KR20220062231A - 인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20220062231A
KR20220062231A KR1020217042257A KR20217042257A KR20220062231A KR 20220062231 A KR20220062231 A KR 20220062231A KR 1020217042257 A KR1020217042257 A KR 1020217042257A KR 20217042257 A KR20217042257 A KR 20217042257A KR 20220062231 A KR20220062231 A KR 20220062231A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
index
beads
barcode
nucleic acid
capture probe
Prior art date
Application number
KR1020217042257A
Other languages
English (en)
Inventor
대런 시갈리
피오나 이. 블랙
제프리 데니스 브로딘
로렌조 베르티
시우 홍 릉
제프리 에스. 피셔
앨런 에크하르트
루이 장
인 나 테오
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일루미나, 인코포레이티드 filed Critical 일루미나, 인코포레이티드
Publication of KR20220062231A publication Critical patent/KR20220062231A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/501—Ligase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/101—Primer extension
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/107—Probe or oligonucleotide ligation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/122—Massive parallel sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/143—Magnetism, e.g. magnetic label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/179—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties the label being a nucleic acid

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 명세서에 제공된 일부 구현예는 어레이 상의 표적 리간드의 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 샘플로부터의 표적 리간드에 특이적으로 결합하고, 어레이에서 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치가 결정되고, 그리고 비드는 포획 프로브 및 샘플을 식별하기 위해 디코딩된다. 일부 구현예에서, 바코드는 비드에 부착된 포획 프로브를 나타내고; 인덱스는 비드의 하위 집단을 나타낸다. 일부 구현예는 비드 어레이 상의 여러 상이한 핵산 샘플로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 것에 관한 것이다.

Description

인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS ON AN ARRAY"라는 명칭으로 2019년 10월 1일자로 출원된 미국 가출원 62/909,014; 및 "METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGH-THROUGHPUT GENOTYPING ON ARRAYS USING INDEXES AND BARCODES"라는 명칭으로 2019년 9월 20일자로 출원된 미국 가출원 62/903,108에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원들은 각각 전체가 참조에 의해 원용된다.
발명의 분야
본 명세서에 제공된 일부 구현예는 어레이 상의 표적 리간드의 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 샘플로부터의 표적 리간드에 특이적으로 결합하고, 어레이에서 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치가 결정되고, 그리고 비드는 포획 프로브 및 샘플을 식별하기 위해 디코딩된다. 일부 구현예에서, 바코드는 비드에 부착된 포획 프로브를 나타내고; 인덱스는 비드의 하위 집단을 나타낸다. 일부 구현예는 비드 어레이 상의 여러 상이한 핵산 샘플로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 것에 관한 것이다.
생물학적 샘플에 존재하는 특정 핵산 서열의 검출은 예를 들어 미생물의 동정 및 분류, 감염성 질환의 진단, 유전적 비정상의 검출 및 특성화, 암과 관련된 유전적 변화의 동정, 질환에 대한 유전적 감수성 연구, 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응의 측정의 방법으로 사용되어 왔다. 생물학적 샘플에서 특정 핵산 서열을 검출하는 일반적인 기술은 핵산 서열분석이다.
핵산 서열분석 방법론은 Maxam 및 Gilbert에 의해 사용된 화학적 분해 방법 및 Sanger에 의해 사용된 가닥 연신 방법에서 크게 발전하였다. 현재 단일 칩에서 수천 개의 핵산을 병렬 처리할 수 있는 몇 가지 서열분석 방법론이 사용되고 있다. 일부 플랫폼은, 서열분석, 유전자형분석, 유전자 발현 프로파일링을 포함한 응용 분야에서 이러한 포맷의 적용에 따라 실리카 비드는 프로브로 기능화되는 비드 기반 및 마이크로어레이 형식을 포함한다.
현재의 비드 기반 어레이 상에서 상이한 샘플을 유전자형분석하는 방법은 비드 칩의 상이한 영역을 다중 섹터로 물리적으로 세분화하기 위한 개스킷을 필요로 한다. 그런 다음 개별 샘플이 개스킷에 의해 생성된 개별 섹션에 로딩된다. 그러나, 이러한 방법은 비교적 낮은 샘플 수 입력으로 사용될 수 있지만, 비드 칩 당 샘플의 밀도가 비드 칩당 24개에서 96개, 384개, 1536개, 또는 그 초과의 샘플로 증가함에 따라 고되거나 감당하기 어렵다.
일부 구현예는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계; (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계; (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계 (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계; 및 (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계.
일부 구현예에서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고; 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 또는 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플을 복수의 트랜스포솜으로 태그부착함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 복수의 트랜스포솜은 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플에 어댑터를 추가하는 단계를 추가로 포함하고, 어댑터는 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플을 제1 및 제2 인덱스를 포함하는 프라이머로 증폭하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 제1 및 제2 인덱스 및 제1 및 제2 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 확장된 포획 프로브에 통합한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 집단은 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고, 비드의 제2 집단은 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 인덱스는 제1 표적 핵산의 공급원을 나타내고, 제2 인덱스는 제2 표적 핵산의 공급원을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 인덱스는 서로 동일하고, 제2 인덱스는 서로 동일하다.
일부 구현예는 또한 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 것은 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 결합 프라이머 부위는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 상이한 핵산 샘플로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 게놈 DNA로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드는 제1 또는 제2 포획 프로브의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 바코드는 서로 상이하고, 제2 바코드는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드를 서열분석하는 단계는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 중합효소 확장을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 단일 뉴클레오타이드를 포획 프로브에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 확장된 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 포획 프로브에 결찰하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 용액 내에서 수행된다.
일부 구현예에서, 어레이는 플로우셀의 표면 상에 위치된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 자성이다.
일부 구현예는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산, 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고, 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 제2 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계; (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계; (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계 (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계; (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계; 및 (g) 제1 및 제2 인덱스를 서열분석함으로써 제1 및 제2 표적 핵산의 핵산 서열 데이터에 대한 공급원을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고; 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 또는 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플을 복수의 트랜스포솜으로 태그부착함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 복수의 트랜스포솜은 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플에 어댑터를 추가하는 단계를 추가로 포함하고, 어댑터는 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플을 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는 프라이머로 증폭하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 제1 및 제2 인덱스 및 제1 및 제2 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 확장된 포획 프로브에 통합한다.
일부 구현예는 또한 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제1 인덱스 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제2 인덱스 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계; (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계; (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계 (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계; 및 (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계.
일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 인덱스는 제1 표적 핵산의 공급원을 나타내고, 제2 인덱스는 제2 표적 핵산의 공급원을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 인덱스는 서로 동일하고, 제2 인덱스는 서로 동일하다.
일부 구현예는 또한 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 것은 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 결합 프라이머 부위는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 상이한 핵산 샘플로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 게놈 DNA로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드는 제1 또는 제2 포획 프로브의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 바코드는 서로 상이하고, 제2 바코드는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드를 서열분석하는 단계는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 중합효소 확장을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드를 포획 프로브에 추가하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 확장된 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 포획 프로브에 결찰하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (c)는 용액 내에서 수행된다.
일부 구현예에서, 플로우셀은 어레이를 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이는 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 자성이다.
일부 구현예는 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 비드의 집단을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 인덱스, 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위, 포획 프로브, 바코드, 및 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하고, 인덱스는 비드에 집단 사이에 상이한, 키트를 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일하다. 일부 구현예에서, 바코드는 포획 프로브의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 바코드는 비드의 집단에서 상이하다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일하다. 일부 구현예는 또한 하기로부터 선택된 시약을 포함한다: 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드; 핵산 샘플을 태그부착하기 위한 트랜스포솜; 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 트랜스포솜; 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 어댑터; 인덱스 프라이머 결합 부위 또는 그것의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머; 및 바코드 프라이머 결합 부위 또는 그것의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머. 일부 구현예는 또한 플로우셀을 포함한다.
일부 구현예는 비드의 인덱싱된 집단을 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 어댑터, 포획 프로브, 및 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 인덱스, 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계; 및 (c) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 비드의 집단에 부착하여 비드의 인덱싱된 집단을 수득하는 단계.
일부 구현예에서, (c)는 중합효소 확장에 의해 어댑터를 확장하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 결합 부위를 포함하고, 부착은 어댑터 결합 부위를 어댑터에 혼성화하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, (c)는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터에 결찰시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 부착은 스플린트 폴리뉴클레오타이드를 어댑터 및 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, (c)는 화학적 반응성 모이어티를 통해 비드의 집단의 어댑터에 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 부착은 클릭 화학 반응을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 집단의 제1 폴리뉴클레오타이드는 서로 상이한 포획 프로브를 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다.
일부 구현예는 또한 비드의 인덱싱된 집단을 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예는 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단을 비드의 추가 인덱싱된 집단과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고, 비드의 추가 인덱싱된 집단은 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단의 인덱스와 상이한 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 유동 셀 상에서 수행된다.
일부 구현예는 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하며, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 바코드 프라이머 결합 부위에 결합할 수 있는 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계; (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계; (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 단계; (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및 (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계.
일부 구현예에서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분배하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화하고; 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화하고; 그리고 바코드 프라이머를 확장하여 바코드의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터와 인덱스 사이에 위치한 절단 가능한 링커를 추가로 포함하고, (f)는 (i) 절단 가능한 링커를 절단하는 단계; 및 (ii) 바코드의 서열을 결정하기 위해 어댑터를 확장하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 유동 셀 상에서 수행된다.
일부 구현예는 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계; (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계; (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제2 폴리뉴클레오타이드에 부착하는 단계; (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및 (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, (d)는 반응성 모이어티를 제2 폴리뉴클레오타이드에 첨가하는 것을 포함하고, 어댑터는 반응성 모이어티에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 반응성 모이어티를 추가하는 것은 클릭 화학 반응을 포함한다.
일부 구현예에서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분배하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, (f)는 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 및 바코드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 유동 셀 상에서 수행된다.
일부 구현예는 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 표적 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 포획 프로브, 바코드 및 바코드 프라이머 결합 부위 를 코딩하는 핵산으로, 바코드는 포획 프로브를 나타내는 핵산, 및 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 인코딩하는 핵산으로, 인덱스는 제1 집단 또는 제2 집단으로부터 비드의 공급원을 나타내는 단계; (b) 비드의 제1 집단을 제1 표적 리간드를 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제1 표적 리간드는 제1 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여 비드의 표적 결합된 제1 집단을 수득하는 단계; (c) 비드의 제2 집단을 제2 표적 리간드를 포함하는 제2 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제2 표적 리간드는 제2 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여 비드의 표적 결합된 제2 집단을 수득하는 단계; (d) 어레이 상에 비드의 표적 결합된 제1 집단 및 비드의 표적 결합된 제2 집단을 무작위로 분배하는 단계; (e) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 단계; 및 (f) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 인덱스 및 바코드의 서열을 결정하는 단계.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 것은 중합효소 확장 또는 결찰에 의해 포획 프로브를 확장하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (f) 후에 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함하고, 제2 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일하고, 제2 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일하다.
일부 구현예에서, 어레이는 플로우셀의 표면 상에 위치된다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 어레이에 부착되도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 그의 유도체를 포함하고; 그리고 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 자성이다.
도 1은 5' 링커를 통해 비드에 부착된 바코드, 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 2는 5' 링커를 통해 비드에 부착된 포획 프로브, 바코드, 및 프라이머 결합 부위를 포함하고 포획 프로브와 바코드 사이의 절단 가능한 링커를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 3은 3' 링커를 통해 비드에 부착된 바코드, 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 4는 5' 링커를 통해 비드에 부착된 스페이서, 바코드, 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 5a는 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 부착된 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 5b는 비드에 부착된 포획 프로브에 혼성화된 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 함유하는 표적 핵산의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 5c는 검출 가능한 마커로 확장된 포획 프로브의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 5d는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 바코드 프라이머 및 바코드 프라이머의 확장의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 5e는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 인덱스 프라이머 및 인덱스 프라이머의 확장의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 6a는 하기의 예시적인 구현예를 도시한다: 포획 프로브를 포함하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드 (왼쪽 패널); 핵산 포획 프로브, 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 비드의 하위집단을 비드의 상이한 하위집단과 구별하기 위한 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드 (중간 패널); 및 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 포획 프로브, 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 비드의 하위집단을 비드의 상이한 하위집단과 구별하기 위한 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드 (우측 패널).
도 6b는 하기의 예시적인 구현예를 도시한다: 표적 핵산에 혼성화된 제1 및 제2 포획 프로브를 포함하는 비드로서, 제1 포획 프로브는 절단 가능한 링커를 포함하는 비드 (왼쪽 패널); 및 기질에 일시적으로 결합하여 검출 가능한 표지를 포함하는 신호를 생성하는 단백질 포획 프로브를 포함하는 비드(우측 패널).
도 6c는, 표적 핵산은 비드 상의 제1 및 제2 포획 프로브에 혼성화되고, 제1 포획 프로브는 제2 포획 프로브에 결찰되고, 절단 가능한 링커는 절단되어 검출 가능한 표지를 포함하는 확장된 제1 포획 프로브를 포함하는 비드를 생성하는 이중 프로브 검정의 예시적인 구현예를 도시한다.
도 7a는 유동 셀에 고정화된 비드 풀의 사진이다.
도 7b는 특정 빈(bin)에서 특정 비드 유형에 대한 카피의 수의 막대 그래프이다.
도 7c는 평균 C 강도 대 평균 T 강도의 그래프이다. 평균 C 강도는 한 쌍의 뉴클레오타이드에서 표지된 시토신으로부터의 형광 강도이고 평균 T 강도는 한 쌍의 뉴클레오타이드에서 표지된 티미딘으로부터의 형광 강도이다.
도 8은 대표적인 샘플에 대한 특정 빈(bin) 내의 특정 비드 유형의 수에 대한 히스토그램이다.
도 9는, 표적 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 인덱스를 포함하는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하기 위한 작업흐름의 구현예를 도시한다.
도 10은 비드가 인덱스를 포함하는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하기 위한 작업흐름의 구현예를 도시한다.
도 11은 비드의 인덱싱된 집단을 제조하기 위한 작업흐름의 구현예, 및 각각의 웰이 상이한 샘플을 함유하는 멀티웰 플레이트에서 인덱싱된 비드의 사용을 도시한다.
도 12a는 비드에 부착된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 개략도이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 스페이서 및 링커 X-Y를 통해 비드에 부착된다.
도 12a는 비드에 부착된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 개략도이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스; 및 인덱스 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 B를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드 및 어댑터에 혼성화된 스플린트를 통해 비드에 부착된다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 어댑터에 결찰될 수 있다.
도 12c는 비드에 부착된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 개략도이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스; 인덱스 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 B; 및 어댑터 결합 부위를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착된 어댑터에 대한 혼성화를 통해 비드에 부착된다. 어댑터는 인덱스의 보체; 프라이머 B를 통합하도록 확장될 수 있다.
도 13a는 비드에 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 개략도이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브를 포함한다. 인덱스; 프라이머 2, 예컨대 인덱스 프라이머 결합 부위; 선택적 절단 가능한 부위, 예컨대 우리딘 절단 부위를 포함하는 스페이서; 및 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 어댑터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제시된다.
도 13b는 인덱스 폴리뉴클레오타이드가 비드에 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 어레이 상의 표적 핵산을 검출하기 위한 작업흐름의 구현예를 도시한다.
도 14는 비드에 부착된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드의 개략도이다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위의 반복부를 포함한다.
도 15a는 인덱스 폴리뉴클레오타이드가 반응성 기를 통해 비드에 부착된 어레이 상의 표적 핵산을 검출하기 위한 작업흐름의 구현예를 도시한다.
도 15b는 어레이 상의 표적 핵산을 검출하기 위한 작업흐름의 구현예를 도시하고, 도 15a의 작업흐름의 연속이다.
본 명세서에 제공된 일부 구현예는 어레이 상의 표적 리간드의 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 핵산, 단백질, 또는 다른 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 샘플로부터의 표적 리간드에 특이적으로 결합하고, 어레이에서 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치가 결정되고, 그리고 비드는 포획 프로브 및 샘플을 식별하기 위해 디코딩된다. 일부 구현예에서, 바코드는 비드에 부착된 포획 프로브를 나타내고; 인덱스는 비드의 하위 집단을 나타낸다. 일부 구현예에서, 바코드 및 인덱스는 서열분석에 의해 결정된다. 일부 구현예는 또한 비드에 부착된 제1 및 제2 포획 프로브가 표적 핵산의 존재 하에 함께 결찰되고, 결찰 생성물의 말단이 비드로부터 절단되는 이중 프로브 검정을 포함하고, 상기 비드는 어레이 상에서 검출되고 디코딩되는 확장 포획 프로브를 포함한다.
