JP2023540776A - 一体化された細孔ベースの検出によるラテラルフロー核酸アッセイ - Google Patents
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Abstract
核酸増幅又は光学部品なしで約5分以内に水性サンプル中の微生物及びウイルスの両方の病原体を検出する可能性を有する、一体化された細孔ベースの検出器を有するラテラルフロー核酸アッセイのための装置。検出器は、超低濃度(約10M~約19Mまで)でのDNA/RNAの低コスト検出を可能にする電気機械的シグナル伝達機構に基づく。このスキームは、ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブの使用に依存する。PNAビーズは、標的病原性DNA/RNAの捕捉時に実質的な負電荷を獲得し、電場内で移動可能になる。約1V~2Vのバイアス電圧を印加すると、ハイブリダイズした標的を有するPNAビーズは、より小さい直径の細孔に電気泳動的に導かれる。その後の細孔遮断は、細孔を通る測定されたイオン電流の強力で持続的な低下をもたらす。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年9月8日に出願された米国仮特許出願第63/075,669号の優先権及び利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年9月8日に出願された米国仮特許出願第63/075,669号の優先権及び利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供に関する記載
研究又は開発
該当なし
研究又は開発
該当なし
著作権保護対象資料の通知
本特許文書の資料の一部は、米国及び他の国の著作権法に基づく著作権保護の対象となり得る。著作権の所有者は、米国特許商標庁の公的に入手可能なファイル又は記録に見られるように、特許文書又は特許開示のいずれかによる複製に異議を唱えないが、それ以外の全ての著作権を留保する。著作権者は、37 C.F.R.§1.14に準拠する権利を含むがこれに限定されない、本特許文書を秘密に保つためのその権利のいずれも放棄しない。
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1.技術分野
本開示の技術は、一般に、電荷中性ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた相補的プローブを用いた特定のRNA又はDNA断片の検出に関し、より詳細には、電荷中性ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた相補的プローブを用いた特定のRNA又はDNA断片のトランスバースフロー検出に関する。
2.背景の説明
数分で結果をもたらす低コスト、正確、かつ堅牢なポイントオブケア(POC)核酸(NA)ベースの診断装置の構想及び開発が強く推進されている。現在、ほとんどの感染症診断は、典型的には数日かかる培養法によって達成される。POCイムノアッセイは、病原体の検出のために市販されているが、これらは、限界の感度及び特異性を有することが多いが、あまり一般的でない核酸(NA)ベースの試験は、検出限界(LOD)が極めて低く、感度及び特異性の両方が90~99%の範囲である。インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、及びA群連鎖球菌を含む少数の分析物に対して、少数のPOC NAベースの検査が利用可能である。
数分で結果をもたらす低コスト、正確、かつ堅牢なポイントオブケア(POC)核酸(NA)ベースの診断装置の構想及び開発が強く推進されている。現在、ほとんどの感染症診断は、典型的には数日かかる培養法によって達成される。POCイムノアッセイは、病原体の検出のために市販されているが、これらは、限界の感度及び特異性を有することが多いが、あまり一般的でない核酸(NA)ベースの試験は、検出限界(LOD)が極めて低く、感度及び特異性の両方が90~99%の範囲である。インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、及びA群連鎖球菌を含む少数の分析物に対して、少数のPOC NAベースの検査が利用可能である。
他の適応症に対するNAベースの検査は、ナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)(NG、淋病)及びクラミジア・トラコマティス(Chlamydia trachomatis)(CT、クラミジア)の場合のような臨床検査室検査であり、サンプルを検査室に搬送し、バッチ処理し、検査し、結果を返すプロセスも典型的には数日かかる。ここで開示する技術の意義に関する要点を以下にまとめる。
ほとんどの感染症診断のための現在の方法は、1日以上を要し、これは、最適な治療及びカウンセリングの迅速な投与を妨げる可能性があり、信頼できないフォローアップ接触への依存をもたらし、抗生物質の不適切な処方をもたらし、長期の患者の苦痛を引き起こす可能性があり、高い医療費に寄与する可能性がある。
臨床サンプルにおける重要な病原体の存在又は非存在の迅速な決定、すなわち定性的検査は、通常、インフルエンザ、RSV、SARS-CoV-2、HIV、ヒトパピローマウイルス(HPV)、NG、CT等を含む最も重要な必要性である。
増幅なしのNA検出に基づく十分に低い検出限界を有する方法はまれであり、一般に高価な試薬及び/又は複雑な分析装置を必要とする。
体液中の重要な病原体の単純な存在又は非存在(はい/いいえの答え)の決定、すなわち定性的試験が最も重要な必要性である。体液中の任意のレベルでのその存在自体が異常であり、感染症の指標である一般的な病原体には、SARS-CoV-2、A群ストレプトコッカス(Streptococcus)、ナイセリア・ゴノレア(NG:Neisseria gonorrhoeae)、クラミジア・トラコマティス(CT:Chlamydia trachomatis)、インフルエンザウイルス及び百日咳菌(百日咳)が含まれる。
NA増幅に基づく病原体検出方法は、重要な欠点を有する。全てのNA増幅依存性デバイスは、サンプル調製(病原体溶解及びNA精製を含む)、NA標的増幅及びアンプリコン検出のためのサブシステムを含まなければならない。
一般に、アンプリコン検出のために光学的方法が使用され、これは、複雑さ及びコストの増加に関連して装置への光学部品の組込みを必要とする。ポリメラーゼ連鎖複製(PCR)サイクリングのための迅速な方法の目覚ましい進歩にもかかわらず、正確な温度制御の必要性により、多くの試験開発者は等温増幅法を追求するようになってきたが、これらの方法は依然として、プライマー、ポリメラーゼ、及びポリメラーゼの阻害剤を除去するための広範なNA精製、並びに慎重に制御しなければならない反応条件を要する。
広く適用可能な、NA増幅なし、標識なし、配列特異的NA検出スキームはまれである。過去10年ほどの間に、一桁のアトモル(aM、10-18M)範囲以下の臨床的に適切な濃度で増幅のないNA検出のための新しいアプローチの開発において著しい進歩がなされている。しかしながら、標的NAに相補的なオリゴヌクレオチド以外の特別な標識を必要としないのはこれらのスキームのほんの一握りである。また、ほぼ半分が何らかの種類の光学系を必要とする。残りのアプローチは、圧電、MALDI TOF MS(マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析)、又は様々な電気化学技術を伴う。
電気化学的検出に基づくこれらのスキームのうち、単純で安価な定電位アンペロメトリを使用するものは1つだけであるが、それでもPtナノ粒子標識が必要である。理想的には、増幅を伴わないNAセンサは、選択的オリゴヌクレオチドプローブのみを含み、更なる試薬、標識又は複雑なシグナル伝達技術の必要性を排除するであろう。しかしながら、上に提示された最新技術は、この理想を満たす検知方式がまれであることを示唆している。
