CN106892978A - 复合物、蛋白质及二者的制备方法 - Google Patents

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CN106892978A CN201710255060.1A CN201710255060A CN106892978A CN 106892978 A CN106892978 A CN 106892978A CN 201710255060 A CN201710255060 A CN 201710255060A CN 106892978 A CN106892978 A CN 106892978A
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高井珍
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Tianjin Shichuan Biological Technology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种复合物、蛋白质及二者的制备方法，涉及生物医药的技术领域。本发明提供的蛋白质的制备方法，在75‑85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本发明提供的蛋白质，利用了本发明提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上；本发明提供的复合物稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。

Description

复合物、蛋白质及二者的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种复合物、蛋白质及二者的制备方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。
胰岛素于1922年开始用于临床，是目前治疗糖尿病的最有效的药物之一。长期以来，胰岛素一直以注射给药为主，胰岛素是I型和中重度II型糖尿病患者每日治疗中不可缺少的药物。由于胰岛素生物半衰期短，糖尿病患者需要终生每日皮下注射胰岛素，长期频繁注射给患者带来很大痛苦和诸多不便，而且长期注射胰岛素还可能产生皮下脂肪萎缩、出现浮肿等，超剂量给药还会引起低血糖休克等多种不良反应。因此，研制开发非注射给药的胰岛素制剂是近年来国内外研究的热点。
但不经特殊的技术处理的普通胰岛素口服制剂生物利用度只有0.1％-0.2％，无临床意义。其主要原因有以下几点：(1)胰岛素是一种肽类激素，其在胃液酸性环境和消化道各种蛋白酶的作用下，极易降解失活；(2)胰岛素分子量为6000左右，且分子间有很强的聚合趋势，从而使其难以通过扩散被胃肠壁的上皮细胞层吸收；(3)存在肝脏首过效应，生物利用度低；(4)制备过程中的胰岛素构象问题。胰岛素的口服给药一直是一个世界性的难题。
因此，开发一种能口服利用度高的，利用胰岛素达到长效降血糖功能的稳定的蛋白质复合物日益成为研究的热点。
同时，提供一种高纯度的，与胰岛素能够形成稳定复合物的蛋白质也尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种复合物，以缓解现有技术中存在的利用胰岛素降糖不能实现口服，且时效短的技术问题。
本发明的第二个目的在于提供一种复合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种蛋白质的制备方法，以缓解现有技术中存在的纯化方法纯化得到的蛋白质纯度低的技术问题。
本发明的第四个目的在于提供一种蛋白质，以缓解现有技术中存在的蛋白质纯度低的技术问题。
本发明提供的一种复合物，包括蛋白质和胰岛素。
进一步地，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。
本发明还提供了一种上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
进一步地，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。
进一步地，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。
本发明还提供了上述的蛋白质的制备方法，包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
进一步地，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
进一步地，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
进一步地，所述物理脱氧的时间为2-6h。
另外，本发明还提供了一种蛋白质，应用上述的制备方法制备得到。
本发明提供的复合物稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发；本发明提供的蛋白质的制备方法，在75-85℃的条件下进行物理脱氧，能够大大提高蛋白质的纯度；本发明提供的蛋白质，利用了本发明提供的蛋白质的制备方法制备得到，纯度达到80％以上。并且，通过本发明提供的蛋白质纯化办法能够除去酵母菌发酵引入的热毒蛋白和核酸物质，为蛋白质作为药物制剂的应用后期的安全性和质量研究带来便利。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明提供的蛋白质的液相色谱结果图；
图1B为胰岛素的液相色谱结果图；
图1C为本发明提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：1时的液相色谱结果图；
图1D为本发明提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：5时的液相色谱结果图；
图1E为本发明提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：10时的液相色谱结果图；
图1F为本发明提供的蛋白质与胰岛素在摩尔比1：20时的液相色谱结果图；
图2为正常小鼠口服本发明提供的复合物对血糖调控功能的结果图；
图3为糖尿病大鼠口服发明提供的复合物对血糖的调控功能的结果图；
图4A为100nM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图4B为10μM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图4C为1mM的复合物的TEM电镜扫描结果图；
图4D为DLS测定本发明提供的复合物纳米球直径试验结果图；
图5为本发明提供的复合物扫描电子显微镜结果图；
图6为本发明提供的制备方法制备得到的蛋白质经硫酸锌处理后的电泳结果图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
传统的蛋白纯化，一般采用直接超滤或液相纯化的方法，在收率和初纯度上效果均不理想，不仅浪费原材料，而且增加了能源及人工成本。
本发明针对现有技术中，蛋白收率和初纯度效果不理想的技术问题，提供了一种蛋白质的制备方法，包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
