CN103983679A - 一种降低电化学传感器背景信号的方法及应用其的传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降低电化学传感器背景信号的方法及应用其的传感器，属于生物分析技术领域。本发明通过在传感器构建或检测过程中形成类似于自然界中常见的“荷叶效应”，将尺寸较小的分子信号探针固定到纳米金颗粒表面合成尺寸较大的纳米探针，从而在传感过程中形成与荷叶表面类似的纳米结构，有效防止了信号探针插入电极表面上的DNA单分子层的分子间隙而引起的吸附，使得电化学传感器背景信号基本清除。结果表明，在检测可卡因和三磷酸腺苷时，采用纳米探针后两者的背景信号几乎完全清除，相应地大大提高了检测的灵敏度，两者的检测灵敏度分别为6nM和5nM，分别提高了2000倍和1000倍；而在检测Hg2+时，其信号残留也从原来的30％下降到了6％以下。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低电化学传感器背景信号的方法及其应用，属于生物分析技术领域。
背景技术
基于固相基质的传感器，如微阵列，试纸条，平面波导系统和电极等因具有高通量，测量简单，便携和自动化、微型化兼容性好等优点而被广泛应用于基础研究和实际检测。但此类传感器也存在不少技术上的难题而限制了它们的应用。最普遍和严重的问题是在固相基质表面信号探针的非特异性吸附引起强的背景信号而造成传感器的检测灵敏度下降。自组装分子层钝化表面(Sens Actuators B Chem.2008，129(1)，225-230.)高分子聚合物(Anal.Chem.2005，77(23)，7758-7762.)，DNA探针(Ahal.Chem.2011，83(17)，6464-6467.)和其他封闭试剂是常用的减少传感器表面吸附的方法。但在很多情况下这些方法并不能有效降低背景信号。因此发展一种通用而又十分简单有效地清除电化学传感器背景信号的方法仍是对广大科研人员的挑战。
纳米金颗粒是一种直径在1～100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性的纳米材料。因为具有高的比表面积，良好的生物相容性和电催化活性等独特性质而被广泛应用于生物传感器中进行分子识别和信号放大等。
发明内容
荷叶具有自清洁的效果，研究表明这种“荷叶效应”是由于荷叶表面具有纳米结构，纳米柱之间的距离远远小于水珠的直径，使得水珠无法进入纳米柱间从而无法沾污荷叶的表面。本发明将小尺寸的分子信号探针通过Au-S键固定到纳米金颗粒表面合成纳米探针，这样就可以在传感过程中形成与荷叶表面类似的纳米结构，达到清除(降低)电化学背景信号的目的。具体地说：分子探针固定到纳米金表面后其直径将超过13nm以上，而按常规方法组装的电化学传感器自组装单分子层探针间距离为4～8nm。此时纳米探针的尺寸超过单分子层探针间距离，在组装或传感过程中将形成与荷叶相似的仿生纳米结构，达到类似“荷叶效应”的自清洁效应，以清除电极表面的非特异性吸附而大幅提高传感器检测性能。
本发明的主要内容是通过将分子探针固定到纳米金表面合成为纳米探针，构建对电化学传感器电极表面非特异性吸附进行自清洁的方法及展示其应用，本发明提供一种降低电化学传感器背景信号的方法，其中，该方法包括如下步骤：步骤一：将化学修饰的捕获探针固定到金电极的表面；步骤二：将分子信号探针通过化学自组装固定到纳米金颗粒表面合成纳米探针。
进一步，根据所述的方法，其中，所述捕获探针或所述分子信号探针为较短链的探针。
进一步，根据所述的方法，其中，步骤一如下：1μM的末端巯基修饰的捕获探针在含有100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的缓冲溶液中(10mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，1.0M NaCl，pH＝7.0)室温下还原1h，将干净的裸金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装，组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍，吹干后放置于缓冲溶液中(10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0)备用。
进一步，根据所述的方法，其中，步骤二如下：将标记电化学氧化还原基团的分子信号探针，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，体积比2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温下反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对分子信号探针定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液(分子信号探针与纳米金摩尔比例为100∶1)，在室温下静置老化16小时，老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入氯化钠缓冲溶液(10mMPB，1M NaCl，pH＝7.4)，使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，用10mM PB(pH＝7.4)洗涤三次，置于4℃下备用。
进一步，根据所述的方法，其中，所述捕获探针为探针5：HS-(CH2)6-AGACAAGGAAAA；所述分子信号探针为探针6：HS-(CH2)6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG-(CH2)6-MB。
