CN104350147A

CN104350147A - Nadp依赖性丙氨酸脱氢酶

Info

Publication number: CN104350147A
Application number: CN201380030225.5A
Authority: CN
Inventors: T.哈斯; J.C.普费弗; A.斯克拉; A.莱希纳; A.雅拉施
Original assignee: 赢创工业集团股份有限公司
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2015-02-11
Also published as: JP2015514407A; EP2653538A1; US20150099282A1; WO2013156454A1; EP2838997A1

Abstract

本发明涉及包含枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ）丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体的多肽，其中Leu197或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸，涉及编码此类多肽的核酸分子，并涉及用于产生丙氨酸或化合物（通过丙氨酸消耗生成）的方法，所述方法包括通过将丙酮酸与根据本发明的多肽或根据本发明的细胞接触来使丙酮酸与铵和NADPH反应以生成丙氨酸的步骤。

Description

NADP依赖性丙氨酸脱氢酶

本发明涉及包含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）丙氨酸脱氢酶(AlaDH)的氨基酸序列或其变体的多肽，其中Leu197或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸，涉及编码此类多肽的核酸分子，并涉及用于产生丙氨酸或化合物（通过丙氨酸消耗生成）的方法，所述方法包括通过将丙酮酸与根据本发明的多肽或根据本发明的细胞接触来使丙酮酸与铵和NADPH反应以生成丙氨酸的步骤。

胺用作化学工业的多种产物的合成单元，诸如环氧树脂、聚氨酯泡沫、异氰酸酯和尤其是聚酰胺。后者是一类特征在于重复的酰胺基团的聚合物。与化学相关的蛋白不同，措辞“聚酰胺”通常涉及合成的、可商购的、热塑性塑料。聚酰胺衍生自可从在化石烃的裂化过程中产生的烷中获得的伯胺或仲胺。然而，胺衍生物，更准确地为氨基羧酸、内酰胺和二胺，还可以用于制备基于酰胺的聚合物。其他感兴趣的起始物质为短链气态烷，其可以借助于生物技术方法获自可再生原材料，并随后胺化。

大量商业需求的许多聚酰胺从内酰胺开始制备。例如，“聚酰胺-6”可以通过将ε-己内酰胺聚合来获得，并且“聚酰胺-12”通过将十二内酰胺聚合来获得。其他商业上感兴趣的产物包括内酰胺的共聚物，例如ε-己内酰胺和十二内酰胺的共聚物。

常规化学技术生产胺依赖于化石原材料的供应，效率低下并且产生大量不期望的副产物，在一些合成步骤中高达80％。此类方法的一个实例是制备十二内酰胺，其常规通过丁二烯的三聚化来获得。将三聚化产物环十二碳三烯氢化，并且产生的环十二烷被氧化以生成环十二烷酮，其随后与羟胺反应来产生环十二烷肟(oxine)，其经Beckmann重排反应最后转化为十二内酰胺。

考虑到这些不利之处，开发了使用生物催化剂从可再生原材料获得胺的方法。在此，农业产品诸如糖或脂肪酸（其可能已包含醇官能团）被氧化以产生醛或酮。在随后步骤中，醛或酮随后通过氨基转移酶转化为胺，并伴有消耗氨基酸。氨基酸有利地通过在氨基转移酶反应过程中存在的氨基酸脱氢酶来再生，并伴有消耗无机氮盐。

例如，国际专利申请PCT/EP 2008/067447描述了使用细胞制备ω-氨基羧酸的生物系统，所述细胞具有一系列合适的酶活性，并且能够转化羧酸为对应的ω-氨基羧酸。尤其是，细胞包括来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GPO1的AlkBGT氧化酶系统，其首先氧化ω-氨基羧酸以产生ω-羟基羧酸并随后产生醛。这随后为氧化产物通过同样表达的氨基转移酶的胺化。

EP11174729.1和EP11006458.1描述了从烷或从醇开始制备胺的方法，所述方法区别在于，其中醇或烷（其在第一方法步骤中被羟基化以产生醇）通过醇脱氢酶反应并伴有消耗NAD⁺以产生醛或酮，并且产物随后通过氨基转移酶反应并伴有消耗作为胺供体的丙氨酸来以产生胺。消耗的丙氨酸可以通过存在的丙氨酸脱氢酶来再生，并伴有消耗丙酮酸和铵，因此，总体上，丙氨酸不需要补充。

在文献中描述的丙氨酸脱氢酶中，枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶及其变体适合于此类方法。这一特定组的丙氨酸脱氢酶的缺点在于它们是NADH依赖性的，也就是说它们消耗另一种还原的氧化还原因子而非在醇氧化过程中大量NAD依赖性醇脱氢酶（其已证实在生物技术中是尤其有利的）产生的氧化还原因子。

在体外反应的情况下，这意味着每反应的醇分子必须向反应提供一个NAD⁺分子和一个NADPH分子。相反，如果反应体内使用全细胞催化剂进行，那么细胞可以原则上经初级代谢提供各个氧化还原因子；然而，这对于代谢是相当程度的负担，其导致降低的产物产量和/或缩短的细胞使用寿命。

针对这一背景，本发明基于的目标是提供用于胺化醇的氧化还原中性酶系统，即包含用于催化醇转化为胺并再生丙氨酸不需要供应外部产生的NAD⁺或NADPH或其他氧化还原因子的酶的系统。

本发明基于的进一步的目标在于提供丙氨酸脱氢酶，其适合于在NADPH存在的情况下酶促催化地转化醇为胺，并且其以尽可能高的酶变率（Wechselzahl）（即，每秒反应的底物分子的数量）催化所述反应。

本发明基于的进一步的目标在于以这样的方式修饰枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶，使得所述酶以对作为底物的NADPH更高的亲和力催化丙酮酸转化为丙氨酸，并且所述酶对NADPH的亲和力优选高于对NADH的亲和力，更优选相对于野生型酶的酶变率，其酶变率不会显著降低。

本发明基于的进一步的目标在于提供胺化醇的氧化还原中性系统，所述系统适合于在温和反应条件下的一锅反应，所述温和条件具体而言是指不具有极端温度或pH值并且不存在含重金属的催化剂或其他毒性化合物的那些条件。

这些和其他目的通过本申请的主题和尤其还通过所附的独立权利要求的主题来实现，其中实施方案可见于从属权利要求中。

在第一方面，本发明基于的问题通过以下解决：包含枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体的多肽，其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸。

在第一方面的第一个实施方案中，所述问题通过多肽来解决，其中带正电侧链的氨基酸是精氨酸。

在第一方面的第二个实施方案中，其也是第一方面的一个实施方案，所述问题通过多肽来解决，其中另外地Asp196或位于氨基酸序列中同源位置的氨基酸交换为具有中性的或带正电的侧链的氨基酸。

在第一方面的第三个实施方案中，其也是第一至第二方面的一个实施方案，所述问题通过多肽来解决，其中具有中性的或带正电的侧链的氨基酸是选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的氨基酸，优选丙氨酸。

在第一方面的第四个实施方案中，其也是第一至第二方面的一个实施方案，所述问题通过多肽来解决，其是显示于SEQ ID No. 1中的多肽。

在第二方面，本发明基于的问题通过核酸分子来解决，所述核酸分子包含编码根据第一方面及其实施方案的多肽的核苷酸序列。

在第二方面的第一个实施方案中，所述问题通过核酸分子来解决，其是显示于SEQ ID No. 2中的核苷酸序列。

在第三方面，本发明基于的问题通过载体来解决，所述载体包含根据第二方面及其实施方案的核酸分子。

在第四方面，本发明基于的问题通过细胞来解决，所述细胞包含根据第一方面的多肽、根据第二方面的核酸分子或第三方面及各个实施方案的载体。

在第四方面的第一个实施方案中，所述问题通过细胞来解决，所述细胞此外表达NADP⁺依赖性醇脱氢酶。

在第四方面的第二个实施方案中，其也是第一方面的一个实施方案，所述问题通过根据第四方面或第四方面的第一个实施方案的细胞来解决，所述细胞此外表达氨基转移酶。

在第四方面，本发明基于的问题通过用于产生丙氨酸或化合物（通过丙氨酸消耗生成）的方法来解决，所述方法包括以下步骤：

c) 通过将丙酮酸与根据第一方面的多肽或与根据第二方面或各个实施方案之一的细胞接触来使丙酮酸与铵和NADPH反应以生成丙氨酸。

在第四方面的第一个实施方案中，所述问题通过方法来解决，所述方法进一步包括

a) 通过在NADP⁺存在的情况下与NADP⁺依赖性醇脱氢酶接触而使伯醇或仲醇反应以产生醛或酮。

在第四方面的第二个实施方案中，其也是第一方面的一个实施方案，所述问题通过方法来解决，所述方法此外包括

b) 通过在丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触而使步骤a）中制备的醛或酮反应以产生胺。

在第四方面的第三个实施方案中，其也是第一至第二方面的一个实施方案，所述问题通过方法来解决，其中步骤a）、b）和c）在相同的反应混合物中进行，优选同时进行。

在第三或第四方面的进一步的实施方案中或在第三或第四方面的一个实施方案中，所述问题通过细胞或通过方法来解决，其中所述细胞胞内定位表达所有来自包含权利要求1-5之一的多肽的组的酶、NADP⁺依赖性醇脱氢酶和氨基转移酶。

在第三或第四方面的进一步的实施方案中或在第三或第四方面的一个实施方案中，所述问题通过细胞或通过方法来解决，其中NADP⁺依赖性醇脱氢酶为选自来自大肠杆菌的醇脱氢酶(YjgB, 数据库编号ZP_07117674, 和YahK, 数据库编号BAE76108.1)和来自青枯菌属种（Ralstonia sp.）的醇脱氢酶(SEQ ID No. 3) 的NADP⁺依赖性醇脱氢酶，优选来自青枯菌属种的醇脱氢酶(SEQ ID No. 5)，或其变体。

