JP6178805B2 - ナノ細孔センサーとともに使用するための二重層を作製するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年2月16日に出願されている米国仮特許出願第61/599,871号の利益と、2012年2月17日に出願されている米国仮特許出願第61/600,398号の利益とを主張し、それらの各々は、本明細書で参照によってその全体が援用される。
核酸の配列決定は、核酸試料に関する配列情報を提供するために使用できる方法である。このような配列情報は、対象の診断および/または処置において有用であり得る。例えば、対象の核酸配列を使用して、遺伝病を識別すること、遺伝病を診断することが可能であり、さらには遺伝病の処置を開発することも可能である。他の例として、病原体の調査により、接触感染性の疾患を処置できるようになる可能性がある。また分子検出(例えばタンパク質の分子検出)も、対象の診断および/または処置において有用であり得る。
(項目1)
ナノ細孔センサーで使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
(a)材料層を有する電極を含むフローチャネルに緩衝溶液を方向付けることであって、前記緩衝溶液は、導電性であり、前記材料層は、1種または複数の脂質を含む、ことと、
(b)前記緩衝溶液と、前記材料層とを接触させることと、
(c)前記電極を通る電流を測定することにより、前記材料層の少なくとも一部が、前記電極に隣接して脂質二重層を形成しているか否かを決定することと、
(d)(c)の決定に基づいて、前記電極に刺激を加えることにより、前記材料層の前記少なくとも一部が前記電極に隣接して前記脂質二重層を形成するように誘導することとを含む、方法。
(項目2)
(c)において、1種または複数の電圧が前記電極に加えられる、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記電圧が、前記電極の上方の前記二重層を破壊または崩壊させるように選択される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記刺激が、前記電極の表面の上方の液体の流れ、前記電極の表面の上方の1種または複数の異なる液体の連続的な流れ、前記電極の表面の上方の1つまたは複数の気泡の流れ、電気パルス、ソニケーションパルス、圧力パルス、または音パルスのうち少なくとも1つを含む、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記材料層が、1種または複数のポリンタンパク質と、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度の1種または複数の界面活性剤とを含む、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記フローチャネルが、複数の電極を含み、前記複数の電極が、前記電極を含む、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記刺激が、前記複数の電極に同時に加えられる、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記材料層が、少なくとも2種の脂質を含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記材料層が、ポアタンパク質を含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記ポアタンパク質が、mycobacterium smegmatisのポリンA(MspA)、α溶血素、smegmatisのポリンA(MspA)もしくはα溶血素のうち少なくとも1つと少なくとも70%の相同性を有する任意のタンパク質、またはそれらの任意の組合せである、項目9に記載の方法。
(項目11)
(d)の後に、前記電極を通して電気刺激を加えることにより、前記脂質二重層における前記ポアタンパク質の挿入を容易にすることをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記脂質二重層および前記ポアタンパク質が共に、約1GΩまたはそれよりも低い抵抗を示す、項目11に記載の方法。
(項目13)
ポアタンパク質のない前記脂質二重層が、約1GΩよりも大きい抵抗を示す、項目1に記載の方法。
(項目14)
前記緩衝溶液の圧力は、前記材料層が、前記刺激なしで前記脂質二重層を形成するように選択される、項目1に記載の方法。
(項目15)
(a)の前に、前記材料層を前記電極に隣接して作り出すことをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目16)