进一步，根据所述的方法，其中，所述捕获探针为探针7：HS-(CH2)6-A5ACCTGGGGGAGTAT；所述分子信号探针为探针8：HS-(CH2)6-A5TGCGGAGGAAGGT-(CH2)6-MB。
进一步，根据所述的方法，其中，所述捕获探针为探针9：T15-(CH2)6-SH；所述分子信号探针为探针10：Fc-(CH2)6-A20-(CH2)6-SH。
本发明还提供一种电化学传感器，其中，将所述的纳米探针溶于10mM PB，0.2M NaCl，pH7.0的缓冲溶液中为电解液，纳米金的终浓度为5nM，以所述的固定捕获探针的金电极作为工作电极组成三电极体系。
本发明还提供一种电化学传感器，其中，将包被了所述的探针10的纳米金用杂交液(1/15M PB，0.3M NaCl，pH7.4)稀释成2nM，与组装了所述探针9的金电极在25℃下抚育3h，再用杂交液冲洗三次，即制得传感器。
本发明中利用纳米探针清除电极表面非特异性吸附来降低电化学传感器背景信号的方法如下：
(1)将化学修饰的捕获探针固定到金电极的表面；
1μM的末端巯基修饰的捕获探针在含有100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的缓冲溶液中(10mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，1.0M NaCl，pH＝7.0)室温下还原1h，将干净的裸金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍，吹干后放置于缓冲溶液中(10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0)备用。
(2)将分子信号探针通过化学自组装固定到纳米金颗粒表面合成纳米探针；
将标记电化学氧化还原基团的分子信号探针，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，体积比2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温下反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对分子信号探针定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液(分子信号探针与纳米金摩尔比例为100∶1)，在室温下静置老化16小时。老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入氯化钠缓冲溶液(10mM PB，1M NaCl，pH＝7.4)，使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，用10mM PB(pH＝7.4)洗涤三次，置于4℃下备用。
(3)传感器的构建与靶标的电化学检测。
本发明中清除(降低)电化学传感器背景信号方法分别在信号增加检测平台(A)和信号减小检测平台(B)上应用，具体操作分别包括如下步骤：
(A)可卡因和三磷酸腺苷的检测：将纳米探针溶于缓冲溶液中(10mM PB，0.2M NaCl，pH7.0)为电解液，纳米金的终浓度为5nM，以固定捕获探针的金电极作为工作电极组成三电极体系，往电解液加入一定浓度的可卡因或者三磷酸腺苷，待体系平衡5分钟后，进行方波伏安(SWV)分析。根据SWV的电信号强度的变化实现对可卡因或者三磷酸腺苷的检测。
(B)Hg2+的检测：将包被了标记二茂铁的全A链的纳米金用杂交液(1/15M PB，0.3M NaCl，pH7.4)稀释成2nM，与组装好全T寡核苷酸链的金电极在25℃下抚育3h，再用杂交液冲洗三次，即制得传感器。检测Hg2+时，将一定浓度的Hg2+配置在杂交液中，将组装好的传感器浸泡于其中，于25℃下抚育30min，再用杂交液冲洗三次。进行方波伏安(SWV)分析。根据SWV的电信号强度的变化实现对Hg2+的检测。
本发明的基于纳米探针来减小电化学传感器电极表面非特异性吸附，从而降低背景信号的方法具有如下的技术效果：
1、本发明基于纳米探针来降低背景信号的方法简单、易行。
2、本发明的方法可以基本清除电化学信号增加检测平台的背景信号，大幅提高检测的灵敏度。
3、本发明的方法可以大幅清除电化学信号减小检测平台的背景信号，提高检测的相对信号变化。
附图说明
图1A一图1B，是利用纳米探针清除传感器电极表面非特异性吸附的原理图。
图2A-图2B，是本发明一个实施例中组装不同长度探针和组装不同密度的探针电极表面非特异性吸附前后的阻抗表征图。图2A中a，b，c分别是探针1，2和3组装到电极上之后的阻抗谱图；a′，b′，c′是上述申极分别与探针4抚育后的阳抗谱图。图2B中a，b，c分别是组装了低密度，中等密度，高密度的探针1的金电极的阻抗谱图；上述电极分别与探针4抚育后的阻抗谱图。
图3A-图3B，是本发明一个实施例中利用纳米探针的方法清除可卡因电化学传感器的背景信号以优化其检测性能的原理图和SWV图及工作曲线。
图4A-图4B，是本发明一个实施例中利用纳米探针的方法清除三磷酸腺苷电化学传感器的背景信号以优化其检测性能的原理图和SWV图及工作曲线。
图5A-图5B，是本发明一个实施例中利用纳米探针的方法清除Hg2+电化学传感器的信号残留以优化其检测性能的原理图和SWV图及工作曲线。
具体实施方式
表1：本发明中使用的核酸探针序列。
实施例l：利用电化学阻抗谱法证实分子探针在金电极表面的非特异性吸附，并研究电极表面DNA自组装单分子层的高度和密度与非特异性吸附强弱的关系。
