面特异性表达，其I型跨膜蛋白结构是PRRSV 感染细胞必需的结构，其生物学功能与受体分子与细胞膜的锚定过程密切相关。因此，构建稳定表达CD163的细胞系，对猪蓝耳病的防治具有重要的意义。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，包括以下步骤：

S1、将目的基因CD163连接至猪ROSA26-Donor载体上，构建得到猪 ROSA26-Donor-CD163重组质粒；

S2、将重组质粒猪ROSA26-Donor-CD163和猪ROSA26-Cas9质粒共转染至猪肾细胞PK-15中；

S3、对转染后的细胞利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法筛选得到稳定表达CD163的细胞系。

优选地，所述猪ROSA26-Donor载体含有CMV启动子序列和猪ROSA26安全位点重组臂。进一步地，所述猪ROSA26-Donor载体还含有PolyA信号序列和嘌呤霉素耐性基因序列。具体地，所述PolyA信号序列为bGH PolyA信号。

优选地，所述猪ROSA26-Cas9质粒含有靶向猪ROSA26安全位点的sgRNA，sgRNA靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。

本发明通过将目的基因CD163导入到猪基因组的ROSA26安全位点，从而构建得到猪肾细胞系PK15-CD163。

ROSA26是一个位于小鼠6号染色体上的非编码基因，广泛表达于小鼠胚胎和成体的所有组织和细胞中。目前基于ROSA26位点已建立了上百种基因敲入小鼠模型，应用广泛。除小鼠外，ROSA26在大鼠和人胚胎干细胞也已被鉴定和靶向修饰。后来，研究者也获得了世界首例ROSA26定点基因敲入的猪模型，为制备外源基因表达稳定、表型一致的模型提供了解决思路。

本发明通过CRISPR-Cas9特异性的在基因组safe harbor位点上生成DNA双链断裂(DSB)，诱发DNA的自然修复机制，促使该位点与转染进入细胞的质粒中的对应序列之间发生同源重组(HR)，将质粒中的CD163基因序列片段整合到猪ROSA26基因组的safe harbor位点，从而实现在细胞中稳定表达CD163蛋白。本发明采用的ROSA26特异性位点在猪或高等哺乳动物基因组中不会受到免疫介导的排斥，能稳定介导外源基因CD163的高效表达。

优选地，扩增sgRNA靶序列的引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，目的基因CD163是从健康的仔猪中分离原代肺泡巨噬细胞，提取总RNA，并反转录为cDNA，然后以获得的cDNA为模板进行PCR扩增而获得的，扩增所用引物的5’端均含有酶切位点和对应的保护碱基。具体地，所述扩增引物如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，所述酶切位点包括KpnI和BamHI。

优选地，猪ROSA26-Donor载体是以小鼠ROSA26 Safe Harbor基因打靶载体为骨架，采用左右同源臂引物构建得到，左同源臂引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，右同源臂引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述重组质粒猪ROSA26-Donor-CD163和猪ROSA26-Cas9质粒的加入量为1∶1。

优选地，嘌呤霉素筛选方法为用含有嘌呤霉素的培养基对转染后的细胞进行培养，挑出单个细胞集落，所述嘌呤霉素在培养基中的浓度为5μg/mL。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：

上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163在制备CD163蛋白中的应用。

上述稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163在提高猪蓝耳病毒敏感性和/或猪蓝耳病毒致病机理研究中的作用。

采用本发明方法构建得到的稳定表达CD163蛋白的PK-15细胞系，除了可以用于高产 CD163蛋白外，还可以用于提高猪蓝耳病毒敏感性和/或猪蓝耳病毒致病机理研究中，此外，也可以为猪蓝耳病毒的分离提供细胞模型，以及为猪蓝耳病的疫苗生产提供平台等，具有重要的应用价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163，所述PK15-CD163 细胞于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCCNo:62053。本发明以鼠ROSA26 Safe Harbor基因敲入载体为骨架，将其改造成猪ROSA26Safe Harbor基因敲入载体，将CD163插入至靶向猪ROSA26的safe harbor位点，通过CRISPR核酸酶作用于某位点使其产生双链断链，将携带CD163的供体质粒转染至猪肾细胞(PK15)，利用嘌呤霉素筛选方法和有限稀释法成功筛选单克隆细胞株，经扩大培养鉴定后即获得稳定表达蓝耳病毒受体CD163蛋白的PK15细胞系，即PK15-CD163细胞系，为蓝耳病毒的分离及病毒与宿主的致病机制研究提供参考。

