CN105759059A - 一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明创造提供一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括抗EV71病毒IgM抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液、浓缩洗液、底物溶液和终止液。本发明创造能够快速简便地消除人血清样本中的特异性IgG抗体对于IgM抗体测定的干扰，提高检测便捷度和准确度。

Description

一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，尤其涉及一种适用于EV71病毒抗原免疫检测的试剂盒及其制备方法。
背景技术
肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。此病毒能够袭击神经系统，引起神经性并发症如无菌性脑膜炎(asepticmeningitis)、缓性麻痹(acuteflaccidparalysis)和脑干脑炎(brainstemencephalitis)。婴幼儿手足口病(HFMD)和疱疹性咽峡炎(hermangina)是EV71感染的主要临床特征。此病多发于学龄前儿童，尤其以三岁及以下婴幼儿发病率最高。EV71病毒有四种基因型(A,B,C,D)，基因型B和C各含有五种亚型，其中C4aEV71的平均进化率比其它EV71基因型都迅速。重要核苷酸或氨基酸变异很可能使进化的C4a病毒神经毒力增加，导致中国大范围内爆发手足口病。2008年至2009年，由EV71病毒感染导致的死亡人数接近500例。国家手足口病监督系统的数据显示，从2008年到2012年，人群感染手足口病病死率为0.03％，严重病例占1.1％。
到目前为止还没有有效的抗EV71病毒疗法，所以控制EV71病毒传播依赖于病毒的快速早期检测和诊断。传统的EV71实验室诊断方法主要是病毒分离和病毒类型识别技术，但此类方法耗时长，妨碍病情的及时诊断，从而拖延疾病的治疗和实施预防措施。另一种诊断方法是先进行细胞培养，随后利用血清型不同的特异性抗血清进行病毒的中和实验。此方法也需要消耗大量的时间来获得结果，而且实验步骤更加繁琐，且需要经过专门培训的技术人员来操作，不能广泛的用于大多数实验室研究。尽管后来的分子学方法(反转录PCR法检测病毒基因组)能够做到准确有效的检测EV71病毒，但由于此方法需要特殊的仪器，并且也需要专门培训的技术人员来操作，检测费用相当昂贵，所以这种方法对于爆发EV71病毒感染的许多国家和地区来说并不适用。
酶联免疫吸附技术(ELISA)操作方便，灵敏度高，检测时间短，是非常高效且准确的检验病毒感染的方法。在EV71病毒的临床检测中，国内外现有的ELISA法检测试剂盒普遍使用的事捕获法，即先将抗人IgM抗体包被在酶标板上，加入血清样本后，抗人IgM将捕获血清样本中的待检IgM抗体，经洗涤去除IgG后，再测定特异性IgM。采用捕获法能够降低血清样本中特异性IgG抗体对于IgM抗体测定的干扰，但此方法操作复杂，检测时间相对较长，灵敏度较低。因此，在EV71病毒临床检测领域内，迫切需要一种高效且高灵敏性和特异性的定量检测IgM的诊断试剂盒产品。
发明内容
本发明创造为解决现有技术中的问题，提供了一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，能够快速简便地消除人血清样本中的特异性IgG抗体对于IgM抗体测定的干扰，提高检测便捷度和准确度。
本发明创造提供的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，包括EV71病毒抗原包被的酶标板、抗EV71病毒抗原IgM抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液、浓缩洗液、类风湿因子吸附剂、样本稀释液、底物溶液和终止液。
其中，所述EV71病毒抗原包被的酶标板采用下述方法获得：
a)EV71病毒抗原包被液的配制：采用以下缓冲溶液将EV71病毒抗原稀释至25-2000ng/100μL；0.01-0.1MPBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0-8.0；0.05-0.1MCBS(碳酸盐缓冲溶液)，其pH9.0-9.6；0.05mol/LTris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液)，其pH10.0-10.6；
b)将3-5％的脱脂奶粉或者1-3％BSA(牛血清白蛋白)加入下述缓冲溶液中，配制成封闭液：缓冲溶液，0.01-0.1MPBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.0-8.0；
c)包被酶标板：
i.将配制的EV71病毒抗原包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-200μL被液；
ii.酶标板置于2-8℃环境下包被8-24h；