以前の研究
本明細書に開示されるRNA/DNA検出装置は、様々な分析種がそれを横切るときに電解質で満たされた細孔又はチャネルのコンダクタンスが監視される、Coulter(DeBlois RW,Bean CP.Counting and Sizing of Submicron Particles by the Resistive Pulse Technique.Review of Scientific Instruments.1970;41(7):909-16)の研究に基づく抵抗パルスセンサではないという点で、他のナノ細孔ベースのNA検知システムとは異なる。むしろ、これは、長時間持続する細孔遮断からの大きな信号のはるかに簡単な導電率測定検出に基づいている。
抵抗パルス手法は、分析物が細孔を横切るときの短い時間スケール(μs~ms)にわたるナノ細孔電流の小さな変化の正確な測定に焦点を当てているが、本明細書に開示される装置技術は、本質的にこの信号をnA範囲に増幅し、分析物の存在を知らせるために持続的な細孔遮断に依存することによってその持続時間を無期限に延長する。
この手法は、2013年3月7日に公開され、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMonbouquette、Harold及びSchmidt、Jacobの、PCT国際公開番号、国際公開第2013/033647号に記載されているように、デバイス電子機器及び読出しを大幅に単純化する。
非特異的に結合したNAは、永続的なシグナルをほとんど与えない。「シグナル」は、数秒以上続くイオン電流の持続的な段階的減少であることに留意されたい。非相補的NAによるほとんどの制御実行は、観察可能な細孔遮断をもたらさず、いくつかの一時的な遮断(信号を構成するのに十分長く持続しない)のみがまれに観察される。しかし、非相補的NAとのビーズのインキュベーションは、一桁の範囲から約20~約30mVへのゼータ電位の増加によって示されるように、時折、実質的な非特異的結合をもたらすことが観察されている。したがって、非特異的に結合したDNAを有するこれらのビーズは、負に帯電し、電気泳動的に移動可能であり、細孔に駆動されることを可能にする。
細孔口では、電場がビーズから非特異的に結合したDNAを除去するのに十分に強く、これがビーズ電荷及び電気泳動移動度の低下を引き起こし、電気浸透流による反対方向の抗力が電気泳動力を超えてビーズを細孔から運び去ることを可能にする。この電気浸透流は、ガラス細孔壁上の固定負電荷に対する正対イオンの対向流から生じる。
実験的証拠、並びに多くの対照研究の結果は、非特異的に結合したNAのみを有するビーズが細孔口に短時間接近し、その後、誘電泳動による可能性のある可動性にもかかわらず反対の電気浸透流によって押し流されることを示す。文献は、偽陽性を回避するためのそのような能動的システムを有する別のNAベースの診断システムを開示していないと思われる。
DeBlois RW,Bean CP.Counting and Sizing of Submicron Particles by the Resistive Pulse Technique.Review of Scientific Instruments.1970;41(7):909-16
この技術は、一体化された細孔ベースの検出器を用いたラテラルフロー核酸アッセイ及びその使用方法を記載する。
一実施形態では、本開示に記載される技術は、薄いガラス膜及び細孔を有するガラスチップをラテラルフロー膜と一体化すること、並びに磁性ポリスチレンビーズ-PNA(ペプチド核酸)コンジュゲートを使用して、膜上のビーズ位置を制御し、ハイブリダイズした標的核酸により、ビーズ-PNAコンジュゲートを検出するためにビーズをガラスチップに近接して配置することを含む。この実施形態では磁性ポリスチレンビーズ-PNAが使用されているが、他の電荷中性核酸類似体を含む、電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブとコンジュゲートすることができる他の磁性基板も使用できることに留意されるべきである。
一体化された装置は、核酸増幅又は光学部品なしで約5分以内に水性サンプル中の微生物及びウイルスの両方の病原体を検出する可能性を有する。検出器は、超低濃度(10-19M程度の低濃度)でのDNA/RNAの、低コスト、無光学及び無増幅(例えば、PCRなし)検出を可能にする新規な電気機械シグナル伝達機構に依存している。
検出器の重要な特徴は、同じ塩基化学を共有するNAに対する非荷電ポリアミド類似体であるペプチド核酸(PNA)捕捉プローブの使用である。ビーズ-PNAコンジュゲートは電荷中性になるように設計されているため、それらはDC電場の存在下では感知できるほどの電気泳動運動を示さない。しかしながら、標的NA配列の捕捉時に得られる実質的な負電荷は、ハイブリダイズされたコンジュゲートを可動にする。
ハイブリダイズした標的NAを有するビーズ-PNAコンジュゲートの、より小さな直径のガラス細孔の口への電気泳動は、細孔抵抗の有意な増加を引き起こし、それにより、測定されたイオン電流の持続的に強い、持続的な低下をもたらす。非特異的に結合したNAは、細孔の口の中の強い電界でビーズコンジュゲートから除去され、持続的なシグナルをもたらさない。更に、ガラス細孔を通る反対の電気浸透流は、細孔の口から離れたハイブリダイズした標的なしでPNA-ビーズコンジュゲートを掃引する。このようにして、この単純な導電率測定装置は、標的NA(及び関連する病原体)の存在又は非存在をシグナル伝達する、高度に選択的な(稀にしか観察されない偽陽性)二値応答を与える。
装置及び方法の診断用途には、限定されないが、以下が含まれる。1.任意の微生物又はウイルス病原体、例えば、SARS-CoV-2、インフルエンザ、淋病、クラミジア、RSV、Strep;2.診療所、救急室、又は緊急治療センターでの使用;3.COVID-19スクリーニング、例えば歯科補綴物、外科予約、現場、小会議;4.家庭用診断;5.食品の安全性;並びに6.口蹄疫(ウシ)。
更なる軍事診断用途には、限定されないが、以下が含まれ得る。下痢性疾患;感染創傷部アッセイ;生物兵器剤、例えば炭疽、ペスト病;並びに場所特異的病原体、例えばデング熱又は黄熱病。
装置及び方法は、堅牢で低電力(例えば、バッテリ駆動)であり、おそらく手持ち式であり、迅速である(検出のために5分未満)。
本明細書に記載の技術の更なる態様は、本明細書の以下の部分で明らかにされ、詳細な説明は、限定を課すことなく、技術の好ましい実施形態を完全に開示することを目的とする。
本明細書に記載の技術は、以下の図面を参照することによってより完全に理解されるであろう。これらの図面は、縮尺通りではなく、例示のみを目的としている。
ここで、この装置の動作特性の図式100である図1を参照する。最初に、膜102が正電圧V+104と負電圧V-106との間に配置される。
この図式は、一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)に相補的な1つ又は複数の共有結合ペプチド核酸(PNA)プローブ110を有するポリスチレンビーズ108、及びビーズ108よりも小さい直径のガラス膜102を通る細孔114を示す。ビーズ108は、アミン末端PNAプローブ110のための結合部位として使用される表面上のカルボキシル基と共に購入される。一実施形態で論じられる特定のビーズ108は、直径が820nmである。
他のビーズ及び細孔の寸法、並びに幾何学的形状が良好に機能し得る。サブミクロン厚膜が最もよく機能したが、他の材料が使用される場合、良好な性能はこの寸法に限定されないことが見出された。更に、円筒形の細孔114が製造の目標であったが、実質的に円錐形の形状が得られた。細孔114の最小寸法が十分に小さく、1つ又は複数のハイブリダイズしたビーズが細孔114を通るイオン電流を遮断し、細孔114電流の低下をもたらすことができる限り、細孔の他の形状も機能することが可能である。