本发明的细胞系所提供的特异性猪源ROSA26安全位点，可以解决外源基因表达的不稳定和打靶的随机性，并且又不会影响细胞的正常生理功能。同时，该细胞系的构建采用了 CRISPR/Cas编辑技术，构建过程简单，可重复性好，效率高，而且通过嘌呤霉素压力筛选及定点整合后左右同源臂序列PCR的鉴定测序，确认其克隆准确度高，确保正确克隆的获取。此外，本发明所采用的ROSA26安全位点打靶特异、高效。

附图说明

图1为猪ROSA26-Cas9的质粒图谱；

图2为猪ROSA26-Donor的质粒图谱；

图3为模板质粒1(pROSA26-Donor-CD163)的质粒图谱；

图4为转染细胞的荧光示意图(A为转染细胞培养24h后的荧光示意图，B为经过嘌呤霉素压力筛选10d后的荧光示意图)；

图5为转染细胞的单克隆细胞群落的荧光示意图；

图6为左同源臂特异引物(a)、右同源臂特异引物(b)和CD163特异引物(c)的扩增电泳结果(M为DNA marker，泳道1-3为细胞系PK15-CD163的DNA)；

图7为单克隆细胞株不同培养代次CD163基因的mRNA鉴定结果；

图8为Western Blot电泳条带；A为细胞系PK15-CD163表达的蛋白的SDS-PAGE电泳图，B为内参GAPDH蛋白的SDS-PAGE电泳图，1代表PK15细胞，2代表PK15-CD163细胞)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系的构建

CD163基因序列通过RT-PCR从猪原代肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolarmacrophage， PAM)扩增得到。大肠杆菌DH5α购自广州擎科生物技术有限公司；PK15细胞由本实验室传代保存；Genome-CRISPR^TM小鼠ROSA26 Safe Harbor基因敲入试剂盒购自广州易锦生物技术有限公司，并由本实验室保存；胎牛血清，MEM培养基，脂质体Lipofectamine^TM3000、嘌呤霉素、DNA抽提、RNA抽提等试剂盒及高保真phusion酶均购自赛默飞世尔科技(中国) 有限公司；

II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1、猪源ROSA26安全位点的获取

猪源ROSA26安全位点(GenBank:NC_010455)位于猪的第13条染色体上，通过CRISPR 单链导向RNA(single-strand guide RNA,sgRNA)在线设计网站(http://crispr.mit.edu/) 设计靶向猪Rosa26安全位点的sgRNA，其序列为：GTGAGAGTTATCTGACCGTAAGG (SEQ ID NO.1)。以鼠源Cas 9质粒为骨架，借助BamHI和XbaI酶切位点，将鼠源sgRNA 替换为猪源sgRNA。具体操作步骤如下：

(1)鼠源sgRNA目的基因获取

sgRNA-F：5’-CGCGGATCCGGTGAGAGTTATCTGACCGTAAGGGTTTTAGAGCTAGAA ATAGCAAG-3’(SEQ ID NO.2)；

sgRNA-R：5’-GCTCTAGAAAAAAGCACCGACT-3’(SEQ ID NO.3)。

PCR扩增体系：

PCR扩增的反应程序为：

98℃预处理30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸 10min。

(2)双酶切

以鼠源Cas 9质粒和上述扩增得到的鼠源sgRNA目的基因，分别使用BamH I和XbaI (购自北京NEB公司)进行双酶切，酶切体系如下：

37℃酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用DNA纯化试剂盒(货号： K0692，Thermo)进行切胶回收目的基因。