본 명세서에 제공된 일부 구현예는 어레이에 대한 고처리량 유전자형분석에 관한 것이다. 일부 구현예는 어레이에서 마이크로피처의 위치를 디코딩하는 것과 관련된다. 일부 구현예에서, 마이크로피처는 바코드 및 인덱스를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예는 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 식별하기 위해 바코드 및 인덱스를 서열분석하는 것을 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 유용할 수 있는 특정 양태는 그 전체가 참고로 포함되는 WO 2020/086746에 개시되어 있다.
혼성화에 의한 디코딩은 포획 프로브의 랜덤 분포 어레이에서 포획 프로브의 위치를 확인하는 것을 포함한다. 이 방법은 일반적으로 표지된 혼성화 프로브를 포획 프로브의 적어도 하나의 부분에 혼성화하고 혼성화 이벤트를 이미징하고 혼성화 프로브를 제거하는 여러 연속 주기를 포함한다. 혼성화에 의한 디코딩에는 특화 시약, 특화 유체 장치 및 특화 검출기가 필요한다. 일부 구현예에서, 혼성화에 의한 디코딩은 7-8 연속 주기로 최대 8시간이 걸릴 수 있다.
본 명세서에 제공된 구현예는 프라이머 결합 부위 및 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 랜덤 분포 어레이를 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드는 고처리량 서열분석 시스템을 사용하여 어레이를 디코딩하도록 용이하게 서열분석될 수 있다. 일부 구현예는 추가 시약, 혼성화 프로브 또는 특화 디코딩 장비 없이 어레이를 디코딩하는 데 걸리는 시간을 상당히 줄일 수 있다.
일부 구현예는 차세대 서열분석(NGS) 기술 및 비드 기반 마이크로어레이의 사용을 포함한다. 이러한 일부 구현예는 기질 및 시약에 대한 약간의 변형으로 일반 NGS 서열분석 플랫폼에서 실행할 수 있는 고성능, 저비용 및 고처리량 유전자형분석을 제공한다.
일부 다중화 방법에서, 상이한 공급원로부터의 다중 핵산 샘플은 각각의 샘플을 물리적으로 분리된 상태로 유지함으로써 병렬로 처리될 수 있다. 본 명세서에 제공된 일부 구현예는 연관된 비드의 인덱스를 통해 각 샘플을 인덱싱함으로써 모든 단계에서 개별 샘플을 분리하는 물리적 장벽의 필요성을 제거하는 핵산 인덱싱 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 탈다중화는 서열분석에 의해 수행되고 합성에 의한 표준 서열분석(SBS) 화학을 사용하여 사용자 부위에서 실행될 수 있다. 또한 표준 플랫폼 및 SBS 화학을 사용하여 고객 부위에서 구현할 수 있는 서열분석에 의한 디코드(DBS) 접근 방식을 채택하여 비드 어레이의 내부 디코딩으로 인한 비용, 공간 및 시간 제한을 줄인다.
일부 구현예는 도 5a에 도시된 비드를 포함하는 인덱싱된 농축 비드 풀을 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 비드는 유전자좌-특이적 포획 프로브, 어레이 상의 연관된 프로브의 위치 식별을 위한 바코드, 및 바코드의 SBS 판독을 위한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드; 및 샘플 다중화를 위한 인덱스, 및 인덱스의 SBS 판독을 위한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드 풀 복잡성은 포획 프로브의 수, 또는 플렉시티(N) 및 지원되는 샘플의 수(S)에 의해 정의된다. 따라서 플렉시티 N 및 S 샘플을 지원하는 비드 풀은 S x N 고유 비드 유형으로 구성된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 및/또는 인덱스 프라이머는 2개의 올리고뉴클레오타이드 중 하나에 대한 SBS 동안 간섭을 피하기 위해 추가의 3' 직교 차단제를 포함한다.
일부 구현예는 S 웰을 함유하는 다중웰 플레이트에 S 비드 풀이 로딩되고, 각각의 비드 풀은 고유한 샘플 인덱스를 갖고, 각각의 웰은 N 고유 비드 유형을 함유하는 유전자형분석 검정을 수행하는 것을 포함한다. 샘플로부터 핵산 라이브러리를 생성한 후, 랜덤 프라이머 증폭, 그 다음 효소 단편화 및 세척을 포함하는 단계로 핵산 샘플을 처리한 후, 각각의 샘플 라이브러리를 인덱싱된 웰에 첨가하고 포획 프로브에 혼성화되도록 한다. 혼성화가 완료된 후, 관심 SNP를 프로빙하기 위한 단일 염기 확장 분석은 형광 뉴클레오타이드 및 적절한 중합효소를 포함하는 혼입 믹스를 추가하여 실행된다. 혼입이 끝나면 플레이트의 모든 비드 포획 샘플이 풀링되어 유동 셀에 로딩된다. 유동 셀은 평범하거나 패턴이 있을 수 있으며 원하는 밀도에서 비드의 고정을 지원하도록 표면을 적절하게 수정한다. 일부 구현예에서, 비드 고정시, SNP 부위에서의 형광 혼입으로부터 유래하는 신호를 판독하기 위한 단일 스캔 주기를 포함하는 SNP 판독이 수행된다. 이 주기에는 기기의 SBS 주기가 포함될 수 있다. 비드풀 플렉시티에 따라 12-20 SBS 주기를 포함하는 바코드 판독도 수행되어 유동 셀 내에서 특정 비드의 위치와 포획 프로브를 식별한다. 일부 구현예에서, 이 단계는 확인된 SNP를 지나는 추가의 서열분석 주기로 대체될 수 있다. 샘플 인덱스를 판독 위한 6-12 SBS 주기를 포함하는 샘플 인덱스 판독도 수행된다. 일부 구현예에서, 전체 온-플로우셀(on-flowcell) 검정은 약 30개 미만의 SBS 주기를 포함할 수 있고 4시간 미만으로 실행될 수 있다.
일부 구현예는 어레이 상의 표적 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 구현예는 비드 어레이 상의 여러 상이한 핵산 샘플로부터 표적 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 것에 관한 것이다. 일부 이러한 구현예에서, 인덱스 서열은 핵산 샘플로부터의 표적 핵산과 회합된다.
본 발명의 한 구체예에서, 개스킷은 유전자 어레이의 다양한 영역을 세분화하는데 사용되지 않는다. 대신, 비드에 혼성화된 샘플을 구별하고 높은 플렉시티 샘플 풀링을 지원하기 위해 인덱스 서열이 샘플에 추가된다. 일부 구현예에서 인덱스는 비드 풀 또는 샘플에 추가될 수 있다.
구현예는 많은 상이한 핵산 샘플로부터 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 제조하고, 각각의 핵산 샘플의 표적 핵산에서 단일 뉴클레오타이드 다형성, 삽입, 결실과 같은 특정 특징의 존재를 결정하는 것에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 표적 핵산의 특정 특징의 존재에 대해 어레이에서 병렬로 조사된다.
일부 구현예에서, 각각의 핵산 샘플은 핵산 샘플로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리가 동일한 인덱스를 포함하도록 상이한 인덱스 서열과 연관된다. 표적 핵산은 표적 핵산을 비드에 부착된 포획 프로브에 선택적으로 혼성화하고, 포획 프로브를 확장하고, 그리고 어레이 상에서 포획 프로브의 확장을 검출함으로써 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리에서 확인된다. 각각의 포획 프로브는 바코드를 포함할 수 있으며, 따라서 포획 프로브는 어레이 상의 포획 프로브와 관련된 바코드를 서열분석함으로써 식별될 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드는 포획 프로브 및 바코드를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드와 관련된 인덱스는 어레이 상에서 서열분석될 수 있다. 포획 프로브의 확장을 위한 어레이 상의 신호 위치, 바코드의 서열, 인덱스의 서열은 특정 핵산 샘플로부터 표적 핵산에서 단일 염기 다형성, 삽입, 결실과 같은 특정 특징의 존재를 식별할 수 있다. 일부 구현예에서, 많은 상이한 핵산 샘플이 단일 어레이에서 시험될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "어레이"는 상이한 마이크로피처가 상대적 위치에 따라 서로 구별될 수 있도록 표면과 연관되거나 부착되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 마이크로피처과 같은 상이한 마이크로피처의 집단을 지칭할 수 있다. 어레이의 개별 피처는 마이크로피처의 단일 카피를 포함할 수 있거나 마이크로피처의 다중 카피는 어레이의 개별 피처에서 마이크로피처의 집단으로 존재할 수 있다. 각각의 피처에서 마이크로피쳐의 집단은 전형적으로 균질한데, 단일 종의 마이크로피처를 갖는다. 따라서, 단일 핵산 서열의 다중 카피는 예를 들어 동일한 서열을 갖는 다중 핵산 분자 상의 특징에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 마이크로피처의 이종 집단이 피처에 존재할 수 있다. 따라서, 특징은 단일 마이크로피처 종만을 포함할 필요는 없지만 대신 상이한 서열을 갖는 핵산의 혼합물과 같은 복수의 상이한 마이크로피처 종을 포함할 수 있다. 어레이의 인접 피처는 겹치지 않는다는 점에서 서로 별개일 수 있다. 따라서 피처는 서로 인접하거나 간격으로 분리될 수 있다. 피처가 이격되어 있는 구현예에서, 인접 부위는 예를 들어 100㎛, 50㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 100㎚, 50㎚, 10㎚, 5㎚, 1㎚, 0.5㎚, 100 pm, 50 pm, 1 pm 미만 또는 전술한 거리 중 임의의 2가지 범위 내의 임의의 거리로 분리될 수 있다. 어레이의 피처 레이아웃은 인접 피처 간의 중심 간 거리의 관점에서도 이해할 수 있다. 본 발명에 유용한 어레이는 약 100㎛, 50㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 100㎚, 50㎚, 10㎚, 5㎚, 1㎚, 0.5㎚, 100 pm, 50 pm, 1 pm 미만의 중심 간 간격 또는 전술한 거리 중 임의의 2가지 범위 내의 임의의 거리를 갖는 인접 피처를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 거리 값은 어레이의 인접 피처 사이의 평균 거리를 나타낼 수 있다. 이와 같이, 구체적으로 반대로 지시되지 않는 한, 예를 들어 거리가 어레이의 모든 인접 피처 사이의 임계 거리를 구성한다는 구체적인 언급에 의해, 모든 이웃하는 특징들이 명시된 범위에 속할 필요는 없다. 구현예는 임의의 다양한 밀도에서 특징을 갖는 어레이와 함께 사용될 수 있다. 특정 구현예에 대한 밀도의 예시적인 범위는 약 10,000,000 피처/cm2 내지 약 2,000,000,000 피처/cm2; 약 100,000,000 피처/cm2 내지 약 1,000,000,000 피처/cm2; 약 100,000 피처/cm2 내지 약 10,000,000 피처/cm2; 약 1,000,000 피처/cm2 내지 약 5,000,000 피처/cm2; 약 10,000 피처/cm2 내지 약 100,000 피처/cm2;약 20,000 피처/cm2 내지 약 50,000 피처/cm2; 약 1,000 피처/cm2 내지 약 5,000 피처/cm2, 또는 전술한 밀도 중 임의의 2가지 범위 내의 임의의 밀도를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "표면"은 시약, 비드 또는 피분석물과 접촉할 수 있는 기질 또는 지지 구조물의 일부를 나타낼 수 있다. 표면은 실질적으로 평평하거나 평면일 수 있다. 또는 표면이 둥글거나 윤곽이 잡힐 수 있다. 표면에 포함될 수 있는 윤곽의 예는 웰, 함몰, 기둥, 능선, 채널 등이다. 기질 또는 지지 구조로 사용될 수 있는 예시적인 물질은 유리 예컨대 변형된 또는 기능화된 유리; 플라스틱 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌의 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 테플론; 다당류 또는 가교결합된 다당류 예컨대 아가로스 또는 세파로스; 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 실리콘 및 변형된 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카계 물질; 탄소-섬유; 금속; 무기 유리; 광학 섬유 다발, 또는 다양한 다른 중합체을 포함한다. 단일 물질 또는 여러 다른 물질의 혼합물은 본 발명에 유용한 표면을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 표면은 웰을 포함한다. 일부 구현예에서 지지 구조물은 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 예시적인 지지 구조물은 칩, 필름, 다중 웰 플레이트 및 유동 셀을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "비드"는 강성 또는 반강성 물질로 제조된 작은 본체를 지칭할 수 있다. 본체는 예를 들어 구형, 타원형, 마이크로구형체, 또는 규칙적 또는 불규칙적 치수를 갖는 다른 인식된 입자 형상을 특징으로 하는 형상을 가질 수 있다. 비드에 유용한 예시적인 물질은 유리 예컨대 변형된 또는 기능화된 유리; 플라스틱 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌과 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 테플론; 다당류 또는 가교결합된 다당류 예컨대 아가로스 또는 세파로스; 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 실리콘 및 변형된 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카계 물질; 탄소-섬유; 금속; 무기 유리; 또는 다양한 다른 중합체를 포함한다. 예시적인 비드는 제어된 기공 유리 비드, 상자성 비드, 토리아 졸, 세파로스 비드, 나노결정 및 당업계에 공지된 기타를 포함한다. 비드는 생물학적 또는 비생물학적 물질로 만들 수 있다. 자성 비드는 본 명세서에 기재된 방법의 다양한 단계에서 자석을 사용하여 자성 비드를 쉽게 조작할 수 있기 때문에 특히 유용한다. 특정 구현예에서 사용되는 비드는 약 0.1㎛ 내지 약 100㎛, 약 0.1㎚ 내지 약 500㎚의 직경, 폭 또는 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 구현예에서 사용되는 비드는 약 100㎛, 50㎛, 10㎛, 5㎛, 1㎛, 0.5㎛, 100㎚, 50㎚, 10㎚, 5㎚, 1㎚, 0.5㎚, 100 pm, 50 pm, 1 pm 미만의 직경, 폭 또는 길이 또는 전술한 직경, 너비 또는 길이 중 임의의 2개의 범위 내의 임의의 직경, 폭 또는 길이를 가질 수 있다. 비드 크기는 크기를 줄이기 위해 선택될 수 있으므로 피처를 분석하기 위해 충분한 신호(피처당 템플릿 카피)를 유지하면서 단위 면적당 더 많은 피처를 얻을 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 기질 표면 상의 웰 내로 분포될 수 있다. 특정 구현예에서 사용될 수 있는 예시적인 비드 어레이는 무작위로 정렬된 BEADARRAY 기술(Illumina Inc., San Diego CA)을 포함한다. 이러한 비드 어레이는 문헌[Michael et al., Anal Chem 70, 1242-8 (1998); Walt, Science 287, 451-2 (2000); Fan et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68:69-78 (2003); Gunderson et al., Nat Genet 37:549-54 (2005); Bibikova et al. Am J Pathol 165:1799-807 (2004); Fan et al., Genome Res 14:878-85 (2004); Kuhn et al., Genome Res 14:2347-56 (2004); Yeakley et al., Nat Biotechnol 20:353-8 (2002); 및 Bibikova et al., Genome Res 16:383-93 (2006)]에 개시되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나의 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 지칭할 수 있다. 따라서 이 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 또한 이중 및 단일 가닥 분자를 모두 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 예는 유전자 또는 유전자 단편, 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 비-코딩 RNA (ncRNA) 예컨대 PIWI 상호작용 RNA (piRNA), 작은 간섭하는 RNA (siRNA), 및 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 작은 헤어핀 (shRNA), 작은 핵 RNA (snRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 작은 핵소체 RNA (snoRNA) 및 바이러스 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 서열, 핵산 프로브, 프라이머 또는 증폭된 카피의 단리된 RNA를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 비-천연 염기를 갖는 뉴클레오타이드, 아자- 또는 데아자-퓨린과 같은 변형된 천연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 4개의 뉴클레오타이드 염기의 특정 서열로 구성될 수 있다: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 및 티민(T). 우라실(U)은 또한 예를 들어 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우 티민의 천연 대체물로 존재할 수 있다. 우라실은 DNA에도 사용될 수 있다. 따라서 '서열'이라는 용어는 천연 및 비천연 염기를 포함하여 폴리뉴클레오타이드 또는 모든 핵산 분자의 알파벳순 표시를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "표적 핵산" 또는 그의 문법적 등가물은 서열분석, 분석 및/또는 추가 조작이 필요한 핵산 분자 또는 서열을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 어레이에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 어레이에 부착될 수 있고 어레이는 프로브와 상호작용하는 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위해 후속적으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서 용어 "표적" 및 "프로브"는 핵산 검출 방법과 관련하여 상호교환가능하게 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 "포획 프로브"는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 상보성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다. 포획 프로브는 다른 핵산 및/또는 혼합물의 성분으로부터 표적 핵산을 분리하기 위한 친화성 결합 분자로서 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 개재 분자를 통해 포획 프로브에 의해 특이적으로 결합될 수 있다. 개재 분자의 예는 링커, 어댑터 및 표적 서열 및 포획 프로브 둘 다에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 상보성을 갖는 다른 가교 핵산을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "혼성화", "혼성화하는" 또는 그의 문법적 등가물은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여, 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 적어도 부분적으로 복합체를 형성하는 반응을 지칭할 수 있다. 수소 결합은 왓슨-클릭 (Watson-Crick) 염기 쌍, 휴스테인(Hoogstein) 결합 또는 기타 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 이중 가닥 복합체를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 가닥은 또한 가교결합되거나 수소 결합 이외에 힘에 의해 결합될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "확장하는(extending)", "확장(extension)" 또는 이들의 임의의 문법적 등가물은 중합효소와 같은 확장 효소에 의해 프라이머, 폴리뉴클레오타이드 또는 기타 핵산 분자에 dNTP를 부가하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 일부 방법에서, 생성된 확장 프라이머는 RNA의 서열 정보를 포함한다. 일부 구현예는 DNA 중합효소 또는 역전사효소와 같은 중합효소를 사용하여 확장을 수행하는 것으로 논의되지만, 확장은 당업계에 잘 알려진 임의의 다른 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 확장은 관심 가닥에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드와 같은 랜덤 올리고뉴클레오타이드의 짧은 조각을 함께 결찰시켜 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "결찰" 또는 "결찰하는" 또는 그의 다른 문법적 등가물은 포스포디에스테르 결합에 의한 2개의 뉴클레오타이드 가닥의 연결을 지칭할 수 있다. 이러한 반응은 리가아제에 의해 촉진될 수 있다. 리가아제는 ATP 또는 유사한 트리인산염의 가수분해와 함께 이 반응을 촉매하는 효소 부류를 지칭한다.
