CN118667752A - 一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法 - Google Patents

一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法 Download PDF

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CN118667752A CN202410994028.5A CN202410994028A CN118667752A CN 118667752 A CN118667752 A CN 118667752A CN 202410994028 A CN202410994028 A CN 202410994028A CN 118667752 A CN118667752 A CN 118667752A
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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法。具体地，本发明的方法主要利用分批培养实现重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的稳定和高产量生产。本发明的方法包括制备优化的细胞培养基，以促进表达rhBMP6的细胞生长。本发明的方法确保了即使在工业生产规模下，细胞活率和蛋白产量的一致性。本发明的细胞培养基和方法为rhBMP6的工业化生产提供了一种高效且可扩展的解决方案。

Description

一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于生产人骨形态发生蛋白的细胞培养方法。
背景技术
骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族的成员。其通过与间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)表面的受体结合，促进其分化为软骨细胞和成骨细胞。近年来的研究表明，BMP在骨骼和软组织再生中起着重要作用。局部给予BMP可以支持新骨、软骨和韧带的形成。其中，含有BMP家族成员BMP2的产品在美国、欧盟、中国获批上市应用于在退行性椎间盘疾病中促进脊柱融合，如(2002年于欧盟获批)、INFUSETM BoneGraft/LT-CAGETM(2002年于美国以器械获批)和INFUSE BONE GRAFT(2023年于中国获批)，含有BMP7的产品在美国和欧盟获批上市，如OP-1TM Putty(2004年于美国以器械获批)、(2009年于欧盟获批)、但已因商业原因于2015年退市。BMP6也是BMP家族的成员之一，具有促进骨形成和加速骨愈合的效果，含有重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的用于促进脊柱融合的候选药物已处于三期临床试验阶段。
为支持开展三期临床试验及该候选药物获批上市后的商业化生产，采取具有高生产效率、具有工艺稳定性、满足药品监管要求、且满足大规模生产的培养方式尤为重要。近年来，重组蛋白工业化生产领域的主流细胞培养方法包括分批培养、补料分批培养、半连续培养、连续培养和灌流培养等。分批培养是指在密闭反应器中将细胞放入一定量的培养基中，在没有补充新鲜培养基或移除代谢废物的情况下，进行一段时间的培养。分批培养的过程中，细胞和培养基的成分会随着时间的推移而变化。在培养过程中，细胞所处的环境变化显著，无法始终保持最佳状态。在后期，代谢副产物的积累会影响细胞生长，导致细胞产量降低。补料分批培养从固定量的培养基开始，随着细胞生长和产物形成，不断向系统中添加营养物质，使细胞继续生长和代谢，直到培养结束。半连续培养基于分批培养原则，定期移除部分培养液并补充等量的新鲜培养基。连续培养在非封闭系统中持续添加新鲜营养液，移除抑制因子，优化生长环境，并收集培养产物。灌流培养则是在细胞大部分留在反应器中的情况下，持续移除部分条件培养基并灌入新鲜培养基。
使用哺乳动物细胞表达重组蛋白的过程中，实现批间稳定性面临诸多挑战。细胞培养过程中的温度、pH值、溶氧水平等条件的变化会导致批次之间存在的差异，对细胞的代谢和重组蛋白的表达有显著影响。在长时间的细胞培养过程中，代谢物的累积可能会影响细胞的健康状况和蛋白质的表达水平，对产品质量带来无法预期的影响。此外，从实验室规模放大至工业化生产时，还面临着规模放大效应的问题，在实验室中可行的工艺在大规模生产时可能会变得复杂，例如，反应条件的控制、热量的管理、混合效率等问题在规模扩大时变得更加显著；实验室设备和工业设备存在差异，选择适合的工业设备将实验室的工艺转移到工业生产是一个挑战；此外，实验室小规模生产和工业大规模生产之间的差异会影响细胞生长和蛋白表达的稳定性，在大规模生产中，确保每一批产品的质量和特性稳定是一个难题。
半连续、连续培养和灌流培养由于能稳定提供新鲜营养并移除废物，不仅可以补充养分，而且可以起到缓解产物抑制和减少代谢副产物积累的作用，从而可以改善培养环境，有助于保持细胞活力的稳定，有利于产物的继续合成，因此受到青睐。例如，连续培养方法被证明能够优化生长条件并增强分泌型重组治疗药物的生产(CN114127260A)。灌流培养通过持续注入新鲜培养基并移除废旧培养基，解决了蛋白质量不稳定和低表达的问题，提高了生产效率(CN112592948B)。半连续、连续培养和灌流培养在提高重组蛋白产量、为细胞提供较为稳定的培养环境、减少批次间的变异、提高产品的一致性和质量等方面具有优势，是目前重组蛋白类药物和抗体类药物的主要的规模化生产工艺。
尽管半连续和灌流培养方法被公认为更高效，并且被优先考虑应用，但在实际培养过程中，这两种方法用于生产rhBMP6时却存在批间不稳定和蛋白表达量低的问题。因此，仍然缺乏批间稳定性以及蛋白表达量和表达效率满足工业生产要求的rhBMP6工业生产培养方法。
发明内容
由于半连续和灌流培养生产rhBMP6存在上述缺陷，无法满足工业化生产的需求，故需要探索更优的培养方法。在此过程中，本申请发明人意外地发现，分批培养反而是适宜于rhBMP6工业化生产的有效方法。具体而言，在密闭反应器中分批培养工程细胞株，通过合理的培养条件，可维持高细胞活率，获得高蛋白产量，并且即使放大至2000升，依然能够保持良好的批间稳定性。使得分批培养在rhBMP6的工业化生产中具有特别的优势，提供了一种高效且可扩展的生产方法。
因此，本发明提供了一种综合方法，用于在受控的细胞培养系统中通过分批培养生产重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)。该方法涵盖细胞培养的各个阶段，包括细胞复苏、种子培养、生产培养、收获和蛋白纯化。
其中，所述rhBMP6包含SEQ ID NO:1:SASSRRRQQSRNRSTQSQDVARVSSASDYNSSELKTACRKHELYVSFQDLGWQDWIIAPKG YAANYCDGECSFPLNAHMNATNHAIVQTLVHLMNPEYVPKPCCAPTKLNAISVLYFDDNS NVILKKYRNMVVRACGCH。
本发明提供了一种生产重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的方法，所述方法为分批培养的方法。
在一些实施方案中，本发明所述的生产重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)方法为分批培养的方法；所述方法在培养过程中rhBMP6的蛋白的产量不少于7.6mg/L，优选不少于7.7mg/L，更优选不少于8.3mg/L，更优选不少于8.5mg/L，更优选不少于8.8mg/L，更优选不少于9.1mg/L。
