CN114026250A - 核酸测序的改善 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种制备用于高通量核酸测序的模板的方法，该方法包括：a)提供固体载体以及文库制剂，其中所述固体载体包含多个核酸引物，其固定与所述核酸引物中的一个或多个核酸引物杂交的衔接子核酸序列，所述文库制剂具有400pM或更小的核酸浓度；c)允许模板核酸的单链片段与所述核酸引物结合，从而将所述单链片段固定在所述固体载体上；以及d)重复步骤b)和c)至少另外三次，即多次加载或多轮模板杂交以改善例如纳米孔在流动池上的占用率。

Description

核酸测序的改善
技术领域
本发明涉及高通量核酸测序的方法的改善，并且具体地讲涉及制备用于高通量核酸测序的模板的方法的改善。
背景技术
核酸测序方法已在本领域中已知多年。一些此类方法基于掺入荧光标记的核酸类似物的连续循环。在此类“合成测序”或“循环测序”方法中，在每次核苷酸添加之后，通过检测荧光标记来测定添加的碱基的同一性。
具体地讲，US 5,302,509描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法，其涉及使用DNA聚合酶或DNA连接酶进行多个延伸反应以连续地掺入与模板链互补的标记的多核苷酸。在此类“合成测序”反应中，通过连续掺入与模板链互补的单独核苷酸在5’至3’方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中所用的底物核苷三磷酸利用不同3’标记在3’位处进行标记，从而允许在添加连续核苷酸时测定掺入的核苷酸的同一性。
为了使核酸测序反应的通量最大化，有利的是能够并行对多个模板分子进行测序。可通过使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。
本领域已描述了用于制造固定核苷酸测定的阵列的各种方法。特别感兴趣的是，WO 98/44151和WO 00/18957两者描述了核酸扩增的方法，其允许将扩增产物固定在固体载体上以便形成阵列，所述阵列由簇或“集落”组成，所述簇或“集落”由多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定的互补链形成。在根据这些方法制备的聚类阵列上的DNA集落中存在的核酸分子可提供用于测序反应的模板，例如如WO 98/44152中所述。
在当前的高通量下一代测序(NGS)方法中，测序化学通常在流动池内进行，在所述流动池中引入核酸和其他试剂。为了制备模板链，将源核酸片段化，并将片段连接至衔接子序列。这些衔接子序列被设计成与固定到流动池内的固体载体上的短引物序列杂交，然后将测序模板扩增，从而产生相同模板链的簇，然后对其进行测序。理想地，这些簇具有相似的大小并且与其他簇间隔开，以在成像时实现准确的分辨率。然后在流动池上进行进一步的测序反应，其中将结果成像并将序列读数进行比对，以得到模板的最终序列。
为了维持不同簇的物理分离，流动池可包括(例如)通过光刻形成的图案化纳米孔；仅纳米孔包括固定的引物序列，并且因此每个簇将在纳米孔内形成。纳米孔图案化确定了合适的簇间距和位置。为了维持每个簇的独特性，期望单个模板链最初在给定纳米孔内杂交；因此，模板DNA通常以低摩尔量(大约10-20pM)引入流动池。此外，可使用排除扩增技术进行扩增，所述排除扩增技术允许同时在纳米孔中接种模板链和扩增，从而促进单克隆簇。
随着NGS方法继续改善，进行了尝试以增加流动池内的纳米孔的密度和数量，从而允许甚至更大的测序通量。然而，本发明人已经发现，当使用较高密度图案化流动池时，低摩尔浓度的模板DNA可能使用效率低下；例如，导致占用的纳米孔的较低比例。低模板接种浓度可能导致升高的复制水平和较低的可用收率。此外，许多常用的文库制备方法可能不适用于修饰来获得增加的模板核酸浓度。为了减轻低样品浓度，本发明人提出了改善的方法，其利用流动池作为核酸捕获装置以增加低浓度测序模板的有效可用浓度。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种制备用于核酸测序反应的模板的方法，所述方法包括：