在第三或第四方面的进一步的实施方案中或在第三或第四方面的一个实施方案中，所述问题通过细胞或通过方法来解决，其中氨基转移酶是选自以下的氨基转移酶：来自青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）(数据库编号NP_901695)、恶臭假单胞菌(数据库编号YP_001668026.1或YP_001671460)和类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）(菌株ATCC 17023; 数据库编号YP_353455)的氨基转移酶及其变体，优选来自青紫色素杆菌的氨基转移酶(数据库编号NP_901695)。

本发明基于发明人令人惊奇的发现，即包含醇脱氢酶优选NADP⁺依赖性醇脱氢酶、氨基转移酶和含有枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体的多肽（其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸）的酶系统可以用于以氧化还原中性方式催化醇的胺化。

此外，本发明基于发明人令人惊奇的发现，即多肽（其包含枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列）对于NADPH的亲和力可以通过如下而得到提高：Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸被交换为具有带正电的侧链的氨基酸，而酶保持催化活性且能够以高酶变率催化反应。

本发明涉及多肽，其包含枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体，其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸。该多肽显示于序列表中SEQ ID No. 1下。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的措辞“丙氨酸脱氢酶”应理解为表示有酶活性的多肽，其催化丙酮酸同时消耗铵和NADH或NADPH，优选NADPH而转化为丙氨酸和NAD⁺或NADP⁺，优选NADP⁺。枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列以及本申请中通过说明数据库编号来指定的其他分子的序列或序列可见于NCBI数据库中2012年4月1日在线版本中的数据库编号L20916下。

然而，本发明的教导不仅可通过使用精确的氨基酸或核酸序列或施加至本文描述的生物大分子的精确的氨基酸或核酸序列（例如数据库编号L20916下的丙氨酸脱氢酶）来进行，还可以使用或施加至可以通过一个或多于一个氨基酸或核酸的缺失、添加或取代来获得的此类大分子的变体来进行。在一个优选的实施方案中，如本文上下文中所用的措辞核酸序列或氨基酸序列的“变体”（其在下文中与措辞“同源物”同义且可交换使用）意指一条不同的核酸或氨基酸序列，其相对于对应的原始野生型核酸序列或野生型氨基酸序列，具有70、75、80、85、90、92、94、96、98、99%或更高百分比的同源性（本文与同一性同义使用），其中优选除形成催化活性中心的氨基酸或除对于结构或折叠必需的氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代，或者后者仅保守取代，例如谷氨酸被取代为天冬氨酸或亮氨酸被取代为缬氨酸。现有技术描述了可用于计算两条序列同源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版。在本发明进一步更优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体，优选除上述序列同源性之外，具有与野生型分子和原始分子基本上相同的酶活性。例如，具有丙氨酸脱氢酶的酶活性的多肽的变体具有相同或基本上相同的蛋白水解活性，即能够催化丙酮酸、铵和NAD(P)H（优选NADPH）转化为丙氨酸。在一个具体的实施方案中，措辞“基本上相同的酶活性”表示关于野生型多肽的底物的活性，其显著高于背景活性和/或与野生型多肽关于相同底物的K_M和/或k_cat值差别为少于3、更优选2、甚至更优选1个数量级。在进一步优选的实施方案中，措辞核酸或氨基酸序列的“变体”包括核酸或氨基酸序列的至少一个活性部分或片段。在进一步优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“活性部分”表示氨基酸序列或核酸序列，其比氨基酸序列全长短，或其编码比氨基酸序列全长短的长度，其中比野生型氨基酸序列长度短的氨基酸序列或编码的氨基酸序列具有基本上与野生型多肽或其变体相同的酶活性。在一个具体的实施方案中，措辞核酸的“变体”包括其互补链将优选在严格条件下与野生型核酸结合的核酸。杂交反应的严格性可以由本领域技术人员容易地确定，并通常依赖于探针的长度、洗涤过程中的温度和盐浓度。通常，更长的探针需要更高的杂交温度，而更短的探针在低的温度下操作。杂交是否发生通常依赖于变性DNA与其环境中存在的互补链退火的能力，更确切地在低于解链温度下进行退火的能力。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述于Ausubel等1995。关于借助于杂交鉴定DNA序列的信息可由本领域技术人员尤其在来自Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)的教科书“The DIG System Users Guide for Filter Hybridization”和在Liebl等人(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))中发现。在一个优选的实施方案中，杂交在严格条件下发生，换言之，仅产生其中探针与靶序列（即，用探针处理的多核苷酸）具有至少70％同一性的杂化物。已知杂交的严格性（包括洗涤步骤）受改变缓冲液组成、温度及盐浓度所影响或由其确定。通常，相比于洗涤步骤，杂交反应在相对低的严格性下进行(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996)。例如，对于杂交反应，可以利用在约50℃–68℃的温度下对应于5 x SSC缓冲液的缓冲液。在此，探针还可以与对探针序列具有低于70％同一性的多核苷酸杂交。此类杂交物是更不稳定的，并且在严格条件下通过洗涤而去除。严格洗涤条件可以通过例如降低盐浓度至2x SSC且任选随后至0.5x SSC来实现(The DIG System User′s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995)，其中建立约50℃–68℃、约52℃–68℃、约54℃–68℃、约 56℃–68℃、约58℃–68℃、约60℃–68℃、约62℃–68℃、约64℃–68℃、约66℃–68℃的温度，这是渐增的优选次序。优选约64℃–68℃或约66℃–68℃的温度范围。任选地，可以降低盐浓度至对应于0.2 x SSC或0.1 x SSC的浓度。通过以1-2℃的步骤将杂交温度从50℃至68℃逐步提高，可以分离多核苷酸片段，例如其与使用的核酸分子序列具有至少70％或至少80％或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性，这是渐增的优选次序。关于杂交的进一步说明可以以所谓的“试剂盒”的形式商购可得(例如来自Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 的DIG Easy Hyb，目录号1603558)。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用，措辞核酸的“变体”包含编码与原始核酸相同的氨基酸序列的或在遗传密码简并性的范围内的该氨基酸序列的变体的任何核酸序列。

为了进行本发明的教导，需要的是使用的枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶不包含酶的野生型序列，而是包含其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸的序列。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的措辞“同源位置”表示当进行所研究的分子的比对时，对应位置呈现为对枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列的位置X的同源物。本领域技术人员熟知大量软件包和算法，借助其可以建立氨基酸序列的比对。软件包方法的实例包括由EMBL提供的ClustalW软件包(Larkin等人, 2007; Goujon等人2010)或说明且描述于Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 第3版。在一个优选的实施方案中，措辞“氨基酸”或“丙氨酸”理解为分别表示产生蛋白质的(proteinogenic)L-氨基酸或L-丙氨酸，即自然界中由生物普遍用于合成多肽的氨基酸。措辞“氨基酸”还包括对应化合物的所有晶体形式、盐形式或类似形式，这如同本申请中提及的所有化合物。例如，组氨酸还包括质子化组氨酸和氯离子的盐。

对于丙氨酸脱氢酶活性必要的是催化的反应的起始材料尤其是无机氮来源以足量存在。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的措辞“无机氮来源”理解为表示含无机氮的盐，其包括铵或其可以在细胞代谢中转化为铵。实例包括氯化铵、硝酸铵、硫酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、碳酸铵等。在一个优选的实施方案中，培养基中的铵浓度为0.05-5，更优选0.1-3，最优选0.5-3 g/l。细胞的无机氮来源优选根据本发明通过添加足量的相应化合物至反应进行的水相中来提供。

具有带正电的侧链的氨基酸包括氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸，优选精氨酸和赖氨酸，最优选精氨酸。可以的根据本发明的多肽包括例如突变Leu197Arg、Leu197Lys和Leu197His。在一个优选的实施方案中，本发明的教导明确地还包含来自除枯草芽孢杆菌以外的生物的丙氨酸脱氢酶，只要它们属于枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶的变体组。

在进一步优选的实施方案中，本发明的教导还包含多肽，其除了在Leu197位置的上述交换外，还包括在位置Asp196或在与其同源的位置上的进一步的交换，其交换为具有中性或带正电的侧链的氨基酸。在一个优选的实施方案中，具有中性侧链的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺。在一个优选的实施方案中，具有带正电侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸，优选精氨酸和赖氨酸。

根据本发明的核酸分子包括所有未修饰的或修饰的DNA和RNA分子，其包含编码根据本发明的多肽的核酸序列。本领域技术人员熟知分子生物学或合成化学的标准方法，借助于所述方法可以制备此类核酸分子，例如借助聚合酶链式反应或固相合成。在一个优选的实施方案中，核酸分子是包含或为SEQ ID No. 2中显示的核苷酸序列的核酸分子。

本发明的教导可以不仅使用根据本发明的分离的多肽、核酸分子或载体进行，还可以使用根据本发明的细胞作为全细胞催化剂来进行。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“全细胞催化剂”理解为表示完整的、有活力的且代谢上有活性的细胞，其提供了期望的酶活性。全细胞催化剂可以转运待代谢的底物（在本发明的情况下为醇或从其产生的氧化产物）进入细胞内部，在那它被细胞溶胶的酶所代谢，或它可以呈递目标酶在它的表面上，其中它直接暴露于培养基中的底物。本领域技术人员熟知用于制备全细胞催化剂的许多系统，例如来自DE 60216245。在一个尤其优选的实施方案中，细胞胞内（即各个酶在其表达后永久地位于细胞内部，尤其是在细胞的细胞溶胶中或作为膜蛋白或锚定于膜中或投射入细胞的细胞溶胶内的蛋白）表达具有NADPH依赖性丙氨酸脱氢酶活性的根据本发明的多肽、氨基转移酶和/或NADP⁺依赖性醇脱氢酶。