其中，pH值例如可以为，但不限于2.0,3.0或4.0；放置时间例如可以为，但不限于8h，9h，10h，11h或12h；加热温度例如可以为，但不限于75℃，80℃或85℃。
在本发明中，蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.1)；
(2)QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.2)；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。
例如可以为，但不限于：
QQCTTGQLQCCKSTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.3)或者
QQCTTGQLQCCKSTSTANDPATSKLLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV(SEQ ID NO.4)。
在本发明中，酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
在本发明中，物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
其中，惰性气体可以为氮气或氩气，优选为氮气。
在另一种实施方式中，物理脱氧的方法为减压真空抽气脱氧。
在本发明中，物理脱氧的时间为2-6h。
其中，物理脱氧的时间例如可以为，但不限于2h，3h，4h，5h或6h。
此外，经过本发明提供的蛋白质制备方法制备得到的蛋白质沉淀，还可以用硫酸锌进行一次处理，进一步提升蛋白质的终纯度。
其中，硫酸锌的浓度为1.3M。
本发明提供的蛋白质的制备方法，在75-85℃的条件下进行物理脱氧，经过这个操作，相比于传统的直接超滤及液相纯化办法在收率和初纯度上具有明显的提高，传统方法在完成超滤或液相纯化后蛋白纯度仅为10％，而采用本发明描述的热鼓泡方法得到的蛋白纯度可达80％以上，在经过一次的硫酸锌(1.3M)沉淀处理后，可使蛋白质的终纯度>90％，满足作为复合物制剂的要求。
本发明还提供了一种蛋白质，应用了上述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种复合物，复合物包括上述的蛋白质和胰岛素。
另外，本发明还提供了上述的复合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤(a)：将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
其中，在步骤(a)中，蛋白质与胰岛素的摩尔比例例如可以为，但不限于1:20，1:15，1:10，1:5，1:1，5:1或10:1；调整的pH例如可以为，但不限于1.7,3.5,6.08,6.8或10.8。
作为一种替换方式，也可将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于生理盐水中，得到混合液。
其中，在步骤(b)中，进行孵育的温度例如可以为，但不限于25℃，30℃或35℃；进行孵育的时间例如可以为，但不限于10min，20min或30min；震荡的时间例如可以为，但不限于3min，5min或10min。
其中，在步骤(d)中，超声波处理的时间例如可以为，但不限于1min，3min或5min；冷藏的温度为4℃。
利用本发明提供的制备方法制备得到的复合物，稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。
本发明的方法可以在传统的市售设备或装置中进行，本领域普通技术人员可以根据本发明方法的条件自行设计所用的设备或装置。所用试剂均为市售，也可以自制。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1pH值
一种蛋白质的制备方法，包括：
实施例1-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例1-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至2.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例1-3
调节Pichia酵母发酵液的pH至4.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例1-4
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀，并将沉淀用1.3M的硫酸锌进行一次处理。
对比例1-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至1.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
对比例1-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至5.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
为了检验Pichia酵母发酵液不同的pH值对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1至1-4及对比例1-1和1-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表1。
表1Pichia酵母发酵液不同的pH值对蛋白质的收率和纯度的影响
收率(％) 纯度(％)
实施例1-1 46 88
实施例1-2 38 82
实施例1-3 41 83
实施例1-4 39 95
对比例1-1 19 55
对比例1-2 22 68
由表1可以看出，应用实施例1-1至1-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当Pichia酵母发酵液的pH值为3.0时，收率和纯度最高，为优选pH值。
实施例2放置时间
一种蛋白质的制备方法，包括：
实施例2-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置8h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例2-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置9h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例2-3
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置11h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例2-4
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置12h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
对比例2-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置5h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