在一些实施方案中，所述方法包括种子培养：在细胞培养基中接种表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，获得种子培养液。
在一些实施方案中，所述方法包括生产培养：在细胞培养基中接种种子培养液，培养5-15天或细胞活率下降，收获细胞培养液。
在一些实施方案中，所述种子培养为一级或多级种子培养。
在一些实施方案中，所述生产培养中，包括降温步骤；所述降温步骤包括培养1-4天后进行降温处理。
在一些实施方案中，所述降温步骤包括：培养1-4天后降温3-7℃。
在一些实施方案中，所述降温步骤包括：设置初始温度为36-38℃、培养1-4天后进行降温处理，设置降温后的温度为31-33℃。
在一些实施方案中，所述生产培养中，pH为6至8。
在一些实施方案中，所述生产培养中，溶解氧DO(％)为10-100。
在一些实施方案中，所述表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一些实施方案中，所述种子培养的培养体积选自250mL、500mL、1L、2L、15L、50L、200L、500L中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述种子培养的时间为24-96h，更优选地，所述种子培养的时间为24-72h。
在一些实施方案中，所述生产培养的培养体积选自50L、200L、500L、2000L中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述重组人骨形态发生蛋白6的产量不少于7.6mg/L，7.7mg/L，更优选不少于8.3mg/L，更优选不少于8.5mg/L，更优选不少于8.8mg/L，更优选不少于9.1mg/L。
在一些实施方案中，生产培养的接种密度为0.50×106-0.90×106个细胞/ml；优选0.70×106个细胞/ml。
在一些实施方案中，培养3-4天后进行降温处理，更优选地，培养3天后进行降温处理。
在一些实施方案中，所述初始温度和降温后的温度的温差为3.5-6.0℃，更优选为3.8-5.8℃。
在一些实施方案中，所述初始温度为36.3-37.3℃，更优选地，所述降温温度为36.8℃。
在一些实施方案中，所述降温后的温度为31.5-32.5℃，更优选地，所述降温温度为32℃。
在一些实施方案中，所述pH为6.65-7.15，更优选为6.90。
在一些实施方案中，所述溶解氧DO(％)为20-80，更优选为20-70，更优选为20-60，更优选为40。
在初步研究和实验室规模生产中，通过一系列优化措施和工艺改进，建立了一种稳定且高效的生产体系。在这些基础上，本发明进一步将这些优化的工艺条件成功应用于更大规模的生产中。通过精确控制生物反应器中的温度、CO2水平、溶解氧和搅拌速度等关键参数，实现了从实验室规模向工业规模生产的无缝过渡。
在一些实施方案中，所述一级或多级种子培养分别在逐级放大的摇瓶或生物反应器中培养细胞。
在一些实施方案中，通过调整种子培养阶段的参数进行放大培养。
在一些实施方案中，根据所述生物反应器或摇瓶体积调整搅拌速度以保持相似的剪切条件。
在一些实施方案中，当所述培养体积为2L时，搅拌速度在240-260rpm范围内，更优选为250rpm。
在一些实施方案中，当所述培养体积为500L时，搅拌速度在65-75rpm范围内，更优选为70rpm。
在一些实施方案中，当所述培养体积为2000L时，搅拌速度在40-60rpm范围内，更优选为50rpm。
在一些实施方案中，CO2分压保持在20-80mmHg范围内，更优选为30-60mmHg范围内。
在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基中含有硫酸葡聚糖钠盐。
在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐(DSS)的浓度为2mg/L-2g/L。
在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐(DSS)的浓度为2mg/L-20mg/L。
在一些实施方案中，所述硫酸葡聚糖钠盐的浓度为2mg/L-2g/L，优选2mg/L-20mg/L。
在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养过程中使用的细胞培养基包含选自以下的一种或多种基础培养基：DMEM、RPMI-1640，或其他专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基。
在一些实施方案中，所述专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基选自以下的一种或多种ProCHOTM-5AGT、CHO、ActiCHO P、BalanCD CHO、CD OptiCHO或Ex-Cell CDCHO中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基为ProCHOTM-5AGT。
在一些实施方案中，所述种子培养和/或生产培养过程中使用的细胞培养基进一步包含以下一种或多种成分：生长因子、缓冲剂、pH调节剂、DNA合成促进剂或表面活性剂；
在一些实施方案中，所述生长因子选自类胰岛素生长因子，更优选地，所述生长因子为重组人胰岛素。
在一些实施方案中，所述缓冲剂选自缓冲盐、HEPES或MOPS，更优选地，所述缓冲剂选自碳酸氢钠或HEPES。
在一些实施方案中，所述pH调节剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，更优选地，所述pH调节剂为氢氧化钠。
在一些实施方案中，所述DNA合成促进剂选自嘌呤化合物或核苷酸，更优选地，所述DNA合成促进剂选自次黄嘌呤或胸苷。
在一些实施方案中，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，更优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
本发明另一方面提供了一种用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)细胞的细胞培养基。
在一些实施方案中，所述细胞培养基用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，所述细胞培养基用于实施上述方法。
其中，所述重组人骨形态发生蛋白6包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞培养基的pH范围为pH为6至8，优选为6.65至7.15，更优选为6.90。
在一些实施方案中，所述培养基包含从DMEM、RPMI-1640或其他专门为CHO细胞培养设计的商业细胞培养基中选择的基础培养基。
在一些实施方案中，所述专门为CHO细胞培养设计的商业细胞培养基选自ProCHOTM-5AGT(Lonza)、CHO(Merck)、ActiCHO P(GE Healthcare LifeSciences)、BalanCD CHO(Irvine Scientific)、CD OptiCHO或Ex-Cell CD CHO。
在一些实施方案中，所述专门为CHO细胞培养设计的商业细胞培养基为ProCHOTM-5AGT。
