CN106164297B - 单分子电子多重snp试验以及pcr分析 - Google Patents
单分子电子多重snp试验以及pcr分析 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106164297B CN106164297B CN201580017155.9A CN201580017155A CN106164297B CN 106164297 B CN106164297 B CN 106164297B CN 201580017155 A CN201580017155 A CN 201580017155A CN 106164297 B CN106164297 B CN 106164297B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- nucleotide
- dna
- primers
- peg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims description 26
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 title description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 203
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 166
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 145
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 247
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 131
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 117
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 112
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 52
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 50
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 28
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 25
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 25
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 24
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 23
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 20
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims description 19
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 18
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 18
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 14
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 10
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical group OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 claims description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 6
- 159000000032 aromatic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 6
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 6
- HBROZNQEVUILML-UHFFFAOYSA-N salicylhydroxamic acid Chemical compound ONC(=O)C1=CC=CC=C1O HBROZNQEVUILML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 5
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 44
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 32
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 68
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 17
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 14
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 12
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 9
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 4
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 4
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- -1 hydrocarbon radical Chemical class 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 5-[(3ar,4r,6as)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@H]2[C@@H](CCCCC(=O)O)SC[C@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZXFLCMHBSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 2
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 2
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene chloride Substances ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 125000006729 (C2-C5) alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006730 (C2-C5) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OWTQQPNDSWCHOV-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-hydroxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound OCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO OWTQQPNDSWCHOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 244000037364 Cinnamomum aromaticum Species 0.000 description 1
- 235000014489 Cinnamomum aromaticum Nutrition 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010000543 Cytochrome P-450 CYP2C9 Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 102100029358 Cytochrome P450 2C9 Human genes 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000033981 Hereditary haemochromatosis Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000004369 butenyl group Chemical group C(=CCC)* 0.000 description 1
- 125000000480 butynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- PWZFXELTLAQOKC-UHFFFAOYSA-A dialuminum;hexamagnesium;carbonate;hexadecahydroxide;tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[Al+3].[Al+3].[O-]C([O-])=O PWZFXELTLAQOKC-UHFFFAOYSA-A 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000020673 hypertrichosis-acromegaloid facial appearance syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 125000004368 propenyl group Chemical group C(=CC)* 0.000 description 1
- 125000002568 propynyl group Chemical group [*]C#CC([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 102200071191 rs1799945 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002569 water oil cream Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/631—Detection means characterised by use of a special device being a biochannel or pore
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供使用标记引物或探针用于核酸目标检测和使用纳米孔检测以单分子灵敏度检测核酸序列中的某些位置处的核苷酸的身份或存在的方法;以及供这类方法中使用的寡核苷酸引物组;以及与纳米孔检测结合的定量PCR方法。
Description
本申请主张2014年2月12日申请的美国临时申请第61/939,144号的权益,所述申请以全文引用的方式并入本文中。
本申请以引用的方式并入有核苷酸及/或氨基酸序列,所述序列存在于被命名为“150212_0575_86100-PCT_SequenceListing_JAK.txt”的文件中,所述文件的大小是1.81千字节并且在与MS-Windows具有操作系统相容性的IBM-PC机格式下创建于2015年2月12日,包含在2015年2月12日申请的文本文件中作为本申请的一部分。
在整个本申请中,引用各种公开。这些参考文献的完整引用在紧接在权利要求书前的说明书的结尾处可见。这些公开的公开内容在此以全文引用的方式并入本申请中以更充分描述本发明所涉及的现有技术水平。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是活生物体的基因组中单碱基的变异。SNP可能发生在基因的编码序列和基因的非编码区(包含调节区)中。基因组编码序列中的SNP分类为两种类型:同义和非同义。同义SNP由于遗传密码的简并而不改变蛋白质序列,而非同义SNP改变经编码蛋白质的氨基酸序列。非同义SNP进一步分为两种类型:错义和无义。错义突变是单核苷酸点突变,产生相比于野生型对不同氨基酸编码的密码子,而无义突变是产生过早终止密码子的点突变。不在蛋白质编码区中的SNP可以通过改变剪接序列和转录因子结合活性以及基因表达来影响基因的功能。在所有遗传变异中,SNP是人与人之间最常见的遗传差异。超过310万个SNP的特征在于第二代人类单倍型图中的人类基因组(弗雷泽(Frazer)等人2007)。因此,SNP是用于研究疾病发展机制下的分子基础,为精密医学奠定基础的重要生物标记物。
人类基因组计划和全面的人类基因组序列图的构建(兰德(Lander)等人2001;文特尔(Venter)等人2001;以及惠勒(Wheeler)等人2008)为遗传变异的研究提供有价值的资源。这些遗传差异包含SNP、基因拷贝数变异、插入以及缺失。SNP已被确立为用于疾病基因探索和表征的独特生物标记物(郭(Kwok)2000和罗塞斯(Roses)2000)。这些研究工作需要使用有成本效益并且高通量与高精确度的技术表征大量SNP。以下DNA测序平台广泛用于表征遗传变异:(1)4色荧光桑格法(4-color fluorescent Sanger method)(史密斯(Smith)等人1986;居(Ju)等人1995;居等人1996;萨拉斯-索拉诺(Salas-Solano)等人1998;以及赫特帕尔(Kheterpal)等人1996);(2)使用可裂解荧光核苷酸可逆终止子的合成测序(SBS)(居等人2006和本特利(Bentley)等人2008);(3)通过检测由在聚合酶反应期间所释放的焦磷酸引起的化学发光信号进行SBS(焦磷酸测序)(马古利斯(Margulies)等人2005);(4)通过电子检测在聚合酶反应期间所释放的质子进行SBS(离子激流测序)(罗斯伯格(Rothberg)等人2011);以及(5)单分子荧光SBS法(哈里斯(Harris)等人2008和艾德(Eid)等人2009)。然而,这些测序技术并非设计用于SNP精确检测,并且对于进行大规模SNP研究来说仍然太昂贵。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和荧光发射是用于SNP分析的两种主要检测方法。使用上述两种检测方法的SNP试验方法如下综述。
