ES2927350T3

ES2927350T3 - Métodos para la ligadura química de ácidos nucleicos

Info

Publication number: ES2927350T3
Application number: ES17797209T
Authority: ES
Inventors: Yin Nah Teo; xi-jun Chen; Tarun Khurana
Original assignee: Illumina Singapore Pte Ltd; Illumina Inc
Current assignee: Illumina Singapore Pte Ltd; Illumina Inc
Priority date: 2016-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: AU2017345562B2; WO2018075785A1; PL3529380T3; CA3038347A1; PT3529380T; WO2018075785A9; US20180127816A1; CN110100009A; EP3529380B1; AU2017345562A1; US20210381040A1; CN110100009B; EP3529380A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos, capturar ADN obtenido de un número limitado de células y escindir selectivamente ssDNA o dsDNA usando diversas reacciones químicas de ligación y clic descritas en este documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la ligadura química de ácidos nucleicos

CAMPO

Esta solicitud generalmente se refiere a la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos y la captura de ácidos nucleicos usando ligadura química.

ANTECEDENTES

La baja entrada de DNA de las aplicaciones de células individuales y las aplicaciones de DNA sin células plantea una gran demanda de la eficiencia de conversión para la preparación de bibliotecas para la secuenciación de DNA. La eficiencia de conversión está determinada en gran medida por la eficiencia de la ligadura enzimática de los adaptadores de secuenciación a la biblioteca de DNA de interés. La ligadura enzimática de ácidos nucleicos a menudo tiene una baja tasa de conversión debido a la baja eficiencia de la ligadura enzimática.

Se conocen una multitud de métodos de ligadura química, incluyendo el uso de varios productos químicos tales como el bromuro de cianógeno. Además, se han descrito reacciones nucleofílicas que implican fosforotioatos y yodoacetilo, bromoacetilo, tosilato y nucleósidos modificados con yodo. Más recientemente, la química clic que utiliza métodos basados en cicloadición 1,3-dipolar se ha utilizado en varios contextos.

Se conocen métodos de ligadura biocompatibles, incluyendo la reacción de ligadura entre 5' yodo y 3' fosforotioato para formar el enlace fosforotioato y la ligadura clic que incluye la reacción entre 3' azida y 5' alquino para formar un conector triazolilo. Se puede utilizar un enlace 3' alquinilo y 5' azido o un grupo 3' azido y 5' alquinilo para la ligadura clic. Se ha demostrado que el primero tiene una biocompatibilidad total, ya que fue copiado fielmente por las polimerasas en una reacción en cadena de la polimerasa. El último también puede ser copiado por polimerasas pero da como resultado 1 base omitida. La base que tiene la modificación 3' azido no es leída por la polimerasa.

Routh Andrew ET AL: "ClickSeq: Fragmentation-Free Next-Generation Sequencing via Click Ligation of Adaptors to Stochastically Terminated 3'-Acido cDNAs", JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 427, núm. 16, 14 August 2015, p. 2610-2616 se refiere a la ligadura clic de adaptadores a 3'-azido cDNA.

En la actualidad, la secuenciación de ácidos nucleicos a partir de tamaños de muestra pequeños y la creación de bibliotecas de ácidos nucleicos adolece de una eficiencia de ligadura enzimática de baja eficiencia que da como resultado lagunas en los resultados de secuenciación resultantes. Además, la captura de ácidos nucleicos de muestras pequeñas en sí misma puede sufrir bajas eficiencias asociadas con la ligadura enzimática.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un método eficaz para ligar ácidos nucleicos entre sí para aumentar el rendimiento y la precisión de la secuenciación. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

BREVE RESUMEN

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En la presente memoria se proporciona, entre otros, métodos útiles para preparar bibliotecas de ácidos nucleicos y capturar ácidos nucleicos de una muestra. Los métodos descritos en la presente memoria, pueden mejorar la eficiencia en la preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra dada, incluyendo, por ejemplo, muestras con cantidades muy pequeñas de ácido nucleico contenidas en la muestra. Por ejemplo, las bajas tasas de conversión debidas a la baja eficiencia de ligadura enzimática usando técnicas estándar pueden incrementarse usando los métodos de ligadura química descritos en la presente memoria.