서열분석에 의한 디코딩
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물의 일부 구현예는 고처리량 서열분석을 사용하여 어레이의 마이크로피처의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이의 마이크로피처는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 기질의 표면 상에 무작위로 분포될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 결합 부위 및 바코드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브, 프라이머 결합 부위, 및 바코드를 포함할 수 있다.
어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 디코딩하기 위한 일부 구현예는 (a) 기질의 표면 상에 분포된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 갖는 기질을 수득하는 단계로서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 바코드 및 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계; (b) 복수의 프라이머를 프라이머 결합 부위에 혼성화하는 단계; 및 (c) 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 바코드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 각각의 바코드의 서열은 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 어레이 상의 바코드의 위치를 확인하는 것이 연관된 포획 프로브의 위치를 나타낼 수 있도록 바코드가 특정 포획 프로브와 연관된 것으로 공지된 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 어레이를 제조할 수 있다. 더 이러한구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 공통 요소를 통해 포획 프로브와 회합될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 포획 프로브는 각각 비드와 같은 동일한 마이크로피처에 결합될 수 있다. 더 그러한 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바코드는 어레이 내의 폴리뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 다른 바코드와 구별되는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이는 또한 바코드의 서열, 및 또한 폴리뉴클레오타이드 내의 바코드의 위치, 예를 들어 프라이머 결합 부위의 위치 5'에 의해 폴리뉴클레오타이드 및 표적 핵산 내의 다른 뉴클레오타이드 서열과 구별될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 바코드의 서열은 복수의 핵산에 1회 이상 존재할 수 있지만, 프라이머 결합 부위의 5'에 위치한 바코드는 검출될 수 있다. 바코드는 집단 내의 복수의 바코드 내 및/또는 분석되거나 조사되는 복수의 폴리뉴클레오타이드 및 표적 핵산 내에서 고유한 뉴클레오타이드 서열이 되기에 충분한 임의의 원하는 서열 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 약 6 내지 30개 뉴클레오타이드 범위의 폴리뉴클레오타이드 내의 핵산 또는 영역이다. 바코드는, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 초과 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 바코드는 35개, 40개, 45개 또는 50 또는 그 초과 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에 적합한 바코드는 그 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제8,053,192호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 바코드는, 각각의 바코드가 다른 바코드와 상이하도록 어레이에서 폴리뉴클레오타이드를 또 다른 폴리뉴클레오타이드와 구별할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 바코드의 세트가 바코드의 다른 세트와 상이하도록 어레이 내에서 폴리뉴클레오타이드의 집단을 폴리뉴클레오타이드의 또 다른 집단과 구별할 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에 유용한 일부 양태는 US20180334711A1 및 US20190085384A1에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 바코드는 고유 분자 식별자(UMI)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 프라이머 결합 부위는 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머가 확장되어 바코드의 보체를 제공할 수 있도록 바코드의 3'일 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 바코드의 서열을 얻기 위해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 결합 부위는 폴리뉴클레오타이드의 바코드에 직접 인접할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 집단의 각 프라이머 결합 부위는 동일한 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 하위집단은 제1 서열을 갖는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오타이드의 또 상이한 하위집단은 제2 서열을 갖는 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 프라이머를 복수의 상이한 프라이머 결합 부위에 혼성화하는 것은 동시적, 순차적 또는 반복적일 수 있다.
일부 구현예는 포획 프로브를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 표적 핵산과 혼성화할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 집단은 서로 상이한 포획 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 포획 프로브는 서로 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 서로 유사할 수 있으며, 예를 들어 유사한 서열 및/또는 유사한 길이를 갖는 유사한 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 미만의 뉴클레오타이드의 수에 의해 또 다른 포획 프로브와 상이할 수 있고, 뉴클레오타이드의 수는 포획 프로브에서 연속 뉴클레오타이드, 비연속 뉴클레오타이드, 삽입된 뉴클레오타이드 또는 결실된 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드에 의해 또 다른 포획 프로브와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 결합 부위 및 바코드는 포획 프로브의 5'일 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 결합 부위 및 바코드는 포획 프로브의 3'일 수 있다.
일부 구현예는 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 절단 가능한 링커는 링커를 절단함으로써 포획 프로브를 프라이머 결합 부위 및 바코드로부터 분리할 수 있도록 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 포획 프로브, 프라이머 결합 부위 및 바코드 사이의 폴리뉴클레오타이드 내에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 프라이머 결합 부위 및 포획 프로브에 연결된 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제거할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 포획 프로브는 모두 비드에 결합될 수 있다. 절단 가능한 링커의 절단은 프라이머 결합 부위 및 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 비드로부터 제거할 수 있다.
일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500개의 뉴클레오타이드에 상응하는 길이, 또는 전술한 길이 중 임의의 2개의 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 빛, 염기, 산과 같은 제제 및/또는 서열 특이적 제한 효소 또는 프로테아제와 같은 효소에 의한 절단이 쉽다. 절단 가능한 링커는 효소의 인식 부위와 같은 뉴클레오타이드의 특정 서열을 포함할 수 있고/있거나 제제에 의한 절단이 쉬운 특정 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 DNA 글리코실라제(UDG)와 같은 외인성 염기 절단제에 의해 절단 가능한 우라실을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 8-하이드록시구아닌 DNA 글리코실라제(FPG 단백질)에 의해 절단될 수 있는 8-하이드록시구아닌을 포함할 수 있다. 절단 가능한 링커의 더 많은 예는 US 특허 출원 공개 2005/0181394에 개시되어 있고, 이는 전체가 참고로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 기질에 부착된다. 일부 구현예에서, 기질은 비드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 또는 그 근처에서 기질의 표면에 단일 지점 공유 부착에 의해 비드 또는 다른 표면과 같은 기질에 고정될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 기질에 부착된 스페이서를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 적어도 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 500개의 뉴클레오타이드에 상응하는 길이, 또는 전술한 길이 중 임의의 2개의 범위 내의 길이를 가질 수 있다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 공유 부착 수단이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 선택한 부착 화학은 고체 지지체의 특성과 여기에 적용된 유도체화 또는 기능화에 따라 달라진다. 폴리뉴클레오타이드는 부착을 용이하게 하기 위해 비-뉴클레오타이드 화학적 변형일 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 5' 말단에 위치한 포스포로티오에이트 또는 티오인산염와 같은 황-함유 친핵체를 포함할 수 있다. 고체로 지지된 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 경우, 이 친핵체는 하이드로겔에 존재하는 브로모아세트아미드 기에 결합한다. 폴리뉴클레오타이드를 고체 지지체에 부착시키는 예시적인 수단은 중합된 아크릴아미드 및 N-(5-브로모아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드(BRAPA)로 구성된 하이드로겔에 대한 5' 포스포로티오에이트 부착을 통하는 것이며, 이는 전체가 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제8,168,388호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 어레이 내의 폴리뉴클레오타이드의 위치는 폴리뉴클레오타이드의 바코드를 서열분석함으로써 디코딩될 수 있다. 예를 들어, 바코드의 서열은 어레이의 부위와 연관될 수 있고 부위는 특정 포획 프로브와 연관될 수 있다. 일부 구현예는 클론 증폭된 분자 및 단일 핵산 분자의 대규모 병렬 서열분석을 허용하는 서열분석 방법을 참조할 수 있는 차세대 서열분석(NGS)을 포함한다. NGS의 예는 가역적 염료 종결자를 사용한 합성에 의한 서열분석(SBS) 및 결찰에 의한 서열분석을 포함한다. SBS에서, 핵산 템플릿을 따라 핵산 프라이머의 확장은 템플릿 내의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 모니터링된다. 기본 화학 공정은 중합일 수 있다. 특정 중합효소 기반 SBS 구현예에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드는 추가되어 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출이 템플릿의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있도록 템플릿 의존적 방식으로 프라이머를 확장한다.
하나 이상의 증폭된 핵산은 SBS 또는 주기로 시약의 반복된 전달을 포함하는 다른 검출 기술에 적용될 수 있다. 예를 들어, 제1 SBS 주기를 시작하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등이 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 수용하는 하이드로겔 비드 내로/이를 통해 흐를 수 있다. 프라이머 확장으로 인해 표지된 뉴클레오타이드가 통합되는 부위가 검출될 수 있다. 선택적으로, 뉴클레오타이드는, 일단 뉴클레오타이드는 프라이머에 추가되면 추가 프라이머 확장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 프라이머에 첨가하여, 탈블록킹제가 모이어티를 제거하기 위해 전달될 때까지 후속 확장이 일어날 수 없도록 할 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 구현예의 경우, 탈블록킹화 시약은 검출이 일어나기 전이나 후에 유동 셀로 전달될 수 있다. 세척은 다양한 전달 단계 사이에 수행될 수 있다. 그런 다음 주기를 n번 반복하여 프라이머를 n개의 뉴클레오타이드만큼 확장함으로써 길이가 n인 서열을 검출할 수 있다.
일부 SBS 구현예는 뉴클레오타이드를 확장 생성물에 혼입할 때 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출을 기반으로 한 서열분석은 상업적으로 이용 가능한 전기 검출기 및 관련 기술을 사용할 수 있다. 이러한 서열분석 시스템의 예는 Roche의 자회사인 454 Life Sciences의 상업적으로 이용 가능한 플랫폼과 같은 파이로서열분석; Pacific Biosciences로부터 상업적으로 이용가능한 플랫폼과 같은 γ-인산염-표지된 뉴클레오타이드를 사용한 서열분석; 및 Life Technologies의 Ion Torrent 자회사로부터 상업적으로 이용 가능한 플랫폼과 같은 양성자 검출을 사용한 서열분석이다. 일부 구현예는 각각이 전체적으로 참조로 포함되어 있는 US 특허 출원 공개 2005/0130173 및 2006/0134633 및 미국 특허 제4,971,903호; 제6,258,568호 및 제6,210,891호에 기재되어 있는 파이로서열분석을 포함한다. 일부 구현예는 각각이 전체적으로 참조로 포함되어 있는 미국 특허 제5,599,675호 및 미국 특허 제5,750,341호에 개시되어 있는 결찰에 의한 서열분석을 포함한다.
일부 구현예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단 함유 중합효소와 γ-인산염 표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호 작용을 통해 또는 제로 모드 도파관(ZMW)을 사용하여 검출할 수 있다. 또 다른 유용한 서열분석 기술은 나노포어 서열분석이다. 일부 나노포어 구현예에서, 표적 핵산 또는 표적 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오타이드는 나노포어를 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오타이드는 나노포어를 통과할 때 기공의 전기 전도도의 변동을 측정하여 각 뉴클레오타이드 유형을 식별할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 일부 구현예에서 어레이의 마이크로피처는 5' 링커(20)를 통해 비드(10)에 부착된 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 바코드(30), 프라이머 결합 부위(40), 및 포획 프로브(50)를 포함할 수 있다. 프라이머(60)은 프라이머 결합 부위에 혼성화할 수 있고 어레이에서 마이크로피처의 위치를 디코딩하기 위해 바코드의 서열을 얻기 위해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 표적 핵산에 혼성화할 수 있고 포획 프로브는 예를 들어 중합효소 또는 리가제에 의해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 브릿지 증폭에 참여할 수 있다. 브릿지 증폭 방법은 미국 특허 제7,985,565호 및 제7,115,400호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
도 2에 도시된 바와 같이, 일부 구현예에서 어레이의 마이크로피처는 포획 프로브(50), 바코드(30), 및 프라이머 결합 부위(40)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 5' 링커(20)를 통해 비드(10)에 부착된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브와 바코드 사이에 절단 가능한 링커(70)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머(60)은 프라이머 결합 부위에 혼성화될 수 있고, 바코드의 서열이 결정되어 어레이에서 마이크로피처의 위치를 디코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 절단될 수 있고, 비드 및 포획 프로브를 포함하는 마이크로피처으로부터 바코드 및 프라이머 결합 부위는 제거될 수 있다. 일부 이러한 구현예는 표적 핵산을 포획 프로브와 혼성화하기 전에 디코딩된 어레이를 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 어레이의 디코딩된 위치에서 포획 프로브에 혼성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브는 예를 들어 중합효소 또는 리가제에 의해 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 브릿지 증폭에 참여할 수 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 일부 구현예에서 어레이의 마이크로피처는 바코드(30), 프라이머 결합 부위(40), 및 3' 링커(25)를 통해 비드(10)에 부착된 포획 프로브(50)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 결합 부위는 비드에 부착된 링커와 접할 수 있다. 일부 구현예는 특정 중합효소를 스크리닝하고 개발하기 위한 분석에서 이러한 마이크로피처의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합효소의 활성은 스페이서가 있는 비드에 부착된 프라이머 부위와 비교하여 스페이서 없이 비드에 부착된 프라이머 부위에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 포획 프로브에 혼성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 혼성화된 표적 핵산은 예를 들어 중합효소 또는 리가제에 의해 확장된다.
도 4에 도시된 바와 같이, 어레이의 마이크로피처의 구현예는 스페이서(80), 바코드(30), 프라이머 결합 부위(40), 및 5' 링커(20)를 통해 비드(10)에 부착된 포획 프로브(50)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
다중 표적 핵산의 서열분석
일부 구현예는 복수의 표적 핵산을 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 상이한 대상체, 예를 들어 상이한 대상체로부터의 게놈 DNA와 같은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 표적 핵산은 상이한 인덱스와 연관될 수 있어서, 인덱스는 단일 공급원으로부터 유래된 집단과 같은 표적 핵산의 특정 집단을 식별할 수 있다.
일부 구현예는 비드의 적어도 제1 및 제2 하위집단을 수득하는 것을 포함하며, 각각의 비드는 포획 프로브, 동일한 비드의 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'을 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 하위집단의 인덱스는 제2 하위집단의 인덱스와 상이하다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및/또는 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 제1 하위집단의 포획 프로브는 서로 다를 수 있고/있거나; 제1 하위집단의 포획 프로브는 서로 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브는 각각 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예는 또한 제1 표적 핵산을 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브에 혼성화하고, 제2 표적 핵산을 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브에 혼성화하는 것을 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브에 제1 표적 핵산을 혼성화하고, 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브에 제2 표적 핵산을 혼성화하는 것은 상이한 위치에서 수행한다. 예를 들어, 상이한 위치는 다중벽 플레이트의 상이한 웰과 같은 상이한 웰과 같은 상이한 반응 부피를 포함한다. 예를 들어, 96개 웰 플레이트에서, 비드의 96개의 상이한 하위집단은 96개의 서로 상이한 표적 핵산과 혼성화될 수 있으며, 비드의 각각의 상이한 하위집단은 상이한 웰의 상이한 표적 핵산에 혼성화된다.
일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 상이한 하위집단은 평면 기질과 같은 기질 상에 분포된다. 일부 구현예에서, 비드의 분포된 하위집단은 어레이를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 개별 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다.
일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 상이한 하위집단은 기질 상에 분포되기 전에 조합된다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 상이한 하위집단은 기질 상에 순차적으로 분포된다. 예를 들어, 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 제1 하위집단은 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 제2 하위집단이 기질 상에 분포되기 전에 기질 상에 분포된다.