iii.将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入50-200μL封闭液置于37℃温箱，30-90分钟；
iv.从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30-90分钟，即得。
其中，所述抗EV71病毒IgM抗体标准品为若干浓度不同的抗EV71病毒IgM抗体溶液，优选的浓度分别为500AU/ml，250AU/ml，125AU/ml，62.5AU/ml，31.25AU/ml。抗EV71病毒IgM抗体标准品中用于稀释抗EV71病毒IgM抗体的液体优选地与样本稀释液相同，更优选为含蛋白质的磷酸盐缓冲液，其中，蛋白质优选为BSA(牛血清白蛋白)，蛋白质在磷酸盐缓冲液中浓度优选为1-5％。
其中，所述辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液是将辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体用HRP偶联物稳定剂以1:1000-1:5000的比例稀释而成，优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体溶液。
其中，所述浓缩洗液(20×0.01MPBS)由下述组分制成：以重量计，氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
其中，所述类风湿因子吸附剂来源于一种抗变性IgG的自身抗体，能特异的与IgGFC片段上抗原表位结合，消除血清中IgG对IgM测定的干扰。可以通过公开号为CN105001337A的专利提供的方法获得，也可以通过其他常规方法、或本案提供的方法获得。
其中，所述样本稀释液优选为含蛋白质的磷酸盐缓冲液，其中，蛋白质优选为BSA(牛血清白蛋白)，蛋白质在磷酸盐缓冲液中浓度优选为1-5％。
其中，所述底物溶液为TMB(四甲基联苯胺)，作为酶的反应底物发生显色反应，且颜色的深浅和待测样品中EV71病毒抗原浓度呈正相关。
其中，所述终止液为硫酸溶液，优选为2mol/L硫酸溶液，可以采用将浓硫酸与超纯水1:8稀释配制而成，用于终止酶的显色反应。
上述过程中，还提供了一种所述检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备方法，以及该试剂盒在检测EV71病毒抗原浓度方面的应用。
上述试剂盒在检测EV71病毒抗原浓度方面的应用的方法为直接ELISA方法，具体步骤包括：
(1)将样本稀释液与类风湿因子吸附剂按比例稀释，优选的稀释比例为10:1；
(2)将待检样本与样本稀释液按比例稀释，优选的稀释比例为1:300-1:500；
(3)将上述步骤(2)和步骤(1)获得的液体混合后静置，优选的混合比例为1:9，优选的静置时间至少15min；
(4)将步骤(3)所得的待测样本加入到EV71病毒抗原包被的酶标板中孵育、孵育后洗板，优选的孵育时间为30-60min；
(5)向步骤(4)获得的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液并孵育、孵育后洗板，优选的孵育时间为30-60min；
(6)向步骤(5)获得的酶标板中加入底物溶液进行显色反应，然后加入终止液进行检测，于酶标仪上读取450nm处的吸光光度值。
上述试剂盒在检测EV71病毒抗原浓度方面的应用原理如下：
(1)将EV71病毒抗原包被在固相载体(酶标板)上，制成固相抗原；
(2)将待检样本用类风湿因子吸附剂处理后加入到包被EV71病毒抗原的酶标板上并恒温孵育，孵育后洗板；
(3)加入辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液，反应一段时间后再加入底物溶液进行显色反应，颜色的深浅和待检样本中EV71病毒抗原浓度呈正相关；
(4)用酶标仪在一定波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线实现对抗原的检测。
其中，本发明所述EV71病毒抗原的制备过程如下：
(1)VP1基因扩增和重组质粒
在GenBank中取VP1全长基因片段，在其两端分别加上BamHI和NdeI限制性酶切位点，使用RT-PCR扩增VP1基因片段，条件如下：94℃3min；94℃15s，55℃45s，72℃30s，30个循环；72℃10min。回收PCR产物并用琼脂糖凝胶电泳鉴定。合成的VP1基因序列和载体pET44a(+)同时使用XhoI和NocI双酶切，回收的目的片段和载体，用T4连接酶16℃连接过夜，构建原核表达载体pET44a(+)-EV71/VP1。将构建好的表达载体pET44a(+)-EV71/VP1转入大肠杆菌Top10中，接种于含氨苄青霉素的LB平板中，挑取单克隆菌落后进行双酶切鉴定。
(2)EV71VP1蛋白的表达和纯化
将重组质粒转入感受态大肠埃希菌BL21(DE3)中，加入IPTG诱导VP1融合蛋白的表达。将含有融合蛋白的包涵体溶解于6M尿素中，缓慢加入pH7的缓冲液使蛋白复性。随后，复性的VP1蛋白溶液经过过滤(膜孔径0.45μm)后使用Ni-NTA亲和层析柱纯化，最终获得rVP1蛋白样品。蛋白纯度经12％的SDS-PAGE电泳鉴定。