Se describe un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra que comprende:

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en donde el ddNTP modificado en 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción de ligadura química, en donde el ddNTP modificado en 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción de ligadura química con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora a cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en donde el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados;

(ii) poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados a un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura que tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, y (2) una pluralidad de cebadores universales;

(iii) extender la pluralidad de cebadores de captura para producir una pluralidad de ácidos nucleicos diana inmovilizados complementarios a los ácidos nucleicos ligados;

(iv) hibridar la pluralidad de cebadores universales a los ácidos nucleicos diana inmovilizados; y

(v) amplificar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la pluralidad de ácidos nucleicos diana inmovilizados.

Se describe un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra que comprende;

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en 3', con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores unidos a un soporte, cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en 3', con una pluralidad de anclajes moleculares, comprendiendo cada una de la pluralidad de anclajes moleculares un resto funcional capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional de la anclaje molecular, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos celulares ligados; y

(ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos celulares ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

También se describe un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra, comprendiendo el método:

(i) unir la pluralidad de ácidos nucleicos celulares a un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende:

(A) una pluralidad de cebadores de captura, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores; y

(B) una pluralidad de cebadores universales en 3';

(ii) extender la pluralidad de cebadores de captura para producir una pluralidad de ácidos nucleicos celulares inmovilizados;

(iii) incorporar un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic en cada uno de los ácidos nucleicos celulares inmovilizados formando así una pluralidad de ácidos nucleicos celulares modificados en 3';

(iv) hacer reaccionar los ácidos nucleicos celulares modificados en 3' con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores que comprenden un ddNTP modificado en 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(v) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

En otro aspecto más se describe en la presente memoria un método para capturar DNA obtenido a partir de un número limitado de células para la preparación de bibliotecas de DNA que comprende:

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de fragmentos de DNA celular que comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic obtenida de una célula individual, en donde el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado; y

(ii) poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados a un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura que tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, capturando así el DNA obtenido a partir de una célula individual.

En otro aspecto se describe en la presente memoria un método para escindir selectivamente una cadena sencilla de una secuencia polinucleotídica de doble cadena, comprendiendo el método:

(i) preparar una cadena molde haciendo reaccionar un primer polinucleótido que comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en donde el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora al primer polinucleótido poniendo en contacto el primer polinucleótido con una polimerasa independiente del molde, con un segundo polinucleótido que comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, en el que la cadena molde comprende un primer sitio de restricción que comprende el enlace de cadena principal modificado;

(ii) extender el primer o segundo polinucleótido para producir un ácido nucleico de doble cadena, en el que la cadena complementaria del ácido nucleico de doble cadena comprende un segundo sitio de restricción complementario al primer sitio de restricción;

(iii) poner en contacto el ácido nucleico de doble cadena con una enzima de escisión de ácido nucleico;

(iv) escindir el ácido nucleico de doble cadena con la enzima de escisión de ácido nucleico, en el que la enzima de escisión de ácido nucleico reconoce el primer y el segundo sitio de restricción y escinde solo en el segundo sitio de restricción, formando una secuencia de cebador en 5' y una cadena en 3'.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la incorporación de TdT de 3' azido ddNTP a ssDNA y dsDNA con extremos romos o un saliente en A.

La Figura 2 muestra la incorporación de TdT de 3' alquinil ddNTP a ssDNA.

La Figura 3 muestra el producto final cliqueado producido por la reacción clic y TdT consecutivo (Carril 6). Las condiciones fueron como se muestra en el ejemplo descrito en la presente memoria.

La Figura 4 muestra el efecto de concentraciones variables de la enzima TdT y 3'-azido-dNTP sobre el rendimiento de la reacción de TdT y el rendimiento de la ligadura clic final.

La Figura 5 muestra el efecto de la duración de la incubación de TdT.

La Figura 6 muestra la ligadura clic y TdT consecutivo con 3'-azido-ddGTP (1,55 pM del molde).

La Figura 7 muestra la ligadura clic asistida por TdT con 3'-azido-ddGTP (18,8 pM).