最初に、特定の一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)は、非結合部分として溶液中に包まれる。しかし、しばらくすると、特異的一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)に相補的な1つ又は複数の共有結合ペプチド核酸(PNA)プローブ110を有するポリスチレンビーズ108は、それらの標的とのハイブリダイゼーションを達成する。これは、共有結合したペプチド核酸(PNA)プローブ118が、場合によっては一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)に結合120している結合ポリスチレンビーズ116の一箇所又は複数箇所に示されている。
この図1の図式では、ポリスチレンビーズ116が3つ例の一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)にハイブリダイズしたことが分かる。この結合は、標的の長さに対応する結合ポリスチレンビーズ116上に多くの負電荷の網を作り出し、それにより、印加された正電圧V+104と負電圧V-106との間の印加された電界により、それが電気泳動的に運動性(又は電気運動性)になることを可能にする。
通常、荷電一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、112)は、細孔114がはるかに大きいので、膜102の細孔114を通って中断することなく進行する122。したがって、荷電一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、122)は、細孔114を通るイオン電流を目に見えるほど乱すことなく、はるかに大きな細孔114を通過する。
この図では、一本鎖核酸標的(DNA又はRNA、124)は、膜102の細孔114を既に通過している。
PNAは、非荷電核酸類似体である。残りのカルボキシル基は、最初にアミン末端ポリエチレングリコール(PEG)でキャップし、次いでエタノールアミンでキャップする。PNAが最適な表面密度でビーズ上にコンジュゲートされることが重要である。ビーズ表面上の残りのカルボキシル基はキャップされなければならない。ここで、ポリエチレングリコール(PEG)は、ビーズ凝集の防止を助けるために使用される。エタノールアミンは、残りのカルボキシル基を封鎖するために使用され、ほぼ電気的中性を達成するために必要である。これらのビーズ修飾ステップの後、ビーズは1桁の低い負mVのゼータ電位を有し(及び本質的に中性である)、中程度の電場では感知できるほどには移動しない。
しかしながら、RNA及びDNA112はかなりの負電荷を有し、標的RNA又はDNAが修飾ビーズ上のPNAにハイブリダイズする120と、結合ポリスチレンビーズ116に示されるように、複合体は印可された電場中で移動するのに十分な負電荷を有する(V-106~V+104)。
結合ポリスチレンビーズ116をもたらすハイブリダイズした標的を有するPNAビーズが細孔114の開口部に近づくと、イオン電流のかなりの持続的な偏向が起こる。イオン電流のこの持続的な減少は、「持続性」と呼ばれる。
ここで、図2A~図2Cを参照すると、これらは全て、Koo B,Yorita AM,Schmidt JJ,Monbouquette HG.「Amplification-free,sequence-specific 16S rRNA detection at 1 aM.」Lab Chip.018;18(15):2291-9.doi:10.1039/C8LC00452H.から入手した先行技術である。
図2Aは、薄くエッチングされた領域の中心に微細加工されたナノ細孔を有する1cm角のホウケイ酸ガラスサンプルの写真である。
図2Bは、斜めから見た場合の、図2Aのナノ細孔のエッチングされた膜の走査型電子顕微鏡写真(SEM)である。
図2Cは、図2Bのエッチングされた膜に集束イオンビーム(FIB)によって生成されたナノ細孔のSEMである。このようなナノ細孔を図1の細孔114として用いてもよい。
ここで、ホウケイ酸ガラスは、科学界での幅広い利用可能性のために使用されてきた。しかしながら、細孔材料は、原則として、偽陽性試験結果を防止するのを助けるために電気浸透流を発生させることができるように、実質的な表面濃度の固定負電荷を有する任意の材料であり得る。更に、2つ以上の材料の複合材料を使用することもできる。
ここで、図3A、図3B、及び図3Cを参照する。
図3Aは、一体化された細孔に基づく検出を伴うラテラルフロー核酸アッセイの一実施形態の側面図300である。基板302としては、ホウケイ酸ガラス顕微鏡スライド等のガラス基板が用いられる。ガラス基板302上に、底面306及び上面308を有する膜304が配置される。膜304の一方の側面には、サンプルローディング領域310がある。
ガラスチップ312は、図1で上述したように製造されたマイクロ又はナノ細孔114を含む。この細孔114は、直径が約500nmであるため、この図では見えにくい。ガラスチップ312は、上面308で膜304に取り付けられ、導電性緩衝液316の液滴を使用して他方の面で白金電極314に導電的に結合される。
これらのガラスチップ312は、PNAビーズ及びプロセス流体を含む使い捨てアッセイカートリッジに組み込まれる。
膜304、底面306、及び基板302の間にはまた、導線320が取り付けられた白金箔電極318が配置される。白金箔電極318及び白金電極314は、イオンが細孔114を通過するときにガラスチップ312に感知電流を伝導するように配置されている。
ここでは箔電極318が示されているが、単純なワイヤ、パターン化されたワイヤ、又は更には基板302上に直接堆積された薄膜導体等、他の電極構成で代用することもできる。
動作中、サンプルはサンプルローディング領域310にローディングされ、膜304は、膜304のキャピラリ作用を介して、より重要なことには細孔114に近接して、ガラスチップ312を横切ってサンプルを横方向に輸送する。そのようなキャピラリベースの膜304は、ニトロセルロースベース、ガラス繊維ベース、又は本発明の実施に使用される材料に対して本質的に非反応性の他の材料であってもよい。
膜304の一例は、Cytiva製のFusion5膜製品である(両面が水透過性であるように裏打ちされていない)。そのような膜304は、磁性又は非磁性PNAビーズのいずれかがそれを通って移動することができるように十分に大きい有効細孔径を有する。Fusion5膜304では、別個のサンプルローディング領域310(異なる材料で構成される)は不要であるが、別個のサンプルパッドを使用することができる。より大きな液体サンプルが使用される場合、追加の吸収パッドをガラス検出器の下流に追加して過剰な液体を吸収し、それによってラテラルフロー膜に沿った流れを促進することができる。
図3Bは、図3Aの一体化された細孔に基づく検出を伴うラテラルフロー核酸アッセイの側面図の拡大断面図である。これは、ガラスチップ312及び細孔114の微細な詳細がより良好に認識され得るように拡大される。
図3Cは、ガラスチップ312上に堆積されたポリジメチルシロキサン(PDMS)上部パターンの上面図である。
ここで、図3A、図3B、及び図3Cを参照する。微細加工ナノ細孔ガラスチップ312は、ハイスループット製造、POCマイクロ流体デバイスへのより直接的なインターフェース、及び低コストデバイスの製造を容易にする。そのようなガラスチップ312は、100ナノメートルからミクロンスケールの細孔114を有するサブミクロン厚のホウケイ酸ガラス膜を作製するためにMEMS(微小電気機械システム)プロセスを使用して開発された。