일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브는 확장된다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브는 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드의 상이한 하위집단이 기질 상에 분포되기 전에 확장된다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브는 혼성화된 포획 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 비드가 기질 상에 분포된 후에 확장된다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브를 확장하는 것은 중합효소 확장을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브를 확장하는 것은 리가제의 존재 하에 확장 프로브를 포획 프로브에 결찰하는 것과 같은 리가제 기반 확장을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장 단계는 검출 가능한 마커를 확장된 포획 프로브에 추가할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 마커는 형광성 마커를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 기질 상의 비드를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 기질 상의 확장된 포획 프로브, 바코드 및 인덱스의 위치를 식별함으로써 비드를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 상의 위치에 특정 바코드의 존재는 그 위치에 특정 포획 프로브를 표시한다. 일부 구현예에서, 기질 상의 위치에서 특정 인덱스의 존재는 표적 핵산의 특정 하위집단의 표적 핵산은 기질 상의 위치와 연관됨을 나타낸다. 일부 구현예에서, 기질 상의 위치에서 확장된 포획 프로브의 존재는 표적 핵산의 하위집단에서 특정 표적 핵산의 존재를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표면 상의 단일 위치에서의 바코드의 동일성, 인덱스의 동일성, 및 확장된 포획 프로브의 존재는 표적 핵산의 특정 하위집단에서 특정 표적 핵산의 존재를 나타낸다.
일부 구현예에서, 기질 상의 비드를 디코딩하는 것은 혼성화된 포획 프로브 또는 확장된 포획 프로브의 위치를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브 또는 확장된 포획 프로브의 위치를 검출하는 것은 혼성화된 포획 프로브를 검출 가능한 마커로 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 포획 프로브 또는 확장된 포획 프로브의 위치를 검출하는 것은 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다.
일부 구현예에서, 기질 상의 비드를 디코딩하는 것은 확장된 포획 프로브를 포함하는 비드의 인덱스의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 복수의 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 부위에 혼성화하고 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것은 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 인덱스의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 인덱스를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 기질 상의 비드를 디코딩하는 것은 확장된 포획 프로브를 포함하는 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 복수의 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 부위에 혼성화하고, 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 상의 비드를 디코딩하는 것은 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것을 포함하고, 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질 상의 비드를 디코딩하는 것은 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것을 포함하고 기질 상의 바코드를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 50개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 100, 200, 300, 400, 또는 500 또는 그 초과 개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 5000개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 50,000개의 포획 프로브를 포함한다.
일부 구현예는 비드의 적어도 10개의 상이한 하위 집단을 포함하며, 각각의 하위 집단은 다른 하위 집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 100개의 상이한 하위집단을 포함하고, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 1000개의 상이한 하위집단을 포함하며, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 10,000개의 상이한 하위 집단을 포함하며, 각각의 하위 집단은 다른 하위 집단과 상이한 인덱스를 포함한다.
일부 구현예의 양태가 도 5a 내지 도 5e에 도시되어 있다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 비드의 하위집단은 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 부착된 제2 폴리뉴클레오타이드를 갖는 비드를 포함한다. 비드의 상이한 하위집단은 다른 인덱스를 포함할 수 있다. 비드의 상이한 하위집단, 특정 인덱스를 갖는 각 하위집단은 각 웰이 비드의 단일 하위집단을 포함하도록 96개의 웰 플레이트의 웰에 분포될 수 있다.
도 5b에 도시된 바와 같이, 표적 핵산 집단으로부터의 표적 핵산은 표적 핵산이 SNP를 함유하는 포획 프로브에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 하위집단은 비드의 하위집단을 함유하는 각 웰에 추가된다. 표적 핵산의 각 하위집단은 상이한 대상체와 같은 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 핵산의 단일 샘플과 같은 핵산의 단일 공급원로부터 핵산 라이브러리를 준비함으로써 표적 핵산의 하위집단을 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 서열분석될 어댑터를 필요로 하지 않는다.
도 5c에 도시된 바와 같이, SNP를 함유하는 표적 핵산에 혼성화된 포획 프로브는 확장될 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 형광 뉴클레오타이드 및 적절한 중합효소를 포함하는 혼입 믹스를 추가하여 실행된다. 일부 구현예에서, 확장은 단일 염기 확장이다.
일부 구현예에서, 모든 비드는 조합되어 플로우셀의 표면 상에 분포된다. 플로우셀은 패턴화된 표면을 가질 수 있으며 표면은 변형되어 원하는 밀도에서 비드의 고정을 지원할 수 있다.
일부 구현예에서, SNP 판독이 수행된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브의 SNP 부위에서의 혼입으로부터 신호를 판독하기 위해 스캔 주기가 수행된다. 일부 구현예에서, 이 주기는 합성에 의한 서열의 적어도 하나의 주기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장된 포획 프로브의 3' 말단이 절단되고 차단된다.
도 5d에 도시된 바와 같이, 바코드 프라이머는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화되고, 바코드 프라이머는 확장된다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머의 확장은 바코드 판독을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 합성에 의한 서열의 적어도 하나의 주기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성에 의한 서열 주기의 수는 비드의 하위집단에서 상이한 바코드의 수에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 합성 주기에 의한 12 내지 20개의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 플로우셀 내의 특정 비드의 위치 및 포획 프로브를 식별한다.
도 5e에 도시된 바와 같이, 인덱스 프라이머는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화되고, 인덱스 프라이머는 확장된다. 일부 구현예에서 인덱스 프라이머의 확장은 인덱스 판독을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 합성에 의한 서열의 적어도 하나의 주기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성에 의한 서열 주기의 수는 비드의 복수의 하위집단에서 상이한 인덱스의 수에 의존할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 합성 주기에 의한 6 내지 12개의 서열을 포함할 수 있다.
표적 리간드를 검출하는 특정 방법
일부 구현예는 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 핵산, 단백질, 또는 다른 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 상이한 공급원, 예를 들어 상이한 샘플, 상이한 개별 대상체, 또는 상이한 대상체 집단으로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 표적 리간드를 검출하는 방법은 비드의 집단을 수득하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 비드는 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 포획 프로브를 포함한다. 예를 들어, 포획 프로브는 핵산, 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 동일한 비드의 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 또한 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 집단은 비드의 제1 및 제2 하위집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스는 비드의 제2 하위집단의 인덱스와 상이하다. 예를 들어, 비드의 제1 하위집단의 인덱스는 비드의 제2 하위집단의 인덱스로부터 비드의 제1 하위집단을 식별하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예는 제1 표적 리간드를 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브에 접촉시키는 단계, 및 제2 표적 리간드를 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브에 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 표적 리간드는 리간드의 제1 샘플로부터 얻어질 수 있고, 제2 표적 리간드는 리간드의 제2 샘플로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예는 또한 기질 상에 특이적으로 결합된 제1 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 제1 및 제2 하위집단을 분포시키는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 기질 상에 분포된 제1 및 제2 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브를 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 기질 상의 검출된 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 핵산을 포함하고, 표적 리간드는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 다른 구현예에서, 포획 프로브는 제1 폴리뉴클레오타이드와 구별된다. 일부 구현예에서, 비드의 하위집단의 포획 프로브는 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 상이한 하위집단은 동일한 상이한 포획 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
이러한 일부 구현예에서, 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브를 검출하는 것은 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 중합효소 확장 및/또는 리가제 확장을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 확장은 형광 표지된 뉴클레오타이드와 같은 검출 가능한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 포획 프로브의 단일 뉴클레오타이드 확장을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 복수의 뉴클레오타이드를 사용한 포획 프로브의 확장을 포함한다.
이러한 일부 구현예에서, 포획 프로브는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 하위집단의 포획 프로브는 서로 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 비드의 상이한 하위집단은 동일한 상이한 포획 프로브를 포함할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 비드의 하위집단의 상이한 포획 프로브는 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브를 검출하는 것은 면역검정을 포함한다. 예를 들어, 포획 프로브에 특이적으로 결합된 표적 리간드는 이차 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉되며, 이차 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다.
일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 하위집단 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 비드의 하위집단을 비드의 상이한 하위집단과 구별할 수 있다. 예를 들어, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열 및 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 표적 리간드를 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브에 접촉시키는 단계, 및 제2 표적 리간드를 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브에 접촉시키는 단계는 상이한 위치에서 수행된다. 예를 들어, 상이한 위치는 상이한 반응 부피, 예를 들어 미세적정 플레이트의 상이한 웰의 상이한 부피를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 또한 기질 상에 비드의 제1 및 제2 하위집단을 분배하기 전에 비드의 제1 및 제2 하위집단을 조합하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 비드의 제2 하위집단이 기질 상에 분포되기 전에 비드의 제1 하위집단이 기질 상에 분포된다. 일부 구현예에서, 비드의 하위집단은, 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브가 검출되기 전에 기질 상에 분포된다.
일부 구현예에서, 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브를 검출하는 것은 또한 기질 상의 표적 리간드에 특이적으로 결합된 포획 프로브의 위치를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 검출된 포획 프로브의 위치를 디코딩하는 것은 검출된 포획 프로브를 포함하는 비드의 인덱스의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또는 복수의 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 부위에 혼성화하고 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것은 또한 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 인덱스의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 인덱스를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 검출된 포획 프로브의 위치를 디코딩하는 것은 검출된 포획 프로브를 포함하는 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 이러한 구현예는 복수의 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 부위에 혼성화하고, 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것은 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 바코드를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은 복수의 개별 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 분포된 제1 및 제2 하위집단은 어레이를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 서로 상이한 적어도 50, 100, 500, 1000, 또는 5000개의 포획 프로브, 또는 전술한 수 중 임의의 2개 사이의 임의의 수의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예는 또한 비드의 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000개의 상이한 하위집단을 포함하며, 각각의 하위집단은 다른 하위집단과 상이한 인덱스, 또는 전술한 수 중 임의의 2개 사이의 비드의 임의의 수의 상이한 하위집단을 포함한다.
구현예는 비드에 부착된 폴리뉴클레오타이드(210)를 갖는 비드(200)를 포함하는 도 6a의 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표적 핵산(220)에 혼성화되는 포획 프로브를 포함한다. 포획 프로브는 검출 가능한 표지(230)를 포함하는 뉴클레오타이드로 확장된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드를 서열화하고 식별하는 데 유용한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 또한 비드의 또 상이한 하위집단으로부터의 비드의 하위집단을 나타내는 인덱스, 및 인덱스의 서열을 지정하고 식별하는 데 유용한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 기질 상의 어레이로 분포될 수 있고 디코딩될 수 있다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다.
구현예는 비드에 부착된 포획 프로브(240)를 갖는 비드(200)를 포함하는 도 6a의 중간 패널에 도시된다. 포획 프로브는 표적 핵산(220)에 혼성화된다. 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드를 서열화하고 식별하는데 유용한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드(260)도 비드에 부착된다. 비드의 또 상이한 하위집단으로부터의 비드의 하위집단을 나타내는 인덱스를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드(250)도 비드에 부착된다. 포획 프로브는 검출 가능한 표지(230)를 포함하는 뉴클레오타이드로 확장된다. 일부 구현예에서, 비드는 기질 상의 어레이로 분포될 수 있고 디코딩될 수 있다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다.
구현예는 포획 프로브가 항체, 또는 항체의 항원-결합 단편인 비드에 부착된 포획 프로브(270)를 갖는 비드(200)를 포함하는 도 6a의 우측 패널에 도시되어 있다. 포획 프로브는 리간드(280)에 특이적으로 결합된다. 리간드는 또한 검출 가능한 표지(230)를 포함하는 이차 항체(290)와 결합된다. 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드를 서열화하고 식별하는데 유용한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드(260)도 비드에 부착된다. 비드의 또 상이한 하위집단으로부터의 비드의 하위집단을 나타내는 인덱스를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드(250)도 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드는 기질 상의 어레이로 분포될 수 있고 디코딩될 수 있다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다.
구현예는 비드에 부착된 단백질을 포함하는 포획 프로브(330)를 갖는 비드(200)를 포함하는 도 6b의 우측 패널에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 비드는 기질 상의 어레이로 분포될 수 있다. 단백질에 대한 기질(340)은 단백질과 접촉하여 검출 가능한 표지(230)를 포함하는 신호를 생성한다. 어레이에서 신호의 위치를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 바코드를 서열화하고 식별하는 데 유용한 바코드 프라이머 결합 부위도 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드는 비드의 또 다른 하위집단으로부터의 비드의 하위집단을 나타내는 인덱스를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 이는 또한 비드에 부착된다. 일부 구현예에서 비드는 어레이 상에서 디코딩된다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 구현예는 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 표적 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 포획 프로브, 바코드 및 바코드 프라이머 결합 부위를 인코딩하는 핵산으로, 바코드는 포획 프로브를 나타내는 핵산, 및 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 인코딩하는 핵산으로, 인덱스는 제1 집단 또는 제2 집단으로부터 비드의 공급원을 나타내는 단계, 및 (b) 비드의 제1 집단을 제1 표적 리간드를 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제1 표적 리간드는 제1 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여 비드의 표적 결합된 제1 집단을 수득하는 단계; (c) 비드의 제2 집단을 제2 표적 리간드를 포함하는 제2 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제2 표적 리간드는 제2 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여 비드의 표적 결합된 제2 집단을 수득하는 단계; (d) 어레이 상에 비드의 표적 결합된 제1 집단 및 비드의 표적 결합된 제2 집단을 무작위로 분배하는 단계; (e) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 단계; 및 (f) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 인덱스 및 바코드의 서열을 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 것은 중합효소 확장 또는 결찰에 의해 포획 프로브를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (f) 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함하고, 제2 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일하고, 제2 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 어레이는 플로우셀의 표면 상에 위치된다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 어레이에 부착되도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 그의 유도체를 포함하고; 그리고 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단은 자성이다.
표적 핵산의 서열분석 및 분석
일부 구현예는 표적 핵산의 서열분석 및/또는 분석을 포함한다. 일부 구현예는 본 명세서에 제공된 방법에 따라 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 디코딩하는 단계; 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하는 단계; 포획 프로브를 확장하는 단계; 및 어레이 상의 위치에서 표적 핵산에 혼성화된 포획 프로브의 확장을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이 상의 폴리뉴클레오타이드의 위치는 표적 핵산을 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하기 전에 디코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 어레이 상의 폴리뉴클레오타이드의 위치는 표적 핵산에 혼성화된 포획 프로브의 확장을 검출한 후에 디코딩될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 공통 요소를 통해 포획 프로브와 회합될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 포획 프로브는 각각 비드와 같은 동일한 마이크로피처에 결합될 수 있다. 더 그러한 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 포획 프로브의 단일 염기 확장(SBE)을 포함한다. 일부 구현예에서, SBE는 표적 핵산에서 대립유전자, 돌연변이 또는 기타 피처의 검출을 위해 사용될 수 있다. 간단히 말해서, SBE는 검출 위치에 근접하거나 인접한 위치에서 표적 게놈 단편에 혼성화하는 포획 프로브를 이용하며, 검출 위치는 특정 유전자좌를 나타낸다. 중합효소는 검출 표지로 표지된 뉴클레오타이드 유사체로 포획 프로브의 3' 말단을 확장하는 데 사용할 수 있다. 효소의 충실도에 따라, 뉴클레오타이드는 표적 핵산의 검출 위치와 상보적인 경우에만 포획 프로브에 혼입된다. 원하는 경우, 가역적 차단 기를 포함하는 차단 기를 사용하여 더 이상의 확장이 발생할 수 없도록 뉴클레오타이드를 유도체화하여 단일 뉴클레오타이드만 첨가할 수 있다. 확장된 포획 프로브에서 표지된 뉴클레오타이드의 존재는 예를 들어 어레이의 특정 위치에서 검출될 수 있고, 추가된 뉴클레오타이드는 유전자좌 또는 대립유전자의 동일성을 결정하기 위해 확인된다. SBE는 각각 그 전체가 참고로 포함되는 US 특허 제9,441,267호 및 US 제9,045,796호에 기재된 것과 같은 공지된 조건 하에 수행될 수 있다.