La Figura 8 muestra que la reacción clic realizada a temperaturas por debajo del punto de congelación dio un rendimiento mucho mayor en comparación con las reacciones realizadas a temperatura ambiente o 70°C. Condiciones de reacción: sulfato de cobre (II) (400 eqv.), ascorbato de sodio (4000 eqv.), PMDETA (20980 eqv.) y molde de DNA (0,9 pM).

La Figura 9 muestra un enlace de triazol formado tras la ligadura clic que se presta como un molde para las ligasas de DNA. La Figura 9A muestra el esquema general. La Figura 9B muestra la eficiencia de la ligadura en diversas condiciones demostrando la biocompatibilidad del producto de ligadura. (Rendimiento porcentual usando ligasa T4 = 89,1%). (Rendimiento porcentual usando ligasa de E. coli = 49,9%).

La Figura 10 muestra una ligadura clic para la captura directa de RNA y la ligadura del adaptador de secuenciación. La Figura 11 muestra el uso de la ligadura clic para la captura directa de bibliotecas.

La figura 12 muestra el enlace triazol de la química clic que puede extenderse mediante el fragmento de Pol Klenow de DNA.

La Figura 13 muestra un esquema de un método de ejemplo para preparar una biblioteca usando los métodos descritos en la presente memoria usando 3'-azido y 5'-alquino.

La Figura 14 muestra un esquema de un método de ejemplo para preparar una biblioteca usando los métodos descritos en la presente memoria usando 3'-alquino y 5'-azido.

Las Figuras 15A-15B muestran la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC) de un polinucleótido natural y un adaptador con y sin férula donde la Figura 15A muestra el esquema de reacción general y la Figura 15B muestra un análisis TBU PAGE de la ligadura.

Las Figuras 16A-16D muestran la CuAAC de dos polinucleótidos con ligadura y extensión usando varias ligasas y el fragmento de Klenow. La Figura 16A muestra el esquema general de ligadura y extensión. La Figura 16B muestra el análisis de ligadura TBU PAGE. La Figura 16C muestra la eficacia de la ligadura usando ligasa T4 (89,7 % de rendimiento). La Figura 16D muestra la eficacia de la ligadura usando ligasa de E. coli (41,2% de rendimiento). Las Figuras 17A-17B muestran la eficacia de la química clic utilizando un grupo 3'-azido para la entrada del polinucleótido (Figura 17A) y un grupo 3'-alquinilo para el fragmento de polinucleótido (Figura 17B). El 3'-alquino proporcionó un mayor rendimiento (86 % en comparación con el 36 %) en la etapa de química clic; un mayor rendimiento en la etapa de ligadura (72 % en comparación con el 12 %) y un mayor rendimiento general (62 % en comparación con el 4 %).

La Figura 18 muestra la presencia del producto ligado mediante química clic utilizando análisis de gel cuando se realiza la reacción clic con una muestra de DNA de entrada de 3'-alquinilo.

La Figura 19 muestra la prueba de diversas condiciones para la ligadura con DNA de entrada que contiene un 3'-alquinilo.

La Figura 20 muestra la eficacia de la ligadura a varios tiempos y temperaturas para realizar la reacción química clic con un resto 3-azido ddTTP en el DNA de entrada. En la reacción se usaron ligandos THPTA y PMDETA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Esta divulgación está dirigida a métodos para sintetizar bibliotecas de polinucleótidos y capturar ácidos nucleicos utilizando técnicas de ligadura química. La síntesis de bibliotecas a partir de una muestra que comprende ácidos nucleicos celulares puede ser útil en una variedad de aplicaciones en las que es deseable determinar la secuencia de ácido nucleico de un polinucleótido en la muestra. En ciertos casos, las muestras pueden comprender cantidades muy pequeñas o actualmente indetectables de polinucleótidos. Los métodos descritos en la presente memoria pueden ser útiles para capturar y secuenciar secuencias de ácidos nucleicos de una muestra de ácidos nucleicos celulares.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Cualquier método, dispositivo y material descrito en la presente memoria puede usarse en la práctica de las composiciones y métodos descritos en la presente memoria. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos que se usan con frecuencia en la presente memoria y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.