制备不同高度的DNA自组装层时，分别将1μM探针1，2和3在100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)，10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0中室温下还原1h，然后将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mMMCH的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍；制备不同密度的自组装层时，分别将1μM探针1在100μM TCEP，10mM PB，0.2MNaCl，pH＝7.0；100μM TCEP，10mM PB，1M NaCl，pH＝7.0；和100μM TCEP，10mM PB，1.5M NaCl，pH＝7.0中室温下还原1h，将未经修饰干净的三根金电极分别浸泡其中抚育2h、过夜和过夜，超纯水冲洗三遍，然后在含1mM MCH的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍。得到组装好的电极先分别在10mM PB，5mMFe(CN)6 3-/Fe(CN)6 4-，1M NaCl，pH＝7.0中做阻抗扫描记录，再分别往电解液中加入探针4使其终浓度为4μM，待体系平衡5分钟后再做阻抗扫描并与前者对比分析结果(图2A-图2B)。
图2A所示组装具有15A、30A和、50A碱基的探针1、2和3的电极在加入15A的探针4后，其阻抗测量值分别增加13.8±0.2％，12.3±0.3％和7.9±0.4％。数据显示组装较短链长探针时电极阻抗值增加的更大，探针4在电极表面的非特异性吸附更强。这可能是由于DNA单分子层高度较小时分子探针进入其空隙接近电极的空间位阻更小。而实际应用时由于组装探针过长会导致自身产生二级构象、分子线性下降、自组装层密度下降以及成本较高等问题，更多的仍是使用较短链的探针组装。
图2B所示按低(1.4×1012条/cm2)、中(4.4×1012条/c2)、高密度(7.1×1012条/cm2)组装探针1的单分子层在加入探针4后，其阻抗测量值分别增加12.7±0.4％，11.3±0.9％和6.7±0.4％，数据显示自组装层密度为低等和中等时电极阻抗值增加的更大，这应该是随着组装密度的提高分子间距离有所减少而导致空间位阻的增加，而使非特异性吸附有所下降。但传感器组装密度过低一般会导致信号下降，而密度过高时又会使杂交效率下降和阻碍分子识别，因此常规传感器自组装层密度一般采用介于两者之间的中等密度，此时非特异性吸附较容易产生。
实施例2：将标记电化学氧化还原基团的分子信号探针固定到纳米金颗粒表面合成纳米探针。
将标记电化学氧化还原基团的分子信号探针，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，体积比2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温，反应20min。使用NAP-5column两次过柱纯化，纯化后的分子信号探针通过在260nm处紫外可见吸收值对还原后的分子信号探针定量。然后加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液，分子信号探针与纳米金的摩尔比例为100∶1，室温下静置老化16小时。老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入高盐浓度的溶液(10m M PB，1M NaCl，pH7.4)使体系中NaCl终浓度为0.2M，振荡16h后，9000rpm离心20min，再以10mM PB，pH＝7.4溶液洗涤离心三次，即制得纳米探针。加入一定量的10mM PB，pH＝7.4溶液，利用520nm处紫外可见吸收峰值对其定量(计算得到纳米探针的浓度为9.8nM)后，置于4℃下备用。
实施例3：利用纳米探针清除传感器电极表面非特异性吸附的方法，提高信号增加检测平台可卡因电化学传感器的灵敏度。
将1μM探针5在100μM TCEP，10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0中室温下还原1h，然后将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍，将组装信号探针6的纳米探针溶于缓冲溶液中(10mM PB，0.2M NaCl，pH7.0)，纳米金的终浓度为5nM。以上述组装了探针5的金电极作为工作电极组成三电极体系，往电解液加入一定浓度的可卡因，待体系平衡5分钟后，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描。并从低到高浓度测量可卡因，并建立工作曲线(图3A-图3B)。
结果表明，在采用纳米探针构建传感器后，传感器的背景信号(图3B中0nM可卡因)得到了很好的清除，其响应电流几乎与只在缓冲溶液中的大小一致，检测灵敏度为6nM(S/N＝3)，检测灵敏度相比使用分子信号探针的现有技术提高了2000倍(J.Am.Chem.Soc.2009，131，6944-6945)。
实施例4：利用纳米探针清除传感器电极表面非特异性吸附的方法提高信号增加检测平台三磷酸腺苷传感器的灵敏度。
将1μM探针7在100μM TCEP，10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0中室温下还原1h，然后将未经修饰的干净的金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装。组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍，将组装信号探针8的纳米探针溶于缓冲溶液中(10mM PB，0.2M NaCl，pH7.0)，纳米金的终浓度为5nM。以上述组装了探针7的金电极作为工作电极组成三电极体系，往电解液加入一定浓度的三磷酸腺苷，待体系平衡5分钟后，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描。并从低到高浓度测量三磷酸腺苷，并建立工作曲线(图4A-图4B)。