在一些实施方案中，所述细胞培养基具有用于生产rhBMP6的优化用量。
在一些实施方案中，所述基础培养基的浓度为10-50g/L，更优选为20g/L。
在一些实施方案中，所述生长因子的浓度为2-20mg/L，更优选为10mg/L。
在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为1-5g/L，更优选为2g/L。
在一些实施方案中，所述pH调节剂的浓度为1-10g/L，更优选为2g/L。
在一些实施方案中，所述DNA合成促进剂的浓度为0.05-0.2mM，更优选为0.1mM。
在一些实施方案中，所述核苷酸的浓度为0.01-0.05mM，更优选为0.02mM。
在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为0.1-2g/L，更优选为1g/L。
在一些实施方案中，所述细胞培养基的pH范围为6.8至7.0，更优选为6.9。
在细胞培养过程中，pH值的控制对于细胞的生长和蛋白的表达至关重要。不同的pH值会显著影响细胞的代谢活动、营养物质的吸收以及最终产物的质量和产量。为了确保最佳的培养环境，本发明特别针对pH值进行了系统的优化研究。
研究表明，细胞培养基的pH范围为6.65至7.15时，可以提供一个稳定且有利于细胞生长的环境。过低或过高的pH值都会对细胞的代谢活动产生不利影响，从而降低蛋白产量和质量。通过实验数据和实际生产经验，本发明确定了pH值范围在6.65至7.15之间为最适合的条件。实验结果显示，在pH值为6.65至7.15的范围内，细胞的生长曲线和蛋白表达量均表现出最佳状态。在6.8至7.0范围内，特别是6.9，细胞密度和活率在整个培养周期中保持稳定，代谢产物(如乳酸)的积累也被有效控制。这一优化措施显著提高了生产过程的效率和产品的一致性，为工业化规模生产提供了坚实的基础。
在一些实施方案中，所述细胞培养基进一步包含用于增强蛋白表达的添加剂，所述添加剂选自肝素、硫酸软骨素、透明质酸、聚乙二醇(PEG)、Ficoll、琼脂或硫酸葡聚糖钠盐(DSS)。
在一些实施方案中，所述的方法中的细胞复苏步骤包括：
在36.5-37.5℃的水浴中解冻工程细胞株；
将解冻后的细胞悬液加入预热的基础培养基中；
离心去除上清后，将细胞重悬于在摇床上预热的培养基中；
将悬液转移至含有培养基的摇瓶中，在36.5-37.5℃下培养24-72小时。
在一些实施方案中，所述的方法中的种子培养步骤包括：
以0.50×106-0.90×106个细胞/ml的密度将细胞接种至摇瓶或细胞培养袋中；
在36.3-37.3℃、5％ CO2、80％湿度、120rpm下培养24-72小时；
当细胞活率低于90％时，进行离心扩种。
在细胞培养过程中，溶解氧DO(％)的控制至关重要。为了确保最佳的细胞生长环境，本发明对溶解氧DO(％)参数进行了精确控制和优化。通过实验数据分析，确定了溶解氧在10-100范围内的最佳控制区间，优选为20-80，更优选为20-70，更优选为20-60，更优选为40，尤其是将DO(％)保持在20-60之间，最优值为40时，达到最佳的细胞生长和蛋白表达效果。
在一些实施方案中，所述的方法中的生产培养包括如下步骤：
i.初始温度为36.3-37.3℃，优选为36.5-37.0℃，更优选为36.8℃；培养3天；
ii.3天后将温度调整至31.5-32.5℃，优选为32℃，并继续培养至第7-8天或细胞活率下降到75％以下。
rhBMP6本发明的方法在实现rhBMP6在工业化及规模化生产中的批间稳定性以及蛋白表达量和表达效率方面取得了显著进展，特别是通过采用合适的分批培养技术提高了rhBMP6规模化生产的重现性和可扩展性。这种方法解决了以rhBMP6为主要活性成分的一类创新药物在研发、生产中面临的关键挑战，特别是在生物制药领域，工艺稳定性和高效放大操作的能力对于获得监管机构批准及新药研发成功至关重要。以下是本技术解决方案所取得的各种进步的详细说明。
本发明的方法在以下几个方面表现出以下创新和改进：
本发明成功建立了适宜于rhBMP6工业化生产的有效方法，解决了rhBMP6规模化放大生产中的批间稳定性差、表达量相对较低的问题，填补了该蛋白难以进行工业化生产的技术空缺，取得了预料不到的技术效果。进一步地，本发明通过逐级扩大生产规模，采用合理的分批培养培养条件(如溶氧、温度和pH)，优化细胞的代谢活动和生产效率，确保细胞在规模化生产过程中，在关键阶段达到最优的生长和蛋白表达条件，提高了蛋白表达的批间稳定性，确保了稳定的产品质量，实现了从实验室规模到工业规模中均能保持细胞代谢和重组蛋白表达的稳定性，满足了药品监管审批的需求。目前采用分批培养生产rhBMP6已完成临床二期研究，正处于临床三期研究阶段。
进一步地，通过在培养体系中添加适量的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)，显著提高了蛋白产量并维持了培养后期细胞的高活率，确保了细胞在放大过程中始终处于最佳生长条件，实现了在不复杂化培养过程的情况下提高蛋白产量。通过改变温度条件，在蛋白表达过程中降低温度，减少了乳酸等代谢副产物的产生，实现了细胞活率和的有效提升。
同时，本发明提高了分批培养操作的成本效率，通过提高每批次的稳健性和产量，总体生产成本得以降低。在提高分批培养的重现性和可扩展性方面取得了显著进展。这一方法不仅满足了生物制药生产的严格标准，还为行业优化其生物加工操作提供了实用且高效的解决方案。重现性确保了每批次都达到相同的高质量和高效能标准，而改进的可扩展性允许从研究到商业规模生产的无缝过渡。
附图说明
图1示出2升规模下分批培养活细胞密度与时间的关系。
图2示出2升规模下分批培养细胞活率随时间的变化。
图3示出500升和2000升规模下分批培养活细胞密度与时间的关系。
图4示出500升和2000升规模下分批培养的细胞活率随时间的变化。
图5示出分批培养pH随时间变化图。
图6示出分批培养氧分压(pO2)随时间变化图。
图7示出半连续培养前两个批次的细胞生长曲线。
图8示出半连续培养后四个批次的细胞生长曲线。
图9示出分批培养中不同浓度硫酸葡聚糖钠盐(DSS)下的批次蛋白表达量。
图10示出分批培养中不同浓度硫酸葡聚糖钠盐(DSS)下的细胞生长曲线。
图11示出分批培养中不同降温策略下的细胞生长曲线。
图12示出分批培养中不同降温策略下乳酸浓度的变化。
具体实施方式
定义和说明
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本发明中另有明确定义，本发明使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。应理解本发明所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。
除非另有说明，本发明中使用的以下术语具有如下含义：
如本文所用，术语“细胞培养基”指的是用于支持体外细胞生长、维持和增殖的多种液体或凝胶配方。在一些实施方案中，所述培养基为商业化的培养基，包括但不限于DMEM、RPMI-1640或其他专门为CHO细胞培养设计的商业细胞培养基，所述专门为CHO细胞培养设计的商业细胞培养基选自ProCHOTM-5AGT、CHO、ActiCHO P、BalanCD CHO、CDOptiCHO或Ex-Cell CD CHO；在一些实施方案中，所述培养基为用于增强rhBMP6生产的定制配方。
如本文所用，术语“Pro CHO 5培养基”指的是ProCHOTM-5AGT，一种专为蛋白生产应用设计的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的专有培养基。ProCHOTM-5AGT由Lonza BioScience生产，是一种无蛋白和无动物成分的培养基，特别适用于高密度悬浮培养CHO细胞和重组蛋白的生产。
如本文所用，术语“分批培养”指的是一种细胞培养方法，其中细胞培养基在培养期开始时接种细胞并提供所有营养物质，在整个过程中不再添加营养物质直至结束。
如本文所用，术语“细胞复苏”指的是将冷冻保存的细胞系恢复到活跃生长状态的过程。这包括解冻冷冻细胞悬液，去除冷冻保护剂，并在受控环境中启动细胞生长。
如本文所用，术语“种子培养”指的是细胞培养的初始阶段，以扩大其数量。这一步骤包括在适当的培养容器中接种细胞，并保持最佳生长条件以准备大规模生产。
如本文所用，术语“生产培养”指的是将细胞转移到生物反应器中进行大规模培养的阶段。在此阶段，细胞在受控条件下生长，温度、pH、溶解氧等参数被精确调控以最大化细胞密度和生产力。
如本文所用，术语“收获”指的是生产阶段后收集细胞培养液的过程。这包括将细胞与培养基分离，以获得含有目标蛋白的液体。
如本文所用，术语“样品预处理和病毒灭活”指的是为纯化收获的培养液所采取的步骤。这包括去除杂质、澄清液体并灭活任何潜在的病毒污染物，以确保最终产品的安全性和质量。
如本文所用，术语“产品纯化”指的是从预处理的培养液中分离和纯化目标蛋白的过程。这包括使用亲和层析等技术以达到适合预期应用的高纯度水平。
如本文所用，“总蛋白产量测定”指的是指在层析步骤中纯化洗脱液中总蛋白含量的定量。通常使用紫外分光光度法进行测定，这提供了蛋白浓度的量度，反映了生产过程的效率和成功。
如本文所用，术语“半连续培养”指的是一种培养方法，包括反复收获部分细胞培养液并在整个培养期内间隔加入新鲜培养基。
如本文所用，术语“灌流培养”指的是一种细胞培养方法，在此方法中，细胞连续或半连续地供应新鲜培养基，同时去除代谢废物和含有产品的培养基。
如本文所用，术语“重现性”指的是在不同批次和生物反应器规模中生产重组蛋白(如rhBMP6)的一致性和可靠性，确保生产结果的变化最小。
如本文所用，术语“可扩展性”指的是在增加生产体积从较小规模到较大生物反应器规模时，保持生产参数和结果一致性的能力，如蛋白产量和细胞活率。
如本文所用，术语“可扩展”、“扩大”或“扩展”指的是将细胞培养体积从实验室或试点规模增加到较大工业规模的过程，同时保持一致的蛋白表达和产量。
如本文所用，术语“工业规模”指的是大容量生产系统，通常超过500升，用于重组蛋白如rhBMP6的商业制造。
如本文所用，术语“活细胞密度(Viable Cell Density，VCD)”或“细胞密度”指的是培养系统中活细胞的浓度，通常以每毫升细胞数(cells/mL)表示，这是优化蛋白生产的关键参数。
如本文所用，术语“细胞活率(Viability，Via)”指的是培养系统中活的健康细胞的比例，以百分比表示，这是高效重组蛋白生产的必要条件。
如本文所用，术语“氧分压pO2(partial pressure of oxygen)”指的是溶解在液体(如培养基)中的氧气的分压。氧分压表示气体混合物中氧气所占的部分压力，是衡量气体中氧气含量的重要参数。在细胞培养过程中，氧分压通常以毫米汞柱(mmHg)或千帕(kPa)为单位，反映了氧气在气相和液相之间的分布情况。
如本文所用，术语“溶解氧(DO，dissolved oxygen)”指的是溶解在液体(如培养基)中的氧气浓度。溶解氧是指一定量的液体中能够溶解的氧气量，通常以毫克每升(mg/L)或百分比(％)表示。溶解氧浓度对细胞的生长和代谢具有重要影响，过低的溶解氧会导致细胞缺氧，而过高的溶解氧可能导致氧中毒。
在细胞培养过程中，pO2和DO(％)具有相关性，通过控制DO(％)水平，监测pO2，可以确保细胞培养环境的最佳条件，从而提高细胞活率和蛋白表达水平。
如本文所用，术语“蛋白滴度”指的是纯化的重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的浓度，以每升培养液中的毫克(mg/L)测量。在本发明的一些实施例中，蛋白滴度表示通过亲和纯化后使用紫外分光光度法定量的rhBMP6浓度。这种方法提供了纯化后rhBMP6浓度的直接测量，反映了蛋白生产过程的效率。
如本文所用，术语“批次蛋白表达量”指的是在分批培养样品中测量的特定蛋白质(在本例中为rhBMP6)的浓度，以每升培养液中的毫克(mg/L)表示。与先前示例中的广泛评估不同，实施例6中的批次蛋白表达量是使用ELISA方法确定的，术语“ELISA”指的是酶联免疫吸附测定，是一种基于板的检测技术，用于检测和定量可溶性物质，如蛋白质、抗体和激素。在本应用中，ELISA专用于定量培养液中生产的rhBMP6。
如本文所用，术语“蛋白产量”指的是在每升培养液中产生的重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的浓度，以毫克(mg/L)表示，反映了整个工艺的效率和优化程度。具体而言，蛋白产量反映了表达水平和最终纯化后的蛋白滴度。蛋白滴度是蛋白产量的一个组成部分，表示纯化后rhBMP6的浓度，通过紫外分光光度法进行测量。蛋白产量用于全面评估从实验室到工业规模生产过程中各阶段的整体性能和生产能力。
如本文所用，术语“接种”指的是将细胞添加到细胞培养基中，细胞将在其中粘附、生长和繁殖的过程。
如本文所用，术语“收获”指的是在定义的生长周期后从培养基中收集细胞或细胞产品(如重组蛋白)的过程。
如本文所用，术语“硫酸葡聚糖钠盐(Dextran Sulfate Sodium salt，DSS)”指的是一种硫酸化的葡聚糖聚合物，因其高负电荷而具有独特的生物学和化学性质。
实施例
材料与方法
本发明通过具体实施例进一步阐述。应理解，这些实施例旨在说明本发明的应用及其优点，但不旨在限制本发明的范围。各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，本发明的范围旨在涵盖所有这些落在所附权利要求的精神和范围内的修改和变化。
利用重组DNA技术在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生产重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的方法描述如下。rhBMP6单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。示例性地，本发明将rhBMP6的编码基因克隆至商业化表达载体pCHO1.0，构建重组表达质粒pCHO1.0-rhBMP6。将构建好的pCHO1.0-rhBMP6重组表达质粒转染至CHO悬浮细胞中。转染后、筛选获得稳定转染的用于表达rhBMP6的CHO细胞株。
SEQ ID NO:2:TCAGCCTCCAGCCGGCGCCG ACAACAGAGT CGTAATCGCT CTACCCAGTCCCAGGACGTG GCGCGGGTCT CCAGTGCTTC AGATTACAAC AGCAGTGAAT TGAAAACAGC CTGCAGGAAGCATGAGCTGT ATGTGAGTTT CCAAGACCTG GGATGGCAGG ACTGGATCAT TGCACCCAAG GGCTATGCTGCCAATTACTG TGATGGAGAATGCTCCTTCC CACTCAACGC ACACATGAAT GCAACCAACC ACGCGATTGTGCAGACCTTG GTTCACCTTATGAACCCCGA GTATGTCCCC AAACCGTGCT GTGCGCCAAC TAAGCTAAATGCCATCTCGG TTCTTTACTT TGATGACAAC TCCAATGTCATTCTGAAAAAATACAGGAAT ATGGTTGTAAGAGCTTGTGG ATGCCAC。
培养基的制备
本发明实施例1-5中使用的培养基为复合培养基，包括支持CHO细胞生长和生产rhBMP6的成分：
ProCHOTM-5AGT(ProCHO-5)：10-50g/L；
重组人胰岛素：2-20mg/L；
碳酸氢钠：1-5g/L；
硫酸葡聚糖钠盐：2-20mg/L；
氢氧化钠：1-10g/L；
HEPES：1-5g/L；
次黄嘌呤：0.05-0.2mM；
胸苷粉：0.01-0.05mM；
泊洛沙姆188(P188)：0.1-2g/L。
实施例6和7中的培养基含ProCHOTM-5AGT商业培养基并添加相应剂量的硫酸葡聚糖钠盐(浓度见实施例6和7)。
实施例1：重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)的生产
使用重组DNA技术在CHO细胞中生产rhBMP6的方法包括以下步骤：细胞复苏、种子培养、生产培养、收获以及产品纯化。
1.细胞复苏：
将工程化的细胞系在37℃的水浴中解冻。将解冻后的细胞悬液加入14ml预热的基础培养基中，离心去除上清，然后重悬于5ml在摇床上预热的培养基中。将此悬液转移至含有15ml培养基的摇瓶中，最终体积为20±2ml，在37℃的摇床上培养24-72小时。
2.种子培养：
将细胞以0.50×106-0.90×106个细胞/ml的密度接种至摇瓶或细胞培养袋中，在36.3-37.3℃、5％ CO2、80％湿度和120rpm、50mm振幅下培养24-72小时，并根据需要逐步扩种。如果细胞活率低于90％，则需要离心进行扩种。
3.生产培养：
按0.50×106-0.90×106个/ml的接种密度将种子细胞液接种至反应器中。控制温度在36.3-37.3℃范围内、控制pH在6.65-7.15范围内，控制DO(％)为20-60，pCO2(mmHg)为20-80条件下培养3天后，将温度调整至31.5-32.5℃，并继续培养至第7-8天或细胞活率降至75％以下，然后通过离心收集培养液。培养过程中每日监测细胞密度、活率、直径、葡萄糖、乳酸浓度、DO(％)和pH的变化趋势。
实施例2：使用分批培养法生产rhBMP6的扩大细胞培养
本研究旨在使用CHO细胞在不同生产体积(具体为2L、500L和2000L)下放大生产重组人骨形态发生蛋白6(rhBMP6)，并评估这些规模下的重现性、可扩展性和蛋白产量。
操作步骤：
1.2L生产培养：
在2L摇瓶中进行细胞培养，按0.50×106-0.90×106个/ml的接种密度将种子细胞液接种至摇瓶中。在36.3-37.3℃范围内，pH 6.65-7.15，DO(％)20-60条件下培养3天，然后将温度降至31.5-32.5℃，并继续培养7-8天或直到细胞活率低于75％。设定转速为250rpm，维持pCO2(mmHg)为20-80。培养过程中每日监测细胞密度、活率、直径、葡萄糖、乳酸浓度、DO(％)和pH的变化趋势。
2.500L生产培养：
在500L反应器中进行细胞培养，按0.50×106-0.90×106个/ml的接种密度将种子细胞液接种至500L细胞培养袋中。在36.3-37.3℃范围内，pH 6.65-7.15，DO(％)20-60条件下培养3天，然后将温度降至31.5-32.5℃，并继续培养7-8天或直到细胞活率低于75％。设定转速为70rpm，维持pCO2(mmHg)为20-80。培养过程中每日监测细胞密度、活率、直径、葡萄糖、乳酸浓度、DO(％)和pH的变化趋势。
3.2000L生产培养：
在2000L反应器中进行细胞培养，按0.50×106-0.90×106个/ml的接种密度将种子细胞液接种至2000L细胞培养袋中。在36.3-37.3℃范围内，pH 6.65-7.15，DO(％)20-60条件下培养3天，然后将温度降至31.5-32.5℃，并继续培养7-8天或直到细胞活率低于75％。设定转速为50rpm，维持pCO2(mmHg)为20-80。培养过程中每日监测细胞密度、活率、直径、葡萄糖、乳酸浓度、DO(％)和pH的变化趋势。
实施例3：使用分批培养法生产rhBMP6的分析
本实施例旨在分析不同生物反应器体积下rhBMP6的最终产品和各种过程参数。在实施例2中建立的细胞培养过程基础上，监测关键过程参数如细胞密度、活率和代谢特征，通过测量蛋白产量和质量评估分批培养的稳定性，验证其是否适宜于工业化放大生产。
收获培养液、亲和纯化后，进行总蛋白产量测定：
采用紫外分光光度计按Warburg-Christian法测定纯化后的总蛋白量，并计算每升培养液收获的总蛋白量(mg总蛋白/L培养液)。
批次详情如下表1。
表1.各组的批次详情
编号 规模
R1-01 2L
R1-02 2L
R1-03 2L
R2-01 500L
R3-01 2000L
R3-02 2000L
结果与讨论：
1.蛋白滴度
蛋白滴度分析旨在确定不同规模的生物反应器(特别是2L、500L和2000L)中生产的rhBMP6浓度。蛋白产量数据如下表2，显示了各组培养液中rhBMP6的浓度(mg/L)。
表2.分批培养各批次rhBMP6浓度(mg/L)
注：所述蛋白滴度是指亲和纯化后通过紫外分光光度法定量的纯化rhBMP6的浓度。
蛋白滴度数据显示，在不同生物反应器规模中实现了稳定的rhBMP6生产。对于2L规模，蛋白滴度值在7.6至8.3mg/L之间，平均蛋白滴度为7.9mg/L。随着规模增加至500L和2000L，蛋白产量也增加，2000L规模下记录的最高蛋白滴度为9.1mg/L。
所有规模的平均蛋白滴度为8.3mg/L，标准偏差为0.6，显示了生产过程的高度重现性。在较大规模(500L和2000L)上观察到的稍高蛋白滴度表明，在恰当的细胞培养和表达工艺中，蛋白质表达具有较高稳定性。
测得的总蛋白滴度为500L批次为8.8mg/L，而2000L批次分别为8.5mg/L和9.1mg/L。平均产量为8.8mg/L，标准偏差为0.3，表明变化幅度不具有显著性差异。
结果表明，通过优化的培养和纯化过程，使得分批培养方法在不同规模下实现了高批间稳定性、高批次重现性和可扩展性，且在放大过程中有效保持了高蛋白质表达水平，保证了实验室水平向商业生产规模的有效转移。
2.细胞密度和活率趋势：
图1展示了2L规模下活细胞密度(VCD)与时间的关系，显示了初始几天内细胞密度迅速增加，约在第3-4天达到峰值，然后稳定并逐渐下降。图2显示了2L培养过程中细胞活率(Via)随时间的变化，显示出较高的细胞活率，始终保持在80％以上，只有在培养期末期略有下降。
图3展示了500L(R2-01)和2000L(R3-01和R3-02)规模下活细胞密度与时间的关系。与2L批次类似，这些较大规模批次的细胞密度迅速增加，约在第4天达到峰值，随后趋于平稳，表明细胞培养过程的有效放大。图4展示了500L和2000L培养的细胞活率随时间的变化，保持较高的细胞活率，与2L批次相当，在第6天后逐渐下降。
图1和图3的数据表明，不同规模间的一致性得到了保持，表明用于细胞培养的过程不仅可扩展，而且具有高度重现性。活细胞密度在2L和更大规模批次(500L和2000L)中在相同时间范围内达到峰值，表明为小规模优化的培养条件有效地转移到更大体积中而不损失细胞生长效率。
图2和图4中的活率趋势显示，整个培养期间在所有规模中都保持较高的活率。在2L、500L和2000L批次中均观察到培养阶段后期活率略有下降，反映了随着营养物质消耗或代谢废物积累的正常进程。
上述结果支持了所采用的方法在高批间稳定性、高批次重现性和可扩展性方面的表现出色。不同规模的细胞密度和活率趋势的一致性，确认了细胞培养生产rhBMP6过程的稳健性，能够在放大时保持细胞健康和生产力。这种稳健性对于商业生产至关重要，过程的可预测性和可靠性是满足生产需求和质量标准的关键。