そのようなガラスチップ312を含むカートリッジは、安価な電子機器、ディスプレイ、及び無線通信を含むハンドヘルドベースユニットに挿入される可能性が高い。
一体化された細孔ベースの検出器300を有するラテラルフロー核酸アッセイの別の実施形態では、磁鉄鉱を含むポリスチレンビーズの位置を維持するために磁石322が使用され、それによって強磁性特性を有し、したがって磁石322に引き付けられる。ポリスチレンビーズを強磁性化するために、他の磁性材料を用いてもよいことに留意されたい。ネオジム磁石、別の永久磁石、又は電磁石であり得る磁石322は、ハイブリダイゼーションを行うためにサンプルがビーズ上に引き込まれている間、磁性PNAビーズを定位置に保持するために使用される。
図3Cでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)の上部パターン324が見られることに留意されるべきである。このパターンは、導電性緩衝液316の液滴が白金電極314から離れて広がるのをより良好に防ぐために、ガラスチップ312の上面に堆積される。これは、細孔114の上に位置する円形開口部326を介してより良好に達成される。
標的核酸は、サンプルローディング領域310に導入されたサンプルがPNAビーズ上を流れると、PNAビーズにハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズした標的を有するビーズがガラスチップに向かって移動し、細孔114を遮断することができるように、磁石322が除去される。典型的には、サンプルは、標的を細孔114に向かって「洗い流す」ように作用するチェイサー流体の添加による膜304のキャピラリ作用によって移動される。
考察
この技術は、低コスト、低電力(例えば、バッテリ駆動)、携帯型、小型、迅速かつ堅牢なデバイスを可能にするNA検出の潜在的に大きな進歩を表す。デバイスの一部として、検出器は、サンプル採取、細胞溶解、NA抽出、及び磁気ビーズ上のPNAプローブへの標的NAハイブリダイゼーションのための全体的なプロセスフローと理想的に一体化される。
サンプルの採取及び溶解は、溶解緩衝液を予めローディングしたシリンジ中で同時にかつ別々に行われる可能性が高い。サンプル(例えば、尿、血液)をシリンジに引き込み、約1分で溶解(すなわち、微生物細胞エンベロープの化学的破壊又はウイルスカプシドの破壊)が起こる。続いて、数滴の溶解されたサンプルが、シリンジに取り付けられたサブミクロンフィルタ(約0.1μmの細孔径)を通してアッセイデバイスのサンプルパッド領域上に堆積される。フィルタは、負に帯電した場合に細孔遮断を引き起こし、偽陽性信号をもたらす可能性がある粒子状物質を除去するために必要である可能性が高い。
PNAビーズは、ガラスチップ312検出器に非常に近い位置又はその真下で膜304上に事前に堆積される。ガラスチップ312は、両側に気泡が閉じ込められることなくガラス膜304が湿潤した状態で取り付けられることを可能にする任意の手段によって膜304上に堆積されてもよい。
ここで、プローブコンジュゲート電荷中性ポリスチレンビーズを用いて特定の核酸を検出するための装置の検出器の図400である図4を参照されたい。これは、図3A~図3Bの装置の実際の動作時の写真から取得した線図である。
例示的な手順
ここで、プローブコンジュゲート電荷中性ポリスチレンビーズを用いて特定の核酸を検出するための方法のフローチャート500である図5A及び図5Bを参照されたい。
502において、
裏打ちされていない(両面水透過性)Fusion5膜を2cm×8cmの帯に切断し、切断中に生成された微粒子を圧縮空気で穏やかに吹き付けることによって除去する。
504において、
Pt箔電極(0.7cm×2cm)をガラス顕微鏡スライド上に配置し、電極が帯のほぼ真下に配置されるように、Fusion5膜帯を上に配置する。マニキュア液は、はんだワイヤを有する電極の端部をスライドに接合し、その周りをシールするために使用される。
506において、
アセンブリは、ネオジム磁石(約1cm×約2cm×約0.2cm)の上に、磁石が電極の下になるように配置される。
508において、
約10mg/mLの磁性PNAビーズ約10μLを電極の上方の膜上に堆積させる。磁石はビーズを定位置に保持すべきである。
510において、
濾過されたサンプル(約200μL又は約4滴)を(サンプルローディング領域内の)Fusion5膜の一端に添加し、続いてサンプルを膜帯に沿ってPNAビーズの上に追い込むのに十分な緩衝液(10mMのNaCl、25mMのTris-HCl、pH7.0)を添加する。
512において、
反転ガラスチップ上に緩衝液の液滴を配置する。次いで、チップを素早く反転させ、PNAビーズ、磁石及び箔電極の真上のFusion5膜上に配置する。次に、1滴の緩衝液をチップの上面のリザーバに添加してガラス膜を覆い、このリザーバに電極を配置する。
514において、
ハイブリダイゼーションを約1分間行った後、磁石を取り外し、電極間に約1V~約1.5Vの電位を印加する。ベースライン電流は、通常、約60nA~約100nAである。
516において、
標的NAがサンプル中に存在した場合、電流のnA範囲の低下は約5分以内に予想される。
更なる開発
この方法及びラテラルフロー装置の実証は、約10,000CFU/mLという比較的高い大腸菌(E.coli)サンプル濃度でのみ行われている。将来の研究では、この設定を使用して少なくとも10CFU/mLの検出限界を実証することができる可能性があり、これは、約1CFU/100mLに相当する約100zMのrRNAの検出限界が検出器のみで実証されていることを考えると、可能であり得るものよりも依然として桁違いに高い。
概念的には、上述したものに類似した市販の装置が想定される。しかしながら、Fusion5膜帯は、使い捨てカートリッジ内に乾式で組み込まれる可能性が高い。乾燥膜は、pHを制御するためにサンプルパッド領域に事前に堆積した緩衝塩、並びに事前に堆積した磁性又は非磁性PNAビーズを有する可能性が高い。磁石は、ベースユニットに組み込まれた電磁石である可能性が高い。サンプルパッドとは反対側の端部の吸収パッドは、流体をFusion5膜を通して引き込むために使用される可能性が高い。
ガラスチップとFusion5膜とのインターフェースの態様は、製造可能なカートリッジでは不明である。1つの手法は、カートリッジがベースユニットに挿入された後のある時点まで、カートリッジの残りの部分から密封された湿潤状態(気泡なし)でガラスチップを収容することである。
電子機器は、電流を監視しながら、ガラス膜を横切る電位を約1V~約2Vに維持する。スクリーン上の細孔通過電流の低下を見ることができ、これは検出事象である。細孔の周りの複数のビーズのクラスタ化に起因する可能性がある二重滴が観察される場合がある。
このシステムを開発している間、先に引用したKooの論文に記載されているような市販のキットを用いて核酸を抽出することが多かった。しかし、約1分間のpH約10でのサンプル溶解、続いて約0.1μmの濾過及び中和が適切であるように見えることも示されている(しかし、まだ公開されていない)。予めローディングされた濃縮高pH緩衝液(又は乾燥緩衝塩)を含むチャンバ内に約1mLのサンプル(尿、血液、唾液、サンプリング綿棒を押し込んだ緩衝液)を引き上げるシリンジ型サンプリングデバイスが開発されている。約1分間待機した後、シリンジを押し下げるが、流出した溶解サンプルは約0.1μmのフィルタを通過し、この溶解及び濾過されたサンプルの数滴がラテラルフロー帯上に堆積する。好ましい構成では、溶解されたサンプルがPNAビーズ上を流れる前にpHを中和するために帯上に乾燥中和緩衝液が存在する。あるいは、濾過の前に中和を行うために、別のチャンバをシリンジサンプリング装置に追加することができる。
一体型細孔ベース検出システムを用いたラテラルフロー核酸アッセイの更なる実施形態