其中，本发明所述EV71病毒IgM抗体，可与EV71病毒抗原特异性结合，用EV71病毒抗原包被，间接法ELISA检测显示其效价不低于1:1×105，其制备过程如下：
用EV71病毒抗原作为免疫原免疫动物得到的血清进行分离纯化，得到抗体，所述纯化方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析法，其中，免疫方法可以为皮下注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注射，免疫剂量为0.1mg-10mg，免疫的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，优选小鼠。
进一步的，上述EV71病毒IgM抗体的具体制备过程为：
(1)收集EV71病毒抗原免疫的BALB/C小鼠体内的血清，分离抗血清；
(2)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化：
a)取2ml抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，于4沉淀过夜；
b)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2mlPBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，在4℃静置1小时；
c)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1mlPBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜；
(3)用亲和层析的方法进一步纯化：
a)用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
b)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
c)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
d)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
e)用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗EV71病毒多克隆抗体。
(4)抗体的人源化
对鼠源单克隆抗体进行人源化处理，得到人源化的特异针对EV71病毒IgM抗体。可自行进行人源化处理，也可委托商业公司进行人源化处理。
本发明创造具有如下优势：
本发明所述EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒采用直接法，先将EV71病毒抗原包被在酶标板上，再将待检样本与包被抗原结合，再经辣根过氧化物酶与底物发生显色反应，测定结果的颜色深浅和待检IgM的浓度呈正相关，其所用抗体为抗人IgM多克隆抗体，可根据IgM标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算待检样本的浓度值。待检样本由于经过类风湿因子吸附剂的处理，消除了样本中来自特异性IgG的干扰，使得该检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，结果与参比试剂符合率高，能提供更准确可靠的检验结果，所述试剂盒操作简便易行，检测快速灵敏，所用酶标仪简单、普及，价格低廉，该检测试剂盒为EV71病毒IgM抗体定量检测提供了一种有效工具。
附图说明
图1是EV71衣壳蛋白VP1基因的PCR扩增；
图2是SDS-PAGE分析EV71VP1重组蛋白纯化结果；
图3是IgG型多克隆抗体的效价测定的结果；
图4是EV71病毒IgM抗体试剂盒标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。
实施例1EV71病毒抗原的制备
(1)引物设计
用PrimerPremier5.0设计EV71VP1基因的两条引物，正向引物：5’-CGGGATCCGGAGATAGGGTGGCAGATGTA-3’(下划线处为BamHⅠ酶切位点)；反向引物为：5’-CGGAATCCAGTAGTGATCGCCGTGCG-3’(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)。
(2)目的基因的扩增
EV71VP1基因购自天津汇滨，全基因序列见GenBankaccessionNo:FJ360544。扩增反应：50μL反应体系包括dNTP、PCR缓冲液、正反向引物、模板和TaqDNA聚合酶，混匀后，94℃变性5min，然后94℃变性30S、50℃退火30s、72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
(3)表达载体的构建