a)提供固体载体，其中所述固体载体包含固定在其上的多个核酸引物；
b)使核酸文库制剂与所述固体载体接触，所述文库制剂包含待测序的模板核酸的多个单链片段，所述模板核酸片段还包含与所述核酸引物中的一个或多个核酸引物杂交的一个或多个衔接子核酸序列，并且所述文库制剂具有400pM或更小的核酸浓度；
c)允许模板核酸的单链片段与所述核酸引物结合，从而将所述单链片段固定在所述固体载体上；以及
d)重复步骤b)和c)至少另外三次；
从而提供具有固定在其上的模板核酸的单链片段的固体载体。
根据本发明的另外的方面，提供了一种制备用于核酸测序反应的模板的方法，所述方法包括：
a)提供流动池，所述流动池包含具有形成于其上的多个纳米孔的固体载体，每个纳米孔包含固定在所述固体载体上的多个核酸引物，并且所述纳米孔以具有500nm或更小的间距的图案化阵列形式形成；
b)使核酸文库制剂与所述流动池接触，所述文库制剂包含待测序的模板核酸的多个单链片段，所述模板核酸片段还包含与所述核酸引物中的一个或多个核酸引物杂交的一个或多个衔接子核酸序列，并且所述文库制剂具有400pM或更小的核酸浓度；
c)允许模板核酸的单链片段与所述核酸引物结合，从而将所述单链片段固定在所述纳米孔中；以及
d)重复步骤b)和c)至少另外三次；
从而提供具有固定在纳米孔中的模板核酸的单链片段的流动池。
本发明人已经确定，此类方法通过允许文库的多次加载“推动”来解决使用低浓度核酸文库的缺点。每个此类推动均改善纳米孔的占有率。低DNA浓度下的多轮模板杂交和捕获增加了有效的DNA浓度，从而使它们进入必要的范围内。这可显著降低文库制备浓度要求，并且由于系统死体积等而减少模板浪费。
该方法可包括重复步骤b)和c)至少四次、五次、六次、七次、八次、九次或更多次。据信有效核酸浓度由重复数乘以原始核酸浓度来给出。例如，200pM样品的四次重复给出有效浓度为800pM。在本发明的优选实施方案中，有效核酸浓度为至少800pM，优选地至少1000pM。
文库制剂可以具有350pM或更小、300pM或更小、250pM或更小或200pM或更小的核酸浓度。文库制剂可以具有至少50pM、至少100pM或至少150pM的核酸浓度。
接触步骤的重复可利用相同的文库制剂或不同文库制剂来进行。例如，该方法可以包括从流动池洗涤未结合的模板核酸片段，并且回收并将未结合的片段重新引入到流动池。然而，在优选的实施方案中，重复的接触步骤利用从相同初始文库制剂中抽取的新鲜样品。
该方法可包括使包含待测序的模板核酸的双链片段的文库制剂变性，以获得待测序的模板核酸的单链片段。变性步骤可以在流动池上进行；例如，可将双链片段文库引入流动池中，然后变性，以产生接触流动池的单链片段文库。在优选的实施方案中，可在接触流动池之前进行变性。
该方法还可包括使核酸的固定的单链片段扩增，从而产生该片段的多个拷贝。在优选的实施方案中，扩增使用排除扩增进行；例如，如WO2013/188582中所述。
在本发明的优选实施方案中，固体载体是玻璃，并且其上包括图案化的纳米孔阵列。纳米孔阵列可以通过光刻法形成。纳米孔阵列的间距(即，纳米孔之间的中心到中心距离)优选地小于750nm，更优选地小于500nm，更优选地小于400nm，并且最优选地350nm或更小。流动池可包括在固体载体上形成的多个通道，其中每个通道包括图案化纳米孔阵列的一部分。例如，流动池可具有由Illumina,Inc(San Diego，USA)生产的类型，其与NovaSeq6000系统一起使用。在EP 2 961 524中阐述了制备其上具有图案化纳米孔阵列的特定类型的固体载体和包含此类固体载体的流动池的说明性方法。
该方法还可包括对核酸的固定的单链片段进行测序。
具体实施方式
在其各个方面，本发明整体涉及高通量核酸测序的方法的改善，并且具体地讲涉及制备用于高通量核酸测序的模板的方法的改善。