对比例2-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置15h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
为了检验不同的放置时间对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、2-1至2-4及对比例2-1和2-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表2。
表2不同的放置时间对蛋白质的收率和纯度的影响
收率(％) 纯度(％)
实施例1-1 46 88
实施例2-1 39 84
实施例2-2 40 84
实施例2-3 41 85
实施例2-4 35 84
对比例2-1 28 71
对比例2-2 21 76
由表2可以看出，应用实施例2-1至2-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当放置的时间为10h时，收率和纯度最高，为优选放置时间。
实施例3加热温度
一种蛋白质的制备方法，包括：
实施例3-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至75℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
实施例3-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至85℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
对比例3-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至70℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
对比例3-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至90℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，4h后离心并收集沉淀。
为了检验不同的加热温度对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、3-1和3-2及对比例3-1和3-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表3。
表3不同的加热温度对蛋白质的收率和纯度的影响
收率(％) 纯度(％)
实施例1-1 46 88
实施例3-1 45 82
实施例3-2 44 83
对比例3-1 23 59
对比例3-2 22 47
由表3可以看出，应用实施例3-1和3-2提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当加热温度为80℃时，收率和纯度最高，为优选加热温度。
实施例4物理脱氧的时间
一种蛋白质的制备方法，包括：
实施例4-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，2h后离心并收集沉淀。
实施例4-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，3h后离心并收集沉淀。
实施例4-3
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，5h后离心并收集沉淀。
实施例4-4
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，6h后离心并收集沉淀。
对比例4-1
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，1h后离心并收集沉淀。
对比例4-2
调节Pichia酵母发酵液的pH至3.0，放置10h后，加热至80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部，7h后离心并收集沉淀。
为了检验物理脱氧的不同时间对蛋白质的收率和纯度的影响，分别应用实施例1-1、4-1至4-4及对比例4-1和4-2提供的制备方法制备蛋白质，并应用western-blot的检测手段对制备所得的蛋白质的收率和纯度进行检测，结果见表4。
表4物理脱氧的不同时间对蛋白质的收率和纯度的影响
收率(％) 纯度(％)
实施例1-1 46 88
实施例4-1 38 84
实施例4-2 41 85
实施例4-3 43 86
实施例4-4 34 84
对比例4-1 24 62
对比例4-2 22 68
由表4可以看出，应用实施例4-1至4-4提供的制备方法制备蛋白质的收率和纯度较现有技术均有显著的提高。当物理脱氧的时间为4h时，收率和纯度最高，为优选物理脱氧时间。
由以上实施例及对比例可以看出，当调节Pichia酵母发酵液的pH为3.0，放置时间为10h，加热温度为80℃，同时将氮气鼓泡入Pichia酵母发酵液的内部4h，制备得到的蛋白质收率和纯度最高，为优选制备条件。
利用优选蛋白制备条件制备得到的蛋白质，与胰岛素制备得到复合物。
实施例5蛋白质与胰岛素的摩尔比例
一种蛋白质与胰岛素复合物的制备方法，包括：
实施例5-1
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:10溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-2
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:20溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-3
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:15溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-4
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:5溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-5
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:1溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-6
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例5:1溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例5-7
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液。
对比例5-1
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:25溶于mops缓冲液中，得到混合液。
对比例5-2
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例15:1溶于mops缓冲液中，得到混合液。