在一个优选的实施方案中，用作全细胞催化剂的细胞或用作表达系统的细胞是原核细胞，优选细菌细胞。在进一步优选的实施方案中，它是哺乳动物细胞。在进一步优选的实施方案中，它是低等真核细胞，优选酵母细胞。原核细胞的实例包括埃希氏菌属（Escherichia），尤其是大肠杆菌（Escherichia coli），和属假单胞菌属（Pseudomonas）和棒杆菌属（Corynebacterium）的菌株。低等真核细胞的实例包括属酵母属（Saccharomyces）、假丝酵母属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、耶罗维亚酵母属（Yarrowia）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces），尤其是菌株热带假丝酵母（Candida tropicalis）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和酿酒酵母（Saccharomycescerivisiae）。

在使用根据本发明的全细胞催化剂的情况下，分子进入全细胞催化剂的内部在一些底物尤其是具有长烷基链的那些的情况下可能限制期望物质的产生。在长链烷及醇的情况下，优选全细胞催化剂包括AlkL多肽。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的“AlkL多肽”为在230个连续氨基酸的长度上与恶臭假单胞菌AlkL（数据库编号CAB69081）具有至少80、优选90、甚至更优选90％序列同一性的多肽和优选具有促进长链烷进入细胞内部的能力的多肽。在进一步的实施方案中，如本上下文所用的“AlkL家族的多肽”是定位于革兰氏阴性细菌的外膜内的多肽，所述多肽具有序列基序DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X是产生蛋白质的氨基酸，并且所述多肽另外优选是恶臭假单胞菌AlkL (数据库编号CAB69081)或其变体。AlkL家族的成员的实例包括来自恶臭假单胞菌的AlkL（数据库编号CAB69081）、来自水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei） VT8的AlkL (数据库编号YP_957722)、来自亚历山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii） HTCC2633的AlkL (数据库编号ZP_00953584)、来自Marinobacter manganoxydans MnI7-9的AlkL (数据库编号ZP_09158756)、来自柄杆菌属种（Caulobacter sp.） K31的AlkL (数据库编号YP_001672217)、来自食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）的AlkL(数据库编号Q00595)及其变体。

然而，根据本发明利用的酶活性多肽，尤其是醇脱氢酶、氨基转移酶和丙氨酸脱氢酶还可以在各种情况下为在整个纯化阶段（从粗裂解物到分离的多肽）的根据本发明的多肽的制备物。细胞可以包含一种或多于一种核酸序列，其编码根据本发明使用的酶，所述核酸序列在质粒上或整合入细胞基因中。本领域技术人员熟知大量方法，借助于所述方法可以在合适细胞中过表达酶活性多肽并进行纯化或分离。因此，本领域技术人员可用的全部表达系统均可用于表达多肽，例如pET或pGEX型载体。适合于纯化的方法是层析方法，例如在组氨酸标签的情况下使用固定的配体（例如镍离子），在与目的蛋白融合的谷胱甘肽-S-转移酶的情况下使用固定的谷胱甘肽，或在含麦芽糖结合蛋白的标签的情况下使用固定的麦芽糖，通过亲和层析纯化标签化的重组蛋白。

使用以分离的形式的本发明的多肽明确地推荐于一系列应用中。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“分离的”表示酶相比于其天然来源以更纯的和/或浓缩的形式存在。在一个优选的实施方案中，当酶是多肽酶并且其总计为多于60、70、80、90或优选95质量％的相应制备物的蛋白含量，则考虑所述酶为分离的。本领域技术人员熟知大量用于测量溶液中蛋白的质量的方法，例如参考SDS-聚丙烯酰胺凝胶上对应的蛋白条带厚度的视觉评估、NMR光谱法或基于质谱的方法。

纯化的酶活性的多肽可以以可溶形式或固定形式来使用。本领域技术人员熟知合适的方法，借助于所述方法多肽可以共价地或非共价地固定于有机或无机固相上，例如通过巯基(Sulphhydryl)偶联化学（例如来自Pierce的试剂盒）。

根据本发明使用的酶优选是重组的酶。在一个优选的实施方案中，如本文上下文中所用的措辞“重组的”理解为表示相应核酸分子不是天然存在的和/或其已使用基因技术方法产生。在一个优选的实施方案中，考虑重组蛋白是其中相应多肽由重组核酸编码的蛋白。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用，将重组细胞理解为表示包括至少一种重组核酸或重组多肽的细胞。本领域技术人员熟知适合于产生重组分子或细胞的方法，例如描述于Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版。

使用本发明的教导的先决条件是存在水相，即含水培养基或反应介质，其适合于至少暂时维持或培养细胞或根据本发明的多肽的活性。本领域技术人员熟知大量含水培养基，其适合于维持或培养细胞，尤其是生物技术上重要的细胞。这些不仅包括完全培养基诸如LB培养基，还包括基本培养基诸如M9培养基和选择培养基，例如具有高盐浓度且因此仅允许嗜盐或至少耐盐生物生长的培养基。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的措辞“水相”理解为表示基于水的反应介质或培养基，其基本上不与疏水性溶剂混溶，且其关于所有相关因素尤其是pH、盐含量和温度是这样的，从而使得其至少暂时维持或促进其中存在的细胞（优选微生物）的生存力。多种生物技术上重要的细胞的温度要求可见于微生物学和分子生物学的教科书中，例如Fuchs/Schlegl, 2008。在一个优选的实施方案中，在接触发生时，含水培养基的pH为4-9，更优选4.5-8.5，最优选6.5-7.5。在进一步优选的实施方案中，温度为5-42℃，更优选15-40℃，最优选20-37℃。

酶的使用需要所有必需底物的存在。例如，丙氨酸脱氢酶的活性需要存在底物铵、合适的还原的氧化还原因子和丙酮酸。此外，酶活性需要合适的水溶液，即这样的溶液，其关于存在的所需的缓冲剂、pH、温度、盐浓度、所需的辅因子或活性促进或活性维持其他多肽的存在和其他相关因子，适合于至少暂时维持酶的活性。选择合适的溶液和酶测试（借助于其可以测定酶的活性）的方法对于本领域技术人员是已知的且描述于现有技术中，例如在Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzyme Kinetics, Portland Press Limited中。

根据本发明，根据本发明的细胞不仅表达修饰的枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶，在一个优选的实施方案中，还表达NADP⁺依赖性醇脱氢酶。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“醇脱氢酶”理解为表示氧化醛或酮以产生对应的伯醇或仲醇或其他醇的酶。实例包括来自大肠杆菌的NADP⁺依赖性醇脱氢酶(YjgB, 数据库编号ZP_07117674, 和YahK, 数据库编号BAE76108.1)和来自青枯菌属种的醇脱氢酶(SEQ ID No. 5)及其各个变体。在一个尤其优选的实施方案中，其是来自青枯菌属种的醇脱氢酶(SEQ ID No. 5)。

根据本发明，根据本发明的细胞不仅表达修饰的枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶和/或NADP⁺依赖性醇脱氢酶，在一个优选的实施方案中，还表达氨基转移酶。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“氨基转移酶”理解为表示这样的酶，其催化氨基从供体分子（优选氨基酸）转移至受体分子（优选酮羧酸）。在一个尤其优选的实施方案中，氨基转移酶选自来自青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）(数据库编号NP_901695)、恶臭假单胞菌(数据库编号YP_001668026)、恶臭假单胞菌(数据库编号YP_001668026.1或YP_001671460)；类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）(菌株ATCC 17023; 数据库编号YP_353455)的ω-氨基转移酶及其变体，并且其优选为来自青紫色素杆菌的氨基转移酶(数据库编号NP_901695)。

在使用至少一种全细胞催化剂的情况下，且如果反应时间延长，应考虑条件与至少一种用作全细胞催化剂的细胞的生存力相容。本领域技术人员可在标准操作（例如Fuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlag）中找到使此类细胞维持活力状态的条件和溶液。

根据本发明的方法可应用于大量的工业上相关的醇。在一个优选的实施方案中，采用ω-羟基羧酸或酯，优选其甲酯的形式，其被氧化并胺化以产生ω-氨基羧酸。在进一步的实施方案中，它是二醇，其被氧化并胺化以产生二胺。在进一步优选的实施方案中，伯醇是羟基烷基胺。碳链的长度在该情况下可变，且x为至少3。优选地，碳链具有多于三个C原子，即x = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。化合物的实例包括ω-羟基月桂酸、ω-羟基月桂酸甲酯、和烷二醇，尤其是1,8-辛二醇和1,10-癸二醇。

其他合适的有α-羟基羧酸，优选可氧化以产生α-酮羧酸的那些，即式R^S-C(OH)H-COOH的那些，其依次可以通过胺化转变为产生蛋白质的氨基酸，其中尤其是必需氨基酸诸如甲硫氨酸和赖氨酸。特定实例包括那些酸，其中R^S为选自H、甲基、-(CH₂)₄-NH₂、(CH₂)₃-NH-NH-NH₂、-CH₂-CH₂-S-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂-CH(CH₃)₂、-CH₂-(1H-吲哚-3-基)、CH(OH)-CH₃、-CH₂-苯基、-CH(CH₃)-CH₂-CH₃的取代基。其他仲醇包含2-烷醇类，例如2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇等。其他合适的有多元仲醇，例如烷二醇类诸如乙二醇，烷三醇类诸如甘油和季戊四醇。其他实例包括环烷醇，优选环己醇和双(对羟基环己基)甲烷、基团H₃C–C(OH)H–(CH₂)_x–R⁴的醇，其中R⁴选自–OH、–SH、–NH₂和–COOR⁵，x为至少3，且R⁵选自H、烷基和芳基。