Los encabezados utilizados en esta solicitud son solo para fines de referencia y no limitan de ninguna manera la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "soporte sólido" u otros equivalentes gramaticales se refiere a cualquier material que contenga y/o pueda modificarse para contener uno o más sitios (por ejemplo, sitios individuales discretos, sitios predefinidos, sitios aleatorios, etc.) apropiados para la unión o asociación de composiciones (por ejemplo, una molécula o resto orgánico) descritos en la presente memoria. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluyendo acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, teflón, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, resinas, sílice o materiales a base de sílice, incluyendo el silicio y el silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, haces de fibras ópticas, nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas inorgánicas (NPs) de óxido de cerio (CeO²), óxido de hierro (Fe³O⁴) y óxido de titanio (TO ²); o nanopartículas orgánicas y bioorgánicas de lípidos, nanocajas, dendrímeros, nanopartículas supermoleculares, nanopartículas de autoensamblaje), y una variedad de otros polímeros. En realizaciones particulares, los soportes sólidos permiten la detección óptica y por sí mismos no emiten una fluorescencia apreciable. Los polinucleótidos y ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, se pueden unir a la macromolécula directamente o mediante un conector. Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "conector" se refiere al fragmento o resto molecular que une el soporte sólido y un polinucleótido.

Un soporte sólido puede ser plano (planar), aunque como apreciarán los especialistas en la técnica, también se pueden usar otras configuraciones de soportes sólidos; por ejemplo, pueden usarse configuraciones tridimensionales, por ejemplo incrustando perlas en un bloque poroso de plástico que permite el acceso de la muestra a las perlas y usar un microscopio confocal para la detección. De manera similar, las perlas se pueden colocar en la superficie interior de un tubo, para el análisis de muestra de flujo continuo para minimizar el volumen de muestra. En algunos aspectos, los soportes sólidos incluyen haces de fibras ópticas y soportes sólidos planos tal como vidrio, poliestireno y otros plásticos y acrílicos. Una perla incluye una pequeña partícula discreta, cuya composición dependerá de la clase de sonda utilizada y el método de síntesis. Las composiciones de perlas adecuadas incluyen las utilizadas en la síntesis de péptidos, ácidos nucleicos y restos orgánicos, incluyendo, pero no limitado a, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, dióxido de torio sólido, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como Sefarose, celulosa, nailon, micelas reticuladas y teflón se pueden utilizar. Véase, por ejemplo, "Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers IN.

En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una o más superficies de una celda de flujo. El término "celda de flujo", como se usa en la presente memoria, se refiere a una cámara que comprende una superficie sólida a través de la cual pueden fluir uno o más reactivos fluidos. Los ejemplos de celdas de flujo y sistemas fluídicos relacionados y plataformas de detección que se pueden usar fácilmente en los métodos de la presente divulgación se describen, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456: 53-59 (2008), las Patentes WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, y US 2008/0108082, .

En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Esto se puede fabricar como se conoce generalmente en la técnica usando una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampado, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la materia, la técnica utilizada dependerá de la composición y la forma del sustrato de la matriz.

Un "anclaje molecular", como se usa en la presente memoria, se refiere a un resto unido covalentemente a un resto funcional capaz de participar en una reacción química clic o de ligadura química con un ácido nucleico. Una anclaje molecular puede ser un soporte sólido como se describe anteriormente. Una anclaje molecular puede ser una etiqueta (por ejemplo, un compuesto u otra molécula química, ácido nucleico, anticuerpo o péptido). Cuando el anclaje molecular es una etiqueta, la etiqueta se puede usar para inmovilizar el ácido nucleico al que se une, por ejemplo, un soporte sólido como se describe en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "inmovilizado" cuando se usa en referencia a un polinucleótido pretende significar unión directa o indirecta a un soporte sólido a través de enlace(s) covalente(s). En ciertas realizaciones de la invención se puede utilizar la unión covalente, pero lo único que se requiere es que los polinucleótidos permanezcan estacionarios o unidos a un soporte en las condiciones en las que se pretenda utilizar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieran amplificación y/o secuenciación de ácidos nucleicos. Los polinucleótidos a utilizar como cebadores de captura o cebadores de amplificación pueden inmovilizarse de modo que un extremo 3' esté disponible para la extensión y/o modificación enzimática y al menos una parte de la secuencia sea capaz de hibridar a una secuencia complementaria. La inmovilización puede ocurrir a través de la hibridación a un oligonucleótido unido a la superficie, en cuyo caso el oligonucleótido o polinucleótido inmovilizado puede estar en la orientación 3' -5'. Alternativamente, la inmovilización puede ocurrir usando los métodos descritos en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, se pretende que los términos "ácido nucleico" y "nucleótido" sean coherentes con su uso en la técnica e incluyan especies de origen natural o análogos funcionales de las mismas. Los análogos funcionales de ácidos nucleicos particularmente útiles son capaces de hibridarse a un ácido nucleico de una manera específica de secuencia o pueden usarse como un molde para la replicación de una secuencia de nucleótidos particular. Los ácidos nucleicos de origen natural generalmente tienen una cadena principal que contiene enlaces fosfodiéster. Una estructura análoga puede tener un enlace de cadena principal alternativo (por ejemplo, un enlace de cadena principal modificado) que incluye cualquiera de una variedad de los conocidos en la técnica. Un "enlace de cadena principal modificado" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier enlace(s) entre bases adyacentes en un polinucleótido que no sea un enlace fosfodiéster. Los ejemplos de enlaces de cadena principal modificados incluyen, pero no se limitan a: triazolilos; fosforotioamidatos; fosforamidatos; y fosforotioatos.