일부 구현예는 대립유전자 특이적 프라이머 확장(ASPE)을 포함한다. 일부 구현예에서 ASPE는 3' 말단에서 뉴클레오타이드 조성이 상이한 포획 프로브의 확장을 포함할 수 있다. ASPE 방법은 절단 가능한 링커를 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 사용하여 수행할 수 있으므로 프로브는 검출된 후 표지를 제거할 수 있다. 이를 통해 프로브를 추가로 사용하거나 검출된 신호가 현재 제거된 표지로 인한 것인지 확인할 수 있다. 간단히 말해서, ASPE는 검출 위치에 상보적인 3' 서열 부분 및 검출 위치에 인접한 서열에 상보적인 5' 부분을 갖는 포획 프로브에 표적 핵산을 혼성화함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 중합효소에 의한 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의한 포획 프로브의 3' 부분의 템플릿 지시 변형은, 템플릿이 표적 서열을 포함하는 경우에만 표지된 확장 생성물을 생성한다. 그런 다음, 그러한 표지된 프라이머-확장 생성물의 존재는 예를 들어 특정 대립유전자의 존재를 나타내기 위한 어레이에서의 위치에 기초하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, ASPE는 표적 핵산에서 동일한 검출 위치에 인접하지만 상이한 3' 말단에 인접하여 어닐링되도록 유사한 5' 말단을 갖는 다중 포획 프로브로 수행될 수 있어, 검출 위치를 보완하는 3' 말단을 갖는 포획 프로브만이 중합 효소에 의해 변형된다. 특정 검출 위치에 상보적인 3' 말단 염기를 갖는 포획 프로브는 위치에 대한 완전 일치(PM) 프로브라고 하는 반면, 3' 말단 불일치 염기를 갖고 ASPE 반응에서 확장될 수 없는 포획 프로브는 위치에 대한 불일치(MM) 프로브이다. PM 프로브에서 표지된 뉴클레오타이드의 존재가 검출될 수 있고 포획 프로브의 3' 서열은 검출 위치에서 특정 대립유전자를 확인하기 위해 결정될 수 있다.
일부 구현예는 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 디코딩하는 방법을 포함한다. 이러한 일부 방법은 (a) 기질의 표면 상에 분포된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 갖는 기질을 수득하는 단계로서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 바코드의 프라이머 결합 부위 3'을 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브에 연결되는 단계; (b) 복수의 프라이머를 프라이머 결합 부위에 혼성화하는 단계; 및 (c) 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 바코드의 서열을 결정하는 단계로서, 각각의 바코드의 서열은 어레이 내의 폴리뉴클레오타이드의 위치를 나타내는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 비드를 통해 포획 프로브에 연결된다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 프라이머 결합 부위의 3'이다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 바코드의 5'이다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 다른 포획 프로브와 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 5개 미만의 상이한 뉴클레오타이드만큼 다른 포획 프로브와 상이하다. 일부 구현예에서, 각각의 포획 프로브는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 기질의 표면 상에 무작위로 분포된다. 일부 구현예에서, 바코드는 다른 바코드와 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 바코드는 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 프라이머 결합 부위는 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드는 웰에 분포된다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 절단 가능한 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 프라이머 결합 부위 및 바코드로부터 포획 프로브를 제거하도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 기질은 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 스페이서를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 기질에 부착된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 비드에 부착된다. 일부 구현예는 또한 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하는 것은 바코드의 서열을 결정한 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하는 것은 바코드의 서열을 결정하기 전에 수행된다. 일부 구현예는 또한 혼성화된 표적 핵산, 또는 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 결찰을 포함한다. 일부 구현예는 또한 표적 핵산을 증폭하는 것을 포함한다.
일부 구현예는 표적 핵산을 서열분석하는 방법을 포함한다. 이러한 일부 방법은 (a) 전술한 방법 중 어느 하나에 따라 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 디코딩하는 단계; (b) 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하는 단계; (c) 표적 핵산에 혼성화된 포획 프로브를 확장하는 단계; 및 (d) 확장된 포획 프로브의 위치를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, (d) 확장된 포획 프로브의 위치를 검출하는 것은 (a) 어레이에서 폴리뉴클레오타이드의 위치를 디코딩하는 단계 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 리가제에 의해 확장된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 중합효소에 의해 확장된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 확장된다. 일부 구현예는 또한 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화하기 전에 포획 프로브로부터 프라이머 결합 부위 및 바코드를 절단하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 표적 핵산을 포획 프로브에 혼성화한 후 포획 프로브로부터 프라이머 결합 부위 및 바코드를 절단하는 것을 포함한다.
일부 구현예는 어레이 상의 상이한 생물학적 공급원으로부터 유래된 표적 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는 것을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 표적 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 샘플의 예는 개체로부터의 게놈 DNA 샘플, cDNA 샘플, RNA 샘플 및 앰플리콘을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 표적 핵산, 인덱스, 및 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 인덱스는 표적 핵산의 공급원을 특정 핵산 샘플로 표시하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 상이한 핵산 샘플로부터 제조된 폴리뉴클레오타이드는 상이한 인덱스를 포함할 수 있다. 각 인덱스는 특정 증폭 프라이머에 결합하도록 설계된 위치를 가질 수 있다. 이 인덱스 프라이머 결합 부위는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 인덱스의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스는 약 3 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 범위의 폴리뉴클레오타이드 내의 핵산 또는 영역이다. 인덱스는 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 초과 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물에 유용한 일부 양태는 US 20180334711A1 및 US 20190085384A1에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 바코드 또는 인덱스는 고유 분자 식별자(UMI)를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산을 포함하는 핵산 샘플은 트랜스포솜으로 태그부착되어 트랜스포솜으로부터 서열을 함유하는 말단을 갖는 핵산 단편을 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 트랜스포솜은 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있어, 태그부착은 핵산 단편에 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 추가한다. 예를 들어, 표적 핵산을 포함하는 입력 핵산은 복수의 트랜스포솜과 접촉될 수 있다. 트랜스포솜은 입력 핵산을 단편화하고 핵산 단편의 말단에 어댑터를 부착할 수 있다. 태그부착 반응의 예는 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제9,040,256호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 표적 핵산을 포함하는 핵산 단편의 말단에 어댑터를 첨가함으로써 제조될 수 있으며, 어댑터는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 증폭 생성물이 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하도록, 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 프라이머로 표적 핵산을 포함하는 핵산 단편을 증폭함으로써 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산은 포획 프로브에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 비드에 부착된다. 일부 구현예에서 올리고뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 포획 프로브, 바코드 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 서열분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 어레이 내에서 포획 프로브와 같은 폴리뉴클레오타이드를 식별하는 데 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바코드는 다른 바코드와 구별되는 고유한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이는 또한 바코드의 서열, 및 또한 폴리뉴클레오타이드 내의 바코드의 위치, 예를 들어 바코드 프라이머 결합 부위에 인접한 위치에 의해 폴리뉴클레오타이드 및 표적 핵산 내의 다른 뉴클레오타이드 서열과 구별될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 바코드의 서열은 복수의 핵산에 1회 이상 존재할 수 있지만, 바코드 프라이머 결합 부위에 인접한 바코드는 검출될 수 있다. 바코드는 집단 내의 복수의 바코드 내 및/또는 분석되거나 조사되는 복수의 폴리뉴클레오타이드 및 표적 핵산 내에서 고유한 뉴클레오타이드 서열이 되기에 충분한 임의의 원하는 서열 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 약 6 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 범위의 폴리뉴클레오타이드 내의 핵산 또는 영역이다. 바코드는, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 초과 개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에 적합한 바코드는 그 전체가 참고로 포함되는 미국 특허 제8,053,192호에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 바코드는, 각각의 바코드가 다른 바코드와 상이하도록 어레이에서 폴리뉴클레오타이드를 또 다른 폴리뉴클레오타이드와 구별할 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드는 어레이에서 비드의 위치를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 바코드를 사용하여 포획 프로브를 식별할 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산은 혼성화된 비드를 얻기 위해 프로브를 포획하도록 혼성화된다. 일부 구현예에서, 혼성화된 비드는 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 포획 프로브는 폴리뉴클레오타이드의 표적 핵산에 혼성될 수 있고, 및 폴리뉴클레오타이드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 혼성화된 비드는 어레이에 무작위로 분포될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산의 서열 정보는 포획 프로브를 확장함으로써 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 표적 핵산에 상보적인 서열을 포함하도록 확장될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 확장은 중합효소 확장을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 확장은 단일 염기 확장(SBE)이다. 일부 구현예에서, SBE는 표적 핵산에서 대립유전자, 돌연변이 또는 기타 피처의 검출을 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 결찰에 의해 확장될 수 있다. 예를 들어, 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드는, 포획 프로브가 표적 핵산에 혼성화하는 부위에 인접한 위치에서 표적 핵산에 혼성화할 수 있고, 이어서 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드는 포획 프로브에 결찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는, 확장된 포획 프로브가 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 포함하도록 확장될 수 있다.
일부 구현예에서, 인덱스는 어레이 상의 비드에 부착된 표적 핵산의 공급원을 결정하기 위해 서열분석된다. 일부 구현예에서, 바코드는 어레이 상의 비드의 위치를 디코딩하도록 서열분석된다. 일부 구현예에서, 바코드는 어레이 상의 비드에 부착된 포획 프로브를 식별하기 위해 서열분석된다.
일부 구현예에서 어레이는 플로우셀의 표면 상에 위치된다. 일부 구현예에서, 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된다. 예를 들어, 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체와 같은 제제를 포함할 수 있고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드 및 어레이는 자성이다.
일부 구현예는 상이한 핵산 샘플로부터 복수의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 단계, 각각의 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포획 프로브를 포함하는 비드의 집단과 혼성화하여 혼성화된 비드를 수득하는 단계, 및 혼성화된 비드를 어레이 상에 무작위로 분포시키는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예는 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 것을 포함하며, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 그리고 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 수득되고, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고, 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있다. 제1 표적 핵산은 제1 포획 프로브에 혼성화되어 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산은 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득한다. 어레이 상의 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드는 어레이 상에 무작위로 분포된다. 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치는 제1 및 제2 바코드를 서열분석하여 어떤 비드가 표적 핵산의 각 세트에 의해 결합되었는지 결정함으로써 디코딩된다. 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 얻는다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 인덱싱된다. 예를 들어, 비드의 제1 및 제2 집단이 수득되며, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 그리고 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 수득되고, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산, 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고, 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 제2 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있다. 제1 표적 핵산은 제1 포획 프로브에 혼성화되어 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산은 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득한다. 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드는 어레이 상에 무작위로 분포된다. 어레이의 제1 및 제2 비드의 위치는 제1 및 제2 바코드를 서열분석하여 디코딩된다. 제1 및 제2 포획 프로브는 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 얻기 위해 확장된다. 제1 및 제2 표적 핵산의 핵산 서열 데이터에 대한 공급원은 제1 및 제2 인덱스를 서열분석함으로써 결정된다.
일부 구현예에서, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고; 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플을 복수의 트랜스포솜으로 태그부착함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 복수의 트랜스포솜은 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플에 어댑터를 추가하는 단계를 추가로 포함하고, 어댑터는 제1 또는 제2 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 또한 태그부착된 핵산 샘플을 제1 및 제2 인덱스를 포함하는 프라이머로 증폭하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 제1 및 제2 인덱스 및 제1 및 제2 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 확장된 포획 프로브에 혼입한다.
일부 구현예에서, 비드는 인덱싱될 수 있다. 예를 들어, 비드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드는 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위, 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비드의 제1 집단은 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있고, 비드의 제2 집단은 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 집단이 수득되며, 비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제1 인덱스 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제2 인덱스 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 수득되고, 제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고, 그리고 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있다. 제1 표적 핵산은 제1 포획 프로브에 혼성화되어 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산은 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득한다. 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드는 어레이 상에 무작위로 분포된다. 어레이의 제1 및 제2 비드의 위치는 제1 및 제2 바코드를 서열분석하여 디코딩된다. 제1 및 제2 포획 프로브는 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 얻기 위해 확장된다. 일부 구현예에서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 인덱스는 제1 표적 핵산의 공급원을 나타내고, 제2 인덱스는 제2 표적 핵산의 공급원을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 인덱스는 서로 동일하고, 제2 인덱스는 서로 동일하다. 일부 구현예는 또한 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 것은 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 결합 프라이머 부위는 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 상이한 핵산 샘플로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 표적 핵산은 게놈 DNA로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드는 제1 또는 제2 포획 프로브의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 바코드는 서로 상이하고, 제2 바코드는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 바코드를 서열분석하는 단계는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일하다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 중합효소 확장을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 단일 뉴클레오타이드를 포획 프로브에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 또한 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 확장된 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 것은 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 포획 프로브에 결찰하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 것은 용액 내에서 수행된다.
일부 구현예에서, 플로우셀은 어레이를 포함한다. 일부 구현예에서, 어레이는 복수의 웰을 포함하고, 각각의 웰은 하나 이상의 비드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드 및 어레이는 자성이다.
표적 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 인덱스를 또한 포함하는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 예시적인 구현예가 도 9에 도시되어 있다. 단일 뉴클레오타이드 다형성(별)을 함유하는 표적 핵산을 포함하는 DNA 샘플은 DNA 샘플이 단편화되고 증폭 프라이머 결합 부위는 단편의 각 말단에 추가되는 태그부착을 겪는다. 단편은 증폭 프라이머 결합 부위에 결합하고 샘플 인덱스 및 인덱스 판독 프라이머 결합 부위를 포함하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭된다. 샘플 인덱스 및 인덱스 판독 프라이머 서열은 증폭된 생성물에 통합된다. 비드에 올리고뉴클레오타이드를 부착하여 비드를 제조한다. 올리고뉴클레오타이드는 링커, 디코딩 서열(바코드 서열로도 알려짐), 디코딩 판독 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함한다. 증폭된 생성물과 비드는 조합된다. 표적 핵산은 포획 프로브에 혼성화된다. 혼성화는 용액 또는 어레이에서 발생할 수 있다. 혼성화된 비드는 어레이에 무작위로 분포되어 있다. 포획 프로브는 완전 기능 뉴클레오타이드(FFN)로 확장되고 확장이 검출된다. 확장된 포획 프로브는 샘플 인덱스 및 인덱스 판독 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 통합하도록 추가로 확장된다. 표적 핵산을 포함하는 가닥은 확장된 포획으로부터 해리된다. 확장된 포획 프로브의 샘플 인덱스는 인덱스 판독 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 서열분석된다. 확장된 포획 프로브의 디코드 서열은 디코드 판독 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 서열분석된다. 표적 핵산의 공급원은 샘플 인덱스의 서열에서 식별된다. 비드는 디코딩되고 포획 프로브는 디코딩 서열로부터 식별된다.
비드가 인덱스를 포함하는 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 또 다른 예시적인 구현예가 도 10에 도시되어 있다. 비드는 포획 프로브 올리고뉴클레오타이드 및 샘플 인덱스 프로브 올리고뉴클레오타이드를 부착하여 제조된다. 포획 프로브 올리고뉴클레오타이드는 링커, 디코드 서열, 디코드 판독 프라이머 결합 부위 및 포획 프로브를 포함한다. 샘플 인덱스 프로브 올리고뉴클레오타이드는 링커, 샘플 인덱스 및 인덱스 판독 프라이머 결합 부위를 포함한다. 비드는 관심의 단일 뉴클레오타이드 다형성(별)을 함유하는 핵산과 같은 표적 핵산을 포함하는 단편화된 핵산과 조합된다. 표적 핵산은 용액 내에서 또는 어레이 상에서 포획 프로브에 혼성화된다. 포획 프로브는 FFN으로 확장된다. 확장이 검출된다. 표적 핵산은 확장된 포획 프로브로부터 해리된다. 샘플 인덱스는 인덱스 판독 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하여 서열분석된다. 확장된 포획 프로브의 디코드 서열은 디코드 판독 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 서열분석된다. 표적 핵산의 공급원은 샘플 인덱스의 서열에서 식별된다. 비드는 디코딩되고 포획 프로브는 디코딩 서열로부터 식별된다.
특정 이중 프로브 방법
일부 구현예는 제1 및 제2 포획 프로브로 표적 핵산을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 제1 포획 프로브에 혼성화할 수 있는 제1 부분, 및 제2 포획 프로브에 혼성화할 수 있는 제2 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 비드가 제1 포획 프로브 및 제2 포획을 포함하는 비드의 집단이 수득된다. 일부 구현예에서, 2개의 포획 프로브 중 하나는 절단 가능한 링커를 통해 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 중 하나는 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 포획 프로브에 혼성화하여 단일 가닥 갭을 포함하는 이중 가닥 핵산을 생성한다. 갭이 채워지고 절단 가능한 링커가 절단된다. 확장된 포획 프로브가 검출된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브 중 하나는 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 가능한 표지는 갭-충전 동안 확장된 포획 프로브 내에 혼입된다.
일부 구현예에서, 제2 포획 프로브는 절단 가능한 링커를 통해 비드에 부착되고, 제2 포획 프로브는 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함한다. 절단 가능한 링커의 예는 화학적 수단, 엔도뉴클레아제와 같은 효소 및 특정 주파수의 빛에 의해 절단될 수 있는 링커가 포함된다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 또한 제1 또는 제2 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 포획 프로브는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 포획 프로브는 제1 폴리뉴클레오타이드와 구별된다.