当提及分子(例如，核酸)对固体载体的附接时，术语“固定的”和“附接的”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这两个术语旨在涵盖直接或间接、共价或非共价附接。在本发明的某些实施方案中，共价附接可以是优选的，但一般来讲全部所需的是分子(例如，核酸)在旨在使用载体的条件下(例如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或附接到载体。当提及核酸对其他核酸的附接时，则本文使用术语“固定的”和“杂交的”，并且一般来讲是指互补核酸之间的氢键合。
如本文所用，当参考项目的集合使用时，术语“每个”旨在识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。
如本文所用，术语“固体载体”是指不溶于水性液体的刚性基底。该基底可以为无孔的或多孔的。该基底可任选地能够吸收液体(例如，由于孔隙率)，但是通常将足够刚性，使得基底在吸收液体时不显著膨胀，并且在通过干燥去除液体时基本上不收缩。无孔固体载体一般来讲对液体或气体不可渗透。示例性固体载体包括但不限于玻璃和改性或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟隆TM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。特别有用的材料为玻璃。其他合适的基底材料可包括聚合物材料、塑料、硅、石英(熔融石英)、硼浮法玻璃、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光纤或光纤束、蓝宝石或塑性材料，诸如COC和环氧化物。可基于特定用途所期望的特性来选择特定材料。例如，对期望波长的辐射是透明的材料可用于将利用期望波长的辐射的分析技术，诸如本文所阐述的技术中的一种或多种。相反，可能期望选择不通过特定波长的辐射的材料(例如，不透明的、吸收性的或反射性的)。这可用于形成待在结构化基底的制造期间使用的掩模；或用于使用结构化基底进行的化学反应或分析检测。可利用的材料的其他特性是对下游过程中使用的某些试剂的惰性或反应性；或在制造加工期间易于操作或低成本。可用于本公开的结构化基底或方法中的材料的另外的示例描述于美国序列号13/661,524和美国专利申请公布2012/0316086A1中，这些文献中的每一篇均以引用方式并入本文。
本发明的某些实施方案利用由基底或基质(例如，载玻片、聚合物小珠等)构成的固体载体，该基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料层或涂层“被官能化”，这些反应性基团允许共价附接到生物分子诸如多核苷酸。此类载体的示例包括但不限于基底，诸如玻璃。在此类实施方案中，生物分子(例如，多核苷酸)可直接共价附接到中间材料，但该中间材料本身可非共价附接到基底或基质(例如，玻璃基底)。术语“共价附接到固体载体”应相应地被解释为涵盖这种类型的布置。另选地，可处理基底(诸如玻璃)以允许生物分子的直接共价附接；例如，玻璃可用盐酸处理，从而暴露玻璃的羟基基团，并且亚磷酸三酯化学物质被用于经由玻璃的羟基基团与核苷酸的磷酸基团之间的共价键将核苷酸直接附接到玻璃。
在本发明的各方面，可通过存在于多核苷酸链的5’端处的含硫亲核物质(诸如硫代磷酸酯)来实现附接。
如本文所用，术语“纳米孔”是指固体载体中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有完全被表面的一个或多个空隙区域包围的表面开口。孔可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的孔的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。在本发明的优选的实施方案中，纳米孔整列包括设置在固体载体上的多个纳米孔；图案化的纳米孔阵列包括纳米孔的重复布置，使得纳米孔在固体载体的一部分处的相对布置与纳米孔在固体载体的至少一个其他部分处的相对布置相同。纳米孔阵列的间距是两个相邻纳米孔之间的中心到中心距离。
如技术人员将理解的，双链核酸通常将由两个互补的多核苷酸链形成，所述两个互补多核苷酸链由通过磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸构成，但可另外包含一个或多个核糖核苷酸和/或非核苷酸化学部分和/或非天然存在的核苷酸和/或非天然存在的主链键。具体地讲，双链核酸可包括非核苷酸化学部分，例如在一条或两条链的5’端处的接头或间隔子。作为非限制性示例，双链核酸可包括甲基化核苷酸、尿嘧啶碱基、硫代磷酸酯基团，也可包括肽偶联物等。可包括此类非DNA或非天然修饰以便赋予核酸一些期望的特性，例如以实现对固体载体的共价附接，或充当间隔子以将裂解位点定位成与固体载体的最佳距离。单链核酸由一个此类多核苷酸链组成。在多核苷酸链仅与互补链部分杂交的情况下，例如，与短核苷酸引物杂交的长多核苷酸链，其在本文中仍可被称为单链核酸。
待测序的模板核酸将包括期望完全或部分测序的“靶”区域。靶区域的性质不限于本发明。其可具有先前已知的或未知的序列，并且可例如来源于基因组DNA片段、cDNA等。模板核酸分子还包括例如在一条或两条链(如果双链的话)的5’和3’端处的非靶序列，其侧接靶区域。如果模板核酸通过固相核酸扩增形成，则这些非靶序列可来源于用于扩增反应的引物。另选地，可将非靶序列连接以使靶序列片段化从而将其掺入核酸分子中。
在本发明的实施方案中，可使双链核酸经受变性条件以便提供单链核酸。适合的变性条件对于技术人员而言将是显而易见的，参考标准分子生物学方案(Sambrook等人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Current Protocols，Ausubel等人编辑)。
变性(并且后续对裂解链的重新退火)导致产生部分或基本上单链的测序模板。然后可通过将测序引物与模板的单链部分杂交来引发测序反应。在本发明的实施方案中，可使用链置换聚合酶进行测序。
在本发明的实施方案中，如本文所用的，术语“固体载体”是指多核苷酸分子所附接的材料。合适的固体载体可商购获得，并且对于技术人员而言将是显而易见的。载体可由材料(诸如玻璃、陶瓷、二氧化硅和硅)制造。也可使用具有金表面的载体。载体通常包括平坦的(平面的)表面，或至少一个结构，其中待询问的多核苷酸处于大致相同的平面中。可使用任何合适大小的载体。另选地，固体载体可以为非平面的，例如微珠。
在本发明的实施方案中，本发明的方法可用于制备用于核酸测序的模板。可扩增固定的单链核酸以提供通过固相核酸扩增产生的核酸集落的聚类阵列。在此上下文中，术语“固相扩增”是指与标准PCR类似的扩增反应，不同的是将正向和/或反向扩增引物固定(例如共价附接)到5’端处或附近的固体载体。因此，PCR反应的产物是通过扩增引物的延伸得到的延伸链，所述扩增引物在5’端处或附近固定到固体载体上。固相扩增本身可例如使用类似于WO 98/44151和WO 00/18957中所述那些的程序进行。
作为通过固相扩增生成集落的第一步，正向和反向扩增引物的混合物可被固定或“接枝”到合适的固体载体的表面上。接枝步骤一般来讲将涉及引物在5’端处或附近共价附接到载体，从而使3’端保持游离以用于引物延伸。
扩增引物通常是具有以下结构的寡核苷酸分子：
正向引物：A-L-S1
反向引物：A-L-S2
其中A表示允许附接到固体载体的任选部分，L表示任选的接头部分，并且S1和S2是多核苷酸序列，其允许扩增包含靶区域的底物核酸分子，所述靶区域需要(完全或部分地)进行测序。
接枝到固体载体上的引物的混合物一般来讲将包含基本上相等量的正向和反向引物。
基团A可以为任何部分(包括非核苷酸化学修饰)，其能够附接(优选共价附接)到固体载体。在本发明的各方面，基团A可包含存在于多核苷酸链的5’端处的含硫亲核试剂，诸如硫代磷酸酯。另选地，在使用合适的化学物质将接头或核酸直接附接到固体载体的情况下，可以省略基团A。
L表示可被包含但不是严格必需的接头或间隔子。可包括接头以便确保作为扩增反应结果产生的固定多核苷酸分子中存在的裂解位点定位在距固体载体的最佳距离处，或者接头本身可含有裂解位点。
接头可以为具有式(CH2)n的含碳链，其中“n”为1至约1500，例如小于约1000，优选地小于100，例如2-50，具体地讲5-25。然而，可使用多种其他接头，对于其结构唯一限制在于在后续旨在使用多核苷酸的条件下，例如在用于DNA扩增和测序的条件下，该接头是稳定的。
也可使用不仅由碳原子组成的接头。此类接头可包括聚乙二醇(PEG)
可修饰主要由碳原子链和PEG形成的接头以便含有中断该链的官能团。此类基团的示例包括酮、酯、胺、酰胺、醚、硫醚、亚砜、砜。可单独地或与此类官能团的存在组合地采用烯烃、炔烃、芳香族或杂芳香族部分或环状脂肪族部分(例如环己基)。环己基或苯基环可以例如通过其1-位和4-位连接到PEG或(CH2)n链。
作为上述接头的另选方案，其主要基于任选地被不饱和碳原子或杂原子中断的饱和碳原子的直链，可设想基于核酸或单糖单元(例如右旋糖)的其他接头。其也在本发明的范围内以利用肽作为接头。
在另外的实施方案中，接头可包含一个或多个核苷酸。此类核苷酸在本文中也可被称为“间隔子”核苷酸。通常，可包括1至20，更优选地1至15或1至10，并且更具体地讲2、3、4、5、6、7、8、9或10个间隔子核苷酸。最优选地，引物将包括10个间隔子核苷酸。优选使用多T间隔子，但可使用其他核苷酸以及它们的组合。在一个优选的实施方案中，引物可包含10T间隔子核苷酸。
为进行引物接枝反应，在允许部分A(如果存在的话)和载体之间，或者核酸与载体之间反应的条件下将扩增引物的混合物施加到固体载体。可合适地官能化固体载体以允许经由部分A共价附接。接枝反应的结果是引物在固体载体的至少一部分上的基本上均匀分布。在固体载体包括纳米孔的情况下，则在优选的实施方案中，引物受纳米孔的位置限制，并且不存在于固体载体的空隙区域中。
核酸文库制剂通常在自由溶液中与流动池接触。然后，扩增反应可基本上如WO98/44151中所述进行。简而言之，在附接引物之后，在允许模板与固定引物之间杂交的条件下使固体载体与待扩增模板接触。通常在合适的杂交条件下在自由溶液中添加模板，这对于技术人员将是显而易见的。通常，杂交条件是例如在40℃下5xSSC。然后可进行固相扩增，扩增的第一步是引物延伸步骤，其中核苷酸被添加到与模板杂交的固定引物的3’端以产生完全延伸的互补链。因此，这种互补链将在其3’端处包含能够与固定在固体载体上的第二引物分子结合的序列。另一轮扩增(类似于标准PCR反应)导致形成与固体载体结合的模板分子的簇或集落。可使用其他扩增程序，并且将是技术人员已知的。例如，扩增可使用链置换聚合酶进行等温扩增；或可以为排除扩增，如WO 2013/188582中所述的。
扩增引物中的序列S1和S2可对期望扩增的特定靶核酸具有特异性，但是在其他实施方案中，序列S1和S2可以为“通用”引物序列，其能够扩增具有已知或未知序列的任何靶核酸，所述靶核酸已被修饰成能够用通用引物进行扩增。
可通过向待扩增的靶多核苷酸的5’和3’端添加已知衔接子序列，修饰包含待扩增(和测序)的靶区域的多核苷酸来制备待用通用引物扩增的合适的核酸。靶分子本身可以是期望进行测序的任何多核苷酸分子(例如人基因组DNA的随机片段)。衔接子序列能够在固体载体上扩增这些分子以使用具有上述通用结构的正向和反向引物形成簇，其中序列S1和S2是通用引物序列。
衔接子通常是可以通过常规方式合成的短寡核苷酸。衔接子可通过多种方式(例如亚克隆、连接等)附接到靶核酸片段的5’和3’端。更具体地讲，将两个不同的衔接子序列附接到待扩增的靶核酸分子，使得一个衔接子附接在靶核酸分子的一端处，并且另一个衔接子附接在靶核酸分子的另一端处。包含由衔接子侧接的靶核酸序列的所得构建体在本文中可被称为“底物核酸构建体”。在用衔接子序列修饰之前，可有利地将靶多核苷酸按大小分级。
衔接子含有允许使用固定在固体载体上的扩增引物分子进行核酸扩增的序列。衔接子中的这些序列在本文中可被称为“引物结合序列”。为了充当核酸扩增的模板，模板构建体的单链必须含有与正向扩增引物中的序列S1互补的序列(使得正向引物分子可结合并引发互补链的合成)和对应于反向扩增引物分子中的序列S2的序列(使得反向引物分子可与互补链结合)。允许与引物分子杂交的衔接子中的序列的长度通常为约20-40个核苷酸，但本发明不限于该长度的序列。
扩增引物中的序列S1和S2的精确同一性，并且因此衔接子中的同源序列对于本发明而言一般不重要，只要引物分子能够与扩增序列相互作用以便引导PCR扩增即可。PCR引物的设计标准一般来讲是本领域普通技术人员所熟知的。