Los ácidos nucleicos de origen natural ("Ácidos nucleicos celulares") generalmente tienen un azúcar desoxirribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido desoxirribonucleico (DNA)) o un azúcar ribosa (por ejemplo, que se encuentra en el ácido ribonucleico (RNA)). Un ácido nucleico puede contener nucleótidos que tengan cualquiera de una variedad de análogos de estos restos de azúcar que se conocen en la técnica. Un ácido nucleico puede incluir nucleótidos nativos o no nativos. En este sentido, un ácido desoxirribonucleico nativo puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, citosina o guanina y un ácido ribonucleico puede tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en uracilo, adenina, citosina o guanina. Las bases no nativas útiles que se pueden incluir en un ácido nucleico o nucleótido se conocen en la técnica. Un "dideoxinucleótido" o "ddNTP" se refiere a un nucleótido que no tiene un grupo hidroxilo en 3'. Los ddNTPs pueden tener una o más bases seleccionadas del grupo que consiste en adenina, timina, uracilo, citosina o guanina.

Como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" pretende significar un ácido ribonucleico o desoxirribonucleico o un análogo del mismo, incluyendo un analito de polinucleótido presentado en cualquier contexto; por ejemplo, una sonda, diana o cebador. Las formas particulares de polinucleótidos de la invención incluyen todos los tipos de ácidos nucleicos que se encuentran en un organismo, así como ácidos nucleicos sintéticos tales como polinucleótidos producidos por síntesis química. Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos que son aplicables para el análisis a través de la incorporación en micromatrices producidas por métodos de la invención incluyen DNA genómico (gDNA), RNA mensajero copiado de DNA (cDNA), RNA mensajero copiado de RNA (cRNA), DNA mitocondrial o genoma, RNA, RNA mensajero (mRNA) y/u otras poblaciones de RNA. Ejemplos adicionales de polinucleótidos incluyen DNA de doble cadena (dsDNA), d Na de cadena sencilla (ssDNA), un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, etiqueta de secuencia expresada (EST) o etiqueta de análisis en serie de expresión génica (SAGE)), DNA genómico, exón, intrón, RNA de transferencia (tRNA), RNA ribosomal (rRNA), ribozima, polinucleótido recombinante, polinucleótido sintético, polinucleótido ramificado, plásmido, vector, DNA aislado de cualquier secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia o copia amplificada de cualquiera de los anteriores. Fragmentos y/o porciones de los ejemplos de ácidos nucleicos anteriores también se incluyen dentro del significado del término como se usa en la presente memoria a menos que se describa de otra manera.

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en la presente memoria. Los diferentes términos no pretenden indicar ninguna diferencia particular en tamaño, secuencia u otra propiedad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Como se usa en la presente memoria, el término "doble cadena", cuando se usa en referencia a un polinucleótido, significa que algunos o todos los nucleótidos entre las cadenas complementarias de un polinucleótido están unidos por hidrógeno para formar una doble hélice parcial o completa. Un polinucleótido parcialmente de doble cadena puede tener al menos el 10 %, 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de sus nucleótidos unidos por hidrógeno a un nucleótido complementario.