在式醇H₃C–C(OH)H–(CH₂)_x–R⁴的醇的情况下，碳链长度可变，且x至少为3。优选地，碳链包括多于三个碳原子，即x = 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多。大量仲醇是可商购的且可直接以商购形式使用。或者，仲醇可以经生物技术预先或原地产生，例如通过用合适的烷氧化酶优选单加氧酶将烷羟基化。

在式H₃C–C(OH)H–(CH₂)_x–R⁴的仲醇的情况下，在尤其优选的实施方案中，R⁴选自-OH和–COOR⁵，x为至少11，且R⁵选自H、甲基、乙基和丙基。

伯醇或仲醇尤其优选为糖醇，其如在一个优选的实施方案（诸如本文）中所用，应理解为表示具有至少一个羟基的碳水化合物。在一个尤其优选的实施方案中，它是双环的糖醇。在一个优选的实施方案中，诸如本文，“双环的糖醇”应理解为表示能够形成两个环系统（至少暂时地）的糖醇。在一个最优选的实施方案中，糖醇为双脱水己糖醇或选自1,4:3,6-双脱水-D-甘露醇、1,4:3,6-双脱水-D-山梨醇(异山梨醇)和1,4:3,6-双脱水-L-艾杜糖醇的化合物。

如果根据本发明待转化的醇如此无法获得，而仅以烷前体的形式，则存在根据本发明的细胞另外表达单加氧酶或在根据本发明的方法中扩展其中单加氧酶羟基化烷的步骤的选项。在一个尤其优选的实施方案中，单加氧酶是来自AlkB家族的单加氧酶。AlkB是来自恶臭假单胞菌AlkBGT系统的氧化还原酶，且已知它的羟化酶活性。这依赖于另两个多肽AlkG和AlkT。将AlkT表征为FAD依赖性红素氧还蛋白还原酶，其从NADH向AlkG转移电子。AlkG是红素氧还蛋白，一种含铁的氧化还原蛋白，其作为AlkB的直接电子供体起作用。在一个优选的实施方案中，如本上下文中所用的措辞“来自alkB家族的单加氧酶”理解为表示膜结合的烷羟化酶。在进一步优选的实施方案中，将同一措辞“alkB型的烷羟化酶”理解为表示与恶臭假单胞菌Gpo1的AlkB的序列（数据库代码：CAB54050.1, 本文中所用的该数据库编号及所有其他数据库编号均来自于在2011年11月9日可用释放的NCBI的Genbank蛋白数据库）具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99%（优先渐增）的序列同源性的多肽。如本上下文所用的措辞“序列”可以指多肽的氨基酸序列和/或编码其的核酸序列。

在进一步优选的实施方案中，单加氧酶是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。在一个优选的实施方案中，措辞“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”理解为表示作为3组分系统的部分的细胞溶胶氧化酶，所述3组分系统还包含铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，所述细胞溶胶氧化酶具有烷结合位点和能够羟基化烷。在一个尤其优选的实施方案中，它是与来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)具有至少80，优选90，最优选95或99％的序列同一性的酶，或包含与来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)具有至少80，优选90，最优选95或99％的序列同一性的多肽序列并此外具有烷羟化酶活性的酶。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的措辞“烷羟化酶活性”理解为表示催化烷或包含至少5个、优选12个碳物质基团的未取代的直链烷基的羟基化的能力。在进一步优选的实施方案中，措辞“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”理解为表示非膜结合的氧化酶，其包括对于烷、包含至少5个、优选12个碳物质基团的未取代的直链烷基、或单羟基化的烷的结合位点，并且其多肽链包括基序LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在一个优选的实施方案中，如本上下文所用的“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)或其变体，其优选具有烷羟化酶活性。

本发明包括具有以下多肽（Polyp）-及核苷酸（DNA）序列的序列表：

SEQ ID No.	类型	描述
			1	Polyp	具有Leu197Arg和Asp196Ala的来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶
2	DNA	编码具有Leu197Arg和Asp196Ala的来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列
			3	Polyp	来自大肠杆菌的醇脱氢酶(YjgB, 数据库编号ZP_07117674)
4	Polyp	来自大肠杆菌的醇脱氢酶(YahK, 数据库编号BAE76108.1)
			5	Polyp	来自青枯菌属种的醇脱氢酶(之前SEQ ID 10)
6	Polyp	来自青紫色素杆菌的氨基转移酶 (数据库编号NP_901695)
			7	Polyp	来自恶臭假单胞菌的氨基转移酶(数据库编号YP_001668026)
8	Polyp	来自恶臭假单胞菌的氨基转移酶(数据库编号YP_001668026.1)
			9	Polyp	来自恶臭假单胞菌的氨基转移酶(数据库编号YP_001671460)
10	Polyp	来自类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）的氨基转移酶(菌株ATCC 17023; 数据库编号YP_353455)
			11	DNA	寡脱氧核苷酸AlaDHfw (之前Seq ID 5)
12	DNA	寡脱氧核苷酸AlaDHrv (之前6)
			13	DNA	寡脱氧核苷酸AlaDH_D196A/L197Rfw (之前8)
14	DNA	寡脱氧核苷酸AlaDH_D196A/L197Rrv (之前9)
			15	DNA	寡脱氧核苷酸ADHfw (之前11)
16	DNA	寡脱氧核苷酸ADHrv (之前12)
			17	Polyp	来自脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的氨基转移酶（之前14）
18	DNA	寡脱氧核苷酸pCR6fw (之前15)
			19	DNA	寡脱氧核苷酸pCR6rv (之前16)
20	DNA	寡脱氧核苷酸pCR6_L417Mfw (之前18)
			21	DNA	寡脱氧核苷酸pCR6_L417Mrv (之前19)
22	Polyp	具有Leu197Arg和Asp196Ala及His标签的来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶
			23	DNA	编码具有Leu197Arg和Asp196Ala及His标签的来自枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列

前面的说明书、权利要求和附图中公开的本发明的特征可以以其多种实施方案单独地或以任何组合对于实现本发明是必需的。

图1显示来自枯草芽孢杆菌的AlaDH的同源性模型(白色；SEQ ID No. 1)、来自希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)的AlaDH的同源性模型（灰色）和来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的AlaDH的晶体结构(黑色；PDB编号: 2VHW)的结构叠加。显示的BasAlaDH的氨基酸Asp196对应于SheAlaDH的氨基酸Asp198和MtAlaDH的氨基酸Asp198。BasAlaDH的氨基酸Leu197对应于SheAlaDH的氨基酸Arg199和MtAlaDH的氨基酸Ile198。BasAlaDH的氨基酸Asn198对应于SheAlaDH的氨基酸Ser200和MtAlaDH的氨基酸Asn200。

图2显示如由三种酶RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化的异山梨醇和铵盐反应96小时后的FMOC/HPLC分析。显示以下内容：（a）标准品（在每种情况下如图3中显示1 mM的氨基醇I、II、III和IV + 在每种情况下1 mM的二胺DAI、DAS和DAM），（b）96小时后由RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化的反应，（c）在96小时后如（b）中的对照反应，但无RasADH。为了衍生化，将20 μl的各种反应样品转移入含有60 μl的0.5 M硼酸钠pH9.0的HPLC小瓶中，将样品充分混合，并加入80 μl的FMOC试剂(Alltech Grom)。通过加入100 μl的EVA试剂(Alltech Grom)俘获过量的FMOC试剂。通过添加440 μl的50 mM乙酸钠, pH 4.2 + 70%乙腈(v/v)建立HPLC分析的条件。层析条件：Agilent SB-C8柱(4.6 × 150 mm); 流速:1 ml/min; 注射体积:20 μl; 缓冲液A:50 mM乙酸钠pH 4.2 + 20% 乙腈(v/v); 缓冲液B:50 mM乙酸钠pH 4.2 + 95% 乙腈(v/v); 梯度:0 min 16% B, 5 min 16% B, 25 min 18% B, 28 min 52% B, 40 min 25% B。

图3显示起始底物异山梨醇(1,4:3,6-双脱水-D-山梨醇)、氨基醇（I至IV）的立体异构体和二胺终产物(DAI: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-L-艾杜糖醇, DAS: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-D-山梨醇和DAM: 2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-D-甘露醇)的立体异构形式的化学式。

图4显示如由RasADH、pCR6(L417M)和AlaDH(D196A/L197R)催化的异山梨醇和不同铵浓度的乙酸铵反应的FMOC/HPLC分析的单胺和二胺产量。反应条件：300 mM异山梨醇, 2 mM NADP⁺, 100–300 mM NH₄OAc, 5 mM L-丙氨酸, 0.3 mM PLP, 132 μM RasADH, 40 μM pCR6(L417M), 24 μM AlaDH(D196A/L197R)于25 mM Hepes/NaOH, pH 8.3中; 在30℃下孵育。

实施例1：使用生物信息学分析和蛋白质工程修饰丙氨酸脱氢酶的共底物特异性

借助于服务器HHpred (Bioinformatics Toolkit; MPI Tübingen)鉴定来自枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶(AlaDH) (BasAlaDH; SEQ ID No. 1)的结构同源物。使用HHBlits (Bioinformatics Toolkit; MPI Tübingen; URL: http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred)在三重复中并使用激活的“二级结构评分”产生全局多序列比对（MSA）。最相似的蛋白（51％序列同一性）证实为来自结核分枝杆菌的AlaDH(MtAlaDH)。该AlaDH的晶体结构(PDB编号: 2VHW、2VHX、2VHY和2VHZ)用作通过HHpred服务器产生BasAlaDH和来自希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)的AlaDH (SheAlaDH)的同源性模型的结构模板（图1）。

与来自枯草芽孢杆菌的酶一样，MtAlaDH具有对NADH的氧化还原因子特异性，而SheAlaDH作为唯一已知的AlaDH能够酶促转化NADH和NADPH两者(Ashida等人(2004) J. Mol. Catal. B: Enzym. 30, 173-176)。BasAlaDH和SheAlaDH与MtAlaDH参考结构的同源性模型结构叠加使用程序Chimera来计算(版本1.5.3; URL:http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ 使用功能“Matchmaker”; URL http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/docs/ContributedSoftware/matchmaker/matchmaker.html) (图1)。使用Blossum-62模板的Needleman-Wunsch算法用于该目的，且“二级结构评分”设定为30％。所用的重复终止为成对原子之间1.0 ?的距离。

提及的三种AlaDH的结构叠加显示在“Rossmann折叠”基序邻近处的保守的天冬氨酸残基，该残基明显负责NADH特异性(SEQ ID No. 1中的Asp196；参见图1)。

保守的天冬氨酸残基是构建BasAlaDH酶变体D196A/L197R的起点，其中用SheAlaDH结构作为模板。如由结构叠加所示（图1），D196A取代阻止从Asp196与NADH核糖的2’-OH和3’-OH形成氢键，但可以使得NADPH磷酸（位于核糖的2'-OH）结合酶。作为取代L197R的结果，进一步有利于新的共底物特异性，其作为引入的精氨酸残基与NADPH磷酸基团之间的盐键形成的结果。

枯草芽孢杆菌AlaDH (SEQ ID No. 4)的基因通过聚合酶链式反应（PCR）使用寡脱氧核苷酸AlaDHfw (SEQ ID No. 11)和AlaDHrv (SEQ ID No. 12)从质粒pUC18-AlaDH扩增，在3'端使用限制性内切酶KpnI切割并连接已用限制性内切酶EheI和KpnI切割的表达载体pASK-IBA35(+) (IBA GmbH, G?ttingen)。所得的表达质粒pASK-IBA35(+)-AlaDH（其上编码具有N末端His₆-标签的BasAlaDH）通过分析性限制酶消化和DNA测序来验证。编码酶变体D196A/L197R的质粒通过基因定点诱变使用寡脱氧核苷酸AlaDH_D196A/L197Rfw (SEQ ID No. 13)和AlaDH_D196A/L197Rrv (SEQ ID No. 14)根据QuikChange方法来产生。所得的表达质粒pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)通过DNA测序验证。

BasAlaDH及其变体D196A/L197R的表达质粒随后用于转化大肠杆菌BL21 (Sambrook等人(2001) Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press)。在每种情况下在具有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(Sambrook等人 2001)(在5-l摇瓶中的2L培养体积)中在30℃下在指数生长期OD₅₅₀ = 0.5时通过添加0.2 μg/ml无水四环素(aTc; Acros, Geel, Belgium)来诱导基因表达。3小时的诱导时间后，收获培养物，并将细胞收纳在40 mM Hepes/NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl中，并在弗氏细胞均化器(French press homogenizer) (G. Heinemann, Schw?bisch Gmünd)中机械破碎。将澄清的上清液施加到装载有Zn²⁺ 的Chelating Sepharose? Fast Flow柱(柱床体积2.8 ml; GE Healthcare, Munich)，并使用在40 mM Hepes/NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl中0-500 mM的线性咪唑/HCl浓度梯度洗脱融合His₆-标签的酶。将洗脱级分通过超滤浓缩并借助于在Superdex200 (GE Healthcare)上在25 mM Hepes/NaOH pH 8.3存在的情况下的凝胶过滤进行层析纯化。

两种纯化的酶对共底物NADH和NADPH的米氏常数(K_M)和酶变率(k_cat)用丙酮酸的还原性胺化进行测定，并计算催化效率(k_cat/K_M)（表1）。酶测定构成如下：

试剂或酶	混合物中的终浓度
		丙酮酸	5 mM
乙酸铵	200 mM
		NADH/H⁺或NADPH/H⁺	10 – 500 μM
BasAlaDH (野生型或双突变体D196A/L197R)	0.5 nM
		Hepes/NaOH缓冲液 pH 8.3	25 mM
总体积	250 μl

在此，发现取代D196A和L197R成功地修饰了BasAlaDH对NADH至NADPH的共底物特异性，而关于丙酮酸的还原性胺化的催化效率几乎保持不变。

表1：使用NADH或NADPH的丙酮酸的BasAlaDH催化的还原性胺化的K_M和k_cat值

实施例2：通过醇脱氢酶、氨基转移酶和丙氨酸脱氢酶的成对酶反应从异山梨醇和铵盐合成单胺和二胺

借助于PCR使用寡脱氧核苷酸ADHfw (SEQ ID No. 15)和ADHrv (SEQ ID No. 16)从质粒pEam-RasADH (Lavandera等人 (2008) J. Org. Chem. 73, 6003-6005)扩增来自青枯菌属种的醇脱氢酶(SEQ ID No. 5)的结构基因，在3'端使用限制性内切酶KpnI切割并最终连接已用限制性内切酶EheI和KpnI切割的表达载体pASK-IBA35(+)。所得的表达质粒pASK-IBA35(+)-RasADH（其上编码具有N末端His₆-标签的醇脱氢酶）通过分析性限制酶消化和DNA测序来验证。

借助于PCR使用寡脱氧核苷酸pCR6fw (SEQ ID No. 18)和pCR6rv (SEQ ID No. 19)从质粒pET21a(+)-pCR6扩增来自脱氮副球菌的氨基转移酶(SEQ ID No. 17)的基因，在3'端使用限制性内切酶HindIII切割并最终连接已用限制性内切酶EheI和HindIII切割的表达载体pASK-IBA35(+)。所得的表达质粒pASK-IBA35(+)-pCR6（其上编码具有N末端His₆-标签的氨基转移酶）通过分析性限制酶消化和DNA测序来验证。编码氨基转移酶的酶变体L417M的质粒根据QuikChange方法(Agilent, Waldbronn)使用寡脱氧核苷酸pCR6_L417Mfw (SEQ ID No. 20)和pCR6_L417Mrv (SEQ ID No. 21)通过质粒pASK-IBA35(+)-pCR6的基因定点诱变来产生。所得的表达质粒pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)通过DNA测序验证。

用于来自枯草芽孢杆菌的AlaDH (SEQ ID No. 1)的D196A/L197R突变体的表达质粒为来自实施例1的pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)。

三种酶的表达质粒pASK-IBA35(+)-RasADH、pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M)和pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R)的每一种随后用于转化大肠杆菌BL21。在三种所获得的菌株中的基因表达在每种情况下在含100 □g/ml氨苄青霉素(在5-l摇瓶中的2l培养体积)的LB培养基中在30℃下在指数生长期OD₅₅₀ = 0.5时通过添加0.2 μg/ml aTc来诱导。3小时的诱导时间后，收获培养物，并将细胞收纳在40 mM Hepes/NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl中，并在弗氏细胞均化器中机械破碎。将澄清的上清液施加到装载有Zn²⁺的Chelating Sepharose? Fast Flow柱，并使用在40 mM Hepes/NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl中0-500 mM的线性咪唑/HCl浓度梯度洗脱融合His6-标签的酶。将洗脱级分通过超滤浓缩并借助于在Superdex200上在25 mM Hepes/NaOH pH 8.3存在的情况下的凝胶过滤进行层析纯化。

三种纯化的酶直接用于异山梨醇(1,4:3,6-双脱水-D-山梨醇)的胺化，且循环使用氧化还原因子NADP⁺和L-丙氨酸。酶测定构成如下：

试剂或酶	混合物中的终浓度
		Hepes/NaOH缓冲液 pH 8.3	25 mM
异山梨醇	300 mM
		NADP⁺	2 mM
L-丙氨酸	5 mM
		磷酸吡哆醛(PLP)	0.3 mM
乙酸铵(NH₄OAc)	100 – 300 mM
		醇脱氢酶	132 μM
氨基转移酶(L417M)	40 μM
		丙氨酸脱氢酶(D196A/L197R)	24 μM
总体积	250 μl

在30℃下0-96 h的孵育后，通过添加过量的FMOC试剂(Alltech Grom, Rottenburg-Hailfingen；参见图1)借助于HPLC (Agilent 1200系列；参见图2)利用荧光检测器来检测并定量测定作为反应产物的单胺和二胺的形成。

图2（中心）显示反应混合物的分离的色谱图。在15.113 min、15.720 min、16.580和14.472 min的保留时间，观察到产物峰，其根据包括的标准品可以被指定为以如图3中显示的4种可能的立体异构形式的6-氨基-3-醇 (IV:3S,6S; III:3R,6R; I:3S,6R; II:3R,6S)。这些峰在阴性对照（类似设置和孵育的反应混合物，但无醇脱氢酶）的FMOC/HPLC分析中未观察到。此外，在96 h的反应时间后，在37.479 min和38.135 min的保留时间观察到进一步的产物峰。借助标准品，它们可以指定为二胺2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-L-艾杜糖醇(DAI)和2,5-二氨基-1,4:3,6-双脱水-2,5-双脱氧-D-山梨醇(DAS)。

因此，偶联三种酶反应可以使得异山梨醇向作为主要产物的(3S,6S)-6-氨基-3-醇的净转化率对NADP⁺的再循环因子为30和对L-丙氨酸的再循环因子为12（图4）。

序列表

<110> Evonik Industries AG

<120> NADP依赖性丙氨酸脱氢酶

<130> 201200079

<160> 23

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 1

Met Ile Ile Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Leu Thr Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg

20 25 30

Val Leu Val Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu

35 40 45

Ala Tyr Glu Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val

50 55 60

Trp Asp Ala Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu

65 70 75 80

Tyr Val Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr

100 105 110

Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu

115 120 125

Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala

130 135 140

Gln Phe Leu Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly

145 150 155 160

Val Pro Gly Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val

165 170 175

Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val

180 185 190

Thr Ile Ile Ala Arg Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile

195 200 205

Phe Gly His Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala

210 215 220

Asp Ala Val Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro

225 230 235 240

Gly Ala Lys Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met

245 250 255

Lys Pro Gly Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile

260 265 270

Val Glu Thr Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu

275 280 285

Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val

290 295 300

Pro Arg Thr Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala

305 310 315 320

Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr

325 330 335

Ala Leu Arg Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu

340 345 350

Ala Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala

355 360 365

Leu Gln Asp Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala

370 375

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 2

atgatcatag gggttcctaa agagataaaa aacaatgaaa accgtgtcgc attaacaccc 60

gggggcgttt ctcagctcat ttcaaacggc caccgggtgc tggttgaaac aggcgcgggc 120

cttggaagcg gatttgaaaa tgaagcctat gagtcagcag gagcggaaat cattgctgat 180

ccgaagcagg tctgggacgc cgaaatggtc atgaaagtaa aagaaccgct gccggaagaa 240

tatgtttatt ttcgcaaagg acttgtgctg tttacgtacc ttcatttagc agctgagcct 300

gagcttgcac aggccttgaa ggataaagga gtaactgcca tcgcatatga aacggtcagt 360

gaaggccgga cattgcctct tctgacgcca atgtcagagg ttgcgggcag aatggcagcg 420

caaatcggcg ctcaattctt agaaaagcct aaaggcggaa aaggcattct gcttgccggg 480

gtgcctggcg tttcccgcgg aaaagtaaca attatcggag gaggcgttgt cgggacaaac 540

gcggcgaaaa tggctgtcgg cctcggtgca gatgtgacga tcattgcccg taacgcagac 600

cgcttgcgcc agcttgatga catcttcggc catcagatta aaacgttaat ttctaatccg 660

gtcaatattg ctgatgctgt ggcggaagcg gatctcctca tttgcgcggt attaattccg 720

ggtgctaaag ctccgactct tgtcactgag gaaatggtaa aacaaatgaa acccggttca 780

gttattgttg atgtagcgat cgaccaaggc ggcatcgtcg aaactgtcga ccatatcaca 840

acacatgatc agccaacata tgaaaaacac ggggttgtgc attatgctgt agcgaacatg 900

ccaggcgcag tccctcgtac atcaacaatc gccctgacta acgttactgt tccatacgcg 960

ctgcaaatcg cgaacaaagg ggcagtaaaa gcgctcgcag acaatacggc actgagagcg 1020

ggtttaaaca ccgcaaacgg acacgtgacc tatgaagctg tagcaagaga tctaggctat 1080

gagtatgttc ctgccgagaa agctttacag gatgaatcat ctgtggcggg tgcttaa 1137

<210> 3

<211> 353

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 3

Met Leu Tyr Thr Ser Gln Thr Thr Pro Glu Lys Asp Gln Lys Met Ser

1 5 10 15

Met Ile Lys Ser Tyr Ala Ala Lys Glu Ala Gly Gly Glu Leu Glu Val

20 25 30

Tyr Glu Tyr Asp Pro Gly Glu Leu Arg Pro Gln Asp Val Glu Val Gln

35 40 45

Val Asp Tyr Cys Gly Ile Cys His Ser Asp Leu Ser Met Ile Asp Asn

50 55 60

Glu Trp Gly Phe Ser Gln Tyr Pro Leu Val Ala Gly His Glu Val Ile

65 70 75 80

Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Ser Ala Ala Gln Asp Lys Gly Leu Gln

85 90 95

Val Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Arg Ser Cys Gly His

100 105 110

Cys Asp Ala Cys Ile Ser Gly Asn Gln Ile Asn Cys Glu Gln Gly Ala

115 120 125

Val Pro Thr Ile Met Asn Arg Gly Gly Phe Ala Glu Lys Leu Arg Ala

130 135 140

Asp Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Glu Asn Ile Asp Ile Glu Ser

145 150 155 160

Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr Val Phe Lys Pro Leu Leu

165 170 175

Met His His Ile Thr Ala Thr Ser Arg Val Gly Val Ile Gly Ile Gly

180 185 190

Gly Leu Gly His Ile Ala Ile Lys Leu Leu His Ala Met Gly Cys Glu

195 200 205

Val Thr Ala Phe Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Gln Glu Val Leu Ala

210 215 220

Met Gly Ala Asp Lys Val Val Asn Ser Arg Asp Pro Gln Ala Leu Lys

225 230 235 240

Ala Leu Ala Gly Gln Phe Asp Leu Ile Ile Asn Thr Val Asn Val Ser

245 250 255

Leu Asp Trp Gln Pro Tyr Phe Glu Ala Leu Thr Tyr Gly Gly Asn Phe

260 265 270

His Thr Val Gly Ala Val Leu Thr Pro Leu Ser Val Pro Ala Phe Thr

275 280 285

Leu Ile Ala Gly Asp Arg Ser Val Ser Gly Ser Ala Thr Gly Thr Pro

290 295 300

Tyr Glu Leu Arg Lys Leu Met Arg Phe Ala Ala Arg Ser Lys Val Ala

305 310 315 320

Pro Thr Thr Glu Leu Phe Pro Met Ser Lys Ile Asn Asp Ala Ile Gln

325 330 335

His Val Arg Asp Gly Lys Ala Arg Tyr Arg Val Val Leu Lys Ala Asp

340 345 350

Phe

<210> 4

<211> 349

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 4

Met Lys Ile Lys Ala Val Gly Ala Tyr Ser Ala Lys Gln Pro Leu Glu

1 5 10 15

Pro Met Asp Ile Thr Arg Arg Glu Pro Gly Pro Asn Asp Val Lys Ile

20 25 30

Glu Ile Ala Tyr Cys Gly Val Cys His Ser Asp Leu His Gln Val Arg

35 40 45

Ser Glu Trp Ala Gly Thr Val Tyr Pro Cys Val Pro Gly His Glu Ile

50 55 60

Val Gly Arg Val Val Ala Val Gly Asp Gln Val Glu Lys Tyr Ala Pro

65 70 75 80

Gly Asp Leu Val Gly Val Gly Cys Ile Val Asp Ser Cys Lys His Cys

85 90 95

Glu Glu Cys Glu Asp Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Asp His Met Thr Gly

100 105 110

Thr Tyr Asn Ser Pro Thr Pro Asp Glu Pro Gly His Thr Leu Gly Gly

115 120 125

Tyr Ser Gln Gln Ile Val Val His Glu Arg Tyr Val Leu Arg Ile Arg

130 135 140

His Pro Gln Glu Gln Leu Ala Ala Val Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly

145 150 155 160

Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Arg His Trp Gln Ala Gly Pro Gly Lys

165 170 175

Lys Val Gly Val Val Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Met Gly Ile Lys

180 185 190

Leu Ala His Ala Met Gly Ala His Val Val Ala Phe Thr Thr Ser Glu

195 200 205

Ala Lys Arg Glu Ala Ala Lys Ala Leu Gly Ala Asp Glu Val Val Asn

210 215 220

Ser Arg Asn Ala Asp Glu Met Ala Ala His Leu Lys Ser Phe Asp Phe

225 230 235 240

Ile Leu Asn Thr Val Ala Ala Pro His Asn Leu Asp Asp Phe Thr Thr

245 250 255

Leu Leu Lys Arg Asp Gly Thr Met Thr Leu Val Gly Ala Pro Ala Thr

260 265 270

Pro His Lys Ser Pro Glu Val Phe Asn Leu Ile Met Lys Arg Arg Ala

275 280 285

Ile Ala Gly Ser Met Ile Gly Gly Ile Pro Glu Thr Gln Glu Met Leu

290 295 300

Asp Phe Cys Ala Glu His Gly Ile Val Ala Asp Ile Glu Met Ile Arg

305 310 315 320

Ala Asp Gln Ile Asn Glu Ala Tyr Glu Arg Met Leu Arg Gly Asp Val

325 330 335

Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Asn Arg Thr Leu Thr Asp

340 345

<210> 5

<211> 789

<212> DNA

<213> 青枯菌属种（Ralstonia sp.）

<400> 5

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg cctatcgact attaaacaaa 60

acagccgtca taaccggtgg aaacagcggc attggcctcg ccacagcgaa gcgcttcgtt 120

gccgagggtg cctatgtatt cattgtcggt cgccggcgga aggaactcga gcaggcggcc 180

gcagaaatcg gtcggaatgt cacggcggtc aaagccgatg tgacaaagct tgaagacctg 240

gaccgacttt acgcgattgt gcgtgagcaa cggggtagca tcgacgtact atttgcgaat 300

tccggcgcaa tcgagcaaaa gacgcttgag gagattactc cggaacacta tgacaggact 360

ttcgatgtca acgttcgggg attgatcttc accgtgcaga aggcacttcc tctgctgcga 420

gacggcggca gcgtgatcct gacaagctcg gtagccggcg tcctaggatt acaggcgcac 480

gacacgtata gtgccgccaa ggcagcggta aggtcgctcg cgaggacatg gaccactgag 540

ttgaaaggtc gcagcattcg tgtcaacgcg gtaagcccag gggcgatcga cacgcctatc 600

atagaaaacc aggtctctac acaggaagaa gctgacgagc tgcgtgcgaa atttgcagct 660

gcgacgcccc tgggtcgcgt cggacgacct gaagagctgg cagcggccgt gttatttctt 720

gcatcggacg acagtagcta cgtagccggc attgagctgt ttgtggacgg tggattgacc 780

caggtctaa 789

<210> 6

<211> 459

<212> PRT

<213> 青紫色素杆菌ATCC 12472

<400> 6

Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu

195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

385 390 395 400

Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg

405 410 415

Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg

420 425 430

Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu

435 440 445

Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala

450 455

<210> 7

<211> 452

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 7

Met Ser Glu Gln Asn Ser Gln Thr Gln Ala Trp Gln Ala Leu Ser Arg

1 5 10 15

Asp His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Val Lys Gln Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Ser Ala Lys Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala Ser Gln Gln Met

65 70 75 80

Lys Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Lys Asn Lys

130 135 140

Asn Val Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ala Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Gln Gln Gly Gly Val

165 170 175

Ile Pro Asp Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu Gly

180 185 190

Gly Asp Met Thr Glu Ala Asp Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln Leu

195 200 205

Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Val Asp Asn Val Ala Ala Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Gln Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Leu Phe

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly Thr Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg Asp

290 295 300

Glu Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn Leu

325 330 335

Arg Ile Leu Arg Asp Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val His Asp Lys Thr

340 345 350

Ala Pro Tyr Leu Gln Gln Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asp His Pro Leu

355 360 365

Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu Val

370 375 380

Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ala Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly Met

385 390 395 400

Ile Cys Arg Gln His Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala Val

405 410 415

Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Val Glu Glu

420 425 430

Ile Asp Glu Leu Val Gln Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr Tyr

435 440 445

Glu Ala Val Arg

450

<210> 8

<211> 452

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 8

Met Ser Glu Gln Asn Ser Gln Thr Gln Ala Trp Gln Ala Leu Ser Arg

1 5 10 15

Asp His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Val Lys Gln Leu Ala Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Ser Ala Lys Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala Ser Gln Gln Met

65 70 75 80

Lys Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Lys Asn Lys

130 135 140

Asn Val Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Val Ala

145 150 155 160

Gly Ala Ala Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Gln Gln Gly Gly Val

165 170 175

Ile Pro Asp Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu Gly

180 185 190

Gly Asp Met Thr Glu Ala Asp Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln Leu

195 200 205

Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Val Asp Asn Val Ala Ala Phe Ile

210 215 220

Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Gln Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Arg Tyr Asp Ile Leu Phe

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly Thr Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg Asp

290 295 300

Glu Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn Leu

325 330 335

Arg Ile Leu Arg Asp Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val His Asp Lys Thr

340 345 350

Ala Pro Tyr Leu Gln Gln Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asp His Pro Leu

355 360 365

Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu Val

370 375 380

Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ala Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly Met

385 390 395 400

Ile Cys Arg Gln His Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala Val

405 410 415

Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser Val Glu Glu

420 425 430

Ile Asp Glu Leu Val Gln Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr Tyr

435 440 445

Glu Ala Val Arg

450

<210> 9

<211> 453

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌

<400> 9

Met Ser Val Asn Asn Pro Gln Thr Arg Glu Trp Gln Thr Leu Ser Gly

1 5 10 15

Glu His His Leu Ala Pro Phe Ser Asp Tyr Lys Gln Leu Lys Glu Lys

20 25 30

Gly Pro Arg Ile Ile Thr Lys Ala Gln Gly Val His Leu Trp Asp Ser

35 40 45

Glu Gly His Lys Ile Leu Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Ala

50 55 60

Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Glu Lys Gln Met

65 70 75 80

Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His Pro Pro

85 90 95

Ala Leu Glu Leu Ala Lys Ala Ile Thr Asp Val Ala Pro Gln Gly Met

100 105 110

Thr His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Gly Asn Asp Thr Val

115 120 125

Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Leu Lys Gly Lys Pro His Lys

130 135 140

Gln Thr Ile Ile Gly Arg Ile Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Phe Ala

145 150 155 160

Gly Ala Cys Leu Gly Gly Met Ser Gly Met His Glu Gln Gly Gly Leu

165 170 175

Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Pro Gln Pro Tyr Trp Phe Gly Glu

180 185 190

Gly Gly Asp Met Thr Pro Asp Ala Phe Gly Val Trp Ala Ala Glu Gln

195 200 205

Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Asp Asn Val Ala Ala Phe

210 215 220

Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Ile Pro Pro Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Trp Pro Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp Ile Leu

245 250 255

Phe Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp

260 265 270

Phe Gly Ser Asp Tyr Tyr Asp Leu Lys Pro Asp Leu Met Thr Ile Ala

275 280 285

Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Ile Val Arg

290 295 300

Asp Thr Val Ala Lys Val Ile Ser Glu Gly Gly Asp Phe Asn His Gly

305 310 315 320

Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Gly Leu Glu Asn

325 330 335

Leu Arg Ile Leu Arg Asp Glu Lys Ile Val Glu Lys Ala Arg Thr Glu

340 345 350

Ala Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Glu Leu Gln Asp His Pro

355 360 365

Leu Val Gly Glu Val Arg Gly Leu Gly Met Leu Gly Ala Ile Glu Leu

370 375 380

Val Lys Asp Lys Ala Thr Arg Ser Arg Tyr Glu Gly Lys Gly Val Gly

385 390 395 400

Met Ile Cys Arg Thr Phe Cys Phe Asp Asn Gly Leu Ile Met Arg Ala

405 410 415

Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ala Pro Pro Leu Val Ile Ser His Ala

420 425 430

Glu Ile Asp Glu Leu Val Glu Lys Ala Arg Lys Cys Leu Asp Leu Thr

435 440 445

Leu Glu Ala Ile Asn

450

<210> 10

<211> 455

<212> PRT

<213> 类球红细菌（Rhodobacter spaeroides）

<400> 10

Met Arg Asp Asp Ala Pro Asn Ser Trp Glu Ser Arg Ala Asp Ala Ser

1 5 10 15

Ser Phe Tyr Gly Phe Thr Asp Leu Pro Ser Val His Gln Arg Gly Thr

20 25 30

Val Val Leu Thr His Gly Lys Gly Pro Tyr Ile Tyr Asp Val His Gly

35 40 45

Arg Ala Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly

50 55 60

Phe Asp His Pro Gly Leu Ile Glu Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg

65 70 75 80

Phe Pro Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val

85 90 95

Met Leu Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Ala Arg Gly Arg

100 105 110

Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys

115 120 125

Met Leu Trp Phe Leu Gly Ala Ala Glu Gly His Pro Glu Arg Arg Lys

130 135 140

Ile Ile Thr Arg Val Asn Ser Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala

145 150 155 160

Ser Met Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Leu Phe Gly Leu Pro Leu Pro

165 170 175

Gly Phe Ile His Val Gly Cys Pro His Tyr Trp Arg Phe Gly Gln Ala

180 185 190

Gly Glu Thr Glu Ala Glu Phe Thr Gln Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu

195 200 205

Ala Thr Ile Ile Lys Glu Gly Pro Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala

210 215 220

Glu Pro Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ser Glu Gly Tyr

225 230 235 240

Phe Gln Ala Val Gln Pro Val Leu Lys Arg Tyr Gly Ile Pro Leu Ile

245 250 255

Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly

260 265 270

Cys Gln Thr Tyr Asp Phe Met Pro Asp Gly Ile Ile Ser Ser Lys Asn

275 280 285

Ile Thr Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu

290 295 300

Leu Ala Asp Arg Leu Gln Ala Ala Ser Glu Ala Val Glu Glu Phe Pro

305 310 315 320

His Gly Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu

325 330 335

Lys Ala Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg

340 345 350

Ala Leu Thr Pro Lys Phe Glu Ala Gly Leu Ala Tyr Leu Ala Glu Asn

355 360 365

Pro Asn Ile Gly Glu Trp Arg Gly Lys Gly Leu Met Gly Ala Leu Glu

370 375 380

Ala Val Lys Asp Lys Ala Thr Lys Thr Pro Phe Pro Gly Asp Leu Ser

385 390 395 400

Val Ser Glu Arg Ile Ala Asn Ser Cys Thr Asp His Gly Leu Ile Cys

405 410 415

Arg Pro Leu Gly Gln Ser Ile Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Met Thr

420 425 430

Glu Ala Gln Met Asp Glu Met Phe Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Lys

435 440 445

Lys Val Phe Ala Glu Val Ala

450 455

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 11

gccatcatag gggttcctaa aga 23

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 12

actgatggta ccttaagcac ccgccacaga 30

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtgacgatca ttgcccgtaa cgcagaccgc ttg 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 14