(2)连接

将上述产物16℃连接2h。

(3)转化

将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，对转化成功的重组载体，挑取单菌落，37℃扩大培养过夜，使用质粒提取试剂盒(货号：K0502，购自Thermo)，送到广州擎科生物技术有限公司进行测序鉴定，并将构建成功的载体命名为猪ROSA26-Cas9质粒，质粒的图谱如图1所示。

2、构建基于猪ROSA26安全位点的打靶载体

(1)PCR扩增猪ROSA26左右同源臂

根据sgRNA靶序列设计左右同源臂，长度分别为501bp和1055bp，并设计左右同源臂引物。使用基因组DNA提取试剂盒(货号：K0721，购自Thermo)提取猪肾脏DNA，PCR 分别扩增猪ROSA26左、右同源臂。

左右同源臂序列如下：

左臂序列(SEQ ID NO.4)：

CCGCAATACCTTTATGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCTTTTCCTAAGGACCGCCCTGGG CCTAGAAAAATCCCTCCCTCCCCCGCGATCTCGTCATCGCCTCCATGTCAGTTTGCTCCT TCTCGATTATGGGCGGGATTCTTTTGCCCTGGCTTAACCTGATTCTTGGGCGTTGTCCTGC AGGGGATTGAGCAGGTGTACGAGGACGAGCCCAATTTCTCTATATTCCCACAGTCTTGA GTTTGTGTCACAAAATAATTATAGTGGGGTGGAGATGGGAAATGAGTCCAGGCAACACC TAAGCCTGATTTTATGCATTGAGACTGCGTGTTATTACTAAAGATCTTTGTGTCGCAATTT CCTGATGAAGGGAGATAGGTTAAAAAGCACGGATCTACTGAGTTTTACAGTCATCCCATT TGTAGACTTTTGCTACACCACCAAAGTATAGCATCTGAGATTAAATATTAATCTCCAAACC TTAGGCCCCCTCACTTGCATCCT。

右臂序列(SEQ ID NO.5)：

TCATACTTTAAGCCCATTTTGTTTGTTGTACTTGCTCATCCAGTCCCAGTCCCATTGG CTTTCTCCTCACCTGTTTTAGGTAGCCAGCAAGTCATGAAATCAGATAAGTTCCACCACC AATTAACACTACCCATCTTGAGCATAGGCCCAACAGTGCATTTATTCCTCATTTACTGATG TTCGTGAATATTTACCTTGATTTTCATTTTTTTCTTTTTCTTAAGCTGGGATTTTACTCCTG ACCCTATTCACAGTCAGATGATCTTGACTACCACTGCGATTGGACCTGAGGTTCAGCAAT ACTCCCCTTTATGTCTTTTGAATACTTTTCAATAAATCTGTTTGTATTTTCATTAGTTAGTA ACTGAGCTCAGTTGCCGTAATGCTAATAGCTTCCAAACTAGTGTCTCTGTCTCCAGTATC TGATAAATCTTAGGTGTTGCTGGGACAGTTGTCCTAAAATTAAGATAAAGCATGAAAATA ACTGACACAACTCCATTACTGGCTCCTAACTACTTAAACAATGCATTCTATCATCACAAAT GTGAAAAAGGAGTTCCCTCAGTGGACTAACCTTATCTTTTCTCAACACCTTTTTCTTTGC ACAATTTTCCACACATGCCTACAAAAAGTACTTCTCTGCTCAAGTCACACTGAGTTGATT GCTATTTACCGAAATCAAAGTAACATTATCAGATCTCTGTAGGGTGGTTCCCTCTGGAAT GCTACCCTCCATAGTCCTTACCCTTCAAGTAAAGAGCATGAAGACTGAAATATCTCTGTG ATCTGTCATCCTTTAAGCCAGAATCCCCCATAAAAAAGTTAGTATTGCTTTCTCCTGATCC CATAGCAGGTTGAATCATAGCACTTATCAGGTTGTTGTCATTGCTTGCTTAAATTCTCCTA ACTATTTGGAGCTTCTTGAGGGCACAGGTTCTTGTTGAGTCTTGTACCTAAGCACCTAGTATAGTCCTTGATGTCTAGCCAACCCTAAATAAAATGCAGTGAGTGACATGTAGATGTCTTTATAAGGTTTGATAGGTTGGTCTCTCAAA。