Un polinucleótido de cadena sencilla se refiere a un polinucleótido que tiene pocos o ningún enlace de hidrógeno con otro polinucleótido, de modo que no se forma una doble hélice o es inestable en un conjunto dado de condiciones de hibridación.

El término "modificado" y similares, como se usa en la presente memoria, se refiere a un nucleótido o polinucleótido que se ha alterado químicamente de modo que incluye una base que comprende un resto funcional capaz de participar en una reacción química clic. Un resto modificado en 3' como se describe en la presente memoria se refiere a la modificación en el extremo 3' de un nucleótido o polinucleótido. Un resto modificado en 5' como se describe en la presente memoria se refiere a la modificación en el extremo 5' de un nucleótido o polinucleótido.

Un "ácido nucleico ligado", como se usa en la presente memoria, se refiere a dos o más ácidos nucleicos unidos covalentemente usando una reacción química clic descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, un ácido nucleico ligado incluye un enlace de cadena principal modificado como se describe en la presente memoria. Un "ácido nucleico celular ligado" como se usa en la presente memoria se refiere a un ácido nucleico unido covalentemente a otro resto distinto de un nucleótido usando una reacción química clic descrita en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el término "biblioteca", cuando se usa en referencia a ácidos nucleicos, pretende significar una colección de ácidos nucleicos que tienen diferentes composiciones químicas (por ejemplo, diferente secuencia, diferente longitud, etc.). Típicamente, los ácidos nucleicos en una biblioteca serán especies diferentes que tienen un rasgo o característica común de un género o clase, pero que difieren de alguna manera. Por ejemplo, una biblioteca puede incluir especies de ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de nucleótidos, pero que son similares con respecto a tener un esqueleto de azúcar-fosfato. Se puede crear una biblioteca utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos ejemplificados en la presente memoria pueden incluir ácidos nucleicos obtenidos de cualquier fuente, incluyendo, por ejemplo, la digestión de un genoma (por ejemplo, un genoma humano) o una mezcla de genomas. En otro ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser los obtenidos a partir de estudios metagenómicos de un entorno o ecosistema particular. El término también incluye bibliotecas de ácidos nucleicos creadas artificialmente, tal como bibliotecas de DNA. En ciertos casos, tales bibliotecas creadas artificialmente pueden ser útiles para codificar información utilizando DNA, como lo ejemplifica Church et al. Science 28 September 2012: vol. 337 no. 6102 pp. 1628. También puede ser útil una biblioteca de otros analitos diana que tengan propiedades similares a las ejemplificadas para los ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente memoria, el término "cebador de captura" pretende significar un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla para analizarse o someterse a una interrogación de ácido nucleico en las condiciones que se encuentran en una etapa de hibridación del cebador de, por ejemplo, una reacción de amplificación o secuenciación. El término también pretende significar un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla que se usa para analizar, interrogar o realizar una acción sobre otra entidad molecular.

Un cebador de captura puede incluir una o más regiones de captura. Una región de cebador de captura puede incluir, por ejemplo, una región de captura universal, un sitio de unión de cebador de secuenciación (SpBS), una región de captura específica de la diana, un sitio de escisión predeterminado, tal como un sitio de restricción, y una región conectora, por ejemplo, una región conectora que separa dos o más regiones del cebador de captura. Algunos cebadores de captura pueden incluir, por ejemplo, una región de captura universal y un SpBS. Otros cebadores de captura pueden incluir una región de captura universal y una región de captura específica de la diana. Todavía otros cebadores de captura pueden incluir, por ejemplo, una región de captura universal, un SpBS y una región específica de la diana. Un cebador de captura puede bloquearse en el extremo 3' (bloqueado en 3') o no bloquearse en el extremo 3' (desbloqueado en 3'). Un cebador con un extremo 3' bloqueado puede, por ejemplo, desbloquearse en una reacción enzimática o química. Un cebador de captura también puede incluir un sitio de escisión predeterminado (no aleatorio). Los sitios de escisión predeterminados ejemplares se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos U.S. Patent No. 8,715,966, que se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad y para todos los propósitos. La escisión en sitios predeterminados puede ocurrir, por ejemplo, como escisión enzimática o no enzimática, tal como la escisión química usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en la presente memoria, los expertos en la técnica comprenderán que un cebador de captura puede contener cualquier número de regiones diferentes que sean útiles en una o más aplicaciones.