通过类似于WO 98/44151或WO 00/18957的方法进行固相扩增将导致产生由“桥接”扩增产物的集落构成的聚类阵列。扩增产物的两条链将在5’端处或附近固定到固体载体上，这种附接来源于扩增引物的初始附接。通常，每个集落内的扩增产物将来源于单个模板(靶)分子的扩增。
实现后续切割桥接扩增产物所需的修饰可有利地包含在一个或两个扩增引物中。此类修饰可置于扩增引物中的任何位置处，前提条件是这不在实质性程度上影响扩增反应的效率。因此，能够裂解的修饰可形成接头区域L的一部分或序列S1或S2中的一者或两者。以举例的方式，扩增引物可被修饰成尤其包括二醇键、尿嘧啶核苷酸、核糖核苷酸、甲基化核苷酸、肽接头、PCR限位子或限制性核酸内切酶的识别序列。因为通过固相扩增制备的所有核酸分子将最终含有来源于扩增引物的序列，所以引物中的任何修饰都将被携带到扩增产物中。
可使用另选的扩增方法(例如，等温扩增；或排除扩增，如WO2013/188582中所述)。
本发明还可包括测序步骤；或本发明的各方面还可涵盖对使用本发明的方法生成的核酸模板进行测序的方法。因此，本发明提供了一种核酸测序的方法，该方法包括使用本文所述的方法提供用于核酸测序的模板，以及进行核酸测序反应以确定在该模板的至少一个区域上的序列。
可使用任何合适的“合成测序”技术进行测序，其中核苷酸连续添加到游离3’羟基基团上，从而导致在5’至3’方向上合成多核苷酸链。优选地在每次添加之后确定添加的核苷酸的性质。
可通过将测序引物退火到模板的单链区域来提供测序反应的起始点。因此，本发明涵盖方法，其中核酸测序反应包括使测序引物与本发明上述方面中提供的固定在纳米孔中的模板核酸的单链片段杂交，将一个或多个核苷酸依次掺入到与待测序的模板区域互补的多核苷酸链中，从而鉴定存在于一个或多个所掺入的核苷酸中的碱基，并且由此确定该模板的区域的序列。
可在本发明中使用的优选的测序方法依赖于使用含有可充当链终止子的3’封端基团的经修饰的核苷酸。一旦已将经修饰的核苷酸掺入与待测序的模板区域互补的生长的多核苷酸链中，就没有游离的3’-OH基团可用于引导进一步的序列延伸，所以聚合酶不能添加另外的核苷酸。一旦已确定掺入生长链中的碱基的性质，就可去除3’嵌段以允许添加下一个连续核苷酸。通过对使用这些经修饰核苷酸衍生的产物进行排序，就可推断出DNA模板的DNA序列。如果经修饰核苷酸中的每一者均已附接了已知对应于特定碱基的不同标记，以有利于区分在每个掺入步骤时添加的碱基，则可在单个实验中完成此类反应。另选地，可单独进行含有经修饰核苷酸中每一者的单独反应。
经修饰核苷酸可携带标记以有利于其检测。优选地，这是荧光标记。每个核苷酸类型可携带不同的荧光标记。然而，可检测标记不需要是荧光标记。可使用允许检测掺入的核苷酸的任何标记。
一种用于检测荧光标记的核苷酸的方法包括使用具有对标记核苷酸具有特异性的波长的激光，或使用其他合适的照明源。来自核苷酸上的标记的荧光可通过CCD相机或其他合适的检测装置来检测。
本发明的方法不限于使用上文概述的测序方法，而是可与基本上任何依赖于将核苷酸连续掺入到多核苷酸链中的测序方法结合使用。合适的技术包括例如焦磷酸测序<TM>、FISSEQ(荧光原位测序)、MPSS(大规模平行特征测序)和通过基于连接的方法测序。
使用本发明方法测序的靶多核苷酸可以为期望测序的任何多核苷酸。靶多核苷酸可具有已知的、未知或部分已知的序列，例如在重新测序应用中。使用本文详细描述的模板制备方法，可从已知、未知或部分已知序列的基本上任何双链靶多核苷酸开始制备模板。在使用阵列的情况下，可对相同或不同序列的多个靶进行并行测序。该方法的特别优选的应用是对基因组DNA的片段进行测序。
现在将参考附图描述本发明的这些和其他方面，其中：
图1示出了可与本文所述的某些方法一起使用的说明性流动池的示意图。
图2示出了多杂交工作流程的概念。
图3示出了对于各种指标，使用1至10次推动(杂交循环)获得的结果。
图4将文库接种效率与两种不同的多杂交工作流程进行比较。
图5给出使用200pM文库浓度的来自4次推动工作流程的结果。