3.pH与溶氧量DO(％)优化
在生产培养阶段，对活细胞密度、细胞活率、细胞直径、在线pH、pCO2、pO2、葡萄糖浓度和乳酸浓度进行了系统监测。图5展示了500L和2000L规模下pH随时间变化图，图6展示了500L和2000L规模下氧分压(pO2)随时间变化图。
在细胞培养过程中，维持适宜的pH对于细胞的生长和代谢至关重要。细胞培养基的pH影响细胞的酶活性、代谢速率以及营养物质的吸收和代谢废物的排出。如图5的在线pH随时间变化图所示，pH值在整个培养过程中保持在6.9左右，正负0.1左右的误差，略有波动但始终在可控范围内。各批次间pH值变化一致，表明在这一范围内，细胞培养环境较为稳定，有利于细胞的生长和蛋白质的表达。通过实验验证，在pH值为6.65至7.15的范围内，细胞活率和代谢特征均保持良好状态，未见显著的不利影响。尤其是在pH值接近6.9时，细胞生长和蛋白质产量表现最佳。
溶解氧DO(％)是细胞培养过程中另一关键参数，它直接影响细胞的呼吸作用和代谢活动。DO(％)值过高或过低都会对细胞的正常生长和代谢产生负面影响。如图6氧分压(pO2)随时间变化图所示，氧分压pO2在培养初期迅速下降，然后在较低水平保持稳定。在2000L(R3-02)批次中，由于取样前DO低于设定值，在取样时进行氧气补充，导致pO2值瞬时偏高。
在实验过程中，通过调节氧气供给，发现DO(％)值控制在10-100的范围内均能维持细胞的正常生长。但为了优化细胞代谢和蛋白表达，DO(％)值保持在20-80之间，更优地，在20-70，更优选为20-60的范围内，尤其是接近40时，细胞表现最佳。这一范围内的DO(％)值能够有效避免氧气过量导致的氧化应激反应，也能防止氧气不足导致的代谢紊乱。
实施例4：半连续培养生产rhBMP6
本实施例旨在比较本发明的半连续培养方法与优化的分批培养方法。研究重点评估半连续方法的稳定性和生产效率，特别是其对细胞生长、蛋白表达和整体培养效率的影响。在培养方式、培养容器有所不同的情况下，为了获得更优的培养效果，适应性地调整了培养条件。
操作步骤：
细胞复苏和初步扩增：
按照实施例1中描述的方法复苏工程细胞系。复苏后，在基础培养基中培养48-96小时或直到细胞密度达到1.0×106-3.0×106个细胞/mL。
接种和Wave生物反应器培养：
当细胞种子满足要求后，以0.2×106至0.5×106个细胞/mL的密度接种到Wave生物反应器中培养条件设定为36.3-37.3℃，转速为10rpm，角度为8°，气流量为300ccm(空气+3％ CO2)。根据细胞生长、pH和溶解氧DO(％)的趋势及时调整转速、角度和通气策略。初始培养体积为1.5升，根据细胞生长状态每2-5天添加新鲜培养基，直到细胞密度达到2.5×106-4.0×106个细胞/mL或培养体积达到3-5升。
扩增至50L Wave生物反应器：达到上述密度后，将细胞转移到50L Wave生物反应器中，使用相同的接种密度。培养条件设定为36.3-37.3℃，10rpm，8°，300ccm气体(空气+3％ CO2)。根据细胞生长、pH和溶解氧DO(％)的趋势及时调整转速、角度和通气策略。此步骤标志着一个完整生长、蛋白表达和培养基补充循环的开始。培养过程需要5-10个循环。根据细胞生长情况，每1-3天添加新鲜培养基，直到细胞密度达到3.0×106-5.0×106个细胞/mL。
蛋白表达和收获：
当细胞密度达到3.0×106-5.0×106个细胞/mL时，将温度降至31.5-32.5℃以促进蛋白表达。继续培养2-5天，然后进行收获。在每轮收获后，添加新鲜培养基并将温度升至36.3-37.3℃以开始另一个培养和表达循环。
每日监测和最终收获：
在整个培养过程中，每日监测活细胞密度、细胞活率、葡萄糖和乳酸浓度。如果细胞活率低于70％，则停止培养或进行收获，在5-10个循环后进行。
蛋白表达测量：
从培养的细胞培养基中纯化rhBMP6，并采用与实施例3相同的方法进行测量。
结果与讨论：
1.蛋白滴度
在实施例4的半连续培养模型中，收获了六批次细胞培养液并进行了亲和纯化。表3列出了收获的详细结果：
表3.半连续培养中rhBMP6浓度(mg/L)
编号 蛋白滴度(mg/L)
SC01 4.3
SC02 1.6
SC03 1.7
SC04 3.1
SC05 2.4
SC06 2.0
Mean 2.5
SD 1.0
注：所述蛋白滴度是指亲和纯化后通过紫外分光光度法定量的纯化rhBMP6的浓度。
结果显示，六批次收获的半连续培养液的蛋白滴度在1.6mg/L至4.3mg/L之间，平均蛋白滴度为2.5mg/L，标准偏差为1.0，为平均值的40％。与之相对的，分批培养方法(实施例3)的蛋白滴度在7.6-9.1mg/L之间，平均蛋白滴度为8.3mg/L，标准偏差为0.6，为平均值的6.6％-7.9％。
通过比较可以发现：对于半连续培养，在同为50L的培养规模的情况下，所收获的六批次的蛋白滴度之间的偏差相对较大；而对于分批培养，在培养规模的跨度为2L-2000L情况下，所收获的六批次的蛋白滴度之间的偏差较小，批间变异性低。由此可知，即便保持半连续培养的培养规模相同，在常规重组蛋白生产中批间稳定性和批间重现性较高的半连续培养，在用于rhBMP6生产时却不及培养规模跨度明显更大的分批培养。在平均蛋白滴度方面，分批培养是半连续培养的3.3倍，分批培养获得了显著更高的平均蛋白产量。
虽然半连续培养方法通常被认为既可以补充养分，也可以缓解产物抑制和减少代谢副产物积累，相比分批培养具有潜在优势但在rhBMP6生产的过程中，发现不同批次中蛋白滴度差异显著，在不同批次间不稳定，反而显示出重现性差的问题，无法满足进一步放大生产的需求。与之相比意外的是，分批培养方法地批间稳定性更高且蛋白滴度更高，尤其是500L和2000L的三个批次间呈现出更高的批间稳定性，满足了GMP工艺验证中对于工艺稳定性的需求和药品监管审批的需求，使其更适合工业规模生产。
2.细胞密度和活率趋势：
图7展示了两个批次半连续培养的细胞生长曲线。观察到细胞在第3天达到3.09×106个细胞/mL的峰值，随后活率逐渐下降，培养至第7天进行部分培养液的收获，添加新鲜培养基后继续培养，培养至15天全部收获。在培养后期，细胞数量和活率较首次收获前低。类似的，图8展示了四个批次半连续培养的细胞生长曲线，持续培养24天。
图7和图8中细胞密度和细胞活率达到峰值后开始下降和波动，表明细胞在半连续培养系统中面临潜在的应激和不稳定，反映出在延长周期中维持稳定的生长条件和细胞健康的存在难度。细胞生长和活率的高变异性会导致后续下游处理中的产品的质量和产量不一致，无法满足GMP工艺验证中对于工艺稳定性的需求和药品监管审批的需求，不适宜于工业规模生产。相比之下，分批培养(如实施例3中讨论的)显示出更稳定的生长和活率趋势，有助于工业规模生产。
实施例5：灌流培养生产rhBMP6
本实施例旨在比较实施例2和3中描述的分批培养方法与灌流培养方法。在培养方式、培养容器有所不同的情况下，为了获得更优的培养效果，适应性地调整了培养条件。
操作步骤：
细胞复苏和接种：
按照实施例1中描述的方法复苏工程细胞系。经摇瓶适应的细胞以0.40×106-0.60×106个细胞/mL的密度接种到配有ATF2灌流系统的2L生物反应器中。
培养条件：
控制温度在36.3-37.3℃范围内、控制pH在6.65-7.15范围内，控制DO(％)为20-60，培养7天后，将温度调整至31.5-32.5℃，考察不同细胞密度、不同灌流速度细胞的生长和表达情况，细胞活率低于70％时结束培养。培养过程中每日监测细胞密度、活率、直径、葡萄糖、乳酸浓度、DO(％)和pH的变化趋势。
收获和纯化：
培养14天后，收集细胞培养液，收获的细胞培养液分为两部分——反应罐内的培养液及经中空纤维过滤后的灌流培养液，灌流培养液(罐外)再分两部分，获得收获液1、收获液2，分别将罐内培养液、收获液1和收获液2进行亲和层析纯化。
蛋白质定量：
使用紫外分光光度法对含有rhBMP6的纯化溶液进行定量，以计算每升培养液中的总蛋白量(mg总蛋白/L)。
结果与讨论：
在实施例5的优化灌流培养中，观察到的蛋白滴度显著低于分批培养方法，尤其是在生物反应器和收获的液体中。表4展示了测量的蛋白滴度：
表4.灌流培养中rhBMP6浓度(mg/L)
蛋白滴度(mg/L)
反应罐内 0.9
收获液1 0.1
收获液2 0.2
注：所述蛋白滴度是指亲和纯化后通过紫外分光光度法定量的纯化rhBMP6的浓度。
灌流培养中的蛋白滴度明显低于本发明的分批培养方法。具体地，在生物反应器内记录的产量为0.9mg/L，而在收获液中记录的产量更低，分别为0.1mg/L和0.2mg/L。这与实施例3中分批培养方法的平均蛋白滴度8.3mg/L形成鲜明对比。
实施例2和3中使用的分批培养方法提供了更高且更稳定的蛋白产量。相比之下，灌流培养中的连续流动和动态条件，虽然理论上可增强营养供应和代谢产物的移出，然而，灌流培养并不适宜于rhBMP6的生产，该蛋白可能吸附在ATF系统的中空纤维上，从而导致蛋白产量减少。此外，管理灌流培养的复杂性，如需要复杂设备和蛋白质吸附的风险，可能使这些系统复杂化并增加生产成本。
小结：
在实施例3至5中，分析了各种培养方法在扩展到工业生产中的适用性，重点关注蛋白产量的稳定性、重现性和效率。
实施例3显示，分批培养扩展到500L和2000L，保持了高重现性和操作简单。数据表明，不同规模(2L、500L和2000L)的蛋白产量一致较高，强调了分批培养在实现稳定和增强蛋白质表达方面的优势。通过优化培养基成分和过程参数(如pH和溶解氧水平)，分批培养确保了在不同规模下的高批间稳定性、高批次重现性和高产量。这种一致性和操作简便性使分批培养特别适合商业规模的扩展，其中可预测性和高产量至关重要。
在实施例4中，评估了半连续培养，通过六批次的收获观察到蛋白质表达在批次间存在显著变异，反映出生产结果不稳定且批次间重现性差。这种变异性表明对于生产rhBMP6来说，半连续培养可能不适合工业规模的扩展，因为它无法保证一致的产品质量和产量。此外，半连续培养在过程控制和管理上也较为复杂，增加了操作难度和成本。
实施例5探讨了灌流培养，发现生物反应器和收获液中的蛋白产量均低于分批培养。进一步分析表明，ATF系统的中空纤维可能吸附了大量目标产物，从而降低了产量。这一问题加上灌流系统管理和操作的复杂性，表明灌流培养对于生产rhBMP6来说，可能不适合工业规模的扩展，工业生产更倾向于高效和简单的生产过程。
总之，尽管半连续和灌流培养在延长培养周期和潜在增强细胞活率方面具有某些优势，实施例3至5的研究结果证明，分批培养在生产rhBMP6方面是工业生产中更可靠和有效的方法。通过优化培养基和过程参数，分批培养方法不仅提高了生产效率，还确保了在大规模生产中的高批间稳定性和高批次重现性。其高蛋白产量、极高的重现性和操作简单性使其成为商业生物加工环境中扩展的首选方法。
在实施例3至5的基础上，出乎意料地摸索出了呈现出更高批间稳定性且符合rhBPM6蛋白工业化生产的分批培养方法。所述批间稳定性是GMP工艺验证中评估工艺稳定性的关键指标之一，也是药品监管审批过程中考虑的重要因素。以下实施例为在分批培养中优化蛋白质表达的探索。
实施例6：分批培养中蛋白表达的优化
本实施例旨在研究不同浓度的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)对分批培养环境中蛋白表达的影响。
操作步骤：
细胞在对数生长期内以0.5×106个细胞/mL的密度接种到Pro CHO 5培养基中。初始培养体积设定为20mL，使用TPP培养容器。培养在37℃、5.0％ CO2、80％湿度和250rpm的摇动速度下进行。在接种时分别添加0.5g/L、1g/L和2g/L浓度的硫酸葡聚糖钠盐。每日监测细胞活率、细胞密度、葡萄糖和乳酸浓度，当细胞活率低于70％时终止培养。使用ELISA方法对培养上清液中的蛋白表达进行定量。
结果与讨论：
实验探索了不同浓度的硫酸葡聚糖钠盐对分批培养环境中蛋白表达的影响。表6和图9展示了在不同条件下获得的批次蛋白表达量水平：
表5.硫酸葡聚糖钠盐对批次蛋白表达量的影响结果
编号 条件 批次蛋白表达量(mg/L)
control NA 13.4
A6 0.5g/L DSS 22.9
A7 1g/L DSS 21.6
A8 2g/L DSS 22.6
注：批次蛋白表达量是指使用ELISA方法测量的每升培养液中的rhBMP6浓度，以mg/L表示。
相较于未添加硫酸葡聚糖钠盐的对照组，添加不同浓度的硫酸葡聚糖钠盐均显著提高了蛋白产量。在0.5g/L DSS(A6)组中，批次蛋白表达量增加到22.9mg/L，相较于对照组提高了约70.9％。在1g/L DSS(A7)组中，批次蛋白表达量达到21.6mg/L，比对照组增加了61.2％。在2g/L DSS(A8)组中，批次蛋白表达量为22.6mg/L，相较于对照组提高了68.7％。这些数据表明，DSS对蛋白表达具有显著的促进作用，且DSS的浓度变化对蛋白表达的提升效果相近。
图9展示了不同浓度硫酸葡聚糖钠盐(DSS)下的细胞生长曲线，显示了在不同DSS浓度下活细胞密度(VCD)和细胞活率(Via)随培养时间的变化情况。初期(0至3天)，所有条件下细胞密度迅速增加，活细胞密度达到约2.5×106cells/mL。中期(4至5天)细胞密度趋于稳定，活率保持在90％以上。后期(6至8天)细胞密度略有下降，但总体保持在较高水平；活率在添加DSS的条件下仍维持较高水平，而对照组则下降至70％以下。结果表明，添加DSS后，细胞密度和活力均显著提升，尤其是在培养后期，DSS的存在帮助细胞维持较高的活力，避免了快速衰退。
综上所述，添加硫酸葡聚糖钠盐(DSS)有助于帮助细胞维持较高的活力，显著提高了蛋白表达量。通过设置不同的DSS的浓度梯度研究其对批次培养生产rhBMP6的影响，发现DSS的浓度变化对蛋白表达的提升效果相近，这一发现提示了在批次培养的培养条件优化过程中，为了进一步优化蛋白表达，如需探索其他培养条件或辅助试剂，可扩展研究到更高或更低的DSS浓度范围。
实施例7：分批培养中降温策略的优化
本实施例的目的是优化分批培养中的降温策略，以评估其对细胞生长和代谢活动的影响。
操作步骤：
细胞以0.5×106个细胞/mL的密度接种到补充有1g/L硫酸葡聚糖钠盐(DSS)的ProCHO 5培养基中。初始培养温度保持在36.3-37.3℃范围内，5.0％ CO2和80％湿度下进行，摇动速度为250rpm。在接种后不同天数(不降温、2天、3天和4天)开始降温至31.5-32.5℃，分别对应实验组F1、F2、F3和F4。在整个7天的培养期间每日监测细胞活率、密度和乳酸浓度。
结果与讨论：
图9展示了不同降温策略下的细胞生长曲线，显示了在7天的培养期内，不同降温启动时间对活细胞密度(VCD)和细胞活率(Via)的影响。在未进行降温的对照组(F1)中，第5天后活率显著下降，收获时活率较低(78.2％)。相反，实施降温的组(F2、F3、F4)显示出更稳定的细胞密度和显著更高的活率，收获时均保持在90％以上。最显著的改善见于第2天启动降温的F2组，整个培养期间均保持高细胞活率和密度。
图10展示了不同降温策略下乳酸浓度的变化。乳酸生产曲线显示，实施降温的组(F2、F3、F4)中的乳酸水平稳定。而对照组(F1)在整个培养期内乳酸水平持续较高。这种对照组中持续的高乳酸水平可能导致培养基酸化，进而不利于维持细胞健康。
这些发现表明，降温策略在优化分批培养条件中起着重要的作用。细胞培养一段时间实施降温处理可以提高细胞活率并稳定代谢过程。这一发现提示了在批次培养的培养条件优化过程中，为了进一步优化蛋白表达，可结合蛋白表达需要实施和摸索最适宜的降温策略。
在上述各实施例所记载的rhBMP6生产的过程中，分批培养方法在简单性、可扩展性和重现性方面一直表现出优越性，优于半连续和灌流培养。实验结果证实了分批培养的如下优势：
分批培养的效能：分批培养方法的批间稳定性更高且蛋白产量更高，尤其是500L和2000L的三个批次间呈现出更高的批间稳定性，这一特性是GMP工艺验证中评估工艺稳定性的关键指标之一，也是药品监管审批过程中考虑的重要因素，使其更适合工业规模生产。
硫酸葡聚糖钠盐的影响：添加不同浓度的硫酸葡聚糖钠盐(DSS)到分批培养中，细胞密度和活力均显著提升，尤其是在培养后期，DSS的存在帮助细胞维持较高的活力，避免了快速衰退。实验结果显示，硫酸葡聚糖钠盐的存在稳定地增强了蛋白表达水平。值得注意的是，所验证的DSS的浓度对蛋白表达的提升效果相近，这一发现提示了在批次培养的培养条件优化过程中，为了进一步优化蛋白表达，如需探索其他培养条件或辅助试剂，可扩展研究到更高或更低的DSS浓度范围。
降温策略的优化：针对降温策略优化的实验显示出对细胞活率和乳酸代谢的显著影响。降温组在收获时的细胞活率显著提高，活力值始终保持在90％以上。相比之下，无降温组的活力迅速下降，收获时的活力仅为78.2％。这一发现提示了在批次培养的培养条件优化过程中，为了进一步优化蛋白表达，可结合蛋白表达需要实施和摸索最适宜的降温策略。
本发明中应用于分批培养框架的技术在增强生物加工的整体效果方面被证明是有效的。通过加入硫酸葡聚糖钠盐和优化降温策略，分批培养的稳健性和效率得到了显著提升。这些改进不仅提高了产量，还确保了更大的一致性和更易于扩展的操作，这对于商业生物生产的成功至关重要。这些优化措施提供了切实的好处，强调了分批培养在生物技术和制药行业中作为主流方法的潜力。

Claims (10)

1.一种生产重组人骨形态发生蛋白6的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
种子培养：在细胞培养基中接种表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，获得种子培养液；
生产培养：在细胞培养基中接种所述种子培养液，培养5-15天或细胞活率下降，收获细胞培养液；
所述种子培养为一级或多级种子培养；
所述方法为分批培养的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生产培养中，包括降温步骤；所述降温步骤包括培养1-4天后进行降温处理；
优选地，所述降温步骤包括：培养1-4天后降温3-7℃；
优选地，所述降温步骤包括：设置初始温度为36-38℃、培养1-4天后进行降温处理，设置降温后的温度为31-33℃；
优选地，所述生产培养中，pH为6至8；
优选地，所述生产培养中，溶解氧DO(％)为10-100。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，所述种子培养的培养体积选自250mL、500mL、1L、2L、15L、50L、200L、500L中的一种或多种；
优选地，所述生产培养的体积选自50L、200L、500L、2000L中的一种或多种；
优选地，所述种子培养的时间为24-96h，更优选地，所述种子培养的时间为24-72h；
优选地，所述重组人骨形态发生蛋白6的产量不少于7.6mg/L，优选不少于7.7mg/L，更优选不少于8.3mg/L，更优选不少于8.5mg/L，更优选不少于8.8mg/L，更优选不少于9.1mg/L；
优选地，生产培养的接种密度为0.50×106-0.90×106个细胞/ml；优选0.70×106个细胞/ml。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，培养3-4天后进行降温处理，更优选地，培养3天后进行降温处理；
优选地，所述初始温度和降温后的温度的温差为3.5-6.0℃，更优选为3.8-5.8℃；
优选地，所述初始温度为36.3-37.3℃，更优选地，所述初始温度为36.8℃；
优选地，所述降温后的温度为31.5-32.5℃，更优选地，所述降温后的温度为32℃；
优选地，所述pH为6.65-7.15，更优选为6.90；
优选地，所述溶解氧DO(％)为20-80，优选为20-70，更优选为20-60，更优选为40。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，通过调整生产培养阶段的参数对生物反应器体积进行放大；
优选地，根据所述生物反应器或摇瓶体积调整搅拌速度以保持相似的剪切条件；
更优选地，当所述培养体积为2L时，搅拌速度在240-260rpm范围内，更优选为250rpm；
更优选地，当所述培养体积为500L时，搅拌速度在65-75rpm范围内，更优选为70rpm；
更优选地，当所述培养体积为2000L时，搅拌速度在40-60rpm范围内，更优选为50rpm；
优选地，CO2分压保持在20-80mmHg范围内，更优选为30-60mmHg范围内。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基中含有硫酸葡聚糖钠盐；
优选地，所述硫酸葡聚糖钠盐的浓度为2mg/L-2g/L，优选2-20mg/L。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基包含选自以下的一种或多种基础培养基：DMEM、RPMI-1640，或其他专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基；
优选地，所述专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基选自以下的一种或多种ProCHOTM-5AGT、CHO、ActiCHO P、BalanCD CHO、CD OptiCHO或Ex-Cell CD CHO中的一种或多种；
更优选地，所述专门为CHO细胞培养设计的细胞培养基为ProCHOTM-5 AGT。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述种子培养和/或生产培养使用的细胞培养基进一步包含以下一种或多种成分：生长因子、缓冲剂、pH调节剂、DNA合成促进剂或表面活性剂；
优选地，所述生长因子选自类胰岛素生长因子，更优选地，所述生长因子为重组人胰岛素；
优选地，所述缓冲剂选自缓冲盐、HEPES或MOPS，更优选地，所述缓冲剂选自碳酸氢钠或HEPES；
优选地，所述pH调节剂选自氢氧化钠或氢氧化钾，更优选地，所述pH调节剂为氢氧化钠；
优选地，所述DNA合成促进剂选自嘌呤化合物或核苷酸，更优选地，所述DNA合成促进剂选自次黄嘌呤或胸苷；
优选地，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，更优选地，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
10.一种细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基用于培养表达重组人骨形态发生蛋白6的细胞，所述细胞培养基为如权利要求7至9中任一项所述的细胞培养基；优选地，所述培养基用于权利要求1-9任一项所述的方法。
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