与可卡因检测得到了类似的结果，在采用纳米探针构建传感器后，传感器的背景信号(图4B中0nM三磷酸腺苷)得到了很好的清除，其响应电流几乎与只在缓冲溶液中的大小一致，与该传感器用分子探针组装时作者报导有明显的背景信号有了很大的提高。检测灵敏度为5nM(S/N＝3)，检测灵敏度相比使用分子信号探针的现有技术提高了1000倍(J.Am.Chem.Soc.2009，131，6944-6945)。
实施例5：利用纳米探针清除传感器电极表面非特异性吸附的方法，降低高信号减小类型Hg2+传感器的信号残余。
在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝74的溶液中制备不同浓度的Hg2+溶液，将组装全T捕获探针9的电极与组装信号探针l0的纳米探针在1/15M PB，0.3M NaCl，pH＝7.4中杂交3小时后制得的传感器浸泡到Hg2+溶液中，室温下反应30min。然后用1/15M PB，0.1M NaCl，pH＝7.4的溶液清洗3次，用多通道恒电位仪(VMP3)做SWV扫描并分析结果，重复以上步骤检测由低浓度到高浓度Hg2+溶液，建立工作曲线(图5A-图5B)。
结果表明，在采用纳米探针构建传感器后，传感器的信号残留较使用分子探针时有了很大的下降，具体的从信号残留30％下降到了10％(图5B)，由于使用分子探针时会产生非特异性吸附接近电极表面，即使再加大汞离子浓度也不能通过配位代替使其远离电极。而信号残留大幅下降是由于纳米探针尺寸加大，在构建传感器的杂交过程中难以通过自组装层的分子间空隙接近电极表面。说明我们这一方法在signal-off类型的电化学传感器也能很好的运用，大大扩展了其应用性。
Claims (9)
1.一种降低电化学传感器背景信号的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一：将化学修饰的捕获探针固定到金电极的表面；步骤二：将分子信号探针通过化学自组装固定到纳米金颗粒表面合成纳米探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获探针或所述分子信号探针为较短链的探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一如下：1μM的末端巯基修饰的捕获探针在含有100μM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的缓冲溶液中(10mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，1.0M NaCl，pH＝7.0)室温下还原1h，将干净的裸金电极浸泡到其中，室温下过夜自组装，组装后的电极用超纯水冲洗三遍，然后将电极放到含1mM巯基己醇(MCH)的水溶液中封闭30分钟，再用超纯水冲洗三遍，吹干后放置于缓冲溶液中(10mM PB，1.0M NaCl，pH＝7.0)备用。
4.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤二如下：将标记电化学氧化还原基团的分子信号探针，溶入到50mM二硫苏糖醇(DTT)，体积比2％三乙胺(TEA)的水溶液中，室温下反应20min。使用NAP-5column过柱纯化，然后通过在260nm处紫外可见吸收峰值对分子信号探针定量，加入到粒径为13nm的9nM纳米金溶液(分子信号探针与纳米金摩尔比例为100∶1)，在室温下静置老化16小时，老化后在分子杂交仪中振荡下分多次加入氯化钠缓冲溶液(10mM PB，1M NaCl，pH＝7.4)，使NaCl终浓度为0.3M，振荡16h后，9000rpm离心20min，用10mM PB(pH＝7.4)洗涤三次，置于4℃下备用。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获探针为探针5：HS-(CH2)6-AGACAAGGAAAA；所述分子信号探针为探针6：HS-(CH2)6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG-(CH2)6-MB。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获探针为探针7：HS-(CH2)6-A5ACCTGGGGGAGTAT；所述分子信号探针为探针8：HS-(CH2)6-A5TGCGGAGGAAGGT-(CH2)6-MB。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述捕获探针为探针9：T15-(CH2)6-SH；所述分子信号探针为探针10：Fc-(CH2)6-A20-(CH2)6-SH。
8.一种电化学传感器，其特征在于，将权利要求1所述的纳米探针溶于10mM PB，0.2M NaCl，pH7.0的缓冲溶液中为电解液，纳米金的终浓度为5nM，以权利要求1所述的固定捕获探针的金电极作为工作电极组成三电极体系。
9.一种电化学传感器，其特征在于，将包被了权利要求7中所述的探针10的纳米金用杂交液(1/15M PB，0.3M NaCl，pH7.4)稀释成2nM，与组装了权利要求7中所述探针9的金电极在25℃下抚育3h，再用杂交液冲洗三次，即制得传感器。
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