参见图1，这示出了可与本文所述的某些方法一起使用的说明性流动池的示意图。流动池以三层形式形成。底层1由硼硅玻璃形成，深度为1000μm。将经蚀刻硅通道层(深度为100μm)置于顶部上以限定8个单独的反应通道。顶层3(深度为300μm)包括与经蚀刻硅通道层的通道对准的两个单独的8孔系列4和4’，以便在使用中组装流动池时提供与通道内容物的流体连通。底层1的硼硅玻璃蚀刻有纳米孔，该纳米孔设置在具有350nm间距的图案化阵列中，并且与反应通道一致地布置。介于通道之间的空隙区域未被蚀刻，并且不包括纳米孔。在使用中，核酸片段模板捕获的引物与纳米孔结合。
为了用制备的测序用文库加载流动池，可使用以下方案。可以以本领域已知的任何合适的方式制备用于待使用的测序技术的双链DNA的初始文库，其包含适当的衔接子。例如，文库制备试剂盒可购自Illumina,Inc(San Diego，USA)以制备合适的文库。使用TruSeqHuman Nano 450制备试剂盒制备本文所述的示例。
以下工作流程模拟了4次推动多杂交方案。杂交事件的总数可根据必要的使用情况和期望的最终有效浓度而上下变化。
文库变性和稀释：
1.利用H2O或RSB缓冲液(可用于TruSeq Human Nano 450制备试剂盒中)，将20ul双链DNA文库稀释至适当浓度。为了利用多杂交工作流程，该工作浓度比标准单一事件杂交方案所必需的浓度低4倍。
2.将文库与LDR变性试剂(100％甲酰胺)1:1混合。
3.加热至65℃并温育8分钟以使双链DNA模板变性。
4.添加160ul HT1(5X SSC+0.1％Tween20)以将变性文库稀释至最终预期的工作浓度。
5.进行到模板杂交
使用Illumina NovaSeq6000系统，利用多杂交工作流程进行模板杂交：
1.用BB6缓冲液灌注/润湿药筒管线和流动池。
2.将流动池加热至40℃。
3.将经变性和稀释的模板泵送到流动池，其中初始冲洗因子足够大以完全覆盖流动池，但不由上游BB6缓冲液进行稀释。
4.温育5分钟。
5.在温育之后，将附加流动池体积的经变性和稀释的模板拉到流动池并温育5分钟。
6.重复步骤5另外两次，获得总共4次总杂交事件。
7.进行到簇生成。
图2示出了多杂交工作流程的概念。典型的单一推送工作流程示于顶部线中，其中模板杂交进行一次，之后进行簇生成。如果模板以800pM浓度加载，则有效浓度保持800pM。第二线和第三线阐述了实现相同浓度的另选的方式；使用400pM的两个杂交循环(第二线)或200pM的四个杂交循环(第三线)。可以看出，在低DNA浓度下的多轮模板杂交/捕获增加了有效的DNA浓度，从而使它们进入必要的范围内。这继而显著降低了文库制备浓度要求并且减少了由于系统死体积、流体管线等引起的模板浪费，并且将潜在地能够运行低收率文库制备的重排。
使用上述方法，制备初始2nM文库并且稀释至200pM浓度。
Figure BDA0003428388920000131
不同应用的典型文库收率如下所示：
Figure BDA0003428388920000132
图3示出了对于各种指标，使用1至10次推动(杂交循环)获得的结果，其中每个工作流程被设计成提供800pM有效浓度。测量的指标包括簇形成％、占据纳米孔％、剩余的复制％、以及可用收率％。可以看出，无论推动次数如何，指标仍在小条带内，并且至多10次的多次推动提供与较高浓度的单一推动相似的指标。对于可用收率和簇形成最佳的是位于4-6次推动范围内。所用的流动池具有350nm纳米孔间距。
图4将文库接种效率与两种不同的多杂交工作流程(2次推动对4次推动)进行比较。将初始已知量的文库在一轮或多轮中与流动池杂交，然后将被杂交的模板洗脱并定量qPCR。初始输入和未捕获的模板级分可用杂交级分定量。该图示出，2次推动和4次推动提供了相似的每纳米孔ssDNA分子数，其随着总DNA暴露增加直至700pM而增加。只要保持最终的DNA暴露，就可改变总推动数以得到相似的结果。相对于4次推动方案，2次推动方案利用2xDNA浓度，但保持每纳米孔相似的最终分子。
图5给出来自4次推动工作流程的结果，其使用200pM文库浓度(800pM有效浓度)，使用由TruSeq Human Nano 450试剂盒制备的文库，在350nm间距的流动池上进行。当总DNA浓度增加至800pM时，可以看出，占据的纳米孔％增加，并且复制％减小。可以看出，随着浓度增加至800pM，通过过滤器％保持一致，从而示出在多次推动中保持较低浓度导致最佳的接种。