EV71VP1PCR扩增产物琼脂用糖凝胶电泳回收，将扩增产物和载体pUC19用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，用T4DNA连接酶连接，16℃水浴过夜连接，转化感受态E.coliTOP10菌株，涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单菌落接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，提取质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定。将鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确后保存质粒。将该阳性质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21gold(DE3)感受态细胞中，并涂布到含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆BL21gold(DE3)/Top10-VP1。
(4)重组蛋白VP1的诱导表达及SDS-PAGE鉴定将BL21gold(DE3)/Top10-VP1接种到3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。第二日，按照1:20的体积比接种至3ml含100μg/ml氨苄青霉素，25μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃培养2h至A600达到0.6，加入终浓度0.05mmol/L的IPTG，诱导表达4h后10000r/min离心收集菌体。收集到的菌体用700μL0.02mol/LPBS重悬，在冰浴中进行超声破碎。超声破碎后12000r/min离心5min，取上清90μL。沉淀继续用700μL0.02mol/LPBS重悬，混匀后取样90μL，与之前的上清各加30μL4*SDS上样缓冲液，煮沸5min，进行SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白。
(5)蛋白的表达与纯化
与小量诱导条件相同，将体积扩大为1L大量诱导蛋白表达，结束后将培养物4000r/min，离心20min，收集菌体。用0.02mol/LPBS缓冲液洗涤2次后重悬，冰浴中超声破碎。获得的裂解液在4℃条件下10000r/min离心15min，弃去上清，收集到的沉淀为粗制包涵体。用5ml/LTritonX-100洗涤，10000r/min离心15min，弃去上清，将沉淀用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)溶解后备用，Ni2+亲和层析柱用含6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)平衡，上样，分别用含50、100、200mmol/L咪唑、6mol/L盐酸胍的0.02mol/L的PB(PH7.8)洗脱，收集样品。取收集的样品90μL，加入等体积100g/L的三氯乙酸，4℃放置30min，12000r/min离心15min，弃去上清，用无水乙醇洗涤沉淀2次，加入1*SDS上样缓冲液，煮沸5min后进行SDS-PAGE分析结果。
实施例2EV71病毒IgM抗体的制备
(1)收集EV71病毒抗原免疫的BALB/C小鼠体内的血清，分离抗血清；
(2)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化：
a)取2ml抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，于4沉淀过夜；
b)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2mlPBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，在4℃静置1小时；
c)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1mlPBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜；
(3)用亲和层析的方法进一步纯化：
a)用5-10倍柱床体积的洗脱缓冲液洗柱；
b)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
c)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
d)用5-10倍柱床体积的偶联缓冲液洗柱；
e)用2-5倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱，得到抗EV71病毒多克隆抗体。
(4)抗体的人源化
对鼠源单克隆抗体进行人源化处理，得到人源化的特异针对EV71病毒IgM抗体。可自行进行人源化处理，也可委托商业公司进行人源化处理。
实施例3抗人IgG抗原多克隆抗体的制备
一、抗人IgG抗原的多克隆抗体的制备
1.免疫动物
将人IgG抗原与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积，充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔免疫剂量控制在0.1-0.5mg。免疫前3天取耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。