1.序論
この実施形態はまた、コンジュゲート化PNA捕捉プローブによる持続的細孔遮断に基づく。しかしながら、この実施形態は、細孔遮断ポリスチレンビーズが磁性である必要はない。
2.ラテラルフロー帯アセンブリ
ここで、ラテラルフロー帯アセンブリ600の側面図である図6を参照する。
組立手順ステップは以下の通りである。
Cytiva製のA-4サイズのFusion5膜シートを1.5cm×3cmの帯に切断する。
用紙カッターを使用して、Cytivaバッキングカードを1.5cm×8cm片に切断する。これがアセンブリのためのバッキング602となる。
Pt箔604を2mm×1cmの帯に切断し、端部にワイヤ606をはんだ付けしてPt箔電極608を作製する。
バッキングカード上のフィルムを剥がし、バッキング602カードの中央にはんだ付けされたPt箔電極608を取り付ける。
Pt箔電極608及びバッキング602の縁部の上に、2つのFusion5膜片、ローディング面610及び吸収面612を取り付ける。これらの2つのFusion5膜片の間に1mm未満の間隙614を残して、Pt箔電極を下に露出させる。この組み立てられたカードは、ラテラルフロー帯アセンブリ600として知られている。
PNA修飾ビーズは、以下で更に詳述するように、ラテラルフロー帯アセンブリ600のローディング面610の点616に配置される。
チップの片側をローディング面610とする。
PNA/PEG/エタノールアミン修飾ポリスチレンビーズをハイブリダイゼーション緩衝液(10mMのNaCl、25mMのTris-HCL、pH7、1%Tween20)で洗浄する。
遠心濾過によってビーズを濃縮し、ローディング点616で間隙614の隣にビーズをロードする。
ビーズが乾燥する前に、ラテラルフロー膜帯をバスソニケーターの壁に保持することによってビーズに振動力を加える。このステップは、ビーズ凝集を防止するのに役立つ。
ビーズを乾燥させる。
3.ガラスチップアセンブリ
ここで、図7A~図7Cを参照する。図7Aは、ガラスチップアセンブリ700の側面図である。図7Bは、ガラスチップ704上に堆積されたポリジメチルシロキサン(PDMS)上部パターン702の図である。このガラスチップ704は、厚さ1μm未満の薄化領域706を形成するために予めエッチングされており、続いてFIB加工されてナノ細孔708を製造する。
図7Aに示すように、使用されるビーズ径よりも小さくなければならない直径約1μm~約800nmの「ナノ細孔」708を有するガラスチップ704は、2つのPDMSOリング状フィルム702及び710の間の中央に挟まれる。セロハンテープ(例えば、スコッチテープ)は、PDMSフィルム702、710上のダストを簡単に除去するために使用され、これはガラスチップ704への良好な取り付けを確実にする。
ここで図7Cを参照すると、ガラスチップ704上に堆積されたポリジメチルシロキサン(PDMS)底部フィルム710の図が見られる。
底部PDMSフィルム710は、約0.3mmの厚さであり、ナノ細孔708を露出させるための円形開口部712を有する。チャネル714は、縁部から円形開口部712まで全面的に形成されている。この設計は、下にあるFusion5膜が濡れると空気を逃がすことを可能にし(以下を参照)、気泡の形成を防止する傾向がある。上部PDMSフィルム702は約1mmの厚さを有し、ナノ細孔を露出させるための円形開口部716も有する。この円形開口部716は、検出に使用される上部電極のための緩衝液リザーバとして作用する(下記参照)。
4.システムアセンブリ全体
ここで、図6、図7A、及び図8を参照する。図8は、システムアセンブリ800全体の側面図である。
作用電極としてPt箔604電極を使用しながら、対向電極及び参照電極の両方として一方のAg/AgCl電極804を使用することによって、ラテラルフロー帯アセンブリ600をポテンショスタット802に取り付ける。
ガラスチップアセンブリ700をラテラルフロー帯アセンブリ600の上部に置く。ナノ細孔708をラテラルフロー帯アセンブリ600内の間隙614の真上に配置する。
ハイブリダイゼーション緩衝液の液滴806を、ガラスチップアセンブリ700のPDMS上部パターン702の円形開口部716に入れる。
上記のAg/AgCl電極804を、同じく上記のPDMS上部パターン702内の上部緩衝液リザーバ液滴804内に静かに下降させて、ガラスチップアセンブリ700内のナノ細孔708を通る電気的接続を確立する。
5.検出
約400μLの試験サンプル808をラテラルフロー帯アセンブリ600のローディング面610上に堆積させる。キャピラリ流により、液体サンプルは、サンプル中の標的RNA又はDNAが修飾ビーズ上のPNAプローブとハイブリダイズするように、点616に配置されたPNA修飾ビーズ上を流れる。
ビーズは流体よりもゆっくりとFusion5膜内を移動するが、少なくとも一部はガラスチップの細孔の下の間隙に運ばれる。流体は、間隙614を通って、Fusion5膜の吸収面612に進む。流体はまた、ガラスチップ704の下の下部PDMS Oリング形状フィルム710の開口部をローディングし、空気は、気泡が形成されないように下部PDMS Oリング形状フィルム710のチャネル714を通って逃げる。
この間隙は、いかなる材料も完全に非含有でなくてもよいことに留意されるべきである。それは、ハイブリダイズしたPNAビーズがその中で十分に移動し、細孔114を遮断するための移動が妨げられないように、十分に開いていなければならない(高い多細孔性、十分に大きい細孔径)。
このプロセスの間、ポテンショスタット802への電源がオンにされ、コンピュータ上のソフトウェアを使用してデータが収集される。
ここで、ポテンショスタット802によって観察される細孔708の電流のプロット900である図9を参照する。
参考までに、「ポテンショスタット」は、実際には、トランス細孔電圧を固定し、電流を監視するために使用される非常に単純な装置であり得る。実際には、電池供給電圧源及び電流モニタと同じくらい簡単であり得る。
安定したベースライン902電流が現れる。陽性試験の場合、数分後、ナノ細孔708を遮断するハイブリダイズした標的核酸を有するPNAビーズに起因して電流の持続的な低下が起こり、これは検出信号とみなされる。陰性試験では、電流の低下は観察されず、安定したベースライン電流のみが存在する。
この図9は、緩衝液中の10aMの大腸菌(E.coli)16S rRNAの検出が達成される典型的な成功した検出データを示す。4つの例示的な検出信号は、904、906、908及び910で囲まれている。電界極性は、最初の3つの検出信号904、906、及び908の後に逆転し、次いで最初の3つの事象の後に戻った。ベースライン902への戻りが観察され、続いて反復信号906、908、910が観察される。
この実施形態では、別の実施形態のように磁性PNAビーズを適所に保持する必要がないので、図3Aの磁石322はもはや必要とされないことに留意されるべきである。
本明細書の説明から、本開示は、以下を含むがこれらに限定されない本技術の複数の実施態様を包含することが理解されよう。
(i)薄いガラス膜及び細孔を有するガラスチップと(ii)ラテラルフロー膜との一体化、並びに膜上のビーズ位置を制御し、ハイブリダイズした標的核酸とのビーズ-PNAコンジュゲートの検出のためにビーズをガラスチップに近接して配置するための磁気ビーズ-PNAコンジュゲートの使用。
上部電極、ラテラルフロー膜、及び下部電極を有するガラスチップを含む、ラテラルフローアッセイ装置であって、ガラスチップはラテラルフロー膜と一体化されている、ラテラルフローアッセイ装置。