通过MALDI-TOF MS检测进行SNP分析
MALDI-TOF MS测量目标分子的质量,具有高度精确结果呈数字格式。其已通过单碱基延伸(SBE)(哈夫(Haff)等人1997;唐(Tang)等人1999;罗斯(Ross)等人1998;裴(Pei)等人1998;以及格里芬(Griffin)等人2000)、杂交(斯特科(Stoerker)等人2000和罗斯等人1997)以及侵袭性裂解(格里芬等人1999和莱米车夫(Lyamichev)等人1999)用于SNP检测。MALDI-TOF MS还通过聚合酶用于在核苷酸延伸的情况下的基因表达分析和单拷贝DNA单倍型分析(丁(Ding)等人,PNAS 100:3059-3064,2003和丁等人,PNAS 100:7449-7453 2003)。
大多数多重SNP分析利用由聚合酶催化的SBE反应的特异性。一种广泛使用的SNP表征方法利用SBE和MALDI-TOF MS检测。在这种方法中,基于目标基因的遗传变异来设计并且合成寡核苷酸引物。引物的3'端紧接着DNA模板的SNP位点退火。接着使与SNP位点互补的单一双脱氧核苷酸通过DNA聚合酶掺入引物中。通过从MALDI-TOF MS谱获得的所得引物延伸产物的质量来确定SNP的身份。
通过荧光检测进行SNP分析
已使用荧光标记和检测,包含微阵列(哈特曼(Hartmann)等人2009)、PCR-RFLP分析(乔杜里(Chowdhury)等人2007)以及塔克曼(TaqMan)实时基因分型(巴伊(Bai)等人2004)开发多种SNP基因分型方法。使用荧光标记和检测有若干优点,包含多种用于标记目标分子的稳固化学偶合方法,若干光物理参数(寿命、发射以及极化)的检测灵敏度高以及多重能力。分子倒置探针(MIP)方法已被开发用于SNP检测(哈登博(Hardenbol)等人2003)。在这种方法中,连续延伸以及基因座特异性DNA探针的连接在目标基因的多态位点产生圆形形状。接着使线性探针选择性降解,而使含有等位基因信息的圆形DNA探针扩增并且使用荧光检测下的微阵列来分析。使用这种方法,哈登博等人(2003)进行每个试验超过1,000个SNP的基因分型。MIP方法具有非常高的多重水平的优点。然而,MIP需要多个酶反应步骤和复杂的探针设计。
先前的多重SNP试验主要使用质谱检测或荧光标签以及光学检测。这些前述试验无一者提供单分子检测灵敏度并且都需要大型仪器。无一者使用纳米孔识别对应于相关核苷酸或SNP的分子或聚合物标签,从而识别相关核苷酸或SNP。
发明内容
本发明提供一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法,其包括以下步骤:
(a)使DNA与以下各者一起培育
(1)至少一个寡核苷酸引物,每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名,其中引物中的对于在所述引物的3'端处的核苷酸是5'的核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补,
(2)终止核苷酸,以及
(3)DNA聚合酶,
以便进行引物的单碱基延伸,引物的3'端核苷酸与DNA中的相关单核苷酸残基杂交,在这个引物存在的情况下使用终止核苷酸,从而形成引物的延伸产物,其具有与DNA中的相关核苷酸互补的3'核苷酸;
(b)从延伸产物去除标记,如果存在的话;
(c)通过纳米孔检测3'端核苷酸与相关单核苷酸残基杂交的引物的标记的签名,从而识别标记和引物,如果存在的话;
从而识别相关单核苷酸残基。
在本发明方法的实施例中,在步骤(a)中,使DNA与多个寡核苷酸引物一起培育,其中所述多个寡核苷酸引物包括至少两个引物,所述两个引物除在两个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列,其中两个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
本发明还提供一种用于进行本发明方法的试验。
本发明还提供一种寡核苷酸引物组,其中每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名,其中所述组包括至少两个引物,所述引物具有(i)相同核苷酸序列,除在两个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外,及(ii)对应于3'端处的不同核苷酸的不同标记,其中两个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA链中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
本发明还提供一种寡核苷酸引物组,其中每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名;并且其中每个引物的3'核苷酸与DNA链中的相关单核苷酸残基互补,并且所述引物中的其它核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
本发明还提供一种在样品中同时检测多个不同目标核酸中的一者或多者的存在的方法,其包括以下步骤:
(a)使样品与多个核酸引物同时并且在允许引物延伸发生的条件下接触,并且持续足以发生引物延伸的一段时间,其中(i)对于每个目标核酸,使用至少一个对应于目标核酸的预定引物,及(ii)每个引物具有以可去除方式连接的标记,所述标记具有可通过纳米孔检测的独特签名;
(b)使任何未延伸引物与任何延伸引物分离;
(c)同时从任何延伸引物去除标记;以及
(d)检测如此去除的任何标记的存在;
其中具有与以可去除方式与预定引物连接的标记相同的签名的去除标记的存在指示样品中存在由所述预定引物特异性辨识的目标核酸。
本发明还提供一种识别或定量目标核酸的方法,其包括以下步骤:
(a)使目标核酸与探针在允许探针与目标核酸杂交的条件下一起培育,其中所述探针包括(i)基本上与目标核酸完全互补的核苷酸序列,及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名的连接标记;
(b)进行PCR;
(c)使标记从探针释放;
(d)通过纳米孔检测由标记引起的电子变化;以及
(e)使在步骤(d)中测定的电子变化的振幅与标记数量有相关性,
从而识别或定量目标核酸。
附图说明
图1.使用可裂解PEG标记引物和生物素标记的双脱氧核苷酸(B-ddNTP)进行的单分子电子多重SNP(SM-EMS)试验流程。使退火到含有SNP位点的DNA模板的PEG标记引物库与B-ddNTP和DNA聚合酶一起培育。每个PEG标记引物的3'端处的核苷酸与模板中的特定SNP互补。仅完全互补的可裂解PEG标记引物通过聚合酶与B-ddNTP延伸。涂有抗生蛋白链菌素的磁珠仅捕获PEG标记引物的经生物素标记的DNA延伸产物,聚合酶反应中的其它组分被洗掉。用TCEP处理所捕获的DNA产物使PEG裂解,通过纳米孔分析PEG,产生独特的电流封锁签名,其中每一者确定唯一SNP。
图2.将使用单个纳米孔获得的超过20种PEG聚合物的质量分布(上图)与其相应的MALDI-TOF质谱(下图)进行比较。直方图(上图)指示单个单体单位不同的PEG聚合物可在单分子水平下以电子方式通过纳米孔检测和区分(改编自罗伯森J.W.(Robertson,J.W.)等人2007)。
图3.可裂解PEG标记引物的设计和合成的流程。
图4.在PEG引物和生物素-ddNTP(B-ddNTP)的情况下SM-EMS试验的分子机制。靶向DNA模板中的特异性SNP的完全互补的可裂解PEG标记引物通过聚合酶与B-ddNTP延伸。涂有抗生蛋白链菌素的磁珠仅捕获生物素标记的DNA延伸产物,而其它组分被洗掉。用TCEP处理所捕获的DNA产物使PEG[连接子-(PEG)n-香豆素]裂解,通过纳米孔分析,产生用于SNP表征的独特的电流封锁签名。
图5.3个PEG标记引物:PEG16-引物-1、PEG20-引物-2以及PEG24-引物-3的MALDI-TOF质谱。质谱上的质量值与相应的PEG标记引物完全匹配。
图6. MALDI-TOF质谱示出TCEP使PEG20-引物-2中的基于叠氮基的连接子完全裂解,产生所释放的PEG20标签和引物-2。PEG20标签:m/z=1380Da;引物-2:m/z=6408Da。
图7. PEG20-引物-2用TCEP进行的裂解反应流程。用TCEP处理PEG20-引物-2使基于叠氮基的连接子完全裂解,产生所释放的PEG20标签和引物-2。
图8.所释放的PEG20标签的MALDI-TOF质谱。在PEG20-引物-2和生物素-aha-dUTP的情况下进行延伸反应,并且使用抗生蛋白链菌素磁珠捕获产物。所捕获的DNA产物的TCEP处理导致PEG20标签释放(m/z=1446Da;PEG20+2Na+)。
图9.质量标签(MassTag)PCR的流程。
图10.纳米标签(NanoTag)PCR的流程。
图11.使用荧光检测(左侧)和纳米标签检测(右侧)进行的实时定量PCR的流程。
具体实施方式
虽然已在本文中示出和描述了本发明的各种实施例,但本领域技术人员应显而易见,所述实施例仅作为实例而提供。本领域技术人员可以在不脱离本发明的情况下想到许多变型、变化以及取代。应理解,可以采用本文中所述的本发明实施例的各种替代方案。
术语
如本文中所用,并且除非另外说明,否则以下术语中的每一者都应具有下文所阐述的定义。
A -腺嘌呤;
C -胞嘧啶;
DNA -脱氧核糖核酸;
G -鸟嘌呤;
RNA -核糖核酸;
T -胸腺嘧啶;以及
U -尿嘧啶。
冠词“一(a/an)”和“所述”是非限制性的。举例来说,“所述方法”包含短语含义的最广泛定义,其可以是多于一种方法。
化合物在孔中的“签名”应包含例如当化合物通过孔或与孔相互作用时发生信号或变化。一个这样的变化可以是电子签名。
通过施加电场通过孔的核苷酸或其它分子(如标记和聚合物标签)的“电子签名”应包含例如核苷酸或分子通过孔的持续时间以及在所述通过期间所观察到的电流振幅。电子签名可以例如通过电流(例如pA)对比时间的曲线图可视化。还设想DNA的电子签名,并且可以是例如通过施加电场使DNA通过孔的电流(例如pA)对比时间的曲线图。
“纳米孔”包含例如一种结构,所述结构包括:(a)通过物理屏障分离的第一及第二隔室,所述屏障具有至少一个直径是例如约1nm到10nm的孔;及(b)一种装置,所述装置对整个屏障施加电场使得带电分子(如DNA)可以通过孔从第一隔室通过到达第二隔室。纳米孔理想地进一步包括用于测量分子通过其屏障的电子签名的装置。纳米孔屏障可以是合成或天然存在的,或在某种程度上两者都可。举例来说,屏障可以是生物制品,包括天然存在的化合物或来源于这类化合物的物质。这包含例如脂质双层,其中具有α-溶血素、寡聚蛋白通道(如孔蛋白和合成肽等)。屏障也可以是例如固态纳米孔,包含例如具有一个或多个大小适合的孔的无机板。在本文中,纳米孔屏障中的“纳米孔”、“纳米孔屏障”以及“孔”有时等效地使用。
“核酸”应意指任何核酸分子,包含(但不限于)DNA、RNA以及其杂交体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T以及U,以及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域中众所周知的,并且示例于PCR系统、试剂以及消费品(PCR Systems,Reagents andConsumables)(珀金埃尔默目录(Perkin Elmer Catalogue)1996-1997,罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems,Inc.),布兰斯堡(Branchburg),新泽西州(New Jersey),美国)中。
“杂交”应意指基于充分理解的序列互补性原理使一个单链核酸(如引物)退火为另一核酸。在实施例中,另一核酸是单链核酸。核酸之间杂交的倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度以及互补性程度。这些参数对杂交的影响描述于例如萨姆布鲁克J(Sambrook J),弗里奇EF(Fritsch EF),马尼亚迪斯T.(Maniatis T.),分子克隆:实验室手册(Molecular cloning:a laboratory manual),冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),纽约(New York)(1989)中。如本文中所用,引物序列或DNA延伸产物的杂交分别可通过使用能够与其形成磷酸二酯键的可用核苷酸或核苷酸类似物产生磷酸二酯键来延伸。
如本文中所用的“引物”(引物序列)是足以与目标DNA(例如单链DNA)杂交并且允许向其中添加核苷酸残基的适当长度(例如约18-24个碱基)的通常化学合成的短寡核苷酸,或在本领域中众所周知的合适条件下由其得到的寡核苷酸或聚核苷酸合成。在实施例中,引物是DNA引物,即由脱氧核糖核苷酸残基组成或基本上由脱氧核糖核苷酸残基组成的引物。引物被设计成具有作为与所述引物杂交的模板/目标DNA的区域的补体的序列。核苷酸残基通过形成磷酸二酯键向引物的3'端的添加产生DNA延伸产物。核苷酸残基通过形成磷酸二酯键向DNA延伸产物的3'端的添加产生另一DNA延伸产物。
“终止核苷酸”应意指任何经修饰或未经修饰的核苷酸,其在被掺入核苷酸链中时阻止或严重阻碍核苷酸链的进一步伸长。一个实例是双脱氧核苷酸。终止核苷酸可以包括钩状物。
如本文中相对于终止核苷酸所用的“钩状物”应指可以与对钩状物具有高亲和力的另一化学部分、化合物或物质结合、反应或由所述另一化学部分、化合物或物质捕获的任何化学部分。钩状物的一个实例是生物素,其与抗生蛋白链菌素强烈相互作用。另一实例是苯基硼酸(PBA),其与水杨基氧肟酸(SHA)强烈相互作用。
如本文中所用,“基本上相同”或“基本上完全互补”序列与核苷酸序列具有分别至少约80%序列一致性或互补性。基本上相同序列或基本上完全互补序列可以具有分别至少约85%、90%、95%或100%的序列一致性或互补性。
单分子电子多重SNP试验原理
单分子电子多重SNP(SM-EMS)试验原理如下所述(图1)。对应于目标基因的不同SNP位点的寡核苷酸引物库通过可以用三-(2-羧乙基)膦(TCEP)有效裂解的基于叠氮基的连接子用大小不同的PEG标记。基于叠氮基的连接子已成功地用于构建用于合成测序的核苷酸可逆终止子(郭(Guo)等人2008)以及用于通过MALDI-TOF MS进行DNA测序和SNP分析的可裂解的生物素标记的双脱氧核苷酸(邱(Qiu)等人,生物化学(Biochem)427:193-201,2012)。每个PEG标记寡核苷酸引物的3'端处的核苷酸与DNA模板中的特定SNP互补。使用可裂解PEG标记引物和生物素标记的双脱氧核苷酸(生物素-ddNTP)以及DNA聚合酶进行在单管中的单碱基延伸。仅与DNA模板完全互补的PEG标记引物通过DNA聚合酶与生物素-ddNTP延伸。随后用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠捕获在3'端处携带生物素的PEG标记的DNA延伸产物;通过洗涤消除未延伸的PEG标记引物以及SBE反应的其它组分。用TCEP处理所捕获的DNA产物使基于叠氮基的连接子裂解,从而释放PEG,通过纳米孔分析PEG。每个大小不同的PEG在类似于单分子电子合成测序的单分子水平下产生独特的纳米孔电流封锁签名(库马尔(Kumar)等人2012),导致SNP的识别(图1)。因此,在SBE中使用PEG标记引物和生物素-ddNTP结合DNA聚合酶的特异性将产生用于以单分子灵敏度以电子方式检测SNP的多重方法。