左右同源臂的引物序列如下：

arm5’-F：5’-ggcctccacggccactaCCGCAATACCTTTATGGGAG-3’(SEQ ID NO.:6)；

arm5’-R：5’-acgcgtctagaaagactggagttAGGATGCAAGTGAGGGGG-3’(SEQ ID NO.7)；

arm3’-F：5’-tatggtgtacaagaTCATACTTTAAGCCCATTTTGTTTGTTG-3’(SEQ IDNO.8)；

arm3’-R：5’-tctcgagcagtttatTTTGAGAGACCAACCTATCAAACC-3’(SEQ ID NO.9)。

PCR扩增体系：

PCR扩增的反应程序为：

98℃预处理30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸 10min。

(2)猪ROSA26左同源臂改造

A、双酶切

以小鼠Rosa26 Safe Harbor基因打靶载体和上述扩增得到的猪ROSA26左同源臂，分别使用SfiI和MluI(购自北京NEB公司)进行双酶切，酶切体系如下：

37℃酶切2h，酶切结束后使用琼脂糖凝胶电泳进行验证，使用DNA凝胶回收试剂盒(货号：K0692，Thermo)进行切胶回收目的基因。

B、连接

将上述产物16℃连接2h。

C、转化

将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，对转化成功的重组载体，挑取单菌落，37℃过夜扩大培养，使用质粒提取试剂盒(货号：K0502，购自Thermo)，送到广州擎科生物技术有限公司进行测序鉴定，暂命名为左-猪ROSA26-Donor载体。

(3)猪ROSA26右同源臂改造

使用载体扩增引物【F：ATAAACTGCTCGAGATGCATG(SEQ ID NO.10)；R：TCTTGTACACCATACCAATGGG(SEQ ID NO.11)】扩增出左-猪ROSA26-Donor载体，然后使用

II One Step Cloning Kit试剂盒(货号：C112，购自诺唯赞生物)进行同源重组反应将猪的右同源臂插入左-猪ROSA26-Donor载体中，转化，提取质粒，送至广州擎科生物技术有限公司进行测序鉴定。改造完成后的载体命名为猪ROSA26-Donor，其图谱如图2所示。

3、细胞系的构建

(1)扩增目的基因

根据CD163基因的序列(NCBI登录号：EU016226.1)设计引物，分别在上下游引物的5’端连接酶切位点KpnI和BamHI以及相应的保护碱基(酶切位点以及保护碱基见引物序列的下划线部分)。

上述引物组的序列具体为：

CD163-F：5’-GGGGTACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’(SEQ ID NO.12)；

CD163-R：5’-CGGGATCCTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTG-3’(SEQ ID NO.13)。

通过从健康的仔猪中分离原代肺泡巨噬细胞(PAM)，具体方法为：对21日龄无特定病原的SPF仔猪，并经ELISA、PCR等检测确定无特定病原抗体、抗原阴性后，采取股动脉放血致死，剖开胸腔，用止血钳结扎气管后连同心脏取出完整的肺，迅速将肺脏置于烧杯中，转移至生物安全柜，用无菌4℃预冷的PBS清洗肺脏表面，以除去血块和肺脏以外的组织。用50mL注射器(或移液管)从气管往肺脏灌入4℃预冷灭菌的PBS，轻轻拍打肺表面，1-2min后，回收灌洗液。按上述方法重复灌洗若干次，直到灌出的液体变得比较清亮。用单层无菌的100目不锈钢筛过滤，以除去大的脂肪组织块等杂质和血块，收集全部灌洗液，1500r/min、 4℃离心10min，细胞沉淀用预冷的无菌PBS重悬细胞，1500r/min离心10min，沉淀用冰预冷的无菌PBS按上述方法重复洗涤1次，离心弃上清后得到猪肺泡巨噬细胞。

根据RNA提取试剂盒从PAM细胞提取总RNA，并反转录为cDNA，以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到CD163目的序列。