特定の核酸を検出するための装置であって、(a)上面、底面、ローディング面、及び吸収面を有するラテラルフロー膜と、(b)ラテラルフロー膜の上面と接触する細孔と、(c)ラテラルフロー膜の底面に配置された底部電極と、(d)細孔の上方に配置され、緩衝液に浸漬された上部電極と、を含み、(e)ローディング面のラテラルフロー膜を濡らすために緩衝液を添加すると、緩衝液のラテラルフローが吸収面へ向かう途中で細孔を通過し、(f)緩衝液は、上部電極と底部電極との間で検出され得る電流を導くように十分に堆積され、(g)上部電極と底部電極との間に電圧が印加されると、電流が細孔を通過する、特定の核酸を検出するための装置。
細孔が、約500nmの最小直径及び約1μm未満の典型的な高さを有する実質的に円筒形から円錐形の形状である、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
細孔が実質的にホウケイ酸ガラスを含む、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
(a)ガラスチップアセンブリであって、(i)典型的に約1μm以下の厚さのホウケイ酸ガラスのエッチングされた部分と、(ii)エッチングされた部分内に配置されている細孔と、(iii)細孔の上、及び細孔の反対側に中心がある円形開口部を含む、ホウケイ酸ガラスの上に堆積されたポリジメチルシロキサン(PDMS)の上部パターンと、を含む、ガラスチップアセンブリを更に含む、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
(a)ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた1つ又は複数の電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブを更に含み、(b)PNA捕捉プローブが標的病原性DNA/RNAを捕捉するように設計されている、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
細孔の直径が、ポリスチレンビーズの直径よりも小さい、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
(a)ポリスチレンビーズの堆積点に隣接する磁石を更に含み、(b)ポリスチレンビーズが一部に磁石材料を含み、(c)磁石は、ポリスチレンビーズを吸着し、保持する、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
特定の核酸を検出するための装置であって、(a)ラテラルフロー帯アセンブリであって、(1)バッキングと、(2)バッキング上に配置されたローディング面と、(3)バッキング上に配置された吸収面と、(4)ローディング面及び吸収面の両方と電気的に接触してバッキング上に配置された電極と、(5)ローディング面と吸収面との間に配置された間隙であって、電極の上方に配置された間隙と、(6)ローディング面の位置に堆積した1つ又は複数のペプチド核酸(PNA)ビーズと、を含む、ラテラルフロー帯アセンブリと、(b)ガラスチップアセンブリであって、(1)上面及び底面を有するガラスチップと、(2)ガラスチップの底部に配置された厚さ約1μm未満のエッチングされた領域と、(3)ガラスチップのエッチングされた領域に配置されたナノ細孔と、(4)ガラスチップの上面に配置された第1の円形開口部を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)上面形状と、(5)ガラスチップの底面に配置された第2の円形開口部を有するPDMS底部形状であって、第2の円形開口部から形状の縁部までの開放チャネルを含む、PDMS底部形状と、を含むガラスチップアセンブリと、(c)システムアセンブリ全体であって、(1)ガラスチップアセンブリに取り付けられたラテラルフロー帯アセンブリと、(2)ガラスチップアセンブリのナノ細孔と整列するラテラルフローアセンブリの間隙と、(3)箔電極及びナノ細孔の上方に配置されたAg/AgCl電極に接続されたポテンショスタットと、を含むシステムアセンブリ全体と、を含む、特定の核酸を検出するための装置。ここではAg/AgCl電極が使用されているが、参照電極及び対電極の両方として同時に作用することができる代替材料を使用することができる。
(a)ガラスチップアセンブリのPDMS上部パターンの円形開口部に配置されたハイブリダイゼーション緩衝液の液滴と、(b)一端が液滴に浸漬されている、Ag/AgCl電極と、を更に含む、任意の先行する又は後続の実施態様の装置。
ポテンショスタットが、ナノ細孔を通過する電流を測定する、任意の先行する又は後続する実施態様の装置。
特定の核酸を検出するための装置であって、(a)薄いガラス膜及び細孔を有するガラスチップと、(b)細孔と接触しているラテラルフロー膜と、(c)磁気ビーズ-PNAコンジュゲートと、を含み、(d)磁気ビーズ-PNAコンジュゲートの位置が、磁石を介して膜上で制御され、(e)磁気ビーズ-PNAコンジュゲートが、ハイブリダイズした標的核酸とのビーズ-PNAコンジュゲートの検出のためにガラスチップ細孔に近接して配置される、特定の核酸を検出するための装置。
標的核酸(NA)を検出するための方法であって、(a)バッキングされていないFusion5膜を帯に切断し、切断中に生成された微粒子を除去することと、(b)箔電極をガラス顕微鏡スライド上に配置し、電極が帯のほぼ真下に配置されるように、Fusion5膜帯を電極の上に配置することと、(c)磁石が電極の下に配置されるように、ガラススライドをネオジム磁石の上に配置することと、(d)電極の上方の位置で膜上に磁性PNAビーズを堆積させることであって、磁石はビーズを所定の位置に保持すべきである、ことと、(e)溶解及び濾過されたサンプルをFusion5膜の一端に添加し、続いてサンプルを膜帯の下方及びビーズの上に追い込むのに十分な緩衝液を添加することと、(f)反転ガラスチップ上に緩衝液の液滴を配置することと、(g)ガラスチップを反転させ、ビーズ、磁石及び箔電極の真上のFusion5膜上にガラスチップを配置することと、(h)ガラスチップの上面のリザーバに緩衝液の液滴を添加し、上部電極をリザーバに配置することと、(i)ハイブリダイゼーションが生じるのを待って、磁石を除去し、電極間に電位を印加することと、(j)標的NAがサンプル中に存在する場合、電流の低下が観察される、ことと、を含む、標的核酸(NA)を検出するための方法。
標的核酸(NA)を検出するための方法であって、(a)上面、底面、ローディング面、及び吸収面を含むラテラルフロー膜を提供することと、(b)ラテラルフロー膜と接触する細孔を提供することと、(c)ラテラルフロー膜の底面に配置された底部電極を提供することと、(d)細孔の上方に配置された上部電極を提供することであって、上部電極は緩衝液に浸漬される、ことと、(e)ローディング面のラテラルフロー膜を濡らすために緩衝液を分注し、それによって緩衝液のラテラルフローが吸収面へ向かう途中で細孔を通過するようにすることと、(f)緩衝液は、上部電極と底部電極との間で検出され得る電流を導くように十分に堆積される、ことと、(g)上部電極と底部電極との間に電圧が印加されると、電流が細孔を通過する、ことと、を含む、標的核酸(NA)を検出するための方法。
標的核酸(NA)を検出するための方法であって、(a)ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブを提供することと、(b)ラテラルフロー膜と接触する細孔を提供することと、(c)サンプルを溶解することと、(d)溶解されたサンプルを濾過することと、(e)溶解され濾過されたサンプルを細孔に隣接してラテラルフローを行うことと、(f)細孔にわたって電圧を印加することと、(g)細孔を通過するイオン電流を検出することと、(h)細孔を通過するイオン電流の持続的な低下を通じて特定の核酸を検出することと、を含む、標的核酸(NA)を検出するための方法。
本明細書で使用される場合、単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことができる。単数形での対象への言及は、明示的に述べられていない限り、「1つ及び唯一の1つ」を意味するものではなく、むしろ「1以上」を意味するものである。