caagcggtct gcgttacggg caatgatcgt cac 33

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 15

gcctatcgac tattaaacaa aacagcc 27

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 16

actgatggta ccttagacct gggtcaatcc 30

<210> 17

<211> 1401

<212> DNA

<213> 脱氮副球菌

<400> 17

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg ccaaccaacc gcaaagctgg 60

gaagcccggg ccgagaccta ttcgctctac ggtttcaccg acatgccctc ggtccatcag 120

cggggcacgg tcgtcgtgac ccatggcgag gggccctata tcgtcgatgt ccatggccgc 180

cgctatctgg atgccaattc gggcctgtgg aacatggtcg cgggcttcga ccacaagggc 240

ctgatcgagg ccgccaaggc gcaatacgac cgctttcccg gctatcacgc ctttttcggc 300

cgcatgtccg accagaccgt gatgctgtcg gaaaagctgg tcgaggtctc gccattcgac 360

aacggccggg tcttctatac caattccggc tccgaggcga acgacaccat ggtcaagatg 420

ctgtggttcc tgcatgccgc cgagggcaag ccgcaaaagc gcaagatcct gacgcgctgg 480

aacgcctatc acggcgtgac cgcggtttcg gcctcgatga ccggcaagcc ctacaactcg 540

gtcttcggcc tgccgctgcc cggcttcatc cacctgacct gcccgcatta ctggcgctat 600

ggcgaggaag gcgagaccga ggcgcaattc gtcgcccgcc tggcacgcga gcttgaggat 660

accatcaccc gcgagggcgc cgacaccatc gccggcttct tcgccgagcc ggtgatgggc 720

gcgggggggg tgatcccgcc ggcgaagggt tatttccagg ccatcctgcc gatcttgcgc 780

aagtatgaca tcccgatgat ctcggacgag gtgatctgcg gcttcgggcg caccggcaac 840

acctggggct gcctgaccta cgacttcatg cccgatgcga tcatctcgtc caagaacctg 900

actgcgggct tcttcccgat gggcgccgtc atcctcgggc ccgacctcgc caagcgggtc 960

gaggccgcgg tcgaggcgat cgaggagttc ccgcacggct tcaccgcctc gggccatccg 1020

gtcggctgcg ccatcgcgct gaaggccatc gacgtggtga tgaacgaggg gctggccgag 1080

aatgtccgcc gcctcgcacc ccgcttcgag gcggggctga agcgcatcgc cgaccgcccg 1140

aacatcggcg aataccgcgg catcggcttc atgtgggcgc tggaggcggt caaggacaag 1200

ccgaccaaga cccccttcga cgccaatctt tcggtcagcg agcgcatcgc caatacctgc 1260

accgatctgg ggctgatctg ccggccgctg ggccagtcca tcgtgctgtg cccgcccttc 1320

atcctgaccg aggcgcagat ggacgagatg ttcgaaaagc tggaaaaggc gctcgacaag 1380

gtctttgccg aggtggccta a 1401

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

gccaaccaac cgcaaagctg gga 23

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

actgataagc ttttaggcca cctcggcaaa gac 33

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 20

ctgccggcca atgggccagt ccat 24

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 21

atggactggc ccattggccg gcag 24

<210> 22

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 枯草芽孢杆菌蛋白mit His-标签

<400> 22

Met Ala Ser Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ala Ile Ile

1 5 10 15

Gly Val Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val Ala Leu Thr

20 25 30

Pro Gly Gly Val Ser Gln Leu Ile Ser Asn Gly His Arg Val Leu Val

35 40 45

Glu Thr Gly Ala Gly Leu Gly Ser Gly Phe Glu Asn Glu Ala Tyr Glu

50 55 60

Ser Ala Gly Ala Glu Ile Ile Ala Asp Pro Lys Gln Val Trp Asp Ala

65 70 75 80

Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Pro Glu Glu Tyr Val Tyr

85 90 95

Phe Arg Lys Gly Leu Val Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu Ala Ala Glu

100 105 110

Pro Glu Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asp Lys Gly Val Thr Ala Ile Ala

115 120 125

Tyr Glu Thr Val Ser Glu Gly Arg Thr Leu Pro Leu Leu Thr Pro Met

130 135 140

Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ala Gln Ile Gly Ala Gln Phe Leu

145 150 155 160

Glu Lys Pro Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ala Gly Val Pro Gly

165 170 175

Val Ser Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly Val Val Gly Thr

180 185 190

Asn Ala Ala Lys Met Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp Val Thr Ile Ile

195 200 205

Ala Arg Asn Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp Ile Phe Gly His

210 215 220

Gln Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asn Pro Val Asn Ile Ala Asp Ala Val

225 230 235 240

Ala Glu Ala Asp Leu Leu Ile Cys Ala Val Leu Ile Pro Gly Ala Lys

245 250 255

Ala Pro Thr Leu Val Thr Glu Glu Met Val Lys Gln Met Lys Pro Gly

260 265 270

Ser Val Ile Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly Ile Val Glu Thr

275 280 285

Val Asp His Ile Thr Thr His Asp Gln Pro Thr Tyr Glu Lys His Gly

290 295 300

Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala Val Pro Arg Thr

305 310 315 320

Ser Thr Ile Ala Leu Thr Asn Val Thr Val Pro Tyr Ala Leu Gln Ile

325 330 335

Ala Asn Lys Gly Ala Val Lys Ala Leu Ala Asp Asn Thr Ala Leu Arg

340 345 350

Ala Gly Leu Asn Thr Ala Asn Gly His Val Thr Tyr Glu Ala Val Ala

355 360 365

Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Tyr Val Pro Ala Glu Lys Ala Leu Gln Asp

370 375 380

Glu Ser Ser Val Ala Gly Ala

385 390

<210> 23

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 枯草芽孢杆菌蛋白mit His-标签

<400> 23

atggctagca gaggatcgca tcaccatcac catcacggcg ccatcatagg ggttcctaaa 60

gagataaaaa acaatgaaaa ccgtgtcgca ttaacacccg ggggcgtttc tcagctcatt 120

tcaaacggcc accgggtgct ggttgaaaca ggcgcgggcc ttggaagcgg atttgaaaat 180

gaagcctatg agtcagcagg agcggaaatc attgctgatc cgaagcaggt ctgggacgcc 240

gaaatggtca tgaaagtaaa agaaccgctg ccggaagaat atgtttattt tcgcaaagga 300

cttgtgctgt ttacgtacct tcatttagca gctgagcctg agcttgcaca ggccttgaag 360

gataaaggag taactgccat cgcatatgaa acggtcagtg aaggccggac attgcctctt 420

ctgacgccaa tgtcagaggt tgcgggcaga atggcagcgc aaatcggcgc tcaattctta 480

gaaaagccta aaggcggaaa aggcattctg cttgccgggg tgcctggcgt ttcccgcgga 540

aaagtaacaa ttatcggagg aggcgttgtc gggacaaacg cggcgaaaat ggctgtcggc 600

ctcggtgcag atgtgacgat cattgcccgt aacgcagacc gcttgcgcca gcttgatgac 660

atcttcggcc atcagattaa aacgttaatt tctaatccgg tcaatattgc tgatgctgtg 720

gcggaagcgg atctcctcat ttgcgcggta ttaattccgg gtgctaaagc tccgactctt 780

gtcactgagg aaatggtaaa acaaatgaaa cccggttcag ttattgttga tgtagcgatc 840

gaccaaggcg gcatcgtcga aactgtcgac catatcacaa cacatgatca gccaacatat 900

gaaaaacacg gggttgtgca ttatgctgta gcgaacatgc caggcgcagt ccctcgtaca 960

tcaacaatcg ccctgactaa cgttactgtt ccatacgcgc tgcaaatcgc gaacaaaggg 1020

gcagtaaaag cgctcgcaga caatacggca ctgagagcgg gtttaaacac cgcaaacgga 1080

cacgtgacct atgaagctgt agcaagagat ctaggctatg agtatgttcc tgccgagaaa 1140

gctttacagg atgaatcatc tgtggcgggt gcttaa 1176

Claims

1.细胞，其包含

含有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体的多肽，其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸，

或含有编码所述多肽的核苷酸序列的核酸分子。

2.产生丙氨酸或通过丙氨酸消耗生成的化合物的方法，其包括步骤：

c) 通过将丙酮酸与权利要求1的细胞或

与含有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列或其变体的多肽接触，其中Leu197或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有带正电的侧链的氨基酸，使丙酮酸与铵和NADPH反应以产生丙氨酸。

3.权利要求2的方法，其还包括

4.权利要求1-3中任一项的方法，其还包括

b) 通过丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触而使步骤a）中制备的醛或酮反应以产生胺。

5.权利要求2-4中任一项的方法，其中步骤a）、b）和c）在相同反应混合物中进行，优选同时进行。

6.权利要求3-5中任一项的细胞或方法，其中所述细胞还表达NADP⁺依赖性醇脱氢酶。

7.权利要求3-6中任一项的细胞或方法，其中所述细胞还表达氨基转移酶。

8.权利要求1-7中任一项的细胞或方法，其中，在多肽细胞中，所有选自多肽、NADP⁺依赖性醇脱氢酶和氨基转移酶的酶胞内定位表达。

9.权利要求6-8中任一项的细胞或方法，其中所述NADP⁺依赖性醇脱氢酶为选自来自大肠杆菌的醇脱氢酶(YjgB, 数据库编号ZP_07117674, 和YahK, 数据库编号BAE76108.1)和来自青枯菌属种（Ralstonia sp.）的醇脱氢酶(SEQ ID No. 10)的NADP⁺依赖性醇脱氢酶，优选来自青枯菌属种的醇脱氢酶(SEQ ID No. 10)或其变体。

10.权利要求7-9中任一项的细胞或方法，其中所述氨基转移酶为选自来自青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum）(数据库编号NP_901695)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(数据库编号YP_001668026)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）(数据库编号YP_001668026.1或YP_001671460)；类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）(菌株ATCC 17023；数据库编号YP_353455)的氨基转移酶及其变体，优选为来自青紫色素杆菌的氨基转移酶(数据库编号NP_901695)。

11.权利要求1-10中任一项的细胞或方法，其中所述具有带正电的侧链的氨基酸为精氨酸。

12.权利要求1-11中任一项的细胞或方法，其中另外地Asp196或位于氨基酸序列中的同源位置的氨基酸交换为具有中性的或带正电的侧链的氨基酸。

13.权利要求1-12中任一项的细胞或方法，其中所述具有中性的或带正电的侧链的氨基酸为选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的氨基酸，优选丙氨酸。

14.权利要求1-13中任一项的细胞或方法，其中所述多肽为SEQ ID No. 1中显示的多肽。

15.权利要求1-14中任一项的细胞或方法，其中所述核苷酸序列为SEQ ID No. 2中显示的核苷酸序列。

16.权利要求1-15中任一项的细胞或方法，其中所述核酸分子为包含核酸分子的载体。