2.多克隆抗体的获得
1)效价测定：免疫过程中，免疫后每隔7天采血测效价1次，免疫次数4次。
2)分离抗血清：血清效价达到很高时，用颈动脉放血的方法大量采血。待血液凝固，血清分离出后，高速离心，取上清，在-20℃下保存。
3)用饱和硫酸铵盐析法进行初步纯化
a)取2ml抗血清样本，加等体积的生理盐水，再加入4ml饱和硫酸铵溶液，于4℃沉淀过夜；
b)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用2mlPBS溶解，缓慢滴加1ml饱和硫酸铵溶液，在4℃静置1小时；
c)10000g低温离心10分钟，弃上清，将沉淀用1mlPBS溶解，用PBS溶液4℃透析过夜。
4)用亲和层析的方法进一步纯化
a)用7倍柱床体积的洗脱缓冲液(0.01MPB磷酸缓冲液)洗柱；
b)用7倍柱床体积的偶联缓冲液(0.01MPBS磷酸盐缓冲液)洗柱；
c)将用饱和硫酸铵盐析法初步纯化过的样品上样；
d)用7倍柱床体积的偶联缓冲液(0.01MPBS磷酸盐缓冲液)洗柱；
e)用3倍柱床体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸)洗脱，得到抗人IgG多克隆抗体。
二、抗体效价的测定
用间接ELISA法对抗体效价进行测定。所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，阴性对照为PBS溶液，以抗体溶液的OD值大于阴性对照OD值的2倍为阳性判定标准。检测结果见附图3，由于IgG与IgM的效价在数量级上保持一致，因此间接反映了IgM的效价。从结果可看出，抗体效价较高，大于1:1×105。
实施例4EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1.包被液的配制：
所述的EV71病毒抗原包被液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将EV71病毒抗原稀释至25ng/100μLpH7.0-7.4。
2.封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液，其中pH7.0-7.4；
2)将3％的脱脂奶粉加入上述溶液中，配制成封闭液。
3.酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入60μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被8h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入60μL封闭液，置于37℃温箱，30分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温30分钟。
4.类风湿因子吸附剂的配制：
1)将纯化后的多克隆抗体IgG溶液置于温度为51-55℃的恒温水浴锅中保温，时间为25-30分钟，然后用冰水冷却；加入饱和硫酸铵溶液，0-10℃沉淀过夜，然后用生理盐水进行重悬。
2)将热聚多克隆抗体IgG溶液按照1:5000稀释，得到类风湿因子吸附剂。
3)类风湿因子吸附剂使用前用样品稀释液按5:1-50:1混合。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
采用类风湿因子吸附剂对EV71病毒IgM抗体母液进行稀释，将EV71病毒IgM抗体母液按500AU/mL，250AU/mL，125AU/mL，62.5AU/mL，31.25AU/mL，进行梯度稀释。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:5000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01MPBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含蛋白质的磷酸盐溶液，具体为含1-5％BSA的磷酸盐缓冲液。
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例5-9EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
分别采用下述表1的溶液将EV71病毒抗原稀释至25ng/100μL，分别获得pH如下表1的EV71病毒抗原包被液，其余步骤同实施例4。
表1
实施例 溶液 pH
实施例5 0.01M磷酸盐缓冲溶液 7.5-8.0
实施例6 0.1M磷酸盐缓冲溶液 7.5-8.0
实施例7 0.05M碳酸盐缓冲溶液 9.0-9.6
实施例8 0.1M碳酸盐缓冲溶液 9.0-9.6
实施例9 0.05M Tris缓冲溶液 10.0-10.6
实施例10EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1.包被液的配制：