将上述实施例5-1至5-7及对比例5-1和5-2的混合液调整pH至6.08后，于30℃进行孵育20min，充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证蛋白质与胰岛素的不同摩尔比例对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1至5-7及对比例5-1和5-2提供的制备方法制备复合物，通过液相法检测制备所得的复合物的稳定性，并应用透析法检测制备所得的复合物的包封率，检测结果见表5。
表5蛋白质与胰岛素的摩尔比例对复合物的稳定性及包封率的影响
稳定性(％) 包封率(％)
实施例5-1 88 91
实施例5-2 77 84
实施例5-3 83 88
实施例5-4 81 88
实施例5-5 76 86
实施例5-6 75 79
实施例5-7 25 15
对比例5-1 24 19
对比例5-2 88 91
由表5可以看出，应用实施例5-1至5-7提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当蛋白质与胰岛素的摩尔比例为1:10时，稳定性和包封率最高，为优选摩尔比例。
实施例6孵育温度
一种蛋白质与胰岛素复合物的制备方法，包括：
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:10溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例6-1
实施例6得到的混合液于25℃进行孵育。
实施例6-2
实施例6得到的混合液于35℃进行孵育。
对比例6-1
实施例6得到的混合液于20℃进行孵育。
对比例6-2
实施例6得到的混合液于40℃进行孵育。
将上述实施例6-1和6-2及对比例6-1和6-2的混合液调整pH为6.08后，孵育20min，充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育温度对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、6-1和6-2及对比例6-1和6-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表6。
表6不同孵育温度对复合物的稳定性及包封率的影响
稳定性(％) 包封率(％)
实施例5-1 88 91
实施例6-1 79 86
实施例6-2 80 86
对比例6-1 24 43
对比例6-2 31 51
由表6可以看出，应用实施例6-1和6-2提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育温度为30℃时，稳定性和包封率最高，为优选孵育温度。
实施例7孵育时间
一种蛋白质与胰岛素复合物的制备方法，包括：
将蛋白质与胰岛素按照摩尔比例1:10溶于mops缓冲液中，得到混合液，将混合液于30℃进行孵育。
实施例7-1
将实施例7得到的混合液孵育10min。
实施例7-2
将实施例7得到的混合液孵育30min。
对比例7-1
将实施例7得到的混合液孵育5min。
对比例7-2
将实施例7得到的混合液孵育40min。
将上述实施例7-1和7-2及对比例7-1和7-2的混合液充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育时间对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、7-1和7-2及对比例7-1和7-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表7。
表7不同孵育时间对复合物的稳定性及包封率的影响
稳定性(％) 包封率(％)
实施例5-1 88 91
实施例7-1 81 90
实施例7-2 85 85
对比例7-1 34 41
对比例7-2 33 44
由表7可以看出，应用实施例7-1和7-2提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育时间为20min时，稳定性和包封率最高，为优选孵育时间。
实施例8孵育pH值
一种蛋白质与胰岛素复合物的制备方法，包括：
将蛋白质与胰胰岛素按照摩尔比例1:10溶于mops缓冲液中，得到混合液。
实施例8-1
将实施例8得到的混合液调节pH至1.7。
实施例8-2
将实施例8得到的混合液调节pH至3.5。
实施例8-3
将实施例8得到的混合液调节pH至6.8。
实施例8-4
将实施例8得到的混合液调节pH至10.8。
对比例8-1
将实施例8得到的混合液调节pH至1.2。
对比例8-2
将实施例8得到的混合液调节pH至11.5。
将上述实施例8-1至8-4及对比例8-1和8-2的混合液于30℃进行孵育20min。充分震荡5min，之后超声波处理2min后，于4℃冷藏降温过夜。
为了验证不同孵育时间对制备得到的复合物的稳定性及包封率的影响，分别应用实施例5-1、8-1至8-4及对比例8-1和8-2提供的制备方法制备复合物，通过实施例5提供的方法检测制备所得的复合物的稳定性和包封率，检测结果见表8。
表8不同孵育pH对复合物的稳定性及包封率的影响
稳定性(％) 包封率(％)
实施例5-1 88 91
实施例8-1 81 84
实施例8-2 85 88
实施例8-3 83 86
实施例8-4 78 82
对比例7-1 24 31
对比例7-2 23 21
由表8可以看出，应用实施例8-1至8-4提供的制备方法制备复合物的稳定性和包封率均处于较高水平。当孵育pH为6.08时，稳定性和包封率最高，为优选孵育时间。
为了进一步说明本发明的有益效果，结合上述优选条件，即用实施例1-4、2-1、3-1和4-1提供的各条件制备蛋白质，制备得到的蛋白质的电泳结果如图6所示，其中M为蛋白maker，lane 1为蛋白质终产品，lane 2为Pichia酵母发酵液。并用所得蛋白质与胰岛素应用实施例5-1和实施例6-1提供的优选条件制备复合物，并通过以下实验检测制备得到的复合物的各项指标。
1.液相色谱
采用液相色谱方法，检测利用优选条件制备得到的复合物的形成及最佳的复合物装载比例。结果如图1A、1B、1C、1D、1E和1F所示。其中，图1A为胰岛素的液相吸收；图1B为蛋白质的液相吸收；图1C为蛋白质与胰岛素在摩尔比1：1时的液相吸收；图1D为蛋白质与胰岛素在摩尔比1：5时的液相吸收，18.6min的吸收峰即为复合物的形成；图1E为蛋白质与胰岛素在摩尔比1：10时的液相吸收，18.6min的吸收峰即为复合物的形成，3.75min的吸收峰为过量蛋白质；图1F为蛋白质与胰岛素在摩尔比1：20时的液相吸收，18.6min的吸收峰即为复合物的形成，3.75min的吸收峰为过量蛋白质。通过上述液相色谱的结果，可以明显的观测到复合物的形成，在蛋白质和胰岛素分别进样的条件，他们显示了不同的保留时间，但是将蛋白质-胰岛素混合后样品呈现了截然不同的液相图谱，证实了蛋白质可与胰岛素形成均一的复合物。而且，随着蛋白质浓度的增加，胰岛素可以完全被其包合，达到包合状态。
2.药效实验
2.1正常小鼠口服复合物对血糖的调控功能
选用昆明种小鼠，体重20～22g，进行血糖调控研究。