可以用于这种方法的一种寡核苷酸引物组的非限制性实例是
5'-W-CAGATGATATGTTCTAATTC-3'(SEQ ID NO:1);
5'-X-TCACAAAGTGTATTTAGCCG-3'(SEQ ID NO:2);
5'-Y-CAGATGATATGTTCTAATTA-3'(SEQ ID N0:3);以及
5'-Z-GAGATAGGCTAGCCGATACA-3'(SEQ ID NO:4),
其中在每个引物中,3'核苷酸与在相关位点(或SNP位点)处发现的核苷酸互补,并且引物中的其余核苷酸与对于在相关位点(或SNP位点)处发现的核苷酸是3'的核苷酸互补,并且W、X、Y以及Z是具有可通过纳米孔检测的独特签名的标记。这种四个引物组可以用于例如同时检测四种SNP的存在。
上述示例性技术可以容易地修改用于识别给定位置处的单核苷酸。制备引物库,其中存在具有含可通过纳米孔检测的独特签名、含相同核酸序列(除3'端处的核苷酸以外)的标记的至少两个引物,其中引物中是3'核苷酸的5'的核苷酸基本上与紧接着相关核苷酸的3'的核苷酸完全互补。使这些引物与含有相关核苷酸的DNA链(也被称作模板DNA)在例如生物素标记的双脱氧核苷酸和DNA聚合酶存在下接触,从而允许单碱基延伸反应发生。接着可以使延伸产物与非延伸引物分离,并且使标记裂解并且通过用纳米孔检测来识别,从而识别延伸的引物。在已知引物除3'端处的核苷酸以外是相同的情况下,3'端处的核苷酸可以易于通过识别独特标记来确定,并且这个核苷酸将与相关核苷酸互补。这种技术可以例如用多组至少两个独特标记的引物进行,从而一次识别多个相关核苷酸。
可以用于这种方法的一种寡核苷酸引物组的非限制性实例是
5'-W-CAGATGATATGTTCTAATTC-3'(SEQ ID NO:1);
5'-X-CAGATGATATGTTCTAATTA-3'(SEQ ID NO:5);
5'-Y-CAGATGATATGTTCTAATTT-3'(SEQ ID NO:6);以及
5'-Z-CAGATGATATGTTCTAATTG-3'(SEQ ID NO:7),
其中每个引物具有相同序列(除3'端核苷酸以外),并且每个引物中的其余核苷酸与对于在相关位点(或SNP位点)处发现的核苷酸是3'的核苷酸互补,并且W、X、Y以及Z是具有可通过纳米孔检测的独特签名的标记。
本发明的实施例
本发明提供一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法,其包括以下步骤:
(a)使DNA与以下各者一起培育
(1)至少一个寡核苷酸引物,每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名,其中引物中的对于在所述引物的3'端处的核苷酸是5'的核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补,
(2)终止核苷酸,以及
(3)DNA聚合酶,
以便进行引物的单碱基延伸,引物的3'端核苷酸与DNA中的相关单核苷酸残基杂交,在这个引物存在的情况下使用终止核苷酸,从而形成引物的延伸产物,其具有与DNA中的相关核苷酸互补的3'核苷酸;
(b)从延伸产物去除标记,如果存在的话;
(c)通过纳米孔检测3'端核苷酸与相关单核苷酸残基杂交的引物的标记的签名,从而识别标记和引物,如果存在的话;
从而识别相关单核苷酸残基。
在本发明方法的实施例中,DNA是单链DNA。在本发明方法的另一实施例中,DNA是双链DNA。
在本发明方法的实施例中,在步骤(a)中,使DNA与多个寡核苷酸引物一起培育,其中所述多个寡核苷酸引物包括至少两个引物,所述两个引物除在两个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列,其中两个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明方法的另一实施例中,在步骤(a)中,使DNA与多个寡核苷酸引物一起培育,其中所述多个寡核苷酸引物包括至少三个引物,所述三个引物除在三个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列,其中三个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明方法的另一实施例中,在步骤(a)中,使DNA与多个寡核苷酸引物一起培育,其中所述多个寡核苷酸引物包括至少四个引物,所述四个引物除在四个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列,其中四个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与单链DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明方法的另一实施例中,终止核苷酸是双脱氧核苷酸。
在本发明方法的另一实施例中,终止核苷酸包括钩状物。
在本发明方法的另一实施例中,钩状物是生物素部分。
在本发明方法的另一实施例中,钩状物是苯基硼酸(PBA)部分。
在本发明方法的另一实施例中,在去除标记之前,使延伸产物与未延伸引物分离。
在本发明方法的另一实施例中,通过在涂有抗生蛋白链菌素的磁珠上捕获延伸产物使延伸产物与未延伸引物分离;
在本发明方法的另一实施例中,通过在涂有水杨基氧肟酸(SHA)的磁珠上捕获延伸产物使延伸产物与未延伸引物分离;
在本发明方法的另一实施例中,标记通过可裂解连接子以可去除方式连接。在本发明方法的另一实施例中,可裂解连接子是基于叠氮基的连接子。在本发明方法的另一实施例中,可裂解连接子在步骤(b)中通过含膦部分裂解。在本发明方法的另一实施例中,可裂解连接子在步骤(b)中用三-(2-羧乙基)膦(TCEP)裂解。在本发明方法的另一实施例中,可裂解连接子与标记与寡核苷酸之间的寡核苷酸引物的5'端连接。
在本发明方法的另一实施例中,标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在本发明方法的另一实施例中,标记是聚乙二醇(PEG)标记。在本发明方法的另一实施例中,PEG标记彼此各自具有不同长度。
在本发明方法的另一实施例中,使DNA与多个引物一起培育,每个引物包括具有可通过纳米孔检测的独特签名的连接标记。在本发明方法的另一实施例中,在步骤(a)中至少20个不同寡核苷酸引物与单链DNA一起培育。
在本发明方法的实施例中,纳米孔是生物制品。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是蛋白质。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔包括α溶血素。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是固态纳米孔。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔呈固态膜形式。
在本发明方法的实施例中,签名是电子签名。在本发明方法的另一实施例中,签名是电流封锁签名。
在本发明方法的实施例中,每个引物的对于所述引物的3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与DNA的对于相关单核苷酸残基是3'的序列至少85%互补。
在本发明方法的另一实施例中,每个引物的对于所述引物的3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与DNA的对于相关单核苷酸残基是3'的序列至少90%互补。
在本发明方法的另一实施例中,每个引物的对于所述引物的3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与DNA的对于相关单核苷酸残基是3'的序列至少95%互补。
在本发明方法的另一实施例中,每个引物的对于所述引物的3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与DNA的对于相关单核苷酸残基是3'的序列100%互补。
在本发明方法的另一实施例中,引物的序列是10-40个核苷酸长。在本发明方法的另一实施例中,引物的序列是18-24个核苷酸长。
在本发明方法的实施例中,相关单核苷酸位于单核苷酸多态性(SNP)位点。
本发明还提供一种用于进行本发明方法中的任一者的试验。
本发明还提供一种寡核苷酸引物组,其中每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名,其中所述组包括至少两个引物,所述引物具有(i)相同核苷酸序列,除在两个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外,及(ii)对应于3'端处的不同核苷酸的不同标记,其中两个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA链中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,所述组包括至少三个引物,所述引物具有(i)相同核苷酸序列,除在三个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外,及(ii)对应于3'端处的不同核苷酸的不同标记,其中三个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA链中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,所述组包括至少四个引物,所述引物具有(i)相同核苷酸序列,除在四个引物中每一个的3'端处具有不同核苷酸以外,及(ii)对应于3'端处的不同核苷酸的不同标记,其中四个引物中每一个中的相同核苷酸基本上与DNA链中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
本发明还提供一种寡核苷酸引物组,其中每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(1)对应于特定引物序列及(2)具有可通过纳米孔检测的独特签名;并且其中每个引物的3'核苷酸与DNA链中的相关单核苷酸残基互补,并且所述引物中的其它核苷酸基本上与DNA中紧接着相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,相关单核苷酸残基位于单核苷酸多态性(SNP)位点。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,每个引物的序列是15-40个核苷酸长。在寡核苷酸引物组的另一实施例中,每个引物的序列是18-24个核苷酸长。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,每个以可去除方式连接的标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在本发明的寡核苷酸引物组的另一实施例中,以可去除方式连接的标记是彼此各自具有不同长度的PEG标记。
本发明还提供一种在样品中同时检测多个不同目标核酸中的一者或多者的存在的方法,其包括以下步骤:
(a)使样品与多个核酸引物同时并且在允许引物延伸发生的条件下接触,并且持续足以发生引物延伸的一段时间,其中(i)对于每个目标核酸,使用至少一个对应于目标核酸的预定引物,及(ii)每个引物具有以可去除方式连接的标记,所述标记具有可通过纳米孔检测的独特签名;
(b)使任何未延伸引物与任何延伸引物分离;
(c)同时从任何延伸引物去除标记;以及
(d)检测如此去除的任何标记的存在;
其中具有与以可去除方式与预定引物连接的标记相同的签名的去除标记的存在指示样品中存在由所述预定引物特异性辨识的目标核酸。
在本发明方法的另一实施例中,至少两个不同引物对应于相同目标核酸。在本发明方法的另一实施例中,第一引物是目标核酸的正向引物并且第二引物是相同目标核酸的反向引物。在本发明方法的另一实施例中,与第一和第二引物连接的标记具有相同签名。在本发明方法的另一实施例中,与第一和第二引物连接的标记具有不同签名。
在本发明方法的实施例中,所述方法检测到样品中存在10个或更多个不同目标核酸。在本发明方法的其它实施例中,所述方法检测到样品中存在50个或更多个、100个或更多个或200个或更多个不同目标核酸。
在本发明方法的实施例中,样品与4个或更多个不同引物接触。在本发明方法的其它实施例中,样品与10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个或200个或更多个不同引物接触。
在本发明方法的实施例中,标记在步骤(d)中通过光裂解去除。在本发明方法的另一实施例中,标记在步骤(d)中在紫外光下进行光裂解。在本发明方法的另一实施例中,标记在步骤(d)中通过化学裂解去除。
在本发明方法的另一实施例中,每个以可去除方式连接的标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在本发明方法的实施例中,标记是聚乙二醇(PEG)标记。在本发明方法的另一实施例中,PEG标记具有不同长度。
在本发明方法的实施例中,纳米孔是生物制品。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是蛋白质。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔包括α溶血素。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是固态纳米孔。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔呈固态膜形式。
在本发明方法的实施例中,签名是电子签名。在本发明方法的另一实施例中,签名是电流封锁签名。
本发明还提供一种识别或定量目标核酸的方法,其包括以下步骤:
(a)使目标核酸与探针在允许探针与目标核酸杂交的条件下一起培育,其中所述探针包括(i)基本上与目标核酸完全互补的核苷酸序列区域,及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名的连接标记;
(b)进行PCR;
(c)使标记从探针释放;
(d)通过纳米孔检测由标记引起的电子变化;以及
(e)使在步骤(d)中测定的电子变化的振幅与标记数量有相关性,
从而定量目标核酸。