因此多次杂交工作流程似乎是在不过度增加复制的簇的情况下有效加载高密度纳米孔流动池的有效方案，并且展示出可使用测序流动池作为DNA捕获装置，以便增加待测序样品的有效浓度，具体地讲当样品制备具有相对低的浓度收率时。优选的四倍杂交方案将文库输入浓度要求降低了四倍，并且潜在地使得能够运行低收率文库制备的重排。

Claims (13)

1.一种制备用于核酸测序反应的模板的方法，所述方法包括：
a)提供固体载体，其中所述固体载体包含固定在其上的多个核酸引物；
b)使核酸文库制剂与所述固体载体接触，所述文库制剂包含待测序的模板核酸的多个单链片段，所述模板核酸片段还包含与所述核酸引物中的一个或多个核酸引物杂交的一个或多个衔接子核酸序列，并且所述文库制剂具有400pM或更小的核酸浓度；
c)允许模板核酸的单链片段与所述核酸引物结合，从而将所述单链片段固定在所述固体载体上；以及
d)重复步骤b)和c)至少另外三次；
从而提供具有固定在其上的模板核酸的单链片段的固体载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是制备用于核酸测序反应的模板的方法，所述方法包括：
a)提供流动池，所述流动池包含具有形成于其上的多个纳米孔的固体载体，每个纳米孔包含固定在所述固体载体上的多个核酸引物，并且所述纳米孔以具有500nm或更小的间距的图案化阵列形式形成；
b)使核酸文库制剂与所述流动池接触，所述文库制剂包含待测序的模板核酸的多个单链片段，所述模板核酸片段还包含与所述核酸引物中的一个或多个核酸引物杂交的一个或多个衔接子核酸序列，并且所述文库制剂具有400pM或更小的核酸浓度；
c)允许模板核酸的单链片段与所述核酸引物结合，从而将所述单链片段固定在所述纳米孔中；以及
d)重复步骤b)和c)至少另外三次；
从而提供具有固定在纳米孔中的模板核酸的单链片段的流动池。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中计算为步骤(c)的循环数乘以文库核酸浓度的有效核酸浓度为至少800pM。
4.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述文库制剂具有250pM或更小的核酸浓度。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述接触步骤的重复利用如步骤(b)中所用的相同文库制剂进行。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，包括使包含待测序的模板核酸的双链片段的文库制剂变性，以获得在步骤(b)中使用的待测序的模板核酸的单链片段。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括使所述核酸的固定的单链片段扩增，从而产生所述片段的多个拷贝。
8.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述固体载体是玻璃。
9.根据权利要求1、或当从属于权利要求1时根据权利要求3至8所述的方法，其中所述固体载体位于流动池上，其中所述固体载体具有形成于其上的多个纳米孔，每个纳米孔包含固定在所述固体载体上的多个核酸引物，并且所述纳米孔以图案化阵列的形式形成。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米孔阵列的所述间距为500nm或更小。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中所述纳米孔阵列的所述间距为350nm或更小。
12.根据权利要求1、或当从属于权利要求1时根据权利要求3至8所述的方法，其中所述固体载体为微珠。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，还包括对核酸的所述固定的单链片段进行测序。
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