本開示内の「A、B及び/又はC」等のフレーズの構築物は、A、B、若しくはCのいずれかが存在し得るか、又は項目A、B、及びCの任意の組合わせについて説明する。「少なくとも1つ」等を示し、続いて要素のグループを列挙するフレーズ構築物は、これらのグループ要素の少なくとも1つが存在することを示し、これは、該当する場合、列挙された要素の任意の可能な組合わせを含む。
「一実施形態」、「少なくとも1つの実施形態」、又は同様の実施形態の表現を指す本開示における言及は、記載された実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、又は特性が本開示の少なくとも1つの実施形態に含まれることを示す。したがって、これらの様々な実施形態の語句は、必ずしも全てが同じ実施形態、又は説明されている他の全ての実施形態とは異なる特定の実施形態を指すとは限らない。実施形態のフレーズは、所与の実施形態の特定の特徴、構造、又は特性が、開示された装置、システム、又は方法の1つ又は複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わされ得ることを意味すると解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「セット」という用語は、1つ又は複数の物体の集合を指す。したがって、例えば、オブジェクトのセットは、単一のオブジェクト又は複数のオブジェクトを含むことができる。
第1及び第2、上部及び底部、上及び下、左及び右等の関係用語は、必ずしもそのような実体又は動作間の実際のそのような関係又は順序を必要とせず、又は暗示せずに、1つの実体又は動作を別の実体又は動作から区別するためにのみ使用され得る。
「を含む(comprises)」、「を含むこと(comprising)」、「を有する(has)」、「を有すること(having)」、「を包含する(includes)」、「を包含すること(including)」、「を含有する(contains)」、「を含有すること(containing)」という用語、又はそれらの任意の他の変形は、非排他的包含を網羅することを意図しており、その結果、要素のリストを含む、有する、含む、含有するプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素のみを含むわけではなく、明示的に列挙されていない、又はそのようなプロセス、方法、物品、若しくは装置に固有の他の要素を含んでもよい。「aを含む」、「aを有する」、「aを包含する」、「aを含有する」の後に続く要素は、更なる制約なしに、その要素を含む、有する、含む、含有するプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一の要素の存在を排除するものではない。
本明細書で使用される場合、「およそ」、「近似」、「実質的に」、「本質的に」、及び「約」という用語、又はそれらの任意の他のバージョンは、小さな変形を記載及び説明するために使用される。事象又は状況と併せて使用される場合、これらの用語は、その事象又は状況が正確に起こる場合、並びにその事象又は状況が近似して起こる場合を指すことができる。数値と組み合わせて使用する場合、用語は、±5%以下、±4%以下、±3%以下、±2%以下、±1%以下、±0.5%以下、±0.1%以下、又は±0.05%以下等、その数値の±10%以下の変動の範囲を指すことができる。例えば、整列された「実質的に」は、±10゜以下、例えば±5゜以下、±4゜以下、±3゜以下、±2゜以下、±1゜以下、±0.5゜以下、±0.1゜以下、又は±0.05゜以下等の範囲の角度変動を指すことができる。
更に、量、比、及び他の数値は、本明細書では範囲形式で提示されることがある。そのような範囲形式は、便宜上及び簡潔さのために使用されることが理解され、範囲の限界として明示的に指定された数値を含むが、各数値及び部分範囲が明示的に指定されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲も含むように柔軟に理解されるべきである。例えば、約1~約200の範囲の比は、約1及び約200の明示的に列挙された限界を含むが、約2、約3、及び約4等の個々の比、並びに約10~約50、約20~約100等の部分範囲も含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される「結合される」という用語は、接続されていると定義されるが、必ずしも直接的ではなく、必ずしも機械的ではない。特定の方法で「構成される」装置又は構造は、少なくともそのように構成されるが、列挙されていない方法で構成されてもよい。
利益、利点、問題に対する解決策、及び任意の利益、利点、又は解決策を発生させるか、又はより顕著にする可能性がある任意の要素(複数可)は、本明細書に記載の技術又は任意の若しくは全ての特許請求の範囲の重要な、必要な、又は本質的な特徴又は要素として解釈されるべきではない。
更に、前述の開示では、本開示を簡素化する目的で、様々な実施形態において様々な特徴を一緒にグループ化することができる。この開示方法は、特許請求される実施形態が各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映すると解釈されるべきではない。本発明の主題は、単一の開示された実施形態の全ての特徴よりも少ない特徴にあり得る。
本開示の要約は、読者が技術的開示の性質を迅速に確認することを可能にするために提供される。それは、特許請求の範囲又は意味を解釈又は限定するために使用されないことを理解して提出される。
いくつかの管轄区域の実施は、その出願が提出された後に本開示の1つ又は複数の部分の削除を必要とし得ることが理解されよう。したがって、読者は、本開示の元の内容について出願時の出願を参照すべきである。本開示の内容のいかなる削除も、出願当初の出願のいかなる主題の放棄、喪失又は公衆への貢献として解釈されるべきではない。
以下の特許請求の範囲は、本明細書によって本開示に組み込まれ、各特許請求の範囲は、別個に特許請求される主題として独立している。
本明細書の説明は多くの詳細を含むが、これらは本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではなく、単に現在好ましい実施形態のいくつかの例示を提供するものとして解釈されるべきである。したがって、本開示の範囲は、当業者に明らかになり得る他の実施形態を完全に包含することが理解されよう。
当業者に知られている開示された実施形態の要素に対する全ての構造的及び機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、本特許請求の範囲に包含されることが意図される。更に、本開示の要素、構成要素、又は方法ステップは、要素、構成要素、又は方法ステップは、特許請求の範囲に明示的に記載されているかどうかにかかわらず、公衆に提供されたものであることを意図していない。本明細書の特許請求の範囲の要素は、その要素が「のための手段(means for)」という語句を使用して明示的に列挙されていない限り、「ミーンズ・プラス・ファンクション(means plus function)」要素として解釈されるべきではない。本明細書の特許請求の範囲の要素は、その要素が「のためのステップ(step for)」という語句を使用して明示的に列挙されていない限り、「ステップ・プラス・ファンクション(step plus function)」要素として解釈されるべきではない。
Claims (15)
- 特定の核酸を検出するための装置であって、
(a)上面、底面、ローディング面、及び吸収面を有するラテラルフロー膜と、
(b)前記ラテラルフロー膜の上面と接触する細孔と、