在本发明方法的实施例中,探针包括不与目标核酸杂交的核苷酸的5'端区域。在本发明方法的另一实施例中,不与目标核酸杂交的核苷酸的5'端区域是3-15个核苷酸。在本发明方法的另一实施例中,不与目标核酸杂交的核苷酸的5'端区域是5-10个核苷酸。
在本发明方法的实施例中,探针的基本上与目标核酸完全互补的核苷酸序列区域是10-40个核苷酸。在本发明的另一实施例中,探针的基本上与目标核酸完全互补的核苷酸序列区域是18-24个核苷酸。
在本发明方法的实施例中,标记与探针的5'端连接。
在本发明方法的实施例中,标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在本发明方法的实施例中,标记是聚乙二醇(PEG)标记。
在本发明方法的实施例中,使用Taq聚合酶进行PCR。在本发明方法的另一实施例中,在PCR反应期间聚合酶的聚合酶活性使标记释放。
在本发明方法的实施例中,纳米孔是生物制品。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是蛋白质。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔包括α溶血素。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔是固态纳米孔。在本发明方法的另一实施例中,纳米孔呈固态膜形式。
在本发明方法的实施例中,签名是电子签名。在本发明方法的另一实施例中,签名是电流封锁签名。
如本文中所用,“烷基”包含具有规定数目的碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基,并且可以是未被取代或被取代的。因此,如“C1-Cn烷基”中的C1-Cn被定义为包含具有呈直链或支链排列的1、2、……、n-1或n个碳原子的基团。举例来说,“C1-C5烷基”被定义为包含呈直链或支链排列的具有1、2、3、4或5个碳原子的基团,并且具体地说包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基以及戊基。
如本文中所用,“烯基”是指含有至少1个碳碳双键的直链或支链非芳香族烃基,并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳双键,并且可以是未被取代或被取代的。举例来说,“C2-C5烯基”意指具有2、3、4或5个碳原子以及分别至多1、2、3或4个碳-碳双键的烯基。烯基包含乙烯基、丙烯基以及丁烯基。
术语“炔基”是指含有至少1个碳碳三键的直链或支链烃基,并且可以存在至多最大可能数目的非芳香族碳-碳三键,并且可以是未被取代或被取代的。因此,“C2-C5炔基”意指具有2或3个碳原子和1个碳-碳三键或具有4或5个碳原子和至多2个碳-碳三键的炔基。炔基包含乙炔基、丙炔基以及丁炔基。
术语“被取代”是指如上所述的官能团,如烷基或烃基,其中与其中所含的氢原子的至少一个键被与非氢或非碳原子的键替换,其限制条件是维持正常价数并且所述取代产生稳定化合物。被取代的基团还包含其中与碳或氢原子的一个或多个键被与杂原子的一个或多个键(包含双键或三键)替换的基团。取代基的非限制性实例包含上述官能团并且是例如N,例如以便形成-CN。
示例性标记
标记(或标签)可以是能够在纳米孔中检测的任何化学基团或分子。在一些情况下,标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
在一些情况下,标记是聚合物。聚乙二醇(PEG)是聚合物的实例并且具有以下结构:
可以使用任何数目的乙二醇单元(W)。在一些情况下,每个标记是包括不同数目的乙二醇单元的PEG标记。
标记的纳米孔检测
先前,卡西亚诺维奇(Kasianowicz)等人(1996)发现α-溶血素(αHL)蛋白纳米孔,其具有1.5nm直径的极限孔径(宋(Song)等人1996;别兹鲁科夫(Bezrukov)等人1996;克拉西尔尼科夫(Krasilnikov)2002;以及卡西亚诺维奇等人1995),可以用于在单分子水平下以电子方式检测核酸。因此,αHL纳米孔已被广泛研究用于开发单分子电子DNA测序技术(卡西亚诺维奇等人1996;卡西亚诺维奇等人2002;卡西亚诺维奇等人1998;以及克拉克(Clarke)等人2009)。大多数这些研究工作涉及通过纳米孔进行链DNA测序,旨在通过使其穿过纳米孔来测序DNA并且检测4个核苷酸(A、C、G、T)的电流封锁(谢里夫(Cherf)等人2012和曼拉奥(Manrao)等人2012)。
天然αHL纳米孔具有用于高分辨率区分分子和离子的固有特性,允许在水性H+与D+离子之间进行区分(卡西亚诺维奇等人1995)。罗伯森(Robertson)等人(2007)已说明αHL纳米孔可以容易地分离在单一单体水平下超过20种不同PEG聚合物(图2)。本研究指示PEG聚合物在孔中的平均滞留时间随着其大小而增加(赖纳(Reiner)等人2010)。最近,库马尔等人(2012)已报告了使用不同大小的4种PEG标记核苷酸的末端磷酸,用于在纳米孔检测下进行单分子电子DNA合成测序。基于这些前述研究,所提出的单分子电子多重SNP试验将能够同时使用20种不同大小的PEG检测20个遗传变异。
参考以下实验细节将更好地理解本发明,但本领域技术人员将容易了解,特定实验仅说明如更充分描述于其后随附权利要求书中的本发明。本申请中所述的每一实施例和特征应理解为可与其内所含的每一实施例互换和组合的。
实验细节和论述
通过MALDI-TOF MS进行SNP分析的综述
早期使用MALDI-TOF MS进行多重SNP分析的SEE方法检测到引物和其延伸产物,因为两者都被装载到MS分析仪上。这需要明确同时检测多重引物和其延伸产物。然而,对于较长生物聚合物,如DNA,MALDI-TOF MS分析仪具有分辨率和灵敏度的局限性。因此,较大DNA分子不能通过MALDI-TOF MS分辨。为解决这个问题,金(Kim)等人开发出通过使用MALDI-TOF MS检测在SBE中使用固相可捕获(SPC)生物素标记的双脱氧核苷酸终止子(生物素-ddNTP)的多重SNP试验(SPC-SBE)(金等人2002和金等人2003)。
在SPC-SBE方法中,对应于多个SNP位点的寡核苷酸引物库被设计成具有不同分子质量。这些引物接着退火到目标基因的SNP位点并且通过DNA聚合酶用特定生物素-ddNTP延伸,产生3'生物素标记的DNA产物。用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠处理聚合酶反应混合物导致捕获在3'端携带生物素部分的DNA产物。洗掉反应物中的过量引物、DNA聚合酶以及盐。随后通过使生物素-抗生蛋白链菌素与甲酰胺在95℃下的相互作用变性使纯DNA延伸产物从磁珠释放,并且用MALDI-TOF MS表征以用于SNP测定。在SPC-SBE方法中,SNP分析中多重的精确度和范围显著增加,因为仅分离的引物延伸产物被装载到MALDI-TOF MS分析仪中。因此,所得质谱不含非延伸引物峰和其结合二聚体,所述峰和二聚体不携带生物素部分并且在SPC期间去除。SPC也有助于使所捕获的DNA产物脱盐并且因此增强用于SNP分析的MS数据的精确度和整体质量。
综上所述,在使用MALDI-TOF MS的SPC-SBE多重SNP试验(金等人2002)中,多重PCR产物以模板形式从基因组DNA产生,用于使用不同质量的SNP特异性引物进行SBE反应。仅捕获通过特定生物素-ddNTP延伸的DNA延伸产物,而反应的其它组分被去除。DNA聚合酶和生物素-ddNTP。接着使所捕获的DNA产物释放并且装载到MALDI-TOF MS分析仪上用于识别核苷酸变异。已示出未延伸引物占据质谱中的有效质量范围,降低多重能力。过量引物可以形成二聚体,在质谱中产生伪峰(罗斯凯(Roskey)等人1996)。所有上述并发情况通过SPC-SBE完全去除。因为四个生物素-ddNTP的大分子量差异,这些双脱氧核苷酸的聚合酶延伸产物经明确检测具有很好分辨的分子量。引物延伸产物的分子量相比于相应引物的质量揭示多态位点处的每个核苷酸的身份。SPC-SBE方法特别有益于确定杂合基因型。在这种情况下,两个峰(一个对应于每个等位基因)将在所得质谱中清楚地可辨别。
在用于表征SNP时,MALDI-TOF MS可以同时测量一定范围内的DNA分子的质量。为最佳利用这一特征用于在单一MS谱中分析多个SNP,如果未去除过量引物,那么所有引物和其延伸产物的质量必须充分不同以产生可以在质谱中充分分辨的峰。举例来说,罗斯等人(1998)通过调整所有引物和其延伸产物的质量从而使得它们将处于4.5kDa和7.6kDa的无重叠的范围内来进行多个SNP的同时检测。相比之下,通过消除占据质谱中有价值的质量范围的未延伸引物,SPC-SBE方法显著增加SNP表征中的多重范围。人类遗传性血色沉着病基因的遗传变异(C282Y和H63D)通过SPC-SBE成功并且精确地表征(金等人2002)。来自维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、头颈鳞状癌以及结肠直肠癌的肿瘤抑制基因p53的外显子5、7以及8中的三十个多态位点(其最经常在人类癌症中突变)(霍尔施泰因(Hollstein)等人1991和白得利(Bardelli)等人2003)也使用SPC-SBE方法精确确定(金等人2004)。使用SPC-SBE方法,米斯拉(Misra)等人在细胞色素P450(CYP450)基因中进行CYP2C9的40个SNP和CYP2A13的50个SNP的并行分析(米斯拉等人2007)。
采用小分子、生物素以及蛋白质、抗生蛋白链菌素在如磁珠的固体表面上的强烈相互作用的DNA纯化被广泛用于生物技术中。然而,生物素与抗生蛋白链菌素之间的亲和力是在最强的已知非共价键之间。生物素-抗生蛋白链菌素相互作用的变性需要在95℃下用甲酰胺处理,并且反应产率通常是低的。为进一步优化SPC的条件并且从涂有抗生蛋白链菌素的磁珠释放DNA延伸产物,邱等人(分析生物化学(Anal.Biochem),427:193-201,2012)开发出一组化学可裂解的生物素标记的双脱氧核苷酸ddNTP-N3-生物素(ddATP-N3-生物素、ddGTP-N3-生物素、ddCTP-N3-生物素以及ddUTP-N3-生物素),应用于DNA测序和通过MALDI-TOF MS进行的SNP分析中。这些可裂解的生物素标记的双脱氧核苷酸已成功地用于SPC-SBE中用于表征线粒体SNP(邱等人,分析生物化学,427:202-210,2012)。
已开发出用于多重SNP分析的使用质谱的若干替代方法。举例来说,西格诺公司(Sequenom Inc.)的市售MASSARRAYTM试验(罗迪(Rodi)等人2002)被广泛用于表征遗传变异,包含用于群体研究的线粒体SNP(塞雷佐(Cerezo)等人2009)和异质性检测(郑秀(Xiu-Cheng)等人2008)。MASSARRAYTM试验在高通量下自动化。在这种方法的一个形式中,引物是通过DNA聚合酶在三个双脱氧核苷酸和对应于两个等位基因之一的一个脱氧核苷酸存在下延伸。在反应结束时,将单核苷酸引物延伸产物和以两个或更多个核苷酸延伸的引物以及未延伸引物都装载到MALDI-TOF MS分析仪上并且在质谱中检测。由于不需要任何反应组分的标记,MASSARRAYTM试验可简单进行。然而,进行同时高水平多重SNP分析受到限制,因为所有反应产物和所有未延伸引物都被装载到MS分析仪中。
通过荧光检测进行SNP分析的综述
荧光偏振模板导引的染料终止子掺入(FP-TDI)SNP试验(陈(Chen)等人1999)使用单核苷酸聚合酶延伸与等位基因特异性荧光标记的双脱氧核苷酸终止子。延伸产物的基因型通过监测荧光偏振的独特变化来表征。FP-TDI方法提供简单的SNP检测方法但具有有限的多重范围。
已开发出BEAMing(珠粒、乳液、扩增以及磁学)方法(德雷斯曼(Dressman)等人2003)用于以高灵敏度和高通量的目的检测遗传变异。在这种方法中,每个个别DNA模板在水-油乳液中通过大量被固定在磁珠上的寡核苷酸引物分开扩增,目标SNP通过独特荧光染料标记探针区分并且使用流式细胞测量术表征。BEAMing方法不仅允许识别等位基因变异,而且提供定量这些变异的能力。另外,DNA样品可以从流式细胞仪回收用于进一步分析。BEAMing方法的缺点是需要多个操作步骤,可能导致等位基因频率的精确表征的困难。
董(Tong)等人已开发出使用SBE和组合荧光能量转移(CFET)标签的多重荧光SNP试验(董等人2002)。已通过采用荧光能量转移和组合概念使用少量具有不同发射的荧光团来构建大量具有独特荧光签名的CFET标签。CFET标签都可以在488nm单一波长下被激发并且通过简单光学系统检测和区分。所述方法的原理如下概述。设计并且合成CFET标记的寡核苷酸引物的库,使得3'端处的核苷酸与模板中的特定SNP互补。在单管反应中,使用CFET标记的寡核苷酸引物和生物素-ddNTP在含有SNP的DNA模板上进行SEE。与DNA模板完全匹配的CFET标记引物是通过DNA聚合酶使用生物素-ddNTP延伸。通过用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠捕获使3’生物素标记的DNA产物分离,而反应中的未延伸引物和其它组分未被捕获并且通过洗涤消除。使用多色激光诱导的荧光电泳仪器分析生物素标记的荧光DNA产物。通过电泳图中每个DNA延伸产物的不同荧光签名和电泳迁移率来确定SNP。使用寡核苷酸连接,董等人(2001)已使用CFET标签同时检测视网膜母细胞瘤的肿瘤抑制基因的多重核苷酸变异。
为说明SM-EMS试验的可行性,基于视网膜母细胞瘤的1个肿瘤抑制基因的序列来选择四种聚合物(PEG16、PEG20、PEG24以及PEG36)标记四个引物。可裂解PEG标记引物的合成流程示于图3中,并且所述步骤在下文中通过在图3中用于标记其的数字识别。市售氨基-dPEG-酸(2-5)首先与6-甲氧基香豆素-NHS酯(1)反应,提供相应的香豆素-(PEG)n-酸(6-9),通过使其与含碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)和三乙胺的无水DMF反应而转化为相应的NHS酯(10-13)。接着使所得四种不同香豆素-(PEG)n-NHS酯(10-13)与叠氮基连接子(14)反应(郭等人2008),产生相应的香豆素-(PEG)n-叠氮基-酸(15-18),随后将其转化为NHS酯。使叠氮基连接子PEG的所得NHS酯与5'-氨基引物偶合,产生目标可裂解PEG标记引物(PEG引物)。
实验1
合成与可裂解香豆素-(PEG)n类似物偶合的引物
所有PEG类似物通过在250×10mm管柱(苏佩克(Supelco))上使用以下流动相进行反相HPLC来纯化:A,8.6mM EtaN/100mM含1,1,1,3,3,3,3-六氟-2-丙醇的水(pH8.1),以及B,甲醇;或A,0.1M三乙基乙酸铵(pH 7.5)缓冲液,以及B,乙腈梯度。在MALDI-TOF MS光谱仪(Voyager-DE活组织分光计测量术工作站,PerSeptiveBiosystems)上获得相应分子的质谱。所有的合成流程步骤示于图3中并且在下文中通过在图3中用于标记其的数字识别。
(A)合成香豆素-PEG-酸和NHS酯