일부 구현예에서, 제1 포획 프로브의 말단은 제2 포획 프로브의 말단에 결찰된다. 일부 구현예에서, 제1 포획 프로브는 표적 핵산을 비드의 집단의 비드의 제1 및 제2 포획 프로브에 혼성화시켜 제1 및 제2 포획 프로브 사이의 단일 가닥 갭을 포함하고 제1 및 제2 포획 프로브 사이의 갭을 충전하는 이중 가닥 핵산을 생성함으로써 제2 포획 프로브에 결찰된다. 일부 구현예에서, 갭-충전은 중합효소 및/또는 리가제로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 절단되어 검출 가능한 표지를 포함하는 제1 포획 프로브를 포함하는 비드를 생성한다. 일부 구현예에서, 비드의 집단은 기질 상에 분포된다. 일부 구현예에서, 비드의 집단은 절단 가능한 링커가 절단된 후 기질 상에 분포된다. 일부 구현예에서, 비드의 집단은 절단 가능한 링커가 절단되기 전, 또는 제1 포획 프로브를 제2 포획 프로브에 결찰시키기 전에 기질 상에 분포된다. 일부 구현예에서, 기질 상의 검출 가능한 표지를 포함하는 제1 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치가 결정된다.
일부 구현예에서, 기질 상의 검출 가능한 표지를 포함하는 제1 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 검출 가능한 표지를 포함하는 제1 포획 프로브를 포함하는 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것을 포함한다. 일부 이러한 구현예는 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 부위에 혼성화하고, 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혼성화된 바코드 프라이머를 확장하는 것은 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 바코드의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 바코드를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 비드는 표적 핵산의 공급원을 나타내는 인덱스, 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 집단은 비드의 제1 및 제2 하위집단을 포함하고, 각각의 비드는 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 하위집단의 인덱스는 제2 하위집단의 인덱스와 상이하다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단과의 결찰 또는 절단 단계는 비드의 제2 하위집단과의 결찰 또는 절단 단계와 상이한 위치에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상이한 위치는 상이한 반응 부피를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 위치는 상이한 웰을 포함한다.
일부 구현예는 또한 기질 상에 비드의 집단을 분배하기 전에 비드의 제1 및 제2 하위집단을 조합하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 비드의 제2 하위집단이 기질 상에 분포되기 전에 비드의 제1 하위집단이 기질 상에 분포된다.
일부 구현예에서, 기질 상의 검출 가능한 표지를 포함하는 제1 포획 프로브를 포함하는 비드의 위치를 디코딩하는 것은 검출된 포획 프로브를 포함하는 비드의 인덱스의 위치를 결정하는 것을 포함한다. 일부 이러한 구현예는 복수의 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 부위에 혼성화하고 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼성화된 인덱스 프라이머를 확장하는 것은 합성에 의한 서열분석의 적어도 하나의 주기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 인덱스의 위치를 디코딩하는 것은 기질 상의 인덱스를 서열분석하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은 복수의 개별 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 분포된 집단은 어레이를 포함한다.
구현예는 비드(200)가 절단 가능한 링커(310)를 통해 비드에 부착된 제1 포획 프로브(300)를 포함하는 도 6b 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 제2 포획 프로브(320)가 비드에 부착된다. 특정 샘플로부터의 표적 핵산(220)은 제1 및 제2 포획 프로브에 혼성화되고, 제1 포획 프로브는 검출 가능한 표지(230)를 포함하는 뉴클레오타이드로 제1 및 제2 포획 프로브 사이의 갭을 채우기 위해 확장된다. 갭이 채워진 후, 표적 핵산은 제거되고, 절단 가능한 링커가 절단되어 비드에 부착된 검출 가능한 표지를 포함하는 확장된 제2 포획 프로브를 생성한다. 비드는 기질의 어레이에 분산되고 디코딩될 수 있다. 비드에 부착된 샘플을 나타내는 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제1 또는 제2 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 표시되지 않는다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다.
구현예는 제1 포획 프로브가 비드(200)에 그것의 5' 말단을 통해 부착되는 도 6c에 도시되어 있다. 제2 포획 프로브(360)는 그의 3' 말단 및 절단 가능한 링커(310)를 통해 비드에 부착된다. 제2 포획 프로브는 검출 가능한 표지(230)를 포함한다. 표적 핵산(220)은 제1 및 제2 포획 프로브에 혼성화되고, 제1 포획 프로브는 확장되어 제2 포획 프로브에 결찰된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 구조적 변이체(SV)를 포함할 수 있다. 절단 가능한 링커는 절단되어 검출 가능한 표지를 포함하고 비드에 부착된 확장된 제1 포획 프로브를 생성한다. 비드는 기질의 어레이에 분산되고 디코딩될 수 있다. 비드에 부착된 샘플을 나타내는 인덱스를 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 제1 또는 제2 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 표시되지 않는다. 디코딩은 어레이 상의 검출 가능한 표지의 위치를 결정하는 단계; 어레이 상의 비드에 부착된 바코드를 결정하는 단계; 및/또는 어레이 상의 비드에 부착된 인덱스를 결정하는 단계를 포함한다. 표적 핵산은 없는 경우, 제2 포획 프로브 및 검출 가능한 표지가 비드에서 절단된다.
인덱싱된 비드의 제조 및 사용을 위한 특정 방법
일부 구현예는 인덱싱된 비드를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 일부 구현예는 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 집단을 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 앵커/어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커/어댑터는 비드에 부착된 어댑터 결합 부위에 결합하거나 혼성화할 수 있다.
일부 구현예는 비드의 인덱싱된 집단을 제조하는 방법을 포함하고, 이 방법은 (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 어댑터, 포획 프로브, 및 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 인덱스, 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계; 및 (c) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 비드의 집단에 부착하여 비드의 인덱싱된 집단을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, (c)는 중합효소 확장에 의해 어댑터를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 결합 부위를 포함하고, 부착은 어댑터 결합 부위를 어댑터에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, (c)는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터에 결찰시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 부착은 스플린트 폴리뉴클레오타이드를 어댑터 및 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, (c)는 화학적 반응성 모이어티를 통해 비드의 집단의 어댑터에 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 집단의 제1 폴리뉴클레오타이드는 서로 상이한 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스는 동일하다. 화학적 결찰에 의해 폴리뉴클레오타이드를 서로 연결하는 데 유용한 방법 및 조성물에 유용한 양태는 그 전체가 참고로 포함되는 US20180127816에 개시되어 있다.
일부 구현예는 또한 비드의 인덱싱된 집단을 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예는 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단을 비드의 추가 인덱싱된 집단과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고, 비드의 추가 인덱싱된 집단은 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단의 인덱스와 상이한 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예는 또한 비드의 인덱싱된 집단을 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예는 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단을 비드의 추가 인덱싱된 집단과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고, 비드의 추가 인덱싱된 집단은 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단의 인덱스와 상이한 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 유동 셀에서 수행된다.
인덱싱된 비드를 제조하기 위한 예시적인 구현예가 도 11에 도시되어 있다. 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 앵커 또는 어댑터, 인덱스, 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함한다. 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 복수의 집단이 제조되고 멀티웰 플레이트의 웰에 분배된다. 각 웰은 동일한 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 웰은 제1 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 집단을 포함할 수 있고, 제2 웰은 제2 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 집단을 포함할 수 있다. 다수의 비드를 웰에 분배할 수 있다. 각각의 비드는 포획 프로브를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 앵커 또는 어댑터에 결합할 수 있는 결합 부위와 같은 인덱스 앵커를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 단일 비드 풀이 각 웰에 추가된다. 단일 비드 풀에는 포획 프로브는 서로 상이한 비드의 집단이 포함될 수 있다. 동일한 인덱스를 포함하는 단일 비드 풀은 단일 샘플과 함께 사용될 수 있으므로, 샘플의 조작된 핵산의 후속 산물의 공급원은 연관된 인덱스를 식별함으로써 단일 샘플에서 유래한 것으로 식별될 수 있다. 도 11에 도시된 바와 같이, 단일 인덱싱된 비드 풀은 각각의 웰이 단일 샘플을 함유하는 멀티웰 플레이트의 단일 웰에 추가될 수 있다.
인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스는 여러 다른 방법에 의해 비드에 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 앵커 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 통해 비드에 혼성화되고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 확장됨으로써 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스의 보체가 비드에 부착된 확장된 제2 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입된다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드는 함께 결찰된다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 화학적 또는 효소적 방법을 통해 비드에 부착된 폴리뉴클레오타이드에 부착된다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착된 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되고, 혼성화된 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스는 어레이 상에서 결정된다.
일부 구현예는 화학적 또는 효소적 방법에 의해 비드에 인덱스를 부가하는 것을 포함한다. 화학적 또는 효소적 방법에 의해 비드에 인덱스를 추가하기 위한 예시적인 구현예는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시하는 도 12a에 도시되어 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브와 같은 프로브; 바코드와 같은 코드; 및 바코드의 서열을 결정하는데 사용될 수 있는 바코드 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 A를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스; 및 인덱스의 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있는 인덱스 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 B를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 스페이서 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 스페이서에 연결하는 모이어티 X-Y를 통해 비드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 서열 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차단 기는 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 또한 가역적으로 차단된 3'-말단을 갖는 헤어핀일 수 있다.
일부 구현예는 비드에 부착된 어댑터를 확장함으로써 비드에 인덱스를 추가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드에 부착된 어댑터는 결찰 또는 중합효소 확장에 의해 확장될 수 있다. 결찰에 의한 확장의 예시적인 구현예는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시하는 도 12b에 도시되어 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브와 같은 프로브; 바코드와 같은 코드; 및 바코드의 서열을 결정하는데 사용될 수 있는 바코드 프라이머 결합 부위와 같은 프라이머 A를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드 둘 다에 혼성화할 수 있는 스플린트를 포함하는 제4 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 인덱스 및 프라이머 B를 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드로 결찰에 의해 확장될 수 있는 어댑터를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 서열 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차단 기는 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 또한 가역적으로 차단된 3'-말단을 갖는 헤어핀일 수 있다.
중합효소 확장에 의한 확장의 예시적인 구현예는 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시하는 도 12c에 도시되어 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 프로브, 프라이머 A 및 코드를 포함한다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 어댑터를 포함한다. 제3 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터에 결합할 수 있는 어댑터 결합 부위, 인덱스, 및 프라이머 B를 포함한다. 제3 폴리뉴클레오타이드는, 제2 폴리뉴클레오타이드가 인덱스를 연장된 어댑터에 통합하기 위해 중합효소 확장에 의해 확장되도록 제2 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 서열 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차단 기는 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 또한 가역적으로 차단된 3'-말단을 갖는 헤어핀일 수 있다.
일부 구현예는 비드에 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 사용을 포함한다. 일부 구현예는 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하며, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 바코드 프라이머 결합 부위에 결합할 수 있는 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계; (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계; (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 단계; (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및 (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분배하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화하고; 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화하고; 그리고 바코드 프라이머를 확장하여 바코드의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터와 인덱스 사이에 위치한 절단 가능한 링커를 추가로 포함하고, (f)는 (i) 절단 가능한 링커를 절단하는 단계; 및 (ii) 바코드의 서열을 결정하기 위해 어댑터를 확장하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유동 셀에서 수행된다.
비드에 부착된 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 사용을 위한 예시적인 구현예가 도 13a 및 13b에 도시되어 있다. 도 13a는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시한다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 프로브, 예컨대 포획 프로브; 프라이머, 예컨대 프라이머 결합 부위; 및 코드, 예컨대 바코드를 포함한다. 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 인덱스; 프라이머 2, 예컨대 인덱스 프라이머 결합 부위; 스페이서, 예컨대 절단 가능한 스페이서; 및 제1 폴리뉴클레오타이드의 프라이머 결합 부위에 혼성화할 수 있는 어댑터를 포함한다. 비드 풀은 도 11에 도시된 바와 같이 인덱스 폴리뉴클레오타이드로 제조될 수 있다. 도 13b의 제1 패널은 표적 핵산이 포획 프로브를 통해 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되고 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 프라이머 결합 부위를 통해 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화되는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시한다. 도 13b의 제2 패널은 비드 어레이 상에서 검출될 수 있는 단일 형광 디데옥시뉴클레오타이드(별)를 갖는 확장된 제1 폴리뉴클레오타이드를 도시한다. 인덱스와 바코드를 결정할 수 있다. 도 13b의 제3 패널은 형광성 디데옥시뉴클레오타이드는 확장된 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 제거되었음을 도시한다. 인덱스 프라이머는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화되어 확장될 수 있고, 인덱스의 서열이 결정된다. 도 13b의 제4 패널은 표적 핵산은 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 탈혼성화되었음을 도시한다. 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 절단 가능한 링커에서 절단되고 어댑터는 이제 확장될 수 있는 프라이머 결합 부위에 혼성화된 바코드 프라이머에 해당하고 바코드의 서열이 결정된다.
일부 구현예는 복수의 인덱스 서열 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 사용을 포함한다. 그러한 일부 구현예에서, 복수의 인덱스 서열은 인덱스가 서열분석될 때 어레이 상의 위치에서 증가된 신호를 초래할 수 있다. 예시적인 구현예가 도 14에 도시되어 있다. 도 14는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시한다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머 A, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위의 반복을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복은 고정화된 인덱스의 수가 적은 비드에서 신호 강도를 개선한다. 일부 구현예에서, 반복은 신호를 감소시키지 않고 프라이머가 차지하는 표면적의 양을 제한할 수 있다.
일부 구현예는 비드에 대한 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 효소적 부가를 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 반응기를 통해 비드에 부착된 폴리뉴클레오타이드를 확장함으로써 비드에 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 비드 풀을 다른 비드 풀과 혼합하기 전에, 예를 들어 혼합물을 어레이에 로딩하기 전에 비드에 부착될 수 있다. 일부 구현예는 표적 리간드를 검출하는 방법을 포함하고, 이 방법은 하기를 포함한다: (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계; (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계; (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계; (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제2 폴리뉴클레오타이드에 부착하는 단계; (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및 (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계. 일부 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, (d)는 반응성 모이어티를 제2 폴리뉴클레오타이드에 첨가하는 것을 포함하고, 어댑터는 반응성 모이어티에 부착될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 반응성 모이어티를 첨가하는 데 유용한 방법 및 조성물에 유용한 양태는 그 전체가 참조로 포함되는 US 20180127816에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분배하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, (f)는 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화하는 단계, 및 바코드의 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 유동 셀에서 수행된다.
비드에 대한 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 예시적인 실시예의 효소적 부가는 도 15a 및 도 15b에 도시되어 있다. 도 15a 및 도 15b는 제1 폴리뉴클레오타이드의 포획 프로브를 통한 표적 핵산의 비드에 대한 혼성화, 제2 폴리뉴클레오타이드를 통한 비드에 대한 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 부가, 및 비드에 부착된 바코드 및 인덱스의 결정을 도시한다. 도 15a의 제1 패널은 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 비드를 도시한다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 다음을 포함한다: 코드, 예컨대 바코드; 프라이머, 예컨대 바코드 프라이머 결합 부위; 및 프로브, 예컨대 포획 프로브. 도 15a의 제2 패널은 표적 핵산의 포획 프로브에 대한 혼성화를 도시한다. 도 15a의 제3 패널은 형광 디데옥시뉴클레오타이드(별)를 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드의 단일 염기 확장부(SBE)를 도시한다. 도 15a의 제4 패널은 반응성 디데옥시뉴클레오타이드와 같은 제2 폴리뉴클레오타이드에 대한 반응성 기(삼각형)의 부가를 도시한다. 첨가는 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)의 사용을 포함할 수 있다. 도 15b의 제1 패널은 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 반응기 및 어댑터를 통해 제2 폴리뉴클레오타이드에 첨가하는 것을 도시한다. 비드는 어레이 상에 로딩될 수 있고, 비드의 위치는 형광성 디데옥시뉴클레오타이드로부터 결정될 수 있고, 형광성 디데옥시뉴클레오타이드는 제거될 수 있다. 도 15b의 제2 패널은 인덱스의 서열을 결정하기 위한 인덱스 프라이머 결합 부위에 대한 인덱스 프라이머의 혼성화를 도시한다. 인덱스 프라이머와 표적 핵산은 탈혼성화될 수 있다. 도 15b의 제3 패널은 바코드의 서열을 결정하기 위한 바코드 프라이머 결합 부위에 대한 바코드 프라이머의 혼성화를 도시한다.