前記作り出すことが、
前記1種または複数の脂質を含む脂質溶液を、前記フローチャネルに方向付けることと、
前記電極上に前記材料層を堆積させることと
を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記脂質溶液が、有機溶媒を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記有機溶媒が、デカンを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、項目1に記載の方法。
(項目20)
前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
(a)の後に、
気泡を前記フローチャネルに方向付けることと、
前記気泡と前記材料層とを接触させることにより、前記材料層を滑らかにすることおよび/または薄くすることと
をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記気泡が、蒸気の気泡である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記材料層に隣接するポアタンパク質溶液を流動させることにより、前記材料層にポアタンパク質を堆積させることと、
前記フローチャネルにおけるイオン溶液および/または別の気泡を用いて前記材料層を薄くすることと
をさらに含む、項目18に記載の方法。
(項目25)
前記1種または複数の脂質が、ジフタノイルホスファチジルコリン(DPhPC)、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジル−コリン(POPC)、ジオレオイル−ホスファチジル−メチルエステル(DOPME)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目26)
前記フローチャネルに曝露される前記電極の表面が、親水性である、項目1に記載の方法。
(項目27)
前記電極が、フローチャネルの1つまたは複数の疎水性表面に隣接して堆積させられる、項目1に記載の方法。
(項目28)
前記1つまたは複数の疎水性表面が、シラン処理されている、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記フローチャネルが、チップに形成される、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記電極が、前記フローチャネル表面に形成される、項目1に記載の方法。
(項目31)
前記フローチャネルが、密閉されている、項目1に記載の方法。
(項目32)
前記1つまたは複数のフローチャネルが、複数のフローチャネルを含む、項目1に記載の方法。
(項目33)
前記複数のフローチャネルが、前記複数のフローチャネルに沿ったガイドレールを用いて流体的に互いに分離されている、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記電極が、個々にアドレス可能な電極である、項目1に記載の方法。
(項目35)
(c)が、前記材料層の少なくとも一部が前記電極の全部または一部の上方に脂質二重層を形成しているか否かを決定することをさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目36)
ナノ細孔感知装置において使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
(a)複数の電極と前記複数の電極に隣接する材料層とを含むチップを提供することであって、前記材料層の各々は、脂質を含む、ことと、
(b)前記材料層と緩衝溶液とを接触させることであって、前記緩衝溶液は、導電性である、ことと、
(c)前記複数の電極の少なくともサブセットに刺激を加えることにより、前記材料層が前記複数の電極に隣接して脂質二重層を形成するように誘導することと、
(d)必要に応じて、前記複数の電極に加えられた約−100ミリボルト(mV)〜−1000mVの電圧パルスで、前記複数の電極の少なくとも約20%が非活性化するまでステップ(b)および(c)を繰り返すことと
を含む、方法。
(項目37)
前記複数の電極が、各々、個々にアドレス可能である、項目36に記載の方法。
(項目38)
工程(b)および(c)が、必要に応じて、前記加えられた電圧パルスで、前記複数の電極の少なくとも約60%が非活性化するまで繰り返される、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記加えられた電圧パルスが、約−400mV〜−700mVである、項目36に記載の方法。