市售氨基-PEG-酸(氨基-dPEG16,20,24,36-酸)(2-5)首先与6-甲氧基香豆素-NHS酯(1)反应,产生相应的香豆素-(PEG)n-酸(6-9)。因此,向溶解于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH8.6)中的氨基-(PEG)n-酸(2-5,1当量)中添加含香豆素-NHS(1,1.5当量)的DMF,并且搅拌反应混合物过夜。通过使用CH2Cl2-MeOH(5-15%)混合物进行硅胶色谱来纯化香豆素-(PEG)n-酸(6-9),并且合并适当洗脱份。通过1H NMR和MALDI-TOF MS分析纯化的化合物。这些分子的MALDI-TOF MS数据如下所列:香豆素-PEG16-COOM(6)[预期分子量(EMW)=996Da;所观察到的分子量(OME)=1016Da)];香豆素-PEG20-COOH(7)(EMW=1172Da;OME=1192Da);香豆素-PEG24-COOH(8)(EMW=1348Da;OME=1368Da);香豆素-PEG36-COOH(9)(EMW=1877Da;OME=1899Da)。OME与EMW之间的差异是因为香豆素-(PEG)n-酸中存在一个钠离子(Na+)。通过与1.5当量碳酸二琥珀酰亚胺酯(DSC)和2当量含三乙胺的无水DMF反应2小时将香豆素-(PEG)n-酸转化为相应的NHS酯(10-13)。比硅胶板上的酸移动稍微更快的NHS酯是通过使用CH2Cl2-MeOH(5-15%)混合物进行硅胶色谱来纯化并且用于下一步骤中。
(B)使用基于叠氮基的连接子合成香豆素-(PEG)n-叠氮基-酸(15-18)
根据文献程序64进行(2-(2-[3-(2-氨基-乙基氨基甲酰基)-苯氧基]-1-叠氮基-乙氧基)-乙氧基)-乙酸(14,图6)的合成。使这一叠氮基连接子与四种不同香豆素-(PEG)n-NHS酯(10-13)反应,提供相应的香豆素-(PEG)n-叠氮基-酸(15-18)(图3),其通过HPLC纯化并且通过MALDI-TOF MS表征。这些分子的MALDI-TOF MS数据如下所列:香豆素-PEG16-N3-连接子-COOH(15)[预期分子量(EMW)=1345Da;所观察到的分子量(OME)=1346Da)];香豆素-PEG20-N3-连接子-COOH(16)(EMW=1521Da;OME=1521Da);香豆素-PEG24-N3-连接子-COOH(17)(EMW=1698Da;OME=1699Da);香豆素-PEG36-N3-连接子-COOH(18)(EMW=2226Da;OME=2230Da)。
(C)5'-氨基引物与香豆素-(PEG)n-叠氮基连接子-酸偶合
向香豆素-(PEG)n-叠氮基连接子-酸(15-18)(3.14mmol)溶解于无水DMF(300ml)中的溶液中添加O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU,3mg,10mmol)于无水DMF(100ml)中的溶液。在氩气氛下在室温下搅拌反应混合物1小时,产生相应的NHS酯,与5'-氨基引物(引物-1,5’-NH2-CAGATGATATGTTCTAATTC-3'(SEQ ID NO:1);引物-2,5'-NH2-PEG20-TCACAAAGTGTATTTAGCCG-3'(SEQ ID NO:2);引物-3,5'-NH2-CAGATGATATGTTCTAATTA-3'(SEQ ID NO:3);引物-4,5'-NH2-GAGATAGGCTAGCCGATACA-3'(SEQ ID NO:4))偶合。将含适当5'-氨基引物(250nmol)的0.1M NaHCO3-Na2CO3缓冲液(pH8.7,250ml)添加到香豆素-(PEG)n-叠氮基连接子-酸的NHS酯中并且在室温下搅拌反应混合物过夜,产生目标分子,可裂解PEG引物(图3),其通过反相HPLC纯化并且通过MALDI-TOFMS表征。PEG引物的MALDI-TOF MS数据如下所列:香豆素-PEG16-N3-连接子-引物-1(PEG16-引物-1)[预期分子量(EMW)=7612Da;所观察到的分子量(OME)=7630Da)];香豆素-PEG20-N3-连接子-引物-2(PEG20-引物-2)(EMW=7798Da;OME=7797Da);香豆素-PEG24-N3-连接子-引物-3(PEG24-引物-3)(EMW=7989Da;OME=7989Da);香豆素-PEG36-N3-连接子-引物-4(PEG36-引物-4)(EMW=8562Da;OME=8550Da)。
实验2
可裂解PEG标记引物和其SBE裂解产物的表征
图4概述在PEG引物和生物素-ddNTP的情况下SM-EMS试验的分子机制。使含有多态位点的DNA模板与PEG引物库、生物素-ddNTP以及DNA聚合酶一起培育。每个PEG标记引物的3'端处的核苷酸与DNA模板中的特定SNP互补。仅完全互补的PEG标记引物通过DNA聚合酶与生物素-ddNTP延伸。涂有抗生蛋白链菌素的磁珠仅捕获生物素标记的DNA延伸产物,而其它组分被洗掉。用TCEP处理所捕获的DNA产物使PEG裂解,将通过纳米孔分析PEG的独特的电流封锁签名,其中每一者确定唯一SNP。
三个PEG引物是通过MALDI-TOF MS表征并且结果示于图5中。每个PEG引物在质谱中产生单峰,PEG16-引物-1的分子量是7630Da,PEG20-引物-2的分子量是7797Da并且PEG24-引物-3的分子量是7989Da,确认每个PEG引物是纯的,具有预期序列和PEG标记。随后,评估PEG引物的用TCEP所得的PEG裂解效率。PEG20-引物-2首先用TCEP处理25分钟,并且通过MALDI-TOF MS分析所得产物。如图6中所示,质谱中产生两个干净峰:分子量是1380Da的峰来自裂解PEG20标签;分子量是6408Da的峰来自PEG20标签已裂解的引物-2。母体PEG20-引物-2没有峰,指示TCEP裂解效率是100%。PEG20-引物-2用TCEP进行的裂解反应流程示于图7中。
为确定在分子水平下SM-EMS试验的可行性,除通过MALDI-TOF MS而不是纳米孔检测最终裂解的PEG20标签之外,使用PEG20-引物-2根据图1中所示的流程进行所有步骤。此处的目的是验证SM-EMS试验的关键步骤的程序。如果涂有抗生蛋白链菌素的磁珠的裂解产物的MALDI-TOF MS分析与预期的PEG20标签匹配,那么所释放的PEG20标签的纳米孔表征应易于根据文献(库马尔等人2012)中所确立的程序实现。使用核苷酸“A”紧接在PEG20-引物-2和生物素-dUTP的启动位点之后的合成DNA模板进行SBE反应。在聚合酶延伸反应之后,在涂有抗生蛋白链菌素的磁珠上捕获产物。仅捕获在3'端处携带生物素并且在5'端处携带PEG20的DNA产物,而反应的其它组分被洗掉。接着用TCEP处理在涂有抗生蛋白链菌素的磁珠上捕获的DNA产物,并且收集裂解产物并且通过MALDI-TOF MS测量。图8中示出分子量是1446Da的单峰,其与携带2个钠离子的裂解PEG20标签(PEG20+2Na+)的质量匹配。
(A)PEG引物的MALDI-TOF MS测量
使用PEG引物(约20pmol)(PEG16-引物-1:5'-PEG16-CAGATGATATGTTCTAA-TTC-3'(SEQ ID NO:1);PEG20-引物-2:5'-PEG20-TCACAAAGTGTATTTAGCCG-3'(SEQ ID NO:2)以及PEG24-引物-3:5'-PEG24-CAGATGATATGTTCTAATTA-3'(SEQ ID NO:3))获得图5中所示的质谱。
(B)TCEP处理PEG20-引物-2使基于叠氮基的连接子裂解产生PEG20标签
在65℃下用10μl TCEP(50mM)处理PEG20-引物-2(200pmol)25分钟,产生所释放的PEG20标签并且去除含PEG20标签的引物-2。两种产物都通过ZipTip C18(ZTC18S096,密理博公司(Millipore))脱盐并且通过MALDI-TOF MS分析,并且结果示于图6中。
(C)在生物素-aha-dUTP的情况下的PEG引物延伸
使用生物素-aha-dUTP(目录号B32766,生命技术公司(Life Technologies))用于基于视网膜母细胞瘤1个肿瘤抑制基因的序列在PEG20-引物-2(5'-PEG20-TCACAAAGTGTATTTAGCCG-3’)(SEQ ID NO:2)和DNA模板(5'-TAGCCTATCTACGGCTAAATACACTTTGTGAACGCCTTCTG-3'(SEQ ID NO:8))的情况下进行聚合酶延伸反应。热测序酶(4U/反应)以20μl总反应体积与100pmol引物、60pmol模板以及300pmol生物素-aha-dUTP一起使用。使用以下循环方案进行延伸:(93℃/30"、55℃/30"、72℃/1')×20,93℃/2',并且接着存储在4℃下。
(D)用抗生蛋白链菌素磁珠捕获DNA延伸产物并且进行TCEP处理以释放PEG20标签
将一百微升涂有抗生蛋白链菌素的磁珠(DynabeadsMyOne抗生蛋白链菌素C1,英杰公司(Invitrogen))用1×结合与洗涤(B&W)缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、2.0MNaCl,pH 7.5)洗涤两次,并且接着再悬浮于50μl 2×B&W缓冲液中。将在PEG20-引物-2和生物素-aha-dUTP的情况下获得的相同体积的引物延伸产物添加到2×B&W缓冲液中。在室温下将混合物放在旋转器上15分钟。去除上清液同时用磁体固定磁珠。珠粒接着用100μl 1×B&W缓冲液洗涤三次并且接着用磁体固定。添加100μl TCEP(50mM)以使珠粒再悬浮并且在65℃下进行培育25min。所得含有所释放的PEG20标签的TCEP溶液使用ZipTip C18(ZTC18S096,密理博公司)脱盐并且通过MALDI-TOF MS分析,并且结果示于图8中。
实验3
通过连接有质量标签的引物识别基因目标
使用常规质量代码(MassCode)引物(连接有质量标签的引物)的PCR已被用于识别基因目标(布里斯(Briese)等人2005和帕拉西奥斯(Palacios)等人2006)。制备引物库,每个具有通过可裂解连接子连接的独特质量标签。对目标基因进行PCR扩增,使得与目标基因的每个链互补的两个引物掺入PCR产物中。使PCR产物经受纯化步骤,以便去除未反应的过量引物。这些PCR产物接着被洗脱到多孔板中用于质谱分析。两个质量标签裂解并且用质谱仪分析,识别两个同源标签,因此识别与它们最初连接的库引物。这个信息用于识别目标基因。然而,这个过程需要使用大型并且昂贵的质谱设备(参见图9)。
通过连接有纳米标签的引物识别基因目标
使用常规纳米标签引物(连接有纳米标签的引物)的PCR使用与上文所述使用质量标签引物的PCR相关的过程,但无必须使用大型并且昂贵的质谱仪的缺点。制备引物库,每个具有通过可裂解连接子连接的独特纳米标签。对目标基因进行PCR扩增,使得与目标基因互补的两个引物掺入PCR产物中。使PCR产物经受纯化步骤,以便去除未反应的过量引物。这些PCR产物接着被洗脱到多孔板中用于纳米孔分析。两个纳米标签裂解并且用纳米孔分析,识别两个同源标签,从而识别与它们最初连接的库引物。这个信息用于识别目标基因(参见图10)。
实验4
使用荧光检测进行定量PCR
使用荧光检测进行实时定量PCR,塔克曼探针部分地与目标分子杂交。探针的每一端通常具有不与目标分子杂交的一段核苷酸。这种探针已连接荧光团和淬灭剂,使得荧光团在与探针连接时不展现荧光。荧光团通常在探针的5'端处与探针连接,并且淬灭剂通常与探针的3'端连接。在PCR期间,Taq聚合酶的5’-3'核酸外切酶活性使荧光团从双标记探针释放。在释放之后,荧光团不受淬灭剂的影响并且发荧光(参见图11,左侧)。假定引入足够的探针,荧光水平将随着目标DNA的量增加而增加。
使用纳米标签检测进行定量PCR
使用纳米标签检测进行实时定量PCR分析提供如下益处:与在荧光团检测下的分析相同,但具有使用纳米孔检测的附加益处,如上文所述。当使用纳米标签检测进行实时定量PCR分析时,与荧光检测相反,探针仅具有一个标记,所述标记可以通过纳米孔检测,连接在探针的5'端。不需要淬灭剂。通常,探针包括不与目标分子杂交的5'端尾。在PCR期间,Taq聚合酶的核酸外切酶活性使纳米标签释放,随后通过纳米孔检测以识别目标。通过纳米孔检测到的电子信号越大,释放的纳米标签越多(参见图11,右侧)。纳米标签释放的增加与目标的较大丰度相关。
结论
提出一种使用单分子灵敏度的纳米孔检测通过基于叠氮基的连接子使用用不同长度的PEG聚合物标记的寡核苷酸引物库进行电子多重SNP试验的新颖方法。已确定这种方法在分子水平下的可行性。所述研究包含新颖的可裂解PEG标记引物的设计和合成以及其通过MALDI-TOF MS进行的表征。示出基于叠氮基的可裂解连接子在聚合酶反应和固相捕获期间是稳定的。用TCEP处理在固相上捕获的PEG标记的DNA产物导致基于叠氮基的连接子定量裂解从而释放预期的PEG标签,通过MALDI-TOF MS确认其结构。在未来可以使用所确立的程序容易地进行PEG标签通过纳米孔表征(罗伯森等人2007和库马尔等人2012)。
已示出不同大小的PEG以电子方式检测和区分,并且在单分子水平下通过蛋白质纳米孔检测和区分。每个大小不同的PEG在纳米孔中产生独特的电流封锁签名。基于前述结果,预期至多20个不同大小的PEG可以用于开发单分子电子多重SNP试验。因此,对应于目标基因的不同SNP位点的20个寡核苷酸引物的库可以通过可以用TCEP有效裂解的基于叠氮基的连接子用20个PEG标记。由于每个PEG标记的寡核苷酸引物的3'端处的核苷酸与模板中的特定SNP互补,这些PEG标记引物可以与生物素标记的双脱氧核苷酸(生物素-ddNTP)一起用于在单管中的单碱基延伸。仅与DNA模板完全互补的PEG标记引物将通过DNA聚合酶与生物素-ddNTP延伸。在3'端处携带生物素的PEG标记的DNA延伸产物将用涂有抗生蛋白链菌素的磁珠捕获;未延伸的PEG标记引物和SBE反应的其它组分将通过洗涤消除。用TCEP处理所捕获的DNA产物使PEG裂解,将通过纳米孔分析PEG。每个大小不同的PEG将在单分子水平下产生独特的纳米孔电流封锁签名,将导致多重SNP的识别。
有广泛的不断努力来构建纳米孔阵列用于高通量生物分子分析(德拉托雷(delaTorre)等人2012和杨(Yang)等人2013)。因此,本文中所述的单分子电子多重SNP试验可以易于用于纳米孔阵列中,形成在单分子水平下高灵敏度的高通量有成本效益的遗传变异分析系统。以下进展的组合使这种方法可行:(1)确立的形成新颖的可裂解PEG标记引物的有机合成方法;(2)生物素与抗生蛋白链菌素之间的分子亲和力;(3)DNA聚合酶在SBE中的特异性;(4)用TCEP进行的位点特异性裂解而不破坏DNA;以及(5)纳米孔充当单分子电子检测器的能力。
在未来充分开发所提出的单分子电子多重SNP试验的进一步努力将包含设计和合成较大的可裂解PEG引物库以及执行图1中所概述的所有步骤以便通过纳米孔进行高层次多重SNP表征。
参考文献
白R.K.(Bai,R.K.)和王L.J.(Wong,L.J.)通过实时扩增失效突变系统定量PCR分析:单步方法来检测和定量异质性突变线粒体DNA(Detection and quantification ofheteroplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractorymutation system quantitative PCR analysis:a single-step approach).临床化学(Clin.Chem.)50,996-1001(2004)。
白得利A.(Bardelli,A.)等人结肠直肠癌中酪氨酸激酶组的突变分析(Mutational analysis of the tyrosine kinome in colorectal cancers).科学(Science)300,949(2003)。
本特利D.R.(Bentley,D.R.)等人使用可逆终止子化学使全人类基因组测序精确(Accurate whole human genome sequencing using reversible terminatorchemistry).自然(Nature)456,53-59(2008)。
别兹鲁科夫S.M.(Bezrukov,S.M.)等人聚合物的动力和自由能分配到纳米级孔中(Dynamics and free energy of polymers partitioning into a nanoscale pore).大分子(Macromolecules)29,8517-22(1996)。
布里斯T.(Briese T.)等人快速并且敏感差示检测病原体的诊断系统(Diagnostic system for rapid and sensitive differential detection ofpathogens).重症感染疾病(Emerg Infect Dis.)11(2):310-13(2005)。
塞雷佐M.(Cerezo,M.)等人对基于大规模人类mtDNA群体的研究应用MALDI-TOFMS(Applications of MALDI-TOF MS to large-scale human mtDNA population-basedstudies).电泳(Electrophoresis)30,3665-3673(2009)。
陈X.(Chen,X.)等人均质核酸分析中的荧光偏振(Fluorescence polarizationin homogeneous nucleic acid analysis).基因组研究(Genome Res.)9:492-498(1999)。
谢里夫G.M.(Cherf,G.M.)等人DNA在纳米孔中在精度下的自动正向和反向棘轮效应(Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore atprecision).自然生物技术(Nat.Biotectmol.)30,344-348(2012)。
乔杜里J.(Chowdhury,J.)等人硫代嘌呤S-甲基转移酶基因的单核苷酸多态性基因分型的微流体平台用于评估不良药物事件的风险(Microfluidic Platform for SingleNucleotide Polymorphism Genotyping of the Thiopurine S-Methyltransferase Geneto Evaluate Risk for Adverse Drug Events).分子诊断学(J.Mol.Diagn.)9,521-529(2007)。
克拉克J.(Clarke,J.)等人连续碱基识别单分子纳米孔DNA测序(Continuousbase identification for single-molecule nanopore DNA sequencing).自然纳米技术(Nat.Nanotechnol.)4,265-70(2009)。
德拉托雷R.(dela Torre,R.)等人制造和表征固态纳米孔阵列用于高通量DNA测序(Fabrication and characterization of solid-state nanopore arrays for high-throughput DNA sequencing).纳米技术(Nanotechnology)23,385308(2012)。
丁C.(Ding,C.)和康托尔C.R.(Cantor,C.R.)使用竞争性PCR和基质辅助激光解吸电离飞行时间MS的高通量基因表达分析技术(A high-throughput gene expressionanalysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight MS)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),100,3059-3064(2003)。
丁C.和康托尔C.R.使用M1-PCR MS进行远程基因组DNA的直接分子单倍型分析(Direct molecular haplotyping of long-range genomic DNA with M1-PCR MS).美国国家科学院院刊,100,7449-7453(2003)。
德雷斯曼D.(Dressman,D.)等人单一DNA分子转化为荧光磁粒用于检测和计数遗传变异(Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particlesfor detection and enumeration of genetic variation).美国国家科学院院刊100,8817-8822(2003)。
艾德J.(Eid,J.)等人单聚合酶分子的实时DNA测序(Real-Time DNA Sequencingfrom Single Polymerase Molecules).科学323,133-138(2009)。
费Z.(Fei,Z.)等人用质量标记ddNTP进行单核苷酸多态性的MALDI-TOF质谱分型(MALDI-TOF mass spectrometric typing of single nucleotide polymorphisms withmass-tagged ddNTPs).核酸研究(Nucleic Acids Res.),26,2827-2828(1998)。
弗雷泽K.A.(Frazer,K.A.)等人超过310万个SNP的第二代人类单倍型图(Asecond generation human haplotype map of over 3.1million SNPs).自然449,851-861(2007)。
格里芬T.J.(Griffin,T.J.)等人通过基质辅助激光解吸/电离质谱进行直接遗传分析(Direct genetic analysis by matrix-assisted laser desorption/ionizationmass spectrometry).美国国家科学院院刊96,6301-6306(1999)。
格里芬T.J.和史密斯L.M.(Smith,L.M.)通过MALDI-TOF质谱进行单核苷酸多态性分析(Single-nucleotide polymorphism analysis by MALDI-TOF mass spectrometry).生物技术趋势(Trends.Biotechnol.)18,77-84(2000)。
郭J.(Guo,J.)等人用3-O修饰的核苷酸可逆终止子和化学可裂解荧光双脱氧核苷酸进行四色DNA测序(Four-color DNA sequencing with 3-O-modified nucleotidereversible terminators and chemically cleavable fluorescentdideoxynucleotides).美国国家科学院院刊105,9145-9150(2008)。
哈夫L.A.(Haff,L.A.)和斯米尔诺夫I.P(Smirnov,I.P)用质量标签标记的引物进行PCR产物的多重基因分型(Multiplex genotyping of PCR products with mass tag-labeled primers).核酸研究,25,3749-3750(1997)。
哈登博P.(Hardenbol,P.)等人用序列标记的分子倒置探针进行多重基因分型(Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes).自然生物技术21:673-678(2003)。
哈里斯T.D.(Harris,T.D.)等人病毒基因组的单分子DNA测序(Single-MoleculeDNA Sequencing of a Viral Genome).科学320,106-109(2008)。
哈特曼A.(Hartmann,A.)等人93个全世界线粒体基因组的基于微阵列的重测序的验证(Validation of microarray-based resequencing of 93worldwide mitochondrialgenomes).人类变异(Hum.Mutat.)30,115-122(2009)。
霍尔施泰因M.(Hollstein,M.)等人人类癌症中的p53突变(p53mutations inhuman cancers).科学.253,49-53(1991)。
居J.(Ju,J.)等人能量转移荧光染料标记的引物用于DNA测序和分析(Energytransfer fluorescent dye-labeled primers for DNA sequencing and analysis).美国国家科学院院刊92,4347-4351(1995)。
居J.等人便捷构建能量转移荧光引物的卡式标记(Cassette labeling forfacile construction of energy transfer fluorescent primers).核酸研究24,1144-1148(1996)。
居J.等人使用可裂解荧光核苷酸可逆终止子进行四色DNA合成测序(Four-ColorDNA Sequencing by Synthesis Using Cleavable Fluorescent Nucleotide ReversibleTerminators).美国国家科学院院刊103,19635-19640(2006)。
卡西亚诺维奇J.J.(Kasianowicz,J.J.)和别兹鲁科夫S.M.(Bezrukov,S.M.)α-毒素离子通道根据pH依赖性电流波动的频谱分析的质子化动力学(Protonation dynamicsof the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent currentfluctuations).生物物理学杂志(Biophys.J.)69,94-105(1995)。
卡西亚诺维奇J.J.等人使用膜通道进行个别聚核苷酸分子的表征(Characterization of individual polynucleotide molecules using a membranechannel).美国国家科学院院刊93,13770-13773(1996)。
卡西亚诺维奇J.J.等人DNA穿过纳米孔的物理学和应用于同步多分析物传感(Physics of DNA threading through a nanometer pore and applications tosimultaneous multianalyte sensing).约束聚合物的结构和动力学(Structure andDynamics of Confined Polymers),卡西亚诺维奇J.J.,克勒迈尔M.S.Z.(Kellemayer,M.S.Z.)以及迪默D.W.(Deamer,D.W.)编,NATO科学系列(NATO Science Series),克卢沃学术出版社(Kluwer Academic Publishers),荷兰(The Netherlands)87,141-164(2002)。
卡西亚诺维奇J.J.等人纳米级多孔传感器(Nanoscopic porous sensors).分析化学年述(Annu Rev Anal Chem)1,737-766(2008)。
赫特帕尔I.(Kheterpal,I.)等人使用四色共聚焦荧光毛细管阵列扫描仪进行DNA测序(DNA Sequencing Using a Four-Color Confocal Fluorescence Capillary ArrayScanner).电泳17,1852-1859(1996)。
金S.(Kim,S.)等人固相可捕获双脱氧核苷酸使用质谱进行多重基因分型(Solidphase capturable dideoxynucleotides for multiplex genotyping using massspectrometry).核酸研究30,e85(p1-6)(2002)。
金S.等人使用固相可捕获双脱氧核苷酸和质谱进行人类β2-肾上腺素受体基因的多重基因分型(Multiplex Genotyping of the Humanβ2-Adrenergic Receptor GeneUsing Solid Phase Capturable Dideoxynucleotides and Mass Spectrometry).分析生物化学(Analytical Biochemistry)316,251-258(2003)。
金S.等人使用固相可捕获双脱氧核苷酸和质谱进行p53基因的三十倍多重基因分型(Thirtyfold multiplex genotyping of the p53gene using solid phasecapturable dideoxynucleotides and mass spectrometry).基因组学(Genomics)83,924-931(2004)。
克拉西尔尼科夫O.V.(Krasilnikov,O.V.)用中性聚合物确定通道大小(Sizingchannels with neutral polymers).约束聚合物的结构和动力学,卡西亚诺维奇J.J.,克勒迈尔M.S.Z.以及迪默D.W.编,NATO科学系列,克卢沃学术出版社,荷兰87,97-116(2002)。
库马尔S.等人PEG标记的核苷酸和纳米孔检测用于单分子DNA合成测序(PEG-labeled nucleotides and nanopore detection for single molecule DNA sequencingby synthesis).科学报告(Sci Rep.)2,684,1-8(2012)。
郭P.Y.(Kwok,P.Y.)高通量基因分型试验方法(High-throughput genotypingassay approaches).药物基因组学(Pharmacogenomics)1,95-100(2000)。
兰德E.S.(Lander,E.S.)等人人类基因组的最初测序和分析(Initialsequencing and analysis of the human genome).自然409,860-921(2001)。
莱米车夫V.(Lyamichev,V.)等人通过寡核苷酸探针的侵袭性裂解进行基因组DNA的多态性识别和定量检测(Polymorphism identification and quantitative detectionof genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes).自然生物技术17,292-296(1999)。
曼拉奥E.A.(Manrao,E.A.)等人用突变MspA纳米孔和phi29DNA聚合酶以单核苷酸分辨率读取DNA(Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspAnanopore and phi29DNA polymerase).自然生物技术30,349-353(2012)。
马古利斯M.(Margulies,M.)等人在显微制造的高密度皮升反应器中的基因组测序(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors).自然437,376-380(2005)。
米斯拉A.(Misra,A.)等人通过使用MALDI-TOF质谱进行细胞色素p450单核苷酸多态性的多重基因分型(Multiplex genotyping of cytochrome p450single-nucleotidepolymorphisms by use of MALDI-TOF mass spectrometry).临床化学53,933-939(2007)。
帕拉西奥斯G.(Palacios G.)等人病毒出血性发热的差示诊断的质量标签聚合酶链反应(MassTag polymerase chain reaction for differential diagnosis of viralhemorrhagic fever).重症感染疾病12(4):692-95(2006)。
邱C.(Qiu,C.)等人设计和合成用于通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行DNA测序的可裂解的生物素标记的双脱氧核苷酸(Design and synthesis of cleavablebiotinylated dideoxynucleotides for DNA sequencing by matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight mass spectrometry).分析生物化学427,193-201(2012)。
邱C.等人使用可裂解的生物素标记的双脱氧核苷酸通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行线粒体单核苷酸多态性基因分型(Mitochondrial single nucleotidepolymorphism genotyping by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry using cleavable biotinylated dideoxynucleotides).分析生物化学427,202-210(2012)。
赖纳J.E.(Reiner,J.E.)等人使用基于纳米孔的单分子质谱进行聚合物分析的理论(Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule massspectrometry).美国国家科学院院刊107,12080-12085(2010)。
罗伯森J.W.(Robertson,J.W.)等人使用单独纳米孔在溶液中进行单分子质谱(Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore).美国国家科学院院刊104,8207-11(2007)。
罗迪C.P.(Rodi,C.P.)等人使用MassARRAYTM系统快速探索疾病标记物的策略(Astrategy for the rapid discovery of disease markers using theMassARRAYTMsystem).生物技术增刊(Biotechniques Suppl.)32,S62-S69(2002)。
罗塞斯A.(Roses,A.)药物遗传学和医学实践(Pharmacogenetics and thepractice of medicine).自然405,857-865(2000)。
罗斯P.L.(Ross,P.L.)等人使用通过MALDI-TOF质谱检测的肽核酸探针区分人类DNA中的单核苷酸多态性(Discrimination of single-nucleotide polymorphisms inhuman DNA using peptide nucleic acid probes detected by MALDI-TOF massspectrometry).分析化学,69,4197-4202(1997)。
罗斯凯M.T.(Roskey,M.T.)等人通过延迟引出基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱进行DNA测序(DNA sequencing by delayed extraction-matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry).美国国家科学院院刊.93,4724-4729(1996)。
罗斯P.等人通过MALDI-TOF质谱进行高层次多重基因分型(High levelmultiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry).自然生物技术16,1347-1351(1998)。
罗斯伯格J.M.(Rothberg,J.M.)等人能够进行非光学基因组测序的集成半导体装置(An integrated semiconductor device enabling non-optical genomesequencing).自然475,348-352(2011)。
萨拉斯-索拉诺O.(Salas-Solano,O.)等人使用可替换的线性聚丙烯酰胺溶液通过毛细管电泳在少于一小时内进行1000个碱基的常规DNA测序(Routine DNA sequencingof 1000bases in less than one hour by capillary electrophoresis withreplaceable linear polyacrylamide solutions).分析化学70,3996-4003(1998)。
史密斯L.M.等人自动DNA测序分析中的荧光检测(Fluorescence detection inautomated DNA sequencing analysis).自然,321,674-679(1986)。
宋L.(Song,L.)等人葡萄球菌α-溶血素的结构,七聚跨膜孔(Structure ofStaphylococcal alpha-hemolysin,a heptameric transmembrane pore).科学274,1859-1866(1996)。
斯特科J.(Stoerker,J.)等人通过MALDI监测的从探针库的核酸酶选择进行快速基因分型(Rapid genotyping by MALDI-monitored nuclease selection from probelibraries).自然生物技术18,1213-1216(2000)。
唐K.(Tang,K.)等人通过质谱进行基于芯片的基因分型(Chip-based genotypingby mass spectrometry).美国国家科学院院刊96,10016-10020(1999)。
董A.K.(Tong,A.K.)等人用于多重生物试验的组合荧光能量转移标签(Combinatorial Fluorescence Energy Transfer Tags for Multiplex BiologicalAssays).自然生物技术19,756-759(2001)。
董A.K.和居J.通过组合荧光能量转移标签和生物素标记的双脱氧核苷酸进行单核苷酸多态性检测(Single-nucleotide Polymorphism Detection by CombinatorialFluorescence Energy Transfer Tags and Biotinylated Dideoxynucleotides).核酸研究30,e19(p1-7)(2002)。
文特尔J.C.(Venter,J.C.)等人人类基因组的序列(The sequence of the humangenome).科学291,1304-1351(2001)。
惠勒D.A.(Wheeler,D.A.)等人通过大规模平行DNA测序的个体的全基因组(Thecomplete genome of an individual by massively parallel DNA sequencing).自然452,872-876(2008)。
郑秀F.A.(Xiu-Cheng,F.A.)等人使用MALDI-TOF质谱识别线粒体DNA的单核苷酸多态性的快速而精确方法(A rapid and accurate approach to identify singlenucleotide polymorphisms of mitochondrial DNA using MALDI-TOF massspectrometry).临床化学实验室医学(Clin.Chem.Lab.Med.)46,299-305(2008)。
杨Y.(Yang,Y.)等人纳米孔测序技术的进展(Advances in nanopore sequencingtechnology).纳米科学纳米技术杂志(J.Nanosci.Nanotechnol.)13,4521-4538(2013)。
Claims (18)
1.一种识别DNA中一段连续核苷酸残基内的位置处的相关单核苷酸残基的方法,其包括以下步骤:
(a)使所述DNA在体外与以下各者一起培育:
(1)至少一个寡核苷酸引物,每个引物包括以可去除方式连接的标记,所述标记(i)对应于特定引物序列及(ii)具有可通过纳米孔检测的独特签名,其中所述引物的5'端处的核苷酸基本上与所述DNA中紧接着相关单核苷酸的3'的核苷酸完全互补,
(2)包括钩状物的终止核苷酸,以及
(3)DNA聚合酶,
以便进行引物的单碱基延伸,引物的3'端核苷酸与所述DNA中的所述相关单核苷酸残基杂交,在这个引物存在的情况下使用所述终止核苷酸,从而形成所述引物的延伸产物,其具有与所述DNA中的所述相关核苷酸互补的3'核苷酸;
(b)通过使掺入所述引物的终止核苷酸的钩状物与对所述钩状物具有高亲和力的化学部分、化合物或其他物质结合或反应,捕获所述延伸产物,以及洗掉来自步骤(a)的任何未延伸引物,从而分离所述延伸产物;
(c)从所述延伸产物去除所述标记,如果存在的话;
(d)通过纳米孔检测3'端核苷酸与所述相关单核苷酸残基杂交的所述引物的所述标记的所述签名,从而识别所述标记和引物,如果存在的话;
从而识别所述相关单核苷酸残基。
2.根据权利要求1所述的方法,所述终止核苷酸是双脱氧核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述DNA是单链DNA或是双链DNA。
4.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中在步骤(a)中,使所述DNA与多个寡核苷酸引物一起培育,其中所述多个寡核苷酸引物包括至少两个引物、至少三个引物或至少四个引物,所述引物除在每一个所述引物的3'端处具有不同核苷酸以外具有(i)相同核苷酸序列,其中每一个所述引物中的所述相同核苷酸基本上与所述DNA中紧接着所述相关单核苷酸残基的3'的核苷酸完全互补。
5.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述终止核苷酸包括钩状物,所述钩状物是生物素部分。
6.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述终止核苷酸包括钩状物,所述钩状物是苯基硼酸(PBA)部分。
7.根据权利要求5所述的方法,其中通过在涂有抗生蛋白链菌素的磁珠上捕获延伸产物使所述延伸产物与所述未延伸引物分离。
8.根据权利要求6所述的方法,其中通过在涂有水杨基氧肟酸(SHA)的磁珠上捕获延伸产物使所述延伸产物与所述未延伸引物分离。
9.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述标记通过可裂解连接子以可去除方式连接,或通过作为叠氮基连接子的可裂解连接子以可去除方式连接,或通过在步骤(b)中用含膦部分或三-(2-羧乙基)膦(TCEP)裂解的可裂解连接子以可去除方式连接,或通过与所述标记与所述寡核苷酸之间的所述寡核苷酸引物的5'端连接的可裂解连接子以可去除方式连接。
10.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述标记包括以下中的一者或多者:乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化学发光化合物、单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香族酸、醇、硫醇基、氰基、硝基、烷基、烯基、炔基、叠氮基或其组合。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述标记是聚乙二醇(PEG)标记,或是彼此各自具有不同长度的PEG标记。
12.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述DNA与多个引物或至少20个不同寡核苷酸引物一起培育,每个引物包括具有可通过纳米孔检测的独特签名的连接标记。
13.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述纳米孔是生物制品,是固态纳米孔,或呈固态膜形式。
14.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述签名是电流封锁签名。
15.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中每个引物的对于所述引物的所述3'核苷酸是5'的部分的核苷酸序列与所述DNA的对于所述相关单核苷酸残基是3'的序列至少85%互补,至少90%互补,至少95%互补或100%互补。
16.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述引物的所述序列是10-40个核苷酸长。
17.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法,其中所述相关单核苷酸位于单核苷酸多态性(SNP)位点。
18.一种试验,其用于进行根据权利要求1到2中任一权利要求所述的方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461939144P | 2014-02-12 | 2014-02-12 | |