所述的EV71病毒抗原包被液，采用0.01M磷酸盐缓冲溶液将EV71病毒抗原稀释至500ng/100μL，其pH7.2-7.4。
2.封闭液的配制：
1)所述的封闭液，采用0.1MPBS磷酸盐缓冲溶液，其pH7.2-7.4；
2)将4％的脱脂奶粉加入上述溶液中，配制成封闭液。
3.酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入100μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被12h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入100μL封闭液，置于37℃温箱，60分钟
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温90分钟。
4.类风湿因子吸附剂的配制
1)将纯化后的多克隆抗体IgG溶液置于温度为51-55℃的恒温水浴锅中保温，时间为25-30分钟，然后用冰水冷却；加入饱和硫酸铵溶液，0-10℃沉淀过夜，然后用生理盐水进行重悬。
2)将热聚多克隆抗体IgG溶液按照1:5000稀释，得到类风湿因子吸附剂。
3)类风湿因子吸附剂使用前用样品稀释液10:1混合。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
采用上述稀释后的类风湿因子吸附剂对EV71病毒IgM抗体母液进行稀释，将EV71病毒IgM抗体母液按500AU/mL，250AU/mL，125AU/mL，62.5AU/mL，31.25AU/mL进行梯度稀释。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:1000的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01MPBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
含蛋白质的磷酸盐溶液，具体为含3％BSA的磷酸盐缓冲液。
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
实施例11-14EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
在制备所述封闭液的过程中，采用0.1MPBS磷酸盐缓冲溶液，其pH7.6-8.0，并分别将下述表2中的原料加入该PBS磷酸盐缓冲溶液中，制成所述封闭液，其余步骤同实施例10。
表2
对比例15EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
一、酶标板的制备
1.包被液的配制：
将EV71病毒抗原用0.1M磷酸盐缓冲液(氯化钠4.25份、十二水合磷酸氢二钠15.40份、磷酸二氢钾0.95份，超纯水500份，pH7.4)稀释至2μg/100μL配制成包被液。
2.封闭液的配制:
1)所述的封闭液，采用0.1MPBS(磷酸盐缓冲溶液)，其pH7.2-7.4；
2)将3％BSA(牛血清白蛋白)加入上述溶液中，配制成封闭液。
3.酶标板的包被方法：
1)将配制的包被液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL包被液；
2)上述酶标板置于2-8℃环境下包被16h；
3)将配制的封闭液加入酶标板孔中，每孔分别加入200μL封闭液，置于37℃温箱，90分钟；
4)从温箱取出酶标板后弃去封闭液，37℃恒温90分钟。
4.类风湿因子吸附剂的配制：
1)将纯化后的多克隆抗体IgG溶液置于温度为51-55℃的恒温水浴锅中保温，时间为25-30分钟，然后用冰水冷却；加入饱和硫酸铵溶液，0-10℃沉淀过夜，然后用生理盐水进行重悬。
2)将热聚多克隆抗体IgG溶液按照1:5000稀释，得到类风湿因子吸附剂。
3)类风湿因子吸附剂使用前用样品稀释液10:1混合。
二、标准品的制备(定量标准曲线的建立)
采用上述稀释后的类风湿因子吸附剂对EV71病毒IgM抗体母液进行稀释，将EV71病毒IgM抗体母液按500AU/mL，250AU/mL，125AU/mL，62.5AU/mL，31.25AU/mL进行梯度稀释。
三、酶标抗体溶液的配制
酶标抗体溶液的配制是将辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体用HRP偶联物稳定剂以1:2500的比例稀释而成。
四、浓缩洗液(20×0.01MPBS)
浓缩洗液：氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
五、样本稀释液
不含蛋白质的磷酸盐溶液。
六、底物溶液(TMB)
TMB四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)
七、终止液(2mol/L硫酸溶液)
将浓硫酸与超纯水1:8稀释，配制成终止液。
对比例16-17EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
样品稀释液分别采用表3中的溶液，其余步骤同对比例15。
表3
实施例 原料
对比例16 不含蛋白的碳酸盐缓冲溶液
对比例17 不含蛋白的Tris缓冲溶液
对比例15-17所得标准曲线如表4所示，NC代表由类风湿因子吸附剂造成的非特异性干扰，企业内部标准指出“NC不大于0.200视为可接受范围”。在对比例15-17中，用不含蛋白的磷酸盐缓冲液处理类风湿因子吸附剂后，所得的NC在可接受范围内，但其NC值仍然接近0.200的上限，其余缓冲液的NC值过高，即使用该种缓冲液处理后，试剂盒灵敏性干扰较大。
表4
抗体浓度(AU/mL) 实施例14 实施例15 实施例16
500 1.904 1.932 1.921
250 1.034 1.156 1.089
125 0.503 0.609 0.586
62.5 0.375 0.412 0.392
31.25 0.243 0.306 0.251
Negative control(NC) 0.194 0.221 0.201
Blank 0.051 0.049 0.045
R2 0.9983 0.9964 0.9994
实施例18-20EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
样品稀释液分别采用表7中的溶液，其余步骤同对比例15。
表5
实施例 原料
实施例18 1％BSA的磷酸盐缓冲液
实施例19 3％BSA的磷酸盐缓冲液
实施例20 5％BSA的磷酸盐缓冲液
所得标准曲线如表6所示，NC代表由类风湿因子吸附剂造成的非特异性干扰，企业内部标准指出“NC不大于0.200视为可接受范围”。在对比例15及实施例18-20中，用不含蛋白的磷酸盐缓冲液，以及含有蛋白(1-5％BSA)的磷酸盐缓冲液处理类风湿因子吸附剂后，所得的NC都在可接受范围内，对检测方法的灵敏性干扰小。
使用含有BSA的磷酸盐缓冲液(实施例18-20)稀释类风湿因子吸附剂能够更加有效的除去样本中的干扰物质，NC值大幅降低，且所得标准曲线线性良好，优选含有3-5％BSA的磷酸盐缓冲液作为样本稀释液。
表6
抗体浓度(AU/mL) 对比例15 实施例18 实施例19 实施例20
500 1.904 1.852 1.821 1.818
250 1.034 0.978 0.953 0.946
125 0.503 0.483 0.436 0.441
62.5 0.375 0.289 0.272 0.245
31.25 0.243 0.192 0.151 0.154
Negative control 0.194 0.123 0.085 0.089
Blank 0.051 0.049 0.045 0.047
R2 0.9983 0.9999 0.9992 0.9993
实施例21-23EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒的制备
所述类风湿吸附剂使用前，分别用样品稀释液按照下表7的比例混合稀释，，其余步骤同实施例18。
表7
实施例 稀释比例
实施例21 1:5
实施例22 1:20
实施例23 1:50
实施例23EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒检测步骤
一、样本的处理
1.将样品稀释液与类风湿因子吸附剂按比例混合
2.将待检样本与样本稀释液以1:(300-500)混合
3.取10μL样本加入到90μL稀释的类风湿因子吸附剂中，混匀静置15分钟；
二、检测步骤
1.取出已预包被抗原的96孔酶标板；
2.配制工作洗涤液：浓缩洗液稀释20×(1份浓缩洗液(20×0.01MPBS)加19份的无菌去离子水或超纯水)；
3.加入样本：分别设标准曲线组、待测样品组，其中标准曲线组：各标准曲线点(31.25-500AU/ml)
待测样本组：处理后的待测样本
将两组分别加入60μL到酶标板孔中，在37℃下孵育20分钟；
4.洗涤：甩掉反应液，每孔每次加入不少于300μL的洗液，静置40s后拍干，重复上述洗涤操作，共洗涤3次；
5.加入酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入羊抗人酶标抗体60μL在37℃下孵育20分钟；
6.洗涤：同步骤4；
7.显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液60μL在37℃下孵育15分钟，避光；
8.终止：每孔内加入50μL终止液，混匀后，在OD450nm处读数；
9.结果判断：在计算机中分别输入标准液和待测样品的吸光度测定值，根据计算软件绘制的半对数标准曲线和方程，即可自动计算出各待测样品中IgM的浓度值。
实施例24试剂盒的临床应用
EV71病毒IgM抗体免疫检测试剂盒参考值的确定:
检测52位正常人样本，以确定阴阳性临界值。测定OD450值，根据标准曲线计算IgM浓度值，最终定参考值判断标准cut-off为0.28。
实施例25试剂盒的方法学考察
1.准确度
将浓度接近线性范围上限的高阳性的样本(A)加入到阴性的血清样本(B)中，所加样本(A)与阴性的血清样本(B)之间的体积比例为1:9(C)，每个样本重复检测3次，分别测定浓度并计算平均值按照公式(1)计算其结果。
R = c × ( V 0 + V ) - c 0 × V 0 V × c s × 100 % - - - ( 1 )
式中：
R——回收率；
V——样本A的体积；
V0——样本B的体积；
c——样本B加入样本A后的检测浓度；
c0——样本B的浓度；
cs——样本A的浓度。
表5准确度试验结果
2.检测限
用样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的吸光度值，计算其均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，代入标准曲线，求出对应的浓度值，即为检测限。
表6检测限测定
3.重复性
取500AU/mL和62.5AU/mL两个浓度的企业内控品各重复检测10次，再留1个孔做空白。计算10次测量浓度值结果的平均值M和标准差SD，根据公式(2)得出变异系数CV。
CV＝SD/M×100％(2)
式中：
CV——变异系数；
SD——10次测量结果的标准差；
M——10次测量结果的平均值。
表7重复性实验结果
4.批内精密度
合格标准：将同一标本在同一批次实验中平行测定10组数据。计算其均值M、标准差SD与变异系数CV，变异系数CV≤15％为合格。本产品批内精密度(即变异系数CV)为11％，小于15％，符合标准，验证合格。
CV＝SD/M×100％(3)
式中：
CV——变异系数；
SD——10次测量结果的标准差；
M——10次测量结果的平均值。
表8批内精密度结果
5.稳定性实验
将组装好的试剂盒在37℃环境中放置，每天做标准曲线检测已知浓度的抗原溶液，连续检测5天，检测值变化率(即变异系数CV)小于20％，见表9，证明试剂盒稳定。其结果显示5天的变异系数CV≤20％，说明本发明稳定性良好。
表9稳定性结果
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，包括EV71病毒抗原包被的酶标板、类风湿因子吸附剂和样本稀释液。
2.根据权利要求1所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括抗EV71病毒IgM抗体标准品、辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液、浓缩洗液、底物溶液和终止液。
3.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗EV71病毒IgM抗体标准品为若干浓度不同的抗EV71病毒IgM抗体溶液，优选的用于稀释抗EV71病毒IgM抗体的液体优选地与样本稀释液相同。
4.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液是将辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体用HRP偶联物稳定剂以1:1000-1:5000的比例稀释而成，优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗人酶标抗体溶液。
5.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗液由下述组分制成：以重量计，氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-200.05份，超纯水1000份。
6.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为TMB。
7.根据权利要求2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液，优选为2mol/L硫酸溶液。
8.根据权利要求1或2所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液优选为含蛋白质的磷酸盐缓冲液，更优选为含BSA的磷酸盐缓冲液，还优选为含1-5％BSA的磷酸盐缓冲液，最优选为含3-5％BSA的磷酸盐缓冲液。
9.权利要求1-8任一项所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒在检测EV71病毒抗原浓度方面的应用。
10.权利要求1-8任一项所述的检测EV71病毒IgM抗体的免疫检测试剂盒在检测EV71病毒抗原浓度方面的应用的方法，包括下述步骤：
(1)将样本稀释液与类风湿因子吸附剂按比例稀释，优选的稀释比例为10:1；
(2)将待检样本与样本稀释液按比例稀释，优选的稀释比例为1:300-1:500；
(3)将上述步骤(2)和步骤(1)获得的液体混合后静置，优选的混合比例为1:9，优选的静置时间至少15min；
(4)将步骤(3)所得的待测样本加入到EV71病毒抗原包被的酶标板中孵育、孵育后洗板，优选的孵育时间为30-60min；
(5)向步骤(4)获得的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的抗人酶标二抗抗体溶液并孵育、孵育后洗板，优选的孵育时间为30-60min；
(6)向步骤(5)获得的酶标板中加入底物溶液进行显色反应，然后加入终止液进行检测，于酶标仪上读取450nm处的吸光光度值。
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