将小鼠分为正常对照组，胰岛素模型组，低剂量组，中剂量组和高剂量组，每组5只，设3个重复。对照组小鼠饲喂正常鼠粮，低剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:1)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料500μg/kg，中剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:6)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料500μg/kg，高剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:10)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料3.5g/kg。分段测量血糖值，结果如图2所示(□为正常对照组，◆为胰岛素模型组，□为复合物低剂量组，●为复合物中剂量组，▲为复合物高剂量组)。由此可知，本发明提供的复合物具有良好的口服吸收能力及长效的血糖调控的效果。
2.2糖尿病大鼠口服复合物对血糖的调控功能
选用ZDF糖尿病大鼠，进行血糖调控研究。
大鼠分为对照组，复合物低剂量组，复合物中剂量组和复合物高剂量组，每组5只，设3个重复。对照组大鼠饲喂正常鼠粮，低剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:1)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料500μg/kg，中剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:6)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料500μg/kg，高剂量组(蛋白质：胰岛素的摩尔比例为1:10)大鼠饲喂拌有本发明提供的复合物的饲料3.5g/kg。分段测量血糖值，结果如图3所示(□为胰岛素组，◆为复合物低剂量组，●为复合物中剂量组，为复合物高剂量组)。由此可知，本发明提供的复合物具有良好的口服吸收能力及长效的血糖调控的效果。
3.复合物的形态学研究
采用透射电子显微镜(TEM)以及动态光散射(DLS)进行针对复合物的形态学研究，结果如图4A、4B、4C及4D所示。
如图4A所示，低浓度(100nM)的复合物的TEM电镜扫描图显示复合物成纳米球状分布；图4B为10μM的复合物的TEM电镜扫描图，图4C为1mM的复合物的TEM电镜扫描图，由图4B和4C可知，当复合物的浓度升高后，TEM扫描图发现这些单独的纳米球还具有相互集结的功能，从而形成了一层稳定的纳米球形网状结构；如图4D所示，采用DLS测定纳米球直径试验结果，证实复合物的大小为100nm。
结果表明，通过控制复合物的自组装条件，最终可形成均一、稳定的纳米颗粒结构。
同时，本申请还采用扫描电子显微镜对复合物进行观察，结果如图5所示。
综上所述，本发明提供的复合物稳定性强，蛋白质能够将胰岛素均一的、紧密的包合在内，并能有效避免胰岛素在肠胃的降解，在利用胰岛素达到长效降血糖功能的基础上，实现能够通过口服的方式给药，且利用度高，为糖尿病相关药物的进一步开发奠定了基础，值得后续的继续研发。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津世传生物科技有限公司
<120> 复合物、蛋白质及二者的制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 1
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 2
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 2
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 3
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 3
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Lys Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val
<210> 4
<211> 83
<212> PRT
<213> Pichia酵母
<400> 4
Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys Lys Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Lys Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val
20 25 30
Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser
35 40 45
Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys
50 55 60
Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro
65 70 75 80
Val Asn Val

Claims (10)

1.一种复合物，其特征在于，所述复合物包括蛋白质和胰岛素。
2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述蛋白质是如下(1)、(2)或(3)：
(1)由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(3)将SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由其衍生的蛋白质。
3.如权利要求1或2所述的复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤(a)：将所述蛋白质与所述胰岛素按照摩尔比例1:20-10:1溶于mops缓冲液中，得到混合液，并调整pH至1.7-10.8；
步骤(b)：将所述混合液于25-35℃进行孵育后，充分震荡；
步骤(c)：将经震荡的混合液进行超生波处理；
步骤(d)：冷藏降温过夜。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中进行孵育的时间为10-30min，震荡的时间为3-10min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)中超声波处理的时间为1-5min，所述冷藏的温度为4℃。
6.如权利要求2所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
调节酵母发酵液的pH至2.0-4.0，放置8-12h后，加热至75-85℃，进行物理脱氧，离心并收集沉淀。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酵母发酵液为Pichia酵母发酵液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述物理脱氧的方法为将惰性气体鼓泡入所述Pichia酵母发酵液的内部。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述物理脱氧的时间为2-6h。
10.一种蛋白质，其特征在于，应用权利要求6-9任一项所述的制备方法制备得到。
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