其中，PCR扩增的反应体系为：

PCR扩增的反应程序为：

98℃预处理30s；98℃变性10s，63℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸 10min。

PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确认正确后用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收目的基因。

(2)模板质粒1的制备。

将上述步骤回收的CD163目的基因与质粒载体1(猪ROSA26-Donor，质粒图谱如图2所示)，分别经限制酶KpnI和BamHI进行双酶切，回收酶切后的片段，采用本领域的常规方法用连接酶将目的基因序列连接至质粒载体1中，得到模板质粒2(猪ROSA26-Donor-CD163，其质粒图谱如图3所示，其中，LA和RA为猪ROSA26安全位点的重组臂)，将模板质粒2 转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，筛选转化结果为阳性的细胞克隆。并使用限制酶KpnI 和BamHI进行酶切和送到广州擎科生物技术有限公司进行测序鉴定，确保克隆的正确性。

(3)筛选最适Puro(嘌呤霉素)筛选浓度

将PK15细胞接种于96孔板(MEM培养基)，培养至85％-90％细胞密度后，用含有不同Puro浓度(分别为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL)的MEM培养基培养，每日更换培养基，连续观察4-7d，其中，在培养3-4d后全部细胞死亡的培养基中的最低Puro 浓度即为最适Puro筛选浓度。

结果发现，在使用含有不同Puro浓度的MEM培养基培养的第一天，实验组及空白对照组(Puro浓度为0μg/mL)的细胞均无明显变化。培养第二天，除空白组外，不同浓度实验组的细胞状态出现较大差异。培养第三天，5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL及10μg/mL实验组的细胞死亡数超过90％，而1μg/mL、2μg/mL实验组的细胞死亡不明显，3μg/mL、4μg/mL 实验组的细胞死亡数则超过50％。说明高浓度的Pμro能很快将细胞杀死，不利于质粒在细胞内的表达，而较低浓度的Puro则无法在合适时间内杀死足够多的细胞，不利于后续对单克隆细胞的筛选。因此，本实施例所采用的PK15细胞最适Puro筛选浓度为5μg/mL，以确保能满足在限定时间内杀死足够多的细胞以及对细胞毒性低的实验要求。

(4)转染细胞

取PK15细胞于MEM培养液【含10％胎牛血清，转染前1d将细胞接种至6孔板(2×10⁵个/孔)】中过夜培养至细胞密度达到90％-95％。使用脂质体(Lipofectamine^TM3000)将上述制备得到的模板质粒2和猪ROSA26-Cas9质粒(质粒图谱如图1所示)共转染至PK-15细胞内，模板质粒2和猪ROSA26-Cas9质粒加入比例为1∶1(质量比)，转染48h后，更换为含有嘌呤霉素的培养基(5μg/mLPuro)进行筛选。

(5)分离单克隆细胞系

1)在灭菌的96孔板中每孔加入100μL培养基(MEM)，留空左上角A1孔。

2)在A1孔加入200μL细胞悬浮液(2×10⁴cells/mL)，取其中100μL与B1孔中的培养基混匀，混匀过程中避免产生气泡。继续在第1列进行同样的1:2稀释至H1孔，并用培养基将第1列每孔体积定容至200μL。

3)混匀第1列的细胞悬浮液，各取其中100μL加至第2列孔中。用移液器轻柔混匀，避免产生气泡。重复此1:2稀释至第12列，并用培养基将每孔体积定容至200μL。

4)将培养板放在37℃培养，避免扰动。

5)培养7-10天后通过显微镜观察到细胞，在培养板盖上对含单群落的孔进行标记，然后将单群落细胞消化下来，依次采用上述同样的方法经24孔、6孔板扩大培养。

共转染PK15细胞培养48h后，以及压力筛选10d后的情况如图4所示。图4表明，转染后48h，细胞的死亡率约为70％，而余下30％的细胞有荧光表达；经压力筛选10d后，大部分非荧光细胞均出现了死亡，且有70％-90％的细胞有荧光表达。经10d压力筛选后的荧光细胞经消化后，按有限稀释法转入96孔板培养10d后，单个细胞形成单克隆细胞群落的情况如图5所示，单克隆细胞群落中的细胞均出现了荧光，说明克隆无误，即构建得到稳定表达CD163的细胞系PK15-CD163。

其中，将阳性细胞克隆株使用MEM培养基连续传代10次以上，按常规方法冻存、复苏，通过观察阳性克隆细胞的荧光，qPCR检测CD163基因的表达水平，来检测细胞系的稳定性，鉴定方法具体步骤如下：

对细胞克隆株培养过程中的第3代、第5代和第10代为检测对象，使用试剂盒或本领域常规方法提取DNA，利用定点整合后的左右同源臂序列【LA-F： CAAAGCCCCCAGGGATGTAA(SEQ ID NO.14)；LA-R：CGCCCATTGATGTACTGC(SEQ ID NO.15)；RA-F：CTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC(SEQ ID NO.16)；RA-R： TGTCGCCGGTATTGTTCG(SEQ IDNO.17)】，以及扩增CD163基因序列的特异性引物分别进行PCR鉴定。

鉴定结果如图6所示，其中，图6a为CD163基因序列的左同源臂，序列长度为0.922kb；图6b为CD163基因序列的右同源臂，序列长度为1.755kb；图6c为CD163基因序列，序列长度为3.348kb；产物大小符合实验预期，且测序结果验证正确，说明目的基因整合无误，构建的模板质粒2命名为猪ROSA26-Donor-CD163。

对细胞克隆株培养过程中的第3代、第5代和第10代为检测对象，用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，然后按照表1的反应体系和表2的反应程序对于反转录的cDNA进行qPCR 鉴定CD163基因的转录水平。qPCR所用的引物为：CD163-qF：CTGGGATGTCCAACTGCTAT (SEQ IDNO.18)，CD163-qR：TCCCAGAGAGCTGACTCATT(SEQ ID NO.19)，扩增曲线见图7，说明CD163基因敲入到细胞基因组内。

表1反应体系

表2反应程序

4、PK15-CD163细胞系的CD163表达效果检测

采用Western Blot鉴定来检测细胞系的CD163表达效果，具体步骤如下：

(1)细胞系表达的CD163蛋白的提取

将上述实施例制备得到的PK15细胞系(稳定表达CD163的细胞系)在6孔板中进行培养至单层，弃去培养液，用预冷的PBS漂洗3次，除去所有液体，加入200μLPierce IPLysis Buffer(货号：87787，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)和2μL蛋白酶抑制剂(货号：P005，碧云天生物技术有限公司)，在冰上进行间断性颠倒直至细胞完全脱落，然后每隔5～6分钟轻柔振荡一次，重复4次，然后10000g、4℃离心5分钟，取上清保存。

(2)SDS-PAGE电泳

配制10％的SDS-PAGE分离胶，并在分离胶溶液上覆盖一层正丁醇封胶，待分离胶完全聚合后倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤数次以除去正丁醇，之后用滤纸将残留液体吸净。随后，灌注5％的积层胶并立即插入干净的梳子，待积层胶聚合后小心拔出梳子等待上样。

将上述制备的适量体积的CD163蛋白和5×上样缓冲液混合后在100℃下加热5min以使蛋白质变性，然后取40μg变性后的蛋白样品和低分子量标准蛋白Marker上样，先以100V 电压进行电泳，待染料前沿进入分离胶时将电压提高到120V直至染料到达分离胶底部。

(3)转膜

将滤纸和硝酸纤维素膜浸泡于转移缓冲液中，在塑料支架上依次叠放湿润的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使其相互对齐，且各层之间无气泡存在，将支架夹紧插入电泳槽中，其中硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，80V电压转膜2h。

(4)封闭

转膜结束后，加入WB封闭液(货号：P0252，购自碧云天生物技术有限公司)浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭2小时。

(5)检测

用洗涤液(货号：P0023C，购自碧云天生物技术有限公司)漂洗封闭后的硝酸纤维素膜 3次，每次5min。分别将硝酸纤维素膜置于兔CD163多克隆抗体(1∶500)和鼠GAPDH抗体(1∶1000)的稀释液中，4℃平缓摇动反应16h，回收抗体；再分别将纤维素膜浸泡于大量洗涤缓冲液中，平缓摇动洗涤3次，每次10min。

以HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2000)和马抗鼠IgG(1∶2000)稀释液为第二抗体，分别与相应的纤维素膜条反应，将膜浸泡在二抗反应液中，室温平缓摇动反应1-2小时，回收二抗，洗膜，然后用TMB显色液显色1-2min，进行显影。

Western Blot电泳条带如图8所示，出现明显单一条带，符合CD163蛋白的大小，说明 CD163蛋白成功在PK-15细胞上表达。

通过对阳性细胞克隆株不同培养代次进行CD163基因的PCR和qPCR扩增(第3代、第5代和第10代)，均有阳性扩增，以及Western Blot鉴定出特异性的条带。综上所述，本发明中构建的稳定表达CD163的细胞系能够稳定且正确的表达CD163蛋白，可以为进一步开展猪蓝耳病的致病机理研究提供可靠的平台。

最后，将上述实施例中制备得到的细胞系PK15-CD163(猪肾细胞)于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系及其构建方法和应用

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> sgRNA(人工序列)

<400> 1

gtgagagtta tctgaccgta agg 23

<210> 2

<211> 56

<212> DNA/RNA

<213> sgRNA-F(人工序列)

<400> 2

cgcggatccg gtgagagtta tctgaccgta agggttttag agctagaaat agcaag 56

<210> 3

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> sgRNA-R(人工序列)

<400> 3

gctctagaaa aaagcaccga ct 22

<210> 4

<211> 501

<212> DNA/RNA

<213> 左臂序列(人工序列)

<400> 4

ccgcaatacc tttatgggag ttctctgctg cctccttttc ctaaggaccg ccctgggcct 60

agaaaaatcc ctccctcccc cgcgatctcg tcatcgcctc catgtcagtt tgctccttct 120

cgattatggg cgggattctt ttgccctggc ttaacctgat tcttgggcgt tgtcctgcag 180

gggattgagc aggtgtacga ggacgagccc aatttctcta tattcccaca gtcttgagtt 240

tgtgtcacaa aataattata gtggggtgga gatgggaaat gagtccaggc aacacctaag 300

cctgatttta tgcattgaga ctgcgtgtta ttactaaaga tctttgtgtc gcaatttcct 360

gatgaaggga gataggttaa aaagcacgga tctactgagt tttacagtca tcccatttgt 420

agacttttgc tacaccacca aagtatagca tctgagatta aatattaatc tccaaacctt 480

aggccccctc acttgcatcc t 501

<210> 5

<211> 1055

<212> DNA/RNA

<213> 右臂序列(人工序列)