(項目40)
前記刺激が、前記電極の表面の上方の液体の流れ、前記電極の表面の上方の1種または複数の異なる液体の連続的な流れ、前記電極の表面の上方の1つまたは複数の気泡の流れ、電気パルス、ソニケーションパルス、圧力パルス、または音パルスのうち少なくとも1つを含む、項目36に記載の方法。
(項目41)
前記材料層の各々が、ポアタンパク質を含む、項目36に記載の方法。
(項目42)
前記ポアタンパク質が、mycobacterium smegmatisのポリンA(MspA)、α溶血素、smegmatisのポリンA(MspA)もしくはα溶血素のうち少なくとも1つと少なくとも70%の相同性を有する任意のタンパク質、またはそれらの任意の組合せである、項目41に記載の方法。
(項目43)
(c)の後に、前記電極の少なくともサブセットを通して電気刺激を加えることにより、前記脂質二重層の各々における前記ポアタンパク質の挿入を容易にすることをさらに含む、項目41に記載の方法。
(項目44)
(a)が、
前記複数の電極と脂質溶液とを接触させることにより、前記材料層を形成すること
をさらに含み、前記脂質溶液が、前記脂質を含む、項目36に記載の方法。
(項目45)
前記脂質溶液が、有機溶媒を含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記有機溶媒が、デカンを含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、項目36に記載の方法。
(項目48)
前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、項目48に記載の方法。
(項目50)
ステップ(a)と(b)との間に、気泡を前記材料層の各々に隣接するように方向付けることをさらに含む、項目36に記載の方法。
(項目51)
前記電極が、前記チップの1つまたは複数のフローチャネルにおいて密閉されている、項目36に記載の方法。
(項目52)
標的分子を検出する方法であって、前記方法は、
(a)感知電極に隣接して、またはその近傍に堆積させられた、膜中にナノ細孔を含むチップを提供することと、
(b)核酸分子を前記ナノ細孔に方向付けることであって、前記核酸分子は、レポーター分子と会合しており、前記核酸分子は、アドレス領域とプローブ領域とを含み、前記レポーター分子は、前記プローブ領域で前記核酸分子と会合しており、前記レポーター分子は、標的分子にカップリングされている、ことと、
(c)前記核酸分子が前記ナノ細孔に方向付けられている間、前記アドレス領域を配列決定することにより、前記アドレス領域の核酸配列を決定することと、
(d)コンピュータプロセッサを用いて、(c)で決定された前記アドレス領域の核酸配列に基づき前記標的分子を識別することと
を含む、方法。
(項目53)
(b)におけるプローブ分子が、前記核酸分子の前記プローブ領域へのレポーター分子の結合によって、細孔中に保持される、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられるときに、前記核酸分子の最大3つの塩基が識別される、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられるときに、前記核酸分子の最大5つの塩基が識別される、項目53に記載の方法。
(項目56)
前記レポーター分子と前記ナノ細孔との相互作用のときに、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が、減少させられる、項目53に記載の方法。
(項目57)
(b)において、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度が、停止させられるか、または失速させられる、項目52に記載の方法。
(項目58)
(d)の前に、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度が減少させられたか否かを決定することをさらに含む、項目52に記載の方法。
(項目59)
(d)において、前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の前記進行速度が減少させられていると決定される場合、前記標的分子が識別される、項目52に記載の方法。
(項目60)
(d)において、前記標的分子が、(i)前記アドレス領域および会合部の核酸配列と、(ii)前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の進行速度との相関に基づき識別される、項目52に記載の方法。
(項目61)
前記ナノ細孔が、個々にアドレス可能である、項目52に記載の方法。