스페이서
본 명세서에 제공된 일부 구현예는 스페이서의 사용을 포함한다. 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500개 이상의 길이의 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 전술한 숫자 중 임의의 2개 범위 내의 길이를 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 입체 장애를 감소시킴으로써 특정 과정의 효율을 증가시키기 위해 2개의 폴리뉴클레오타이드 요소 사이에 위치할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 비드에 부착된 폴리뉴클레오타이드와 같은 기질에 대한 중합효소, 리가제 및/또는 말단 트랜스퍼라제의 사용과 같은 효소적 과정의 효율성을 증가시키는 데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 스페이서는 비드에 대한 폴리뉴클레오타이드의 부착된 말단과 같은 비드, 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 포함하는 임의의 2개의 요소 사이에 위치할 수 있다.
키트 및 시스템
일부 구현예는 어레이 상의 폴리뉴클레오타이드와 같은 마이크로피처을 디코딩하기 위한 키트 및 시스템을 포함한다. 이러한 키트 및 시스템 중 일부는 칩과 같은 기질, 또는 기질 표면에 무작위로 분포된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 갖는 유체 세포를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 바코드의 프라이머 결합 부위 3'을 포함할 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함할 수 있다. 더 그러한 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 공통 요소를 통해 포획 프로브와 회합될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및 포획 프로브는 각각 비드와 같은 동일한 마이크로피처에 결합될 수 있다. 일부 구현예는 어레이의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 시약으로부터의 신호를 검출하도록 구성된 검출기를 포함하고; 이러한 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 뉴클레오타이드와 같은 서열분석 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 뉴클레오타이드를 피로인산염와 같은 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키거나 수소 이온의 변화로부터 야기될 수 있는 신호를 검출하도록 적응된 검출기를 포함한다.
일부 구현예는 비드의 적어도 제1 및 제2 하위집단을 포함하는 키트 또는 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 하위집단의 각각의 비드는 포획 프로브, 동일한 비드의 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하위집단의 각각의 비드는 또한 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 하위집단의 인덱스는 비드의 특정 하위집단을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 하위집단의 인덱스는 제2 하위집단의 인덱스와 상이하다. 본 명세서에 제공된 키트 및 시스템의 일부 구현예에서, 제1 부피는 비드의 제1 하위집단을 포함하고, 제2 부피는 비드의 제2 하위집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 상이한 포획 프로브는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 바코드 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 바코드 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 인덱스 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 인덱스 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은 복수의 개별 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 비드의 제1 및 제2 하위집단의 조합이 기질의 표면 상에 비드 어레이를 형성하고, 어레이가 합성 주기에 의해 복수의 서열분석으로 서열분석될 수 있도록 조정된다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 50개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 500개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 5000개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 50000개의 포획 프로브를 포함한다.
일부 구현예는 비드의 적어도 10개의 상이한 하위집단을 포함하고, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 100개의 상이한 하위집단을 포함하고, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 1000개의 상이한 하위집단을 포함하며, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다. 일부 구현예는 비드의 적어도 10000개의 상이한 하위집단을 포함하며, 각각의 하위집단은 상이한 하위집단과 상이한 인덱스를 포함한다.
일부 구현예는 기질의 표면 상에 무작위로 분포된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 포함하는 키트를 포함하며, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 바코드의 프라이머 결합 부위 3'를 포함하고 포획 프로브에 연결되며, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 상이한 바코드를 포함하여 다른 포획 프로브에 연결된다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 비드를 통해 포획 프로브에 연결된다. 일부 구현예에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 평면이다. 일부 구현예에서, 기질은 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 비드는 웰에 분포된다. 일부 구현예에서, 유동 셀은 어레이를 포함한다.
일부 구현예는 비드의 제1 및 제2 하위집단을 포함하는 키트 및 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 포획 프로브를 포함한다. 표적 리간드의 예는 핵산, 단백질 또는 기타 항원을 포함한다. 포획 프로브의 예는 핵산, 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 동일한 비드의 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 비드는 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'를 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 하위집단의 인덱스는 제2 하위집단의 인덱스와 상이하다. 예를 들어, 비드의 제1 하위집단의 인덱스를 사용하여 비드의 제1 하위집단과 비드의 제2 하위집단을 구별할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단은 비드의 제2 하위집단과 별개이다. 예를 들어, 제1 부피는 비드의 제1 하위집단을 포함하고 제2 부피는 비드의 제2 하위집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 핵산을 포함하고, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 그의 보체에 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 포획 프로브는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 비드의 제1 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합하고; 비드의 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 상이한 포획 프로브는 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 비드의 제1 하위집단의 다른 포획 프로브 세트는 비드의 제1 하위집단의 다른 포획 프로브 세트와 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 바코드 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 바코드 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고/하거나, 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 인덱스 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 인덱스 프라이머를 포함한다.
일부 구현예에서, 기질은 복수의 개별 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 복수의 채널을 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 비드의 제1 및 제2 하위집단의 조합이 기질의 표면 상에 비드 어레이를 형성하고, 어레이가 합성 주기에 의해 복수의 서열분석으로 서열분석될 수 있도록 조정된다.
일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 서로 상이한 적어도 50, 100, 500, 1000, 또는 5000개의 포획 프로브, 또는 전술한 수 중 임의의 2개 사이의 임의의 수의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예는 또한 비드의 적어도 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000개의 상이한 하위집단을 포함하며, 각각의 하위집단은 다른 하위집단과 상이한 인덱스, 또는 전술한 수 중 임의의 2개 사이의 비드의 임의의 수의 상이한 하위집단을 포함한다.
일부 구현예는 제1 및 제2 비드의 하위집단을 포함하는 키트를 포함하며, 각각의 비드는 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 포획 프로브, 포획 프로브를 나타내는 바코드, 및 바코드의 바코드 프라이머 결합 부위 3'을 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 인덱스 및 인덱스의 인덱스 프라이머 결합 부위 3'을 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제1 하위집단의 인덱스는 제2 하위집단의 인덱스와 상이하고, 제1 부피는 비드의 제1 하위집단을 포함하고, 그리고 제2 부피는 비드의 제2 하위집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 핵산을 포함하고, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 상이한 포획 프로브는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 포획 프로브는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 포획 프로브는 각각 서로 상이한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단의 상이한 포획 프로브는 동일한 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 바코드 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 바코드 프라이머를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 비드의 제2 하위집단의 인덱스의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위의 뉴클레오타이드 서열은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예는 또한 인덱스 프라이머 부위에 혼성화할 수 있는 복수의 인덱스 프라이머를 포함한다. 일부 구현예에서, 플로우셀은 기질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기질은 비드의 제1 및 제2 하위집단의 조합이 기질의 표면 상에 비드 어레이를 형성하고, 어레이가 합성 주기에 의해 복수의 서열분석으로 서열분석될 수 있도록 조정된다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 서로 상이한 적어도 50개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드의 제1 및 제2 하위집단은 각각 서로 상이한 적어도 500개의 포획 프로브를 포함한다. 일부 구현예는 또한 비드의 적어도 10개의 상이한 하위 집단을 포함하며, 각각의 하위 집단은 다른 하위 집단과 상이한 인덱스를 포함한다.
본 명세서에 제공된 키트 및 시스템의 추가 구현예는 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 비드의 집단을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 인덱스, 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위, 포획 프로브, 바코드, 및 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하고, 여기서 인덱스는 비드에 집단 사이에 상이하다. 일부 구현예에서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일하다. 일부 구현예에서, 바코드는 포획 프로브의 핵산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 바코드는 비드의 집단에서 상이하다. 일부 구현예에서, 바코드 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일하다. 일부 구현예에서, 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 그의 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 자성이다.
일부 구현예는 또한 하기로부터 선택된 시약을 포함한다: 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드; 핵산 샘플을 태그부착하기 위한 트랜스포솜; 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 트랜스포솜; 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 어댑터; 인덱스 프라이머 결합 부위 또는 그것의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머; 및 바코드 프라이머 결합 부위 또는 그것의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머. 일부 구현예는 또한 플로우셀 표면의 어레이와 같은 어레이를 포함한다. 일부 구현예는 어레이의 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 시약으로부터의 신호를 검출하도록 구성된 검출기를 포함하고; 이러한 시약은 검출 가능한 표지를 포함하는 뉴클레오타이드와 같은 서열분석 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예는 뉴클레오타이드를 피로인산염와 같은 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키거나 수소 이온의 변화로부터 야기될 수 있는 신호를 검출하도록 적응된 검출기를 포함한다.
실시예
실시예 1 - 서열분석에 의한 어레이의 디코딩
복수의 폴리뉴클레오타이드는 합성되고, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 5' 내지 3': 스페이서, 고유 바코드, 프라이머 결합 부위 및 고유 포획 프로브를 포함한다. 바코드 및 포획 프로브의 서열이 알려져 있고; 프라이머 결합 부위의 서열은 각 폴리뉴클레오타이드에 대해 동일한다. 각 폴리뉴클레오타이드는 비드에 부착된다. 비드는 칩의 웰에 무작위로 분포된다. 비드 어레이는 프라이머 결합 부위에 프라이머를 혼성화하고, 프라이머를 확장하고, 바코드의 서열을 검출함으로써 디코딩된다. 바코드의 위치는 연관된 포획 프로브의 위치를 식별한다.
실시예 2 - 서열분석에 의한 어레이의 바코드 디코딩
인간 게놈 DNA로부터 제조된 핵산 라이브러리를 제조하였다. 비드의 하위집단을 제조하였다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 각 비드에 부착하였다. 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브, 바코드 프라이머 결합 부위, 및 포획 프로브를 나타내는 바코드를 포함하였다. 제2 폴리뉴클레오타이드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하였다.
18816개의 다른 코드/프로브 유형을 포함하는 비드 풀을 HiSeq 유동 셀에 로딩하였다(도 7a). 고정화 후, SBS 화학을 사용하여 20개의 뉴클레오타이드 길이의 코드를 서열분석하고 코드 서열을 비드 유형 목록에 정렬하여 각 비드의 동일성을 결정하였다. 도 7b는 특정 빈에서 특정 비드 유형에 대한 복제물의 수의 히스토그램이고, 서열분석 기반 해독 공정을 사용하여 예상 함량의 97.5%가 확인되고, 대다수의 비드 유형이 유전자형결정 연구에 충분한 수준으로 존재함을 나타내었다.
실시예 3 - FFN 검출을 사용한 HiSeq의 유전자형분석 성능
FFN 검출을 사용하여 HiSeq에 대한 유전자형분석 성능을 입증하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 표적 DNA를 프로브 올리고에 접합된 비드 현탁액에 혼성화시켰다. 비드를 HiSeq 유동 셀에 로딩하였다. 형광 뉴클레오타이드를 사용하여 표적 DNA에 결합된 프로브를 단일 염기로 확장하였다. 비드 로딩된 유동 셀은 유전자형분석 비드 강도를 얻기 위해 이미지화되었다. 형광 뉴클레오타이드를 절단하고 비드를 SBS 화학을 사용하여 디코딩하였다. 분석 성능을 측정하기 위해 디코딩 및 유전형 판독을 정렬하였다. 개별 포인트를 예상 유전자형에 따라 착색하였다. 도 7c는 C 강도 대 T 강도의 그래프이며, 여기서 각각의 포인트는 주어진 비드 유형에 대한 모든 복제물의 평균이고, 예상된 유전자형에 따라 착색되고, 형광 뉴클레오타이드를 사용한 단일 염기 프로브 연장이 정확한 유전자형분석을 가능하게 한다는 것을 나타내었다.
실시예 4 - 10,368-플렉스 비드 풀로 12개 샘플 다중화
이 예는, 단일 유동 셀에서 다중 샘플을 탈다중화하고, 특히 10,368-플렉스 비드 풀로 12개 샘플을 다중화하는 능력을 입증한다. 단일 비드 풀 12개의 다른 인덱스 서열에 별도로 혼성화하였다. 혼성화 후 샘플을 풀링하고 HiSeq 유동 셀에 로딩하였다. 그런 다음 두 개의 개별 판독이 수행되었는데, 하나는 혼성화된 인덱스를 기반으로 샘플을 식별하기 위한 것이고, 다른 하나는 디코딩 판독을 기반으로 비드 유형을 식별하기 위한 별도의 판독이었다. 도 8은 대표적인 샘플에 대한 특정 결합에서 특정 비드 유형의 수에 대한 히스토그램이며, 대부분의 비드 유형이 주어진 샘플에 대한 유전자형분석 실험에 충분한 수준으로 존재함을 보여주었다. 도 7의 표는 동시에 풀링되고 로딩된 12개의 인덱싱된 샘플에 걸친 디-멀티플렉싱 및 해독 비드의 일관성의 요약이며, 이는 샘플 표현이 균일하고 대부분의 프로브가 모든 샘플에 걸쳐 존재함을 입증한다.
실시예 5 - 대규모 병렬 SNP 유전자형분석
이것은 단일 서열분석 실행에서 384개 샘플의 유전자형에 대한 예시적인 작업흐름이다. 관심의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 포함하는 표적 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 384 웰 플레이트에서 준비된다. 각 웰은 다른 주제의 DNA를 함유한다. DNA는 DNA를 단편화하고 단편의 각 끝에 증폭 프라이머 결합 부위를 추가하는 트랜스포솜으로 태그부착된다. 단편은 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 프라이머로 증폭되어 증폭된 각 단편의 적어도 하나의 말단이 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 증폭 단편을 수득한다. 인덱스는 특정 웰에서 유래된 폴리뉴클레오타이드는 특정 인덱스로 식별될 수 있도록 웰마다 다르다. 제조된 폴리뉴클레오타이드는 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위 및 표적 핵산을 포함한다.
비드의 집단을 각 웰에 첨가한다. 비드의 집단은 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 바코드, 바코드 프라이머 결합 부위 및 포획 프로브를 포함한다. 포획 프로브는 길이가 50개 뉴클레오타이드이며 특정 표적 핵산에 대해 특이적이다. 바코드는 포획 프로브를 식별하는 데 사용할 수 있다. 비드에 집단은 다른 포획 프로브를 포함한다. 표적 핵산은 각 웰의 용액에서 포획 프로브와 혼성화하여 혼성화된 비드를 얻는다. 각 웰의 혼성화된 비드를 함께 풀링하고 유동 셀의 비드 어레이에 로딩한다. 혼성화된 비드는 어레이에 무작위로 분포된다.
어레이에서, 포획 프로브는 SNP를 식별하기 위해 단일 뉴클레오타이드로 확장된다. 인덱스는 표적 핵산의 공급원을 식별하기 위해 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 서열분석된다. 어레이 상의 비드 위치를 디코딩하기 위해 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장함으로써 바코드의 서열이 결정된다. 특정 SNP가 식별되고 특정 대상의 특정 DNA 샘플과 연관된다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "비롯한(including)", "함유하는(containing)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동의어이며, 포괄적이거나 제한이 없으며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
상기 설명은 본 발명의 여러 방법 및 물질을 개시한다. 본 발명은 제조 방법 및 장비에서의 변경뿐만 아니라 방법 및 물질에서의 변형에 민감하다. 이러한 변형은 본 명세서에 개시된 본 개시내용 또는 본 발명의 실시를 고려하여 당업자에게 명백해질 것이다. 결과적으로, 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 구현예로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 본 발명의 진정한 범위 및 취지 내에 있는 모든 변형 및 대안을 포함하는 것으로 의도된다.
공개 및 공개되지 않은 출원, 특허 및 문헌 참고문헌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되고, 본 명세서에 본 명세서의 일부로 만들어진다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 한, 본 명세서는 임의의 이러한 모순된 자료를 대체하고/하거나 우선하도록 의도된다.

Claims (116)

  1. 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법으로서, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서,
    비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
    비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단계;
    (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서,
    제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고,
    제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계;
    (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계;
    (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계;
    (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계; 및
    (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고; 그리고
    제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 또는 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플을 복수의 트랜스포솜으로 태그부착함으로써 수득되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 복수의 트랜스포솜은 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 태그부착된 핵산 샘플에 어댑터를 추가하는 단계를 추가로 포함하고, 어댑터는 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는 프라이머로 태그부착된 핵산 샘플을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 제1 및 제2 인덱스 및 제1 및 제2 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 확장된 포획 프로브에 통합하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    비드의 제1 집단은 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고,
    비드의 제2 집단은 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인덱스는 제1 표적 핵산의 공급원을 나타내고, 제2 인덱스는 제2 표적 핵산의 공급원을 나타내는, 방법.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인덱스는 서로 동일하고, 제2 인덱스는 서로 동일한, 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인덱스 결합 프라이머 부위는 동일한, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 핵산은 상이한 핵산 샘플로부터 수득되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 핵산은 게놈 DNA로부터 수득되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 바코드는 제1 또는 제2 포획 프로브의 핵산 서열을 나타내는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바코드는 서로 상이하고, 상기 제2 바코드는 서로 상이한, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 바코드를 서열분석하는 단계는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 중합효소 확장을 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 단일 뉴클레오타이드를 포획 프로브에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 확장된 포획 프로브에 결찰시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 용액 내에서 수행되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이는 플로우셀의 표면 상에 위치되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제1 및 제2 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함하는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 제1 및 제2 비드가 자성인, 방법.