US61/939,144 | 2014-02-12 | ||
PCT/US2015/015647 WO2015123430A2 (en) | 2014-02-12 | 2015-02-12 | Single molecule electronic multiplex snp assay and pcr analysis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106164297A CN106164297A (zh) | 2016-11-23 |
CN106164297B true CN106164297B (zh) | 2020-09-08 |
Family
ID=53800752
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580017155.9A Expired - Fee Related CN106164297B (zh) | 2014-02-12 | 2015-02-12 | 单分子电子多重snp试验以及pcr分析 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10718011B2 (zh) |
EP (1) | EP3105354B1 (zh) |
CN (1) | CN106164297B (zh) |
WO (1) | WO2015123430A2 (zh) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
WO2002029003A2 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
WO2007002204A2 (en) | 2005-06-21 | 2007-01-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pyrosequencing methods and related compostions |
US7982029B2 (en) | 2005-10-31 | 2011-07-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Synthesis of four color 3′O-allyl, modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods |
US7883869B2 (en) | 2006-12-01 | 2011-02-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
CN103282518B (zh) | 2010-12-17 | 2016-11-16 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序 |
WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
CN107082792A (zh) | 2012-04-09 | 2017-08-22 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 纳米孔的制备方法和其用途 |
EP2864502B1 (en) | 2012-06-20 | 2019-10-23 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules |
US9605309B2 (en) | 2012-11-09 | 2017-03-28 | Genia Technologies, Inc. | Nucleic acid sequencing using tags |
CN105102627B (zh) | 2013-03-15 | 2018-10-19 | 纽约哥伦比亚大学理事会 | 用于检测样品中多种预定化合物的方法 |
US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
MA39774A (fr) | 2014-03-24 | 2021-05-12 | Roche Sequencing Solutions Inc | Procédés chimiques pour produire des nucléotides étiquetés |
EP3268050B1 (en) | 2015-03-09 | 2021-07-14 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Pore-forming protein conjugate compositions and methods |
CN108779138B (zh) | 2015-09-28 | 2022-06-17 | 哥伦比亚大学董事会 | 用作dna合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成 |
CN105400877B (zh) * | 2015-12-07 | 2020-11-06 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种基于免疫酶联反应的基因组snp位点检测方法 |
CN109661232B (zh) | 2016-05-23 | 2023-03-03 | 纽约哥伦比亚大学董事会 | 核苷酸衍生物及其使用方法 |
US11591647B2 (en) | 2017-03-06 | 2023-02-28 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleic acid sequencing-by-synthesis (SBS) methods that combine SBS cycle steps |
CN108841924A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-11-20 | 济南广音医疗科技有限公司 | 外周血白细胞snp位点快速检测方法 |
WO2020086834A1 (en) | 2018-10-25 | 2020-04-30 | Singular Genomics Systems, Inc. | Nucleotide analogues |
EP3908286A4 (en) | 2019-01-08 | 2022-10-12 | Singular Genomics Systems, Inc. | NUCLEOTIDE CLEAVABLE LINKERS AND USES THEREOF |
CN110144399B (zh) * | 2019-04-09 | 2021-12-03 | 中源维康(天津)医学检验所有限公司 | 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013095896A1 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | General Electric Company | Photoactivated chemical bleaching of dyes |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0713143D0 (en) * | 2007-07-06 | 2007-08-15 | Ucl Business Plc | Nucleic acid detection method |
WO2010056513A2 (en) * | 2008-10-30 | 2010-05-20 | Sequenom, Inc. | Products and processes for multiplex nucleic acid identification |
EP2864502B1 (en) * | 2012-06-20 | 2019-10-23 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules |
-
2015
- 2015-02-12 WO PCT/US2015/015647 patent/WO2015123430A2/en active Application Filing
- 2015-02-12 CN CN201580017155.9A patent/CN106164297B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-02-12 EP EP15749646.4A patent/EP3105354B1/en active Active
- 2015-02-12 US US15/118,812 patent/US10718011B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013095896A1 (en) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | General Electric Company | Photoactivated chemical bleaching of dyes |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis;Shiv Kumar et al.;《SCIENTIFIC REPORTS》;20120921;第2卷;对比文件1第1-3页,第7页第4段 * |
Shiv Kumar et al..PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis.《SCIENTIFIC REPORTS》.2012,第2卷对比文件1第1-3页,第7页第4段. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015123430A2 (en) | 2015-08-20 |
WO2015123430A3 (en) | 2015-11-19 |
EP3105354A2 (en) | 2016-12-21 |
US10718011B2 (en) | 2020-07-21 |
EP3105354B1 (en) | 2020-05-06 |
EP3105354A4 (en) | 2018-02-14 |
CN106164297A (zh) | 2016-11-23 |
US20170058335A1 (en) | 2017-03-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106164297B (zh) | 单分子电子多重snp试验以及pcr分析 | |
CN107922968B (zh) | 用于单分子电子snp测定的聚合物标记的核苷酸 | |
US11634768B2 (en) | Methods for indexing samples and sequencing multiple polynucleotide templates | |
KR102417849B1 (ko) | 무효소 및 무증폭 시퀀싱 | |
US6960436B2 (en) | Quantitative methylation detection in DNA samples | |
EP2321429B1 (en) | Methods and kits for nucleic acid sequencing | |
JP4498657B2 (ja) | Dnaサンプル中のシトシン−メチル化とsnp又は突然変異の同時検出方法 | |
Larsen et al. | Recent developments in high-throughput mutation screening | |
WO2011032040A1 (en) | Methods of targeted sequencing | |
WO2005093094A2 (en) | Methods and means for nucleic acid sequencing | |
EP1999276A2 (en) | Methods and means for nucleic acid sequencing | |
CN106795554A (zh) | 使用核苷酸可逆终止子的离子传感器dna和rna合成测序 | |
EP1737978A1 (en) | Nucleic acid sequencing | |
US20200040390A1 (en) | Methods for Sequencing Repetitive Genomic Regions | |
WO2008134867A1 (en) | Methods, kits, and systems for nucleic acid sequencing by hybridization | |
Qiu | Novel molecular engineering approaches for genotyping and DNA sequencing | |
WO2010083046A2 (en) | Methods for using next generation sequencing to identify 5-methyl cytosines in the genome | |
JP4528475B2 (ja) | 5−位置メチル化変性体の識別方法 | |
de Paula Careta et al. | Recent patents on high-throughput single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping methods | |
JP4920201B2 (ja) | 核酸中の特定塩基を測定する方法 | |
US20030077584A1 (en) | Methods and compositons for bi-directional polymorphism detection | |
Cho | Development of Single Molecule Electronic SNP Assays using Polymer Tagged Nucleotides and Nanopore Detection | |
EP3010929A1 (en) | Universal methylation profiling methods | |
Fujishima et al. | A Microbead-based Single Base Extension Assay for the Detection of Known Single-base Changes in Genomic DNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200908 |