(c)前記ラテラルフロー膜の底面に配置された底部電極と、
(d)前記細孔の上方に配置され、緩衝液に浸漬された上部電極と、
を含み、
(e)前記ローディング面の前記ラテラルフロー膜を濡らすために緩衝液を添加すると、前記緩衝液のラテラルフローが前記吸収面へ向かう途中で前記細孔を通過し、
(f)前記緩衝液は、前記上部電極と前記底部電極との間で検出され得る電流を導くように十分に堆積され、
(g)前記上部電極と前記底部電極との間に電圧が印加されると、前記電流が前記細孔を通過する、
装置。 - 前記細孔が、約500nmの最小直径及び約1μm未満の高さを有する実質的に円筒形から円錐形の形状である、請求項1に記載の装置。
- 前記細孔が実質的にホウケイ酸ガラスを含む、請求項2に記載の装置。
- (a)ガラスチップアセンブリであって、
(i)約1μm以下の厚さのホウケイ酸ガラスのエッチングされた部分と、
(ii)前記エッチングされた部分内に配置されている前記細孔と、
(iii)前記細孔の上、及び前記細孔の反対側に中心がある円形開口部を含む、前記ホウケイ酸ガラスの上に堆積されたポリジメチルシロキサン(PDMS)上部パターンと、
を含む、ガラスチップアセンブリを更に含む、請求項3に記載の装置。 - (a)ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた1つ又は複数の電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブを更に含み、
(b)前記PNA捕捉プローブが標的病原性DNA/RNAを捕捉するように設計されている、
請求項1に記載の装置。 - 前記細孔の直径が、前記ポリスチレンビーズの直径よりも小さい、請求項5に記載の装置。
- (a)前記ポリスチレンビーズの堆積点に隣接する磁石を更に含み、
(b)前記ポリスチレンビーズが一部に磁鉄鉱を含み、
(c)前記磁石は、前記ポリスチレンビーズを吸着し、保持する、
請求項6に記載の装置。 - 特定の核酸を検出するための装置であって、
(a)ラテラルフロー帯アセンブリであって、
(1)バッキングと、
(2)前記バッキング上に配置されたローディング面と、
(3)前記バッキング上に配置された吸収面と、
(4)前記ローディング面及び吸収面の両方と電気的に接触して前記バッキング上に配置された電極と、
(5)前記ローディング面と前記吸収面との間に配置された間隙であって、前記電極の上方に配置された間隙と、
(6)前記ローディング面の位置に堆積した1つ又は複数のペプチド核酸(PNA)ビーズと、
を含む、ラテラルフロー帯アセンブリと、
(b)ガラスチップアセンブリであって、
(1)上面及び底面を有するガラスチップと、
(2)前記ガラスチップの底部に配置された厚さ1μm未満のエッチングされた領域と、
(3)前記ガラスチップの前記エッチングされた領域に配置されたナノ細孔と、
(4)前記ガラスチップの上面に配置された第1の円形開口部を有するポリジメチルシロキサン(PDMS)上面形状と、
(5)前記ガラスチップの前記底面に配置された第2の円形開口部を有するPDMS底部形状であって、前記第2の円形開口部から前記形状の縁部までの開放チャネルを含む、PDMS底部形状と、
を含むガラスチップアセンブリと、
(c)システムアセンブリ全体であって、
(1)前記ガラスチップアセンブリに取り付けられた前記ラテラルフロー帯アセンブリを含み、
(2)前記ラテラルフローアセンブリの前記間隙が、前記ガラスチップアセンブリの前記ナノ細孔と整列し、
(3)前記箔電極及び前記ナノ細孔の上方に配置されたAg/AgCl電極に接続されたポテンショスタットを含む、
システムアセンブリ全体と、
を含む、装置。 - (a)前記ガラスチップアセンブリの前記PDMS上部パターンの前記円形開口部に配置されたハイブリダイゼーション緩衝液の液滴と、
(b)一端が前記液滴に浸漬されている、前記Ag/AgCl電極と、
を更に含む、請求項8に記載の特定の核酸を検出するための装置。 - 前記ポテンショスタットが、前記ナノ細孔を通過する電流を測定する、請求項9に記載の特定の核酸を検出するための装置。
- 特定の核酸を検出するための装置であって、
(a)薄いガラス膜及び細孔を有するガラスチップと、
(b)前記細孔と接触しているラテラルフロー膜と、
(c)磁気ビーズ-PNAコンジュゲートと、
を含み、
(d)前記磁気ビーズ-PNAコンジュゲートの位置が、磁石を介して前記膜上で制御され、
(e)前記磁気ビーズ-PNAコンジュゲートが、ハイブリダイズした標的核酸とのビーズ-PNAコンジュゲートの検出のために前記ガラスチップ細孔に近接して配置される、
装置。 - 上部電極、ラテラルフロー膜、及び下部電極を有するガラスチップを含む、ラテラルフローアッセイ装置であって、前記ガラスチップは前記ラテラルフロー膜と一体化されている、ラテラルフローアッセイ装置。
- 標的核酸(NA)を検出するための方法であって、
(a)バッキングされていないFusion5膜を帯に切断し、切断中に生成された微粒子を除去することと、
(b)箔電極をガラス顕微鏡スライド上に配置し、Fusion5膜帯を前記電極の上に、前記電極が前記帯のほぼ真下に配置されるように配置することと、
(c)前記ガラススライドをネオジム磁石の上に、前記磁石が前記電極の下に配置されるように配置することと、
(d)前記電極の上方の位置で前記膜上に磁性PNAビーズを堆積させることであって、前記磁石は前記ビーズを所定の位置に保持すべきである、ことと、
(e)溶解及び濾過されたサンプルを前記Fusion5膜の一端に添加し、続いて前記サンプルを前記膜帯の下方及び前記ビーズの上に追い込むのに十分な緩衝液を添加することと、
(f)反転ガラスチップ上に緩衝液の液滴を配置することと、
(g)前記ガラスチップを反転させ、前記ビーズ、磁石及び箔電極の真上の前記Fusion5膜上に前記ガラスチップを配置することと、
(h)前記ガラスチップの上面のリザーバに緩衝液の液滴を添加し、上部電極を前記リザーバに配置することと、
(i)ハイブリダイゼーションが生じるのを待って、前記磁石を除去し、前記電極間に電位を印加することと、
(j)標的NAが前記サンプル中に存在する場合、電流の低下が観察される、ことと、
を含む、方法。 - 標的核酸(NA)を検出するための方法であって、
(a)上面、底面、ローディング面、及び吸収面を含むラテラルフロー膜を提供することと、
(b)前記ラテラルフロー膜と接触する細孔を提供することと、
(c)前記ラテラルフロー膜の前記底面に配置された底部電極を提供することと、
(d)前記細孔の上方に配置された上部電極を提供することであって、前記上部電極は緩衝液に浸漬される、ことと、
(e)前記ローディング面の前記ラテラルフロー膜を濡らすために緩衝液を分注し、それによって前記緩衝液のラテラルフローが前記吸収面へ向かう途中で前記細孔を通過するようにすることと、
(f)前記緩衝液は、前記上部電極と前記底部電極との間で検出され得る電流を導くように十分に堆積される、ことと、
(g)前記上部電極と前記底部電極との間に電圧が印加されると、前記電流が前記細孔を通過する、ことと、
を含む、方法。 - 標的核酸(NA)を検出するための方法であって、
(a)ポリスチレンビーズにコンジュゲートされた電荷中性ペプチド核酸(PNA)捕捉プローブを提供することと、
(b)ラテラルフロー膜と接触する細孔を提供することと、
(c)サンプルを溶解することと、
(d)前記溶解されたサンプルを濾過することと、
(e)前記溶解され濾過されたサンプルを前記細孔に隣接してラテラルフローを行うことと、
(f)前記細孔にわたって電圧を印加することと、
(g)前記細孔を通過するイオン電流を検出することと、
(h)前記細孔を通過するイオン電流の持続的な低下を通じて特定の核酸を検出することと、
を含む、方法。
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