  30. 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법으로서, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서,
    비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
    비드의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 단계;
    (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서,
    제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산, 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고,
    제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 제2 프라이머 결합 부위를 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계;
    (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계;
    (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계;
    (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계;
    (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계; 및
    (g) 제1 및 제2 인덱스를 서열분석함으로써 제1 및 제2 표적 핵산의 핵산 서열 데이터에 대한 공급원을 결정하는 단계.
  31. 제30항에 있어서,
    제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 인덱스, 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하고; 그리고
    제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산, 제2 인덱스, 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제1 또는 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 핵산 샘플을 복수의 트랜스포솜으로 태그부착함으로써 수득되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 복수의 트랜스포솜은 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 태그부착된 핵산 샘플에 어댑터를 추가하는 단계를 추가로 포함하고, 어댑터는 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 제1 또는 제2 인덱스를 포함하는 프라이머로 태그부착된 핵산 샘플을 증폭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 제1 및 제2 인덱스 및 제1 및 제2 인덱스 프라이머 결합 부위에 상보적인 서열을 확장된 포획 프로브에 통합하는, 방법.
  37. 어레이 상의 표적 핵산을 서열분석하는 방법으로서, 하기의 단계들을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서,
    비드의 제1 집단은 제1 포획 프로브, 제1 바코드, 및 제1 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제1 인덱스 및 제1 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고,
    비드 의 제2 집단은 제2 포획 프로브, 제2 바코드, 및 제2 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위, 및 제2 인덱스 및 제2 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고;
    (b) 제1 및 제2 복수의 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서,
    제1 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제1 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제1 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있고,
    제2 복수의 폴리뉴클레오타이드는 제2 표적 핵산을 포함하고, 복수의 제2 폴리뉴클레오타이드는 용액 내에 있는 단계;
    (c) 제1 표적 핵산을 제1 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제1 비드를 수득하고, 제2 표적 핵산을 제2 포획 프로브에 혼성화하여 혼성화된 제2 비드를 수득하는 단계;
    (d) 혼성화된 제1 비드 및 혼성화된 제2 비드를 어레이 상에 무작위로 분배하는 단계;
    (e) 제1 및 제2 바코드를 서열분석함으로써 어레이 상의 제1 및 제2 비드의 위치를 디코딩하는 단계; 및
    (f) 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하여 제1 및 제2 표적 핵산에 대한 핵산 서열 데이터를 수득하는 단계.
  38. 제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제1 인덱스를 포함하고; 제2 집단의 비드의 올리고뉴클레오타이드는 제2 인덱스를 포함하는, 방법.
  39. 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인덱스는 제1 표적 핵산의 공급원을 나타내고, 제2 인덱스는 제2 표적 핵산의 공급원을 나타내는, 방법.
  40. 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인덱스는 서로 동일하고, 상기 제2 인덱스는 서로 동일한, 방법.
  41. 제30항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제1 및 제2 인덱스를 서열분석하는 단계는 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 제30항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 인덱스 결합 프라이머 부위는 동일한, 방법.
  44. 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 핵산은 상이한 핵산 샘플로부터 수득되는, 방법.
  45. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 표적 핵산은 게놈 DNA로부터 수득되는, 방법.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 바코드는 제1 또는 제2 포획 프로브의 핵산 서열을 나타내는, 방법.
  47. 제30항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 바코드는 서로 상이하고, 상기 제2 바코드는 서로 상이한, 방법.
  48. 제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 바코드를 서열분석하는 단계는 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화된 프라이머를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  49. 제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 바코드 프라이머 결합 부위는 동일한, 방법.
  50. 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 중합효소 확장을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 단일 뉴클레오타이드를 포획 프로브에 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 확장된 포획 프로브에 결찰시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 포획 프로브를 확장하는 단계는 유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드를 포획 프로브에 결찰시키는 것을 포함하는, 방법.
  54. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 용액 내에서 수행되는, 방법.
  55. 제30항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우셀은 어레이를 포함하는, 방법.
  56. 제30항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이는 복수의 웰을 포함하는, 방법.
  57. 제30항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 비드는 어레이에 부착되도록 적합화된, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 제1 및 제2 비드는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함하는, 방법.
  59. 제57항에 있어서, 제1 및 제2 비드가 자성인, 방법.
  60. 키트로서, 비드에 부착된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 복수의 비드의 집단을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드는 인덱스, 인덱스에 인접한 인덱스 프라이머 결합 부위, 포획 프로브, 바코드, 및 바코드에 인접한 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하고, 인덱스는 비드에 집단 사이에 상이한, 키트.
  61. 제60항에 있어서, 인덱스 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일한, 키트.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 바코드는 포획 프로브의 핵산 서열을 나타내는, 키트.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 바코드는 비드의 집단에서 상이한, 키트.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 바코드 프라이머 결합 부위는 복수의 집단에서 동일한, 키트.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 하기로부터 선택된 시약을 추가로 포함하는, 키트:
    유전자좌 특이적 올리고뉴클레오타이드;
    핵산 샘플을 태그부착하기 위한 트랜스포솜;
    인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 트랜스포솜;
    인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 어댑터;
    인덱스 프라이머 결합 부위 또는 이의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머; 및
    바코드 프라이머 결합 부위 또는 이의 보체에 혼성화할 수 있는 프라이머.
  66. 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 플로우셀을 추가로 포함하는, 키트.
  67. 비드의 인덱싱된 집단을 제조하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 어댑터, 포획 프로브, 및 바코드 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계;
    (b) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계로서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 포함하는 단계; 및
    (c) 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 비드의 집단에 부착하여 비드의 인덱싱된 집단을 수득하는 단계.
  68. 제67항에 있어서, (c)는 중합효소 확장에 의해 어댑터를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터 결합 부위를 포함하고, 부착은 어댑터 결합 부위를 어댑터에 혼성화하는 것을 포함하는, 방법.
  70. 제67항에 있어서, (c)는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터에 결찰시키는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 부착은 스플린트 폴리뉴클레오타이드를 어댑터 및 인덱스 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 것을 포함하는, 방법.
  72. 제67항에 있어서, (c)는 화학적 반응성 모이어티를 통해 비드의 집단의 어댑터에 복수의 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 부착하는 것을 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 부착은 클릭 화학 반응을 포함하는, 방법.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 비드의 집단의 제1 폴리뉴클레오타이드는 서로 상이한 포획 프로브를 포함하는, 방법.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 인덱스 폴리뉴클레오타이드의 인덱스는 동일한, 방법.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함하는, 방법.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 비드의 인덱싱된 집단을 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 표적 핵산을 포함하는 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단을 비드의 추가 인덱싱된 집단과 혼합하는 단계를 추가로 포함하고, 비드의 추가 인덱싱된 집단은 복수의 핵산과 접촉된 비드의 인덱싱된 집단의 인덱스와 상이한 인덱스를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  79. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 프로브는 단백질을 포함하는, 방법.
  80. 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 셀 상에서 수행되는, 방법.
  81. 표적 리간드를 검출하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계;
    (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위, 및 바코드 프라이머 결합 부위에 결합할 수 있는 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계;
    (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계;
    (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제1 폴리뉴클레오타이드에 혼성화하는 단계;
    (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및
    (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계.
  82. 제81항에 있어서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분포시키는 것을 포함하는, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드로부터 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 탈혼성화하고; 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화하고; 그리고 바코드 프라이머를 확장하여 바코드의 서열을 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  85. 제81항 또는 제82항에 있어서, 인덱스 폴리뉴클레오타이드는 어댑터와 인덱스 사이에 위치한 절단 가능한 링커를 추가로 포함하고, (f)는 다음을 포함하는, 방법:
    (i) 절단 가능한 링커를 절단하는 단계; 및
    (ii) 어댑터를 확장하여 바코드의 서열을 결정하는 단계.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 프로브는 단백질을 포함하는, 방법.
  87. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함하는, 방법.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드의 첨가를 포함하는, 방법.
  91. 제81항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 셀 상에서 수행되는, 방법.
  92. 표적 리간드를 검출하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 포획 프로브, 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드, 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단계;
    (b) 인덱스, 인덱스 프라이머 결합 부위 및 어댑터를 포함하는 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계;
    (c) 표적 리간드를 포획 프로브에 특이적으로 결합시키는 단계;
    (d) 인덱스 폴리뉴클레오타이드를 어댑터를 통해 제2 폴리뉴클레오타이드에 부착하는 단계;
    (e) 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 단계; 및
    (f) 제1 폴리뉴클레오타이드의 인덱스 및 바코드를 결정하는 단계.
  93. 제92항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오타이드는 바코드, 및 바코드 프라이머 결합 부위를 포함하는, 방법.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, (d)는 반응성 모이어티를 제2 폴리뉴클레오타이드에 첨가하는 것을 포함하고, 어댑터가 반응성 모이어티에 부착될 수 있는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 반응성 모이어티의 첨가가 클릭 화학 반응을 포함하는, 방법.
  96. 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, (e)는 어레이 상에 비드의 집단을 분포시키는 것을 포함하는, 방법.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, (f)는 인덱스 프라이머를 인덱스 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고 인덱스의 서열을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  98. 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, (f)는 바코드 프라이머를 바코드 프라이머 결합 부위에 혼성화시키고, 그리고 바코드의 서열을 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  99. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 프로브는 단백질을 포함하는, 방법.
  100. 제92항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 리간드는 표적 핵산을 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 포획 프로브를 포함하는, 방법.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, (e)는 표적 핵산에 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 확장은 검출 가능한 디데옥시뉴클레오타이드의 첨가를 포함하는, 방법.
  104. 제92항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 유동 셀 상에서 수행되는, 방법.
  105. 어레이 상의 표적 리간드를 검출하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 비드의 제1 및 제2 집단을 수득하는 단계로서, 각각의 비드는 다음을 포함하는 단계:
    포획 프로브로서, 표적 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 포획 프로브,
    바코드 및 바코드 프라이머 결합 부위를 인코딩하는 핵산으로서, 바코드는 포획 프로브를 나타내는 핵산,
    인덱스 및 인덱스 프라이머 결합 부위를 코딩하는 핵산으로서, 인덱스는 제1 집단 또는 제2 집단으로부터의 비드의 공급원을 나타내는 핵산,
    (b) 비드의 제1 집단을 제1 표적 리간드를 포함하는 제1 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제1 표적 리간드는 제1 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여, 비드의 표적 결합된 제1 집단을 수득하는 단계;
    (C) 비드의 제2 집단을 제2 표적 리간드를 포함하는 제2 샘플과 접촉시키는 단계로서, 제2 표적 리간드는 제2 집단의 비드의 포획 프로브에 특이적으로 결합하여, 비드의 표적 결합된 제2 집단을 수득하는 단계;
    (d) 어레이 상에 비드의 표적 결합된 제1 집단 및 비드의 표적 결합된 제2 집단을 무작위로 분배하는 단계;
    (e) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 단계; 및
    (f) 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 인덱스 및 바코드의 서열을 결정하는 단계.
  106. 제105항에 있어서, 포획 프로브는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 표적 리간드는 핵산을 포함하는, 방법.
  108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이 상의 제1 표적 리간드 및 제2 표적 리간드를 포함하는 비드의 위치를 검출하는 단계는 중합효소 확장 또는 결찰에 의해 포획 프로브를 확장하는 것을 포함하는, 방법.
  109. 제105항에 있어서, 포획 프로브는 단백질을 포함하는, 방법.
  110. 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (f) 후에 수행되는, 방법.
  111. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함하고, 제2 집단의 비드의 바코드는 서로 상이한 바코드를 포함하는, 방법.
  112. 제105항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일하고, 제2 집단의 비드의 인덱스는 서로 동일한, 방법.
  113. 제105항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 어레이가 플로우셀의 표면 상에 위치되는, 방법.
  114. 제105항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 비드의 제1 및 제2 집단이 어레이에 부착되도록 적합화되는, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 비드의 제1 및 제2 집단은 바이오틴, 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체를 포함하고; 어레이는 바이오틴, 스트렙타비딘, 또는 이들의 유도체를 포함하는, 방법.
  116. 제114항에 있어서, 비드의 제1 및 제2 집단은 자성인, 방법.
KR1020217042257A 2019-09-20 2020-09-18 인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물 KR20220062231A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962903108P 2019-09-20 2019-09-20
US62/903,108 2019-09-20
US201962909014P 2019-10-01 2019-10-01
US62/909,014 2019-10-01
PCT/US2020/051646 WO2021055864A1 (en) 2019-09-20 2020-09-18 Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220062231A true KR20220062231A (ko) 2022-05-16

Family

ID=72802138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217042257A KR20220062231A (ko) 2019-09-20 2020-09-18 인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20210087613A1 (ko)
EP (1) EP4031682A1 (ko)
JP (1) JP2022549048A (ko)
KR (1) KR20220062231A (ko)
CN (1) CN114051535A (ko)
AU (1) AU2020351230A1 (ko)
BR (1) BR112021026562A2 (ko)
CA (1) CA3142535A1 (ko)
IL (1) IL288708A (ko)
MX (1) MX2021015885A (ko)
SG (1) SG11202113372WA (ko)
WO (1) WO2021055864A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117580959A (zh) * 2021-06-24 2024-02-20 因美纳有限公司 用于基于小珠的核酸的组合索引的方法和组合物
CN116536399A (zh) * 2023-07-07 2023-08-04 之江实验室 一种基于微珠测序的基因芯片编解码方法及基因芯片

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4971903A (en) 1988-03-25 1990-11-20 Edward Hyman Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids
US5552278A (en) 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
US5882521A (en) * 1996-04-18 1999-03-16 Waters Investment Ltd. Water-wettable chromatographic media for solid phase extraction
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
EP3034626A1 (en) 1997-04-01 2016-06-22 Illumina Cambridge Limited Method of nucleic acid sequencing
US6031098A (en) * 1997-08-11 2000-02-29 California Institute Of Technology Detection and treatment of duplex polynucleotide damage
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
AR031640A1 (es) * 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
WO2005003375A2 (en) 2003-01-29 2005-01-13 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US20050181394A1 (en) 2003-06-20 2005-08-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US9045796B2 (en) 2003-06-20 2015-06-02 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20090264299A1 (en) * 2006-02-24 2009-10-22 Complete Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on DNA arrays
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
US7323527B1 (en) * 2006-06-08 2008-01-29 Rohm And Haas Company Process for macroporous acrylic resins
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
EP3161160B1 (en) * 2014-06-26 2021-10-13 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
IL299976B1 (en) * 2014-10-17 2024-07-01 Illumina Cambridge Ltd Continuity-preserving transposition
WO2017075294A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017123647A1 (en) * 2016-01-15 2017-07-20 Quantapore, Inc. Optically-based nanopore analysis with reduced background
KR102650753B1 (ko) * 2016-10-01 2024-03-26 버클리 라잇츠, 인크. 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법
ES2927350T3 (es) 2016-10-19 2022-11-04 Illumina Inc Métodos para la ligadura química de ácidos nucleicos
CA3060369A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 Illumina, Inc. Optimal index sequences for multiplex massively parallel sequencing
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
IL281551B1 (en) 2018-10-25 2024-09-01 Illumina Inc Methods and preparations for identifying ligands in arrays using indices and barcodes

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022549048A (ja) 2022-11-24
SG11202113372WA (en) 2021-12-30
BR112021026562A2 (pt) 2022-11-29
MX2021015885A (es) 2022-03-22
AU2020351230A1 (en) 2022-01-20
CN114051535A (zh) 2022-02-15
US20210087613A1 (en) 2021-03-25
WO2021055864A1 (en) 2021-03-25
IL288708A (en) 2022-02-01
CA3142535A1 (en) 2021-03-25
EP4031682A1 (en) 2022-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7498254B2 (ja) 固形支持体でのサンプル調製
CN112840023B (zh) 使用索引和条形码识别阵列上的配体的方法和组合物
US20190024141A1 (en) Direct Capture, Amplification and Sequencing of Target DNA Using Immobilized Primers
US20220356514A1 (en) Systems and methods for detecting multiple analytes
US20210087613A1 (en) Methods and compositions for identifying ligands on arrays using indexes and barcodes
RU2825578C1 (ru) Способы и композиции для определения лигандов на матрицах с использованием индексов и штрихкодов
RU2816708C2 (ru) Способы и композиции для определения лигандов на матрицах с использованием индексов и штрихкодов
CA2473308C (en) Assay and kit for analyzing gene expression
CN117625764A (zh) 准确地平行检测和定量核酸的方法
CN117625763A (zh) 准确地平行定量变体核酸的高灵敏度方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination