CN105087635A - 一种诱导三分三毛状根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导三分三毛状根的方法，主要提供了通过发根农杆菌介导的三分三毛状根诱导技术。具体涉及发根农杆菌的活化、转化菌液的制备、外植体的转化、毛状根的继代培养及毛状根的PCR检测等方法。本发明通过三分三毛状根的高效诱导和规模化培养，可实现托品烷类生物碱的工厂化生产，对三分三这一珍稀药用植物资源的可持续利用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其是三分三叶片愈伤组织的产生及毛状根的诱导形成。
背景技术
三分三（AnisodusacutangulusC.Y.WuetC.Chen）为我国特有的一种茄科多年生珍稀草本药用植物，以根、茎、叶和种子入药，味苦、辛，性温，有剧毒，剂量超过三分三厘则可能中毒，故名三分三。其根、茎、叶和种子均富含托品烷类生物碱，主要有莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱和樟柳碱，具有较强的抗胆碱生理活性，用于各种诱因引起的休克、成人呼吸窘迫综合症、重症肝炎等多种疾病，其中，莨菪碱、东莨菪碱是重要的反副交感神经作用类药物，临床上主要用作镇静剂，需求量不断增加。
开发和利用天然药物已成为现代医药的重要领域，但由此也对许多野生名贵中药材资源造成严重威胁。应用现代生物技术生产天然药用有效成分则可以有效缓解药用植物资源压力，并能为中药的安全、有效、稳定、可控提供保障。毛状根作为生物反应器具有生产周期短、易规模化、不受外界环境干扰而且生理代谢活力强、有效成分产量高、遗传稳定性好等特点，已被广泛用于药用植物离体培养以大量生产药效成分。毛状根是由植株、器官或组织经过发根农杆菌感染，在感染过程中发根农杆菌将其携带的Ri质粒上的T-DNA转移到植物细胞中，并且在宿主细胞基因组中发生整合，进而形成类似于毛发一样细长的根状组织，故名毛状根或发根。毛状根属于激素自养型，培养基中不需要外加生长调节物质，可有效降低生产成本。目前为止，国内外毛状根诱导培养技术已在人参、紫草、黄连、丹参、青蒿、甘草、长春花、黄芪、颠茄、红花等重要药用植物上取得成功，人参皂甙、紫草宁、黄连素、丹参酮等已通过毛状根培养得以工业化生产。因此，毛状根培养技术在继植物愈伤组织和细胞离体培养之后，正在成为利用生物技术生产药用天然产物、实现药用植物资源可持续利用的又一崭新途径。
发明内容
本发明的目的是：提供一种一种诱导三分三毛状根的方法，它能实现三分三毛状根的高效诱导和规模化培养，并且丰富了利用生物技术生产天然药用的种类。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：诱导三分三毛状根的方法，利用发根农杆菌侵染三分三种子萌发，获得的无菌苗叶片，诱导三分三叶片愈伤组织产生毛状根，以获取托品烷类生物碱；具体步骤如下：
步骤1：活化发根农杆菌A4菌株，制备OD600=0.6～0.8的转化菌液；
步骤2：将经过预培养的外植体在转化菌液中浸染2～5min后，接种到共培养基上，置于温度为23～27℃的恒温培养箱中暗培养3～5d；
步骤3：将所述步骤2中共培养的外植体接种到抑菌培养基上，置于23～27℃的恒温培养箱中暗培养，直至外植体上愈伤组织产生毛状根；
步骤4：剪取毛状根接种于脱菌培养基上暗培养1～3周，选取生长快、分支好的毛状根每2～4周继代一次，头孢霉素Cef的浓度逐渐降低直到完全脱菌；
步骤5：配制含rolB基因序列特异性引物的PCR反应体系，提取所述步骤4中获得的无菌三分三毛状根DNA进行PCR分子检测，以确定三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。
步骤1中所述的转化菌液的制备是：将发根农杆菌菌株A4接种于LB添加卡拉霉素Kan40～60mg/L的液体培养基中，在27～29℃、170～190rpm转速下进行两次振荡活化，培养至对数生长期，即OD600=0.6～0.8；将菌液离心并弃掉上清液，沉淀下来的菌体用MS液体培养基，添加乙酰丁香酮AS50～150μmol/L，悬浮并调节OD600=0.6～0.8，用于转化。
步骤2中所述的外植体是指用三分三种子萌发获得的无菌苗叶片；所述的外植体预培养是将叶片剪成1.5cm×1.5cm的小片接种在预培养基上，于23～27℃下培养12～48h，预培养基组成为MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L+AS50～150μmol/L，pH5.8；所述的共培养基是MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L，pH5.8。
步骤3中所述的抑菌培养基是MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L+Cef100～300mg/L，pH5.8。
步骤4中所述的脱菌培养基是MS+Cef100～300mg/L，pH5.8；脱菌培养时间为2周，以后每3周继代一次。
步骤5中所述的rolB基因序列特异性引物大小为741bp，其正向引物的序列为5′-CTATTCCTTCCACGATTTCAACCA-3′，反向引物的序列为5′-CTGCAGCAGGCTTCATGACGCCC-3′；所述的PCR反应体系为2.5μLNuclease-FreeWater+7.5μL2×GreenMasterMix+1.5μL10μmol/LForwardPrimer+1.5μL10μmol/LReversePrimer+2μLDNAtemplate；PCR反应条件为95℃预变性5min，35个循环（95℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共25个循环），72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物；PCR扩增产物检测采用2%琼脂糖凝胶（EB染色）电泳（75V，20min），DNA相对分子质量标准为DL1000，用Bio-RAD凝胶成像系统拍照。PCR检测结果证明了发根农杆菌A4菌株的毛状根基因rolB已转移并整合到三分三毛状根基因组中，说明三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是叶片感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。作为优选方案，步骤1中Kan浓度为50mg/L，AS浓度为100μmol/L，培养温度为28℃，摇床转速为180rpm，OD600=0.7。
作为优选方案，步骤2中外植体预培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+AS100μmol/L，预培养温度为（25±1）℃，预培养时间为24h；外植体在转化菌液中浸染时间为3min；共培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L，共培养温度为（25±1）℃，共培养时间为4d。
作为优选方案，步骤3中的抑菌培养基为MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+Cef200mg/L，抑菌培养温度为（25±1）℃。
作为优选方案，步骤4中毛状根脱菌培养基为MS+Cef200mg/L，脱菌培养时间为2周，以后每3周继代一次。
由于采用了以上技术方案，与现有技术相比，本发明本发明以三分三叶片为外植体，利用发根农杆菌A4菌株侵染而诱导叶片愈伤组织产生毛状根，进而获取托品烷类生物碱，既丰富了利用生物技术生产天然药用的种类，也保障了三分三这一珍稀药用植物资源的可持续利用。毛状根生产周期短、易规模化、不受外界环境干扰，而且具有生理代谢活力强、有效成分产量高、遗传稳定性好等特点。本发明获得的三分三毛状根属于激素自养型，人工规模化培养中不需要外加生长调节物质，可有效降低生产成本，市场前景广阔。
附图说明
图1为发根农杆菌A4侵染的叶片与对照（CK）的差异；
图2为三分三毛状根单克隆；
图3为三分三毛状根rolB基因的PCR检测；
图3中M为核酸相对分子质量标准DL1000；1是空白对照，2、3是作为阴性对照的三分三普通根，4、5是不同毛状根单克隆，6是作为阳性对照的发根农杆菌A4；rolB表示rolB基因。
具体实施方式
本发明的实施例：诱导三分三毛状根的方法
本发明中的材料三分三（AnisodusacutangulusC.Y.WuetC.Chen）种子由中国科学院昆明植物研究所提供，三分三无菌组培系统由贵州大学生命科学院植物生理研究室建立；发根农杆菌A4由贵州大学生命科学院植物生理研究室保存（该菌种为公知菌种，多数实验室均可获取）。
（1）活化发根农杆菌，制备转化菌液：在无菌条件下，用接种环挑取于-20℃低温冰箱中冻存的发根农杆菌A4菌株，在LB+Kan50mg/L的固体平板上划线后置于28℃恒温培养箱中倒置暗培养，直到长出单菌落。挑取一个单菌落接种于50mL容量的装有LB10mL+Kan50mg/L液体培养基的三角瓶中，于28℃、180rpm的摇床内暗培养复苏21h（LB液体培养基变成浑浊的淡黄色时，证明细菌已正常长出）。取50μL该菌液于上述培养基中再次活化21h（条件同上），使其达到对数生长期（OD600=0.7）。室温、4000rpm离心10min，弃上清液，菌体用MS液体培养基+AS100μmol/L悬浮，调OD600值至合适浓度（OD600=0.7），继续培养30min后即可作为转化菌液用于转化三分三外植体。
（2）外植体的转化：将刚刚长出嫩叶不久的三分三无菌种子苗叶片剪成1.5cm×1.5cm的小片，接种于MS预培养基上预培养24h后置入转化菌液中浸染3min，其间不断轻轻晃动浸染瓶，使叶片切口与菌液充分接触。将浸染叶片用无菌滤纸吸去其表面多余菌液后置入共培养基，于（25±1.0）℃恒温暗培养箱中让发根农杆菌和外植体共培养4d，以未被农杆菌侵染的叶片（仅接种LB培养液，培养条件相同）作对照。每个处理接种12个叶片小片，重复三次。共培养结束后，将侵染和未侵染的叶片转移到脱菌培养基上，置于（25±1.0）℃恒温培养箱暗培养，30d后统计毛状根发生情况（见表1和图1）；其中，图A显示被侵染叶片愈伤组织长出毛状根，图B显示未侵染叶片（CK）愈伤组织不产生毛状根。
毛状根诱导率=产生毛状根的外植体数/外植体总数×100%
毛状根诱导密度=毛状根总数/产生毛状根的外植体数
（3）毛状根的继代培养：剪取长约2～3cm的毛状根，接种到无激素的MS脱菌培养基上（含Cef200mg/L），置于（25±1.0）℃恒温培养箱中暗培养，每3周继代1次，并逐步降低Cef浓度。待彻底脱菌后，将毛状根剪成3cm的小段，接种于无激素、无抗生素的MS培养基上培养，且对每个培养皿中毛状根的接种量均作4个处理，分别为1、2、3、4条，每个处理接种5皿，重复3次，10d后观察毛状根生长和分枝情况（见表2和图2）。
（4）毛状根的PCR检测：提取三分三毛状根的DNA，合成发根农杆菌Ri质粒中与转化有关的关键基因（rolB基因）引物；其正向引物的序列为5′-CTATTCCTTCCACGATTTCAACCA-3′，反向引物的序列为5′-CTGCAGCAGGCTTCATGACGCCC-3′；①优化PCR反应体系（15μL）：2.5μLNuclease-FreeWater+7.5μL2×GreenMasterMix+1.5μL10μmol/LForwardPrimer+1.5μL10μmol/LReversePrimer+2μLDNAtemplate。②优化PCR反应条件：95℃预变性5min，35个循环（95℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共25个循环），72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。③PCR扩增产物检测：2%琼脂糖凝胶（EB染色）电泳（75V，20min），DNA相对分子质量标准为DL1000，用Bio-RAD凝胶成像系统拍照。PCR检测时以未转化的三分三根作阴性对照，相应的农杆菌菌株作阳性对照。从图3的检测结果可以证明，发根农杆菌A4菌株的毛状根基因rolB已转移并整合到三分三毛状根基因组中，因此三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是叶片感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。
SEQUENCELISTING
序列表
<110>贵州大学
<120>一种诱导三分三毛状根的方法
<130>nm:
<160>2
<170>PatentInversion
<210>SEQIDNO：1
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>引物与模板序列互补，引物与引物间避免形成二聚体，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应；用于三分三毛状根DNA的PCR检测
<400>1
CTATTCCTTCCACGATTTCAACCA24
<210>SEQIDNO.2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物与模板序列互补，引物与引物间避免形成二聚体，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应；用于三分三毛状根DNA的PCR检测
<400>2
CTGCAGCAGGCTTCATGACGCCC23
Claims (6)
1.一种诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：利用发根农杆菌侵染三分三种子萌发，获得的无菌苗叶片，诱导三分三叶片愈伤组织产生毛状根，以获取托品烷类生物碱；具体步骤如下：
步骤1：活化发根农杆菌A4菌株，制备OD600=0.6～0.8的转化菌液；
步骤2：将经过预培养的外植体在转化菌液中浸染2～5min后，接种到共培养基上，置于温度为23～27℃的恒温培养箱中暗培养3～5d；
步骤3：将所述步骤2中共培养的外植体接种到抑菌培养基上，置于23～27℃的恒温培养箱中暗培养，直至外植体上愈伤组织产生毛状根；
步骤4：剪取毛状根接种于脱菌培养基上暗培养1～3周，选取生长快、分支好的毛状根每2～4周继代一次，头孢霉素Cef的浓度逐渐降低直到完全脱菌；
步骤5：配制含rolB基因序列特异性引物的PCR反应体系，提取所述步骤4中获得的无菌三分三毛状根DNA进行PCR分子检测，以确定三分三叶片愈伤组织产生的毛状根是感染发根农杆菌A4后毛状根基因rolB表达的结果。
2.根据权利要求1所述的诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：步骤1中所述的转化菌液的制备是：将发根农杆菌菌株A4接种于LB添加卡拉霉素Kan40～60mg/L的液体培养基中，在27～29℃、170～190rpm转速下进行两次振荡活化，培养至对数生长期，即OD600=0.6～0.8；将菌液离心并弃掉上清液，沉淀下来的菌体用MS液体培养基，添加乙酰丁香酮AS50～150μmol/L，悬浮并调节OD600=0.6～0.8，用于转化。
3.根据权利要求1所述的诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：步骤2中所述的外植体是指用三分三种子萌发获得的无菌苗叶片；所述的外植体预培养是将叶片剪成1.5cm×1.5cm的小片接种在预培养基上，于23～27℃下培养12～48h，预培养基组成为MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L+AS50～150μmol/L，pH5.8；所述的共培养基是MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：步骤3中所述的抑菌培养基是MS+2,4-D0.3～0.8mg/L+6-BA0.5～1.5mg/L+Cef100～300mg/L，pH5.8。
5.根据权利要求1所述的诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：步骤4中所述的脱菌培养基是MS+Cef100～300mg/L，pH5.8；脱菌培养时间为2周，以后每3周继代一次。
6.根据权利要求1所述的诱导三分三毛状根的方法，其特征在于：步骤5中所述的rolB基因序列特异性引物大小为741bp，其正向引物的序列为5′-CTATTCCTTCCACGATTTCAACCA-3′，反向引物的序列为5′-CTGCAGCAGGCTTCATGACGCCC-3′；所述的PCR反应体系为2.5μLNuclease-FreeWater+7.5μL2×GreenMasterMix+1.5μL10μmol/LForwardPrimer+1.5μL10μmol/LReversePrimer+2μLDNAtemplate；PCR反应条件为95℃预变性5min，35个循环（95℃变性45s，52℃退火45s，72℃延伸1min，共10个循环；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共25个循环），72℃延伸10min，4℃保存PCR扩增产物；PCR扩增产物检测采用2%琼脂糖凝胶（EB染色）电泳（75V，20min），DNA相对分子质量标准为DL1000，用Bio-RAD凝胶成像系统拍照。
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