CN101230398A

CN101230398A - 一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法

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Publication number: CN101230398A
Application number: CNA2008100207961A
Authority: CN
Inventors: 潘志强; 陆祖宏; 肖鹏峰; 李燕强
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2008-02-27
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: CN100590204C

Abstract

一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在0.0005～100uM，丙烯酰胺质量浓度在1～30％，凝胶聚合催化剂质量浓度在0.001～2％，丙三醇的质量浓度为10～55％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。由本发明制得的DNA微阵列检测芯片具有高的检测准确性和灵敏性、极好的重复性、均一性和低凝胶背景等优点，可以广泛应用于科研和临床检测诊断之中。

Description

一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法

一、技术领域

本发明属于DNA微阵列芯片的制备技术，特别涉及一种无需激发剂的丙烯酰胺凝胶微阵列芯片的快速制备方法。

二、背景技术

现有技术：DNA芯片的制作方法主要有点样法和原位合成法。与原位合成法相比，点样法具有机动性强、制备快速的特点，因此能够用于大多数的科学研究和临床检测中。无论哪种方法制备出的核酸芯片，核酸固定的稳定性和探针杂交的高效率是影响目的信号检测准确度和灵敏性的两个主要因素。目前，已经有多种化学固定核酸的方法，例如通过不同的化学方法处理芯片后，可以将核酸固定在玻片，石英以及塑料等不同基片上。然而，这些方法对核酸的固定效率往往都很低，需要用人工合成的大量寡核苷酸或通过对大量纯化的PCR产物的固定，才能达到信号的检测要求。具有三维结构的凝胶芯片对核酸有很强的的固定能力，如聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶已经被用于三维凝胶芯片的制备。这两种方法都是事先在基片表面制备出凝胶膜，尔后通过一定的化学反应将具有氨基或醛基修饰的核酸与凝胶膜相交联，然而这两种方法在固定DNA过程中，仍需要用化学反应的方法来激发凝胶，因此核酸固定的过程显得不够稳定和方便；而且制备出的凝胶芯片有很强的背景信号。Rehman等发展了一种将5’端带有丙烯酰胺基团修饰的核酸直接参入到丙烯酰胺凝胶的聚合反应中，该方法进一步增大了对核酸的固定能力，(可以达到200fmol/mm²)，而且凝胶对核酸固定非常牢固。在该制备方法中，由于丙烯酰胺预聚混合物中同时含有催化剂和激发剂(两者同时存在会加速凝聚)，所以很难制备出均一的凝胶芯片。2004年Rubina在准备预聚物时不使用激发剂，先制备出均一的阵点，再采用紫外照射聚合的方法解制备出了均一的凝胶芯片。然而这种采用紫外光照的方法对于需要固定的核酸破坏作用极大，因此该法很少被应用。2005年XPF改进了Rehman制备方法，先制备出不含有激发剂的预聚物均一微阵列，而后将其置于盛有激发剂的器皿中进行真空抽虑。由于激发剂具有挥发作用，当起挥发到预聚物阵列表面时，通过对预聚物中催化剂的激发而是丙烯酰胺发生聚合反应，从而将核酸固定于凝胶中。该方法能够制备的凝胶芯片可以用来进行高通量核酸检测。但是该聚合方法主要聚合过程较缓慢，而且激发剂-四甲基乙二胺，容易造成凝胶芯片的高背景，并且是一种具有刺激性气味的毒性气体。所以，目前科研和医学诊断中急需一种省时省力、快速、简单方便和具有低背景的三维凝胶制备新技术。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一种基于凝胶固定核酸的DNA微阵列芯片的快速制备方法，尤其涉及一种无需激发剂(四甲基乙二胺)的三维凝胶的微阵列芯片的快速制备方法，由本发明制得的DNA微阵列检测芯片具有高的检测准确性和灵敏性、极好的重复性、均一性和低凝胶背景等优点，可以广泛应用于科研和临床检测诊断之中。该制备凝胶芯片的方法具有简单、易操作、芯片的制备时间短以及能防止芯片遭受外源污染等优点。

技术方案：本发明的技术解决方案为：一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在0.0005～100uM，丙烯酰胺质量浓度在1～30％，凝胶聚合催化剂质量浓度在0.001～2％，丙三醇的质量浓度为10～55％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。丙烯酰胺修饰的核酸是经过化学合成的有5’或3’末端修饰有丙烯酰胺的寡核苷酸，或是经过带有丙烯酰胺修饰的引物经聚合酶链式反应扩增或滚环扩增或其他任何形式的基因扩增所得的核酸产物。丙烯酰胺为丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体的混合物，丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体的混合质量比为5∶1～50∶1。固体基片为硬质基片或软质基片。凝胶聚合的催化剂为过硫酸铵或核黄素。对基片进行加热的加热温度为60～120℃，加热时间为1～3分钟。硬质基片：玻片、硅片、陶瓷或金属，或软质基片：塑料、尼龙膜。

有益效果：本发明提供了一种新颖的凝胶芯片的制备方法。本发明方法制备凝胶芯片具有以下优点：a.检测核酸的准确性与灵敏度高。由于芯片上的预聚物点在短时间内吸收了大量的热，预聚物中的水分会迅速蒸发，蒸发产生的推动力会使凝胶迅速收敛凝聚，所以凝胶内的固定的核酸浓度会增大，最终检测的信号强度也会相应提高，这样核酸检测的准确性与灵敏度高就会得到改善。b.极好的重复性与均一性(见图1.)。c.较低的背景。由于凝胶的过程是采用加热聚合的方法，而加热能够有效避免凝胶对荧光性杂质的黏附，加上无需使用激发剂四甲基乙二胺(会污染凝胶使其背景升高)，所以凝胶背景信号能得到极大的降低。d.该制备凝胶芯片的方法具有简单、易操作、芯片的制备时间短。预聚物的聚合仅需在1～3分钟的加热时间即可完成。

四、附图说明

图1为利用该方法制备出的12×5阵列的凝胶芯片。

五、具体实施方式

实施例1

一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在0.0005uM，丙烯酰胺质量浓度在1％，凝胶聚合催化剂质量浓度在0.001％，丙三醇的质量浓度为10％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。丙烯酰胺修饰的核酸是经过化学合成的有5’末端修饰有丙烯酰胺的寡核苷酸，丙烯酰胺为丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体，质量比为50∶1的混合物。固体基片为硬质基片或软质基片。凝胶聚合的催化剂为过硫酸铵或核黄素。对基片进行加热的加热温度为60℃，加热时间为1分钟。硬质基片可以为玻片、硅片、陶瓷片或金属片，也可以是软质基片塑料片、尼龙膜。

实施例2

一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在100uM，丙烯酰胺质量浓度在30％，凝胶聚合催化剂质量浓度在2％，丙三醇的质量浓度为55％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。丙烯酰胺修饰的核酸是经过化学合成的有3’末端修饰有丙烯酰胺的寡核苷酸，丙烯酰胺为丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体，质量比为29∶1的混合物。固体基片为硬质基片或软质基片。凝胶聚合的催化剂为过硫酸铵或核黄素。对基片进行加热的加热温度为120℃，加热时间为3分钟。硬质基片可以为玻片、硅片、陶瓷片或金属片，也可以是软质基片塑料片、尼龙膜。

实施例3

一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在50uM，丙烯酰胺质量浓度在20％，凝胶聚合催化剂质量浓度在1％，丙三醇的质量浓度为25％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。丙烯酰胺修饰的核酸是经过带有丙烯酰胺修饰的引物经聚合酶链式反应扩增或滚环扩增或其他任何形式的基因扩增所得的核酸产物。丙烯酰胺为丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体，质量比为5∶1的混合物。固体基片为硬质基片或软质基片。凝胶聚合的催化剂为过硫酸铵或核黄素。对基片进行加热的加热温度为90℃，加热时间为2分钟。硬质基片可以为玻片、硅片、陶瓷片或金属片，也可以是软质基片塑料片、尼龙膜。

实施例4.利用该方法制备出的凝胶芯片同时对500个人的同一SNP位点进行分型。

5’-GCTTTCTTGTTTGTTTTCCCTCCTTTACCAY(C/T)

CCAGAAATCCATTTGAGTCTGCTCCTTGT-3’