(項目62)
前記核酸分子が、一本鎖である、項目52に記載の方法。
(項目63)
前記ナノ細孔中に前記核酸分子を捕獲することをさらに含む、項目52に記載の方法。
(項目64)
前記核酸分子が、前記核酸分子の末端部分の1つまたは複数に形成されているバルキーな構造を用いて、前記ナノ細孔中に捕獲される、項目63に記載の方法。
(項目65)
前記核酸分子が、前記核酸分子の末端部分の1つまたは複数に取り付けられているバルキーな構造を用いて前記ナノ細孔中に捕獲される、項目63に記載の方法。
(項目66)
前記ナノ細孔を通る前記核酸分子の流れの方向を逆転させることをさらに含む、項目52に記載の方法。
(項目67)
前記核酸分子の流れの方向を逆転させると、前記アドレス領域の少なくとも一部を再度配列決定することをさらに含む、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記レポーター分子が、前記レポーター分子の末端部分に抗体またはアプタマーを含み、前記抗体またはアプタマーは、前記標的分子と会合している、項目52に記載の方法。
(項目69)
アドレス領域およびプローブ領域が、公知の核酸配列を有する、項目52に記載の方法。
(項目70)
前記レポーター分子が、前記プローブ領域の核酸配列に相補的な核酸配列を含む、項目52に記載の方法。
(項目71)
前記核酸分子が、前記のように方向付けられる前に前記レポーター分子と会合している、項目52に記載の方法。
(項目72)
(b)の前に、前記核酸分子が、前記ナノ細孔を通って進み、(b)において、前記レポーター分子が、前記ナノ細孔を通って進んだ前記核酸分子と会合している、項目52に記載の方法。
概要
ナノ細孔は、核酸分子を包含するポリマーを配列決定して、および/または例えばタンパク質などの分子を検出するのに使用することができる。ポリマーの例としては、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)が挙げられる。これを考慮して、核酸分子の識別、核酸の配列決定、および分子検出のための改良方法への必要性が認識されている。本明細書では、センサーの近傍で、脂質二重層(また本明細書では「二重層」ともいう)を形成して、二重層にナノ細孔を挿入する方法を説明する。
本明細書で述べられた全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個々に参照により組み入れられることを提示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
試験ポリヌクレオチドは、一本鎖試験ポリヌクレオチド(すなわち、ss試験ポリヌクレオチド)であってもよいし、二本鎖試験ポリヌクレオチド(すなわち、ds試験ポリヌクレオチド、例えばds試験DNA、ds試験RNA、およびds試験DNA−RNAハイブリッドなど)であってもよい。ss試験ポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、本明細書において説明される方法でスピードバンプにより結合しているssポリヌクレオチドのセクションを含む。ss試験ポリヌクレオチドは、試料ポリヌクレオチドおよび他の機能的な部分(例えば、前バルキーな構造、識別子、および単離用タグ)をさらに含んでいてもよい。
本明細書において、ナノ細孔を用いて分子またはそれらの一部を識別するシステムおよび方法が提供される。ナノ細孔を用いて例えば分子またはそれらの一部などの化学種を識別する方法は、膜中に、電極に隣接して、またはその近傍に堆積させられた少なくとも1つのナノ細孔を含むバイオチップ(また本明細書では「チップ」ともいう)を準備することを含んでいてもよい。電極は、ナノ細孔を通過する電流を検出するように適合させることができる。本方法はさらに、ナノ細孔に分子またはそれらの一部を挿入すること、およびナノ細孔全体および/または膜全体に加えられる電圧を変化させることを包含していてもよい。いくつかの場合において、本方法は、複数の電圧で電流を測定して、分子またはそれらの一部を識別することを包含する。いくつかの実施形態において、複数の電圧における電流は電子署名を含み、電子署名と複数の参照電子署名とを比較して、分子またはそれらの一部を識別することをさらに含む。
図3は、本明細書で説明されているように分子を検出する(および/または核酸を配列決定する)のに使用できるナノ細孔装置300(またはセンサー)を図式的に例示する。脂質二重層を含有するナノ細孔は、抵抗およびキャパシタンスによって特徴付けることができる。ナノ細孔装置300は、導電性固体基板306の脂質二重層適合性表面304上に形成された脂質二重層302を包含し、この場合、脂質二重層適合性表面304は、脂質二重層不適合性表面305で隔てられていてもよく、導電性固体基板306は、断熱材307で電気的に絶縁されていてもよく、この場合、脂質二重層302は、脂質二重層不適合性表面305上に形成された無定形脂質303で取り囲まれていてもよい。脂質二重層302の両側の間で、検出される分子および/または小さいイオン(例えば、Na+、K+、Ca2+、Cl−”)が通過できる程度に大きいナノ細孔310を有する単一のナノ細孔構造308が脂質二重層302に埋め込まれていてもよい。水分子314の層は、脂質二重層適合性表面304上で吸収される可能性があり、脂質二重層302と脂質二重層適合性表面304との間に挟まれている。親水性の脂質二重層適合性表面304上で吸収された水性フィルム314は、脂質分子の秩序化を促進し、脂質二重層適合性表面304上での脂質二重層の形成を容易にする可能性がある。検出される分子(例えば、核酸分子、いくつかの場合において、必要に応じてタグを有するヌクレオチドまたは他の構成要素を有する核酸分子)312の溶液を含有する試料チャンバー316が、脂質二重層302の上方に提供されてもよい。このような溶液は、電解質を含有し、最適なイオン濃度に緩衝化され、ナノ細孔310が開口したままになるように最適pHに維持されている水溶液であってもよい。この装置は、脂質二重層全体に電気刺激(例えば電圧バイアス)を提供するため、および脂質二重層の電気的な特性(例えば、抵抗、キャパシタンス、およびイオン電流の流れ)を感知するための、可変電圧源320にカップリングされた電極318の対(負極ノード318aおよび陽極ノード318bを包含する)を包含する。陽極318bの表面は、脂質二重層適合性表面304であるか、またはその一部を形成する。導電性固体基板306は、一方の電極318にカップリングされていてもよいし、または一方の電極318の一部を形成していてもよい。装置300はまた、電気刺激を制御するための、および検出されたシグナルをプロセシングするための電気回路322を包含していてもよい。いくつかの実施形態において、(例えば可変)電圧源320は、電気回路322の一部として包含される。電気回路322は、増幅器、積分器、ノイズフィルター、フィードバック制御ロジック、および/または様々なその他の構成要素を包含していてもよい。電気回路322は、ケイ素基板328内に統合された統合型電気回路であってもよいし、メモリ326にカップリングされたコンピュータプロセッサ324にさらにカップリングされていてもよい。
いくつかの場合において、電流は、様々な印加電圧で測定することができる。これを達成するために、望ましい電位を電極に加えてもよいし、その後、加えられた電位を測定中ずっと維持してもよい。ある実施において、このような本明細書で説明されている目的のために、演算増幅器による積分器のトポロジーが使用される可能性がある。積分器は、容量性帰還を用いて電極で電位差を維持する。積分器の回路は、優れた直線性、セル間マッチング、およびオフセット特性をもたらす可能性がある。演算増幅器による積分器は、典型的には、必要な性能を達成するには大きいサイズを必要とする。本明細書では、より小型の積分器のトポロジーを説明する。
本開示は、分子の検出および/または核酸の配列決定のためのナノ細孔検出器(またはセンサー)のアレイを提供する。図5を参照すれば、複数の(例えば核酸)分子を、ナノ細孔検出器のアレイで検出および/または配列決定することができる。ここで各ナノ細孔の位置(例えば501)は、ナノ細孔を含み、いくつかの場合において、このナノ細孔は、ポリメラーゼ酵素および/またはホスファターゼ酵素に付着していてもよい。また、一般的に、本明細書で説明されているように、各アレイ位置にセンサーが存在していてもよい。いくつかの例において、核酸ポリメラーゼに付着したナノ細孔のアレイが提供され、ポリメラーゼによりタグを有するヌクレオチドが取り込まれる。重合中、タグは、ナノ細孔によって(例えば、ナノ細孔中で、またはナノ細孔を通って放出され通過することにより、またはナノ細孔に供給されることにより)検出される。
本開示の装置、システム、および方法は、コンピュータシステムを用いて調節することができる。図6は、ナノ細孔の検出および/または核酸の配列決定システム602にカップリングされたコンピュータシステム601を含むシステム600を示す。コンピュータシステム601は、1つのサーバまたは複数のサーバであってもよい。コンピュータシステム601は、試料調製およびプロセシング、ならびに配列決定システム602による核酸の配列決定を調節するようにプログラム化されていてもよい。ナノ細孔の検出および/または配列決定システム602は、本明細書で説明されるようなナノ細孔ベースのシーケンサー(または検出器)であってもよい。
ここで、半導体ナノ細孔センサーチップを生成する(例えば、個々に制御された)電極のアレイ上に脂質二重層およびナノ細孔を作製する方法を説明する。チップは、例えば核酸配列などのポリマー配列を決定するのに使用することができる。
一態様において、本開示は、ヘテロジニアスまたはホモジニアスな混合物から、個々の分子(例えばタンパク質)を捕捉し、検出し、計数し、ソートし、ビニングし、および濃縮する方法を提供する。
(A1)プローブのポリヌクレオチドを調製すること、ここでポリヌクレオチドは、本明細書で説明されるような図23に示される構造を含み、レポーター分子は、レポーター分子用の結合部位に結合することができ;
(B1)第一の条件で第一の前バルキーな構造から第一のバルキーな構造(BS1)を形成すること、
(B2)電位を加えて、ssプローブポリヌクレオチドをナノ細孔検出器のナノ細孔に流すこと、
(B3)第二の条件で、第二の前バルキーな構造から第二のバルキーな構造(BS2)を形成すること、
(B4)いくつかの場合において、別の電位を加えて、ナノ細孔のくびれ領域の前でss試験ポリヌクレオチドがBS2によって停止するまでss試験ポリヌクレオチドの流れを逆転させること、
(B5)いくつかの場合において、プローブのポリヌクレオチドの識別子(例えば第一の方向識別子、第二の方向識別子、プローブ識別子、参照シグナル識別子、およびプローブ源識別子)を識別して、バルキーな構造(複数可)の適切な形成(複数可)を確認し、プローブのポリヌクレオチドを識別すること、ここで後者は、ナノ細孔アレイ中に2個以上のナノ細孔が存在する場合に重要であり、その場合、各ナノ細孔は、プローブのポリヌクレオチドを識別することによりアドレス可能であり、アドレス可能なナノ細孔と標的との関連が確立され、
(B6)ssプローブのポリヌクレオチドと、レポーター/標的とを接触させ、レポーター分子−プローブのポリヌクレオチドセグメントを含むssプローブポリヌクレオチド複合体を形成すること;
(B7)別の電位を加えて、ナノ細孔のくびれ領域の前でレポーター分子−プローブのポリヌクレオチドセグメントが停止するまでプローブのポリヌクレオチド複合体をナノ細孔に流すこと、
(B8)一時停止時間にわたりナノ細孔の内部でレポーター分子−プローブのポリヌクレオチドセグメントが失速したときに、第一の電気シグナルのセットを得ること、
(B9)プローブのポリヌクレオチドの流れ方向でレポーター分子−プローブのポリヌクレオチドセグメントの前にある構造を識別することによって、レポーター分子が固定されているか否かを決定すること、ここでレポーター分子が標的との化合物/複合体を形成する場合、レポーター分子が固定されていればその標的は固定されており、および
(B10)いくつかの場合において、I2およびLI中の1つまたは複数の識別子(例えばプローブ識別子、参照シグナル識別子、およびプローブ源識別子)を識別すること
を含む。
二重層の形成および細孔の挿入
手作業によるシリンジ構成およびシリンジポンプ構成を使用したフローセルでの二重層の形成および細孔の挿入により、高い二重層と単一の溶血素の細孔が得られる。脂質で被覆されたチップ表面全体に1Mまたは0.3MのKCl溶液と気泡を流動させ、電気的な刺激を加えることによって、二重層が両方の構成で形成される。2つの溶血素を適用する方法により、高収量の単一の細孔が得られる。1つの方法は、以下のステップ:(1)デカン中で溶血素と脂質とを予備混合するステップ、(2)チップ表面の上方に溶血素−脂質混合物を流し、2〜3分インキュベートするステップ、(3)二重層を形成するステップ、および(4)電気刺激を加えることにより、エレクトロポレーションして二重層に細孔を入れるステップを含む。第二の方法は、以下のステップ:(1)チップ表面の上方にデカン中の脂質を流すステップ、(2)二重層を形成するステップ、(3)チップ表面全体に溶血素を流すステップ、(4)即座にKCl洗浄液を流すステップ、および(5)電気刺激を加えることにより、エレクトロポレーションして二重層に細孔を入れるステップを含む。溶血素挿入のために二重層をより流動的にするために、両方の適用方法におけるエレクトロポレーションステップの間、チップを加熱してもよい。細孔の寿命を長くするために、エレクトロポレーションステップ中またはその後のいずれかに温度を室温またはそれより低い温度に下げる。
フローセルの形態
図24および図25を参照すると、半導体チップの上部にガスケットを直接置くことにより、フローセルをチップパッケージ上に組み立てる。ガスケットの厚さは50μmから500μmまで様々である。ガスケットは、片側または両側に感圧接着剤を有するプラスチック、シリコーン膜、または例えばEPDMなどのフレキシブルなエラストマーで作られ得る。ガスケットは、あらゆる形状に製造することができる。ガスケット(例えば、PSAが積層されたPMMAで作製された)上部に硬質プラスチックの蓋(例えばPMMAで作製された)を置き、感圧接着剤で、またはガスケットに圧縮力を適用する固定メカニズムによって蓋をガスケットに封止してもよい。蓋は、フローセルに試薬および空気を流すのに使用される単一または複数の入口および出口ポートを有する。
流体工学シリンジポンプ
図26および図27を参照すると、チップ全体にわたる空気および液体の流れの速度は、流体工学ポンプおよび注入バルブによって制御される。ポンプによって作り出された流速は、0.01μl/秒から100μl/秒より大きい値まで様々である。流体工学制御器は、緩衝液入口ポート、出口ポート、および脂質/溶血素注入ポートを含むマルチポート選択バルブを有する。
シリンジポンプでのフロープロトコール
この実施例は、90%を超える脂質被覆率および30%の溶血素の細孔挿入を達成する。チップ表面全体へのDPhPCおよび溶血素の混合物の注入によっても、50%の細孔挿入収量も達成する。
(a)100μlの1MのKClを引き出し、10μl/秒の流速でフローセルシステム全体に流す。
(b)Ag/AgCl参照電極を使用した電位ステップを適用することによってチップ電極を調整する。
(c)チップ全体にデカン中の7.5mg/mlのDPhPC(40μl)を1μl/秒の流速で注入する。
(d)チップ全体に20μlの空気の気泡を注入する。
(e)チップ全体に100μlのKClを1μl/秒の流速で注入する。
(a)チップ表面全体に50μlの溶血素溶液を1μl/秒の流速で注入する。
(b)チップ表面全体に100μlのKCl溶液を流す。
(c)ステップa)の直後、ステップb)の前、またはステップb)の後のいずれかに、細孔挿入のために電極電位をモジュレートする。
手作業によるシリンジを使用したフロープロトコール
二重層の調製:
(a)100μlの1MのKClを引き出し、フローセルシステム全体に流す。
(b)Ag/AgCl参照電極を使用した電位ステップを加えることによってチップ電極を調整する。
(c)デカン中に7.2mg/mlのDPhPCおよび5ug/ml溶血素を含有する溶血素−脂質ミックス、それに続いて120μlのKClを流す。
(d)一連の負の電気パルスを加えて、脂質の被覆を除去する。
(e)20μLのKClおよび20μlの気泡を2回、それに続いて120μlのKClを流す。およそ4回、または電極の少なくとも80%が300pAよりも高い電流を示すまで、電気パルスを加えながらステップdおよびeを繰り返す。
(f)20μLのKClおよび20μlの気泡を2回、それに続いて120μlのKClを流して、二重層を有する電極を回復させる。
(a)チップ温度をおよそ55℃に高める。
(b)電気パルスを加えることにより、エレクトロポレーションして二重層に細孔を入れる。
材料および構成
試薬:0.3MのKCl、20mMのHepes(pH7)
デカン中の7.2mg/mlのDPhPCおよび2.5%グリセロール中の5μg/mlの溶血素
デカン中の7.2mg/mlのDPhPCおよび2.5%グリセロール中の20μg/mlの溶血素。
30μMの30T DNA w/7.5μMのストレプトアビジン
30μMの30T DNA w/7.5μMのストレプトアビジンおよび0.83%グリセロール。
Rev2ディープウェルのラージキャップ
Rev1ディープウェルのラージキャップ。
(実施例7)
二重層の形成プロトコール
1.デカン中の7.5mg/mlのDPhPC(20μL)、それに続いて120μLのKClを流す。
2.300pAの非活性化電流で−250mVから−1Vの範囲の一連の負の電気パルスを加えることにより、二重層の電圧上昇3bを行う。
3.チップを、20μLのKCl、20μLの気泡で2回、さらに120μLのKClで洗浄する。
4.二重層の電圧上昇3b。
5.−400mV〜−700mVのパルスでセルの少なくとも80%が非活性化されるまでステップ3および4を繰り返す。
a.約4〜8回繰り返す。
6.セルを、20μLのKCl、20μLの気泡で2回、さらに120μLのKClで回復させる。
細孔挿入プロトコール
方法1:実験開始時に溶血素と脂質とを混合する
1.二重層を形成した後、フローセルの上部に加温器を置く。
2.エレクトロポレーションして二重層に細孔を入れる(細孔の獲得12b)。
1.二重層を形成した後、フローセルに0.3MのKClおよび5%グリセロール中の100μg/mlの溶血素20μlを流す。
2.20μlの気泡および80μLのKClで洗浄する。
3.フローセルの上部に加温器を置き、エレクトロポレーションして二重層に細孔を入れる(細孔の獲得12b)。
ポンプで自動化された二重層の形成および電圧上昇
図28は、繰り返しの二重層生成の洗浄条件下でのセル位置に対する二重層の電圧上昇を示す。自動的な気泡およびKClでの洗浄プロトコールにより、均質な二重層の形成が可能になる。表1は、様々な条件下での(例えば、溶血素と脂質を用いる、または溶血素を用いない)二重層の形成および電圧上昇量を示す。
加えられた波形
図29は、開口したチャネルの加えられた波形およびDNA捕捉データの一例を示す。波形は、チップコード042bと名付けられ、縦軸には−0.1から0.2ボルトの範囲の加えられた電圧が示される。横軸には0から6秒の範囲の時間が表示される。捕獲波形は、−50mVで33秒の再充電の後に生じる。
開口したチャネルのデータ
実施例8の方法1を使用して、様々なプロトコールを実行する。図30〜32にプロトコールの結果を示す。
DNAの捕捉
実施例8の方法1を使用して、様々なプロトコールを実行する。図33〜37にプロトコールの結果を示す。
DNAの捕捉
図38は、二重層の形成後の(例えば、自動化プロトコール後の)細孔に関する電流対時間またはセルの数のプロットを示す。細孔の形成条件は、1MのKCl、pH7.5、室温、デカン中の15mg/mLのDPhPC脂質、およびpH7.5の水中の20μg/mlの溶血素である。
Claims (14)
- ナノ細孔センサーで使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
(a)材料層を有する電極を含むフローチャネルに緩衝溶液を方向付けることであって、前記緩衝溶液は、導電性であり、前記材料層は、1つまたは複数の脂質を含む、ことと、
(b)前記緩衝溶液と前記材料層とを接触させることと、
(c)前記電極を通る電流を測定することにより、前記材料層の少なくとも一部が、前記電極に隣接して脂質二重層を形成しているか否かを決定することと、
(d)(c)の決定に基づいて、前記電極に刺激を加えることにより、前記材料層の前記少なくとも一部が前記電極に隣接して前記脂質二重層を形成するように誘導することと
を含む、方法。 - (c)において、1つまたは複数の電圧が前記電極に加えられる、請求項1に記載の方法。
- 前記材料層が、1つまたは複数のポリンタンパク質と、界面活性剤の臨界ミセル濃度未満の濃度の1つまたは複数の界面活性剤とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記フローチャネルが、複数の電極を含み、前記複数の電極が、前記電極を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記材料層が、少なくとも2種の脂質を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝溶液が、イオン溶液を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イオン溶液が、塩化物陰イオンを含む、請求項6に記載の方法。
- 前記イオン溶液が、酢酸ナトリウムを含む、請求項7に記載の方法。
- 前記電極が、フローチャネルの1つまたは複数の疎水性表面に隣接して堆積させられる、請求項1に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のフローチャネルが、複数のフローチャネルを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のフローチャネルが、前記複数のフローチャネルに沿ったガイドレールを用いて流体的に互いに分離されている、請求項10に記載の方法。
- ナノ細孔感知装置において使用するための脂質二重層を形成する方法であって、前記方法は、
(a)複数の電極と前記複数の電極に隣接する複数の材料層とを含むチップを提供することであって、前記複数の材料層の各々は、脂質を含む、ことと、
(b)前記複数の材料層と緩衝溶液とを接触させることであって、前記緩衝溶液は、導電性である、ことと、
(c)前記複数の電極の少なくともサブセットに刺激を加えることにより、前記複数の材料層が前記複数の電極に隣接して脂質二重層を形成するように誘導することと、
(d)前記複数の電極の少なくとも約20%が、前記加えられた刺激にもはや応答しなくなるまで、ステップ(b)および(c)を繰り返すことであって、前記加えられた刺激は、前記複数の電極に加えられた約−100ミリボルト(mV)〜−1000mVの電圧パルスを含む、ことと
を含む、方法。 - 前記複数の材料層の各々が、ポアタンパク質を含む、請求項12に記載の方法。
- (a)が、前記複数の電極と脂質溶液とを接触させることにより、前記複数の材料層を形成することをさらに含み、前記脂質溶液が、前記脂質を含む、請求項12に記載の方法。
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