<400> 5

tcatacttta agcccatttt gtttgttgta cttgctcatc cagtcccagt cccattggct 60

ttctcctcac ctgttttagg tagccagcaa gtcatgaaat cagataagtt ccaccaccaa 120

ttaacactac ccatcttgag cataggccca acagtgcatt tattcctcat ttactgatgt 180

tcgtgaatat ttaccttgat tttcattttt ttctttttct taagctggga ttttactcct 240

gaccctattc acagtcagat gatcttgact accactgcga ttggacctga ggttcagcaa 300

tactcccctt tatgtctttt gaatactttt caataaatct gtttgtattt tcattagtta 360

gtaactgagc tcagttgccg taatgctaat agcttccaaa ctagtgtctc tgtctccagt 420

atctgataaa tcttaggtgt tgctgggaca gttgtcctaa aattaagata aagcatgaaa 480

ataactgaca caactccatt actggctcct aactacttaa acaatgcatt ctatcatcac 540

aaatgtgaaa aaggagttcc ctcagtggac taaccttatc ttttctcaac acctttttct 600

ttgcacaatt ttccacacat gcctacaaaa agtacttctc tgctcaagtc acactgagtt 660

gattgctatt taccgaaatc aaagtaacat tatcagatct ctgtagggtg gttccctctg 720

gaatgctacc ctccatagtc cttacccttc aagtaaagag catgaagact gaaatatctc 780

tgtgatctgt catcctttaa gccagaatcc cccataaaaa agttagtatt gctttctcct 840

gatcccatag caggttgaat catagcactt atcaggttgt tgtcattgct tgcttaaatt 900

ctcctaacta tttggagctt cttgagggca caggttcttg ttgagtcttg tacctaagca 960

cctagtatag tccttgatgt ctagccaacc ctaaataaaa tgcagtgagt gacatgtaga 1020

tgtctttata aggtttgata ggttggtctc tcaaa 1055

<210> 6

<211> 37

<212> DNA/RNA

<213> arm5’-F(人工序列)

<400> 6

ggcctccacg gccactaccg caataccttt atgggag 37

<210> 7

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> arm5’-R(人工序列)

<400> 7

acgcgtctag aaagactgga gttaggatgc aagtgagggg g 41

<210> 8

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213> arm3’-F(人工序列)

<400> 8

tatggtgtac aagatcatac tttaagccca ttttgtttgt tg 42

<210> 9

<211> 39

<212> DNA/RNA

<213> arm3’-R(人工序列)

<400> 9

tctcgagcag tttattttga gagaccaacc tatcaaacc 39

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 载体扩增引物F(人工序列)

<400> 10

ataaactgct cgagatgcat g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 载体扩增引物R(人工序列)

<400> 11

tcttgtacac cataccaatg gg 22

<210> 12

<211> 33

<212> DNA/RNA

<213> CD163-F(人工序列)

<400> 12

ggggtaccat ggacaaactc agaatggtgc tac 33

<210> 13

<211> 34

<212> DNA/RNA

<213> CD163-R(人工序列)

<400> 13

cgggatcctc attgtacttc agagtggtct cctg 34

<210> 14

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> LA-F(人工序列)

<400> 14

caaagccccc agggatgtaa 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> LA-R(人工序列)

<400> 15

cgcccattga tgtactgc 18

<210> 16

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> RA-F(人工序列)

<400> 16

ctgcattcta gttgtggttt gtc 23

<210> 17

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> RA-R(人工序列)

<400> 17

tgtcgccggt attgttcg 18

<210> 18

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> CD163-qF(人工序列)

<400> 18

ctgggatgtc caactgctat 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> CD163-qR(人工序列)

<400> 19

tcccagagag ctgactcatt 20

Claims

1.一种稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163，其特征在于，所述PK15-CD163细胞于2021年11月11日送往广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为GDMCC No:62053。

2.权利要求1所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将目的基因CD163连接至猪ROSA26-Donor载体上，构建得到猪ROSA26-Donor-CD163重组质粒；

3.根据权利要求2所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，所述猪ROSA26-Donor载体含有CMV启动子序列和猪ROSA26安全位点重组臂。

4.根据权利要求2所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，所述猪ROSA26-Cas9质粒含有靶向猪ROSA26安全位点的sgRNA，sgRNA靶序列的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，扩增sgRNA靶序列的引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求2所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，目的基因CD163是从健康的仔猪中分离原代肺泡巨噬细胞，提取总RNA，并反转录为cDNA，然后以获得的cDNA为模板进行PCR扩增而获得的，扩增所用引物的5’端均含有酶切位点和对应的保护碱基。

7.根据权利要求2所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，猪ROSA26-Donor载体是以小鼠ROSA26 Safe Harbor基因打靶载体为骨架，采用左右同源臂引物构建得到，左同源臂引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，右同源臂引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

8.根据权利要求2所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163的制备方法，其特征在于，嘌呤霉素筛选方法为用含有嘌呤霉素的培养基对转染后的细胞进行培养，挑出单个细胞集落，所述嘌呤霉素在培养基中的浓度为5μg/mL。

9.权利要求1所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163在制备CD163蛋白中的应用。

10.权利要求1所述的稳定表达CD163蛋白的猪肾细胞系PK15-CD163在猪蓝耳病毒致病机理研究中的作用。