序列中的Y(C/T)，是一个与高血稠脂肪蛋白基因突变(Homo sapiensdystrobrevin binding protein 1，DTNBP1)有关的一个基因位点。通过一对引物(反向引物具有丙烯酰胺修饰)用PCR分别扩增出500个人的含有该位点一段基因序列，直接将5-10μl PCR产物或纯化过的产物与丙烯酰胺、过硫酸铵、丙三醇和水混合成预聚合物，并将其转移到384孔板中，通过芯片点样仪将500个样点在同一张玻片上点成微阵列。然后将该芯片置于80℃加热2分钟后取出，用NaOH将固定在凝胶上的双链DNA变性，从而制备出具有单链DNA的凝胶微阵列芯片。最后将该微阵列与一对荧光检测探针(5’-Cy5-TTTAC CACCCAGAA-3’和5’-Cy3-TTTACCATCCAGAA-3’)杂交，由于正配的探针与序列可以杂交而错配的不可以或杂交极少，最后通过对Cy5和Cy3荧光的双色扫描，并根据每个样本双色荧光强度的比值大小就可以对500人的SNP分型情况进行准确判断。

实施例5.利用该方法制备出的凝胶芯片用于高通量基因测序

将一个通用的PCR反向引物用丙烯酰胺修饰，而另一个正向的引物不修饰。将上述反向引物与与丙烯酰胺、过硫酸铵、丙三醇和水混合成预聚合物，点于芯片上。用与例1.中同样加热方法快速制备出含有扩增引物的凝胶微阵列芯片。将一个较大的基因组DNA用超声波打断，然后在每个片段的两端分别连接上同一通用连接子(与固定在凝胶中的反向引物互补)。用PCR扩增溶液(含有Taq酶，缓冲液、正向引物和dNTP)覆盖在凝胶微阵列上，使每一个凝胶微阵列阵点中平均分配一个DNA片段或没有，而后将凝胶阵点外多余溶液去除。再用石蜡油将微阵列阵点密封，进行在片PCR扩增35循环。接着用NaOH将扩增的双链DNA进行变性处理。这样每个凝胶微阵列的阵点就只包含有单克隆的DNA片段。最后将凝胶DNA微阵列用于SOLEX基因测序。

实施例6.利用该方法制备出的凝胶芯片对800个人P16内含子I区的CpG岛进行甲基化检测

直接把800个人的血样适当稀释后作为扩增模板，用一个正向引物和一个具有丙烯酰胺基团修饰的反向引物进行PCR扩增。扩增后将PCR产物用四倍的无水乙醇沉淀1小时，离心后去上清，将沉淀配成5％的丙烯酰胺预聚物，其中不含有TEMED，将这些样品预聚物移入384孔板，用芯片点样仪点样。对芯片直接进行80℃加热2分钟，然后用缓冲液冲洗一遍。再用NaOH进行变性处理，并用去离子水清洗一遍。再用亚硫酸钠处理芯片上固定的单链DNA，并用缓冲液冲洗一遍。最后同检测探针杂交后进行图像扫描，通过扫描图像就可以对800个样品的CpG岛的甲基化情况进行准确判断。

Claims

1.一种无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于制备步骤为：首先将丙烯酰胺基团修饰的核酸、丙烯酰胺、凝胶聚合催化剂、丙三醇和水混合成预聚合物，其中，预聚合物中：核酸的浓度在0.0005～100uM，丙烯酰胺质量浓度在1～30％，凝胶聚合催化剂质量浓度在0.001～2％，丙三醇的质量浓度为10～55％；将预聚合物点样于固体基片上，点样完成后直接对基片进行加热，加热完成后即得三维凝胶微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述丙烯酰胺修饰的核酸是经过化学合成的有5’或3’末端修饰有丙烯酰胺的寡核苷酸，或是经过带有丙烯酰胺修饰的引物经聚合酶链式反应扩增或滚环扩增或其他任何形式的基因扩增所得的核酸产物。

3.根据权利要求1所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述丙烯酰胺为丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体的混合物，丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺单体的混合质量比为5∶1～50∶1。

4.根据权利要求1所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述固体基片为硬质基片或软质基片。

5.根据权利要求1所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述凝胶聚合的催化剂为过硫酸铵或核黄素。

6.根据权利要求1所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述对基片进行加热的加热温度为60～120℃，加热时间为1～3分钟。

7.根据权利要求4所述的无需激发剂三维凝胶微阵列芯片的制备方法，其特征在于所述硬质基片：玻片、硅片、陶瓷或金属，或软质基片：塑料、尼龙膜。