En comparación, el término "universal" cuando se usa en referencia a un cebador de captura u otra secuencia de oligonucleótidos pretende significar un cebador de captura u otro oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos común entre una pluralidad de cebadores de captura. Una secuencia común puede ser, por ejemplo, una secuencia complementaria a la misma secuencia del adaptador. Los cebadores de captura universales son aplicables para interrogar una pluralidad de polinucleótidos diferentes sin distinguir necesariamente las diferentes especies, mientras que los cebadores de captura específicos de la diana son aplicables para distinguir las diferentes especies.

Se pretende que "endonucleasa de restricción" sea consistente con su uso en la técnica y se refiere a una enzima que después de unirse a su secuencia de reconocimiento (por ejemplo, "sitio de restricción"), hidroliza ambas cadenas del polinucleótido dúplex.

Se pretende que "endonucleasa cortante" sea consistente con su uso en la técnica y se refiere a una enzima que después de unirse a su secuencia de reconocimiento hidroliza solo una de las cadenas del polinucleótido dúplex.

Una "polimerasa independiente del molde" se refiere a una enzima que cataliza la adición de uno o más nucleótidos en/sobre un polinucleótido sin una cadena plantilla. Una “nucleotidil transferasa específica de RNA”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una enzima que polimeriza ribonucleótidos en el extremo 3' de un polinucleótido de RNA. Una nucleotidil transferasa específica de DNA como se usa en la presente memoria se refiere a una enzima que polimeriza desoxinucleótidos en el extremo 3' de un polinucleótido de DNA.

Como se usa en la presente memoria, el término "cada uno", cuando se usa en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no necesariamente se refiere a cada artículo en la colección. Pueden ocurrir excepciones si la divulgación o el contexto explícito dictan claramente lo contrario.

Los términos "química clic" y "reacción química clic" se usan indistintamente en la presente memoria y se pretende que sean coherentes con su uso en la técnica. En general, las reacciones químicas clic son rápidas (por ejemplo, rápidas para completar la reacción), simples, fáciles de purificar y regioespecíficas. La química clic incluye reacciones tales como, pero no limitado a, la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC); cicloadición de azidaalquino promovida por tensión anular (SPAAC), también conocida como química clic sin cobre; cicloadición de alquinonitrona promovida por tensión anular (SPANC); hidrotiolación de alquinos; e hidrotiolación de alquenos. La química clic que usa Cu como catalizador a menudo incluye un ligando estabilizador de Cu que es lábil. Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, el ligando puede estabilizar/proteger el ion Cu de la oxidación de la especie reactiva Cu(I) a la especie Cu(II) y también puede actuar como un aceptor de protones reduciendo o eliminando el requisito de una base en la reacción.

La química clic entre polinucleótidos puede, en algunas realizaciones, ser asistida mediante el uso de un resto que acerque a los dos compañeros de reacción lo suficientemente cerca para reaccionar. En algunas realizaciones de la presente memoria, los polinucleótidos ligados descritos en la presente memoria pueden sintetizarse usando los métodos de la presente memoria en presencia de una férula. Una "férula" se refiere a un polinucleótido de longitud corta que tiene una secuencia complementaria a la región donde se producirá la reacción química clic entre los dos polinucleótidos que reaccionan. En algunas realizaciones, la férula tiene un tamaño de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se indique lo contrario, el término "añadir", "reaccionar", "tratar" o similar significa poner en contacto un reactivo, disolvente, catalizador, grupo reactivo o similar con otro reactivo, disolvente, catalizador, grupo reactivo o similar. Los reactivos, disolventes, catalizadores, grupos reactivos o similares pueden añadirse individualmente, simultáneamente o por separado y pueden añadirse en cualquier orden que logre el resultado deseado. Pueden añadirse en presencia o ausencia de un aparato de calefacción o refrigeración y, opcionalmente, pueden añadirse bajo una atmósfera inerte.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "alquilo" se refiere a un radical hidrocarburo saturado lineal o ramificado. El término "alquilo" también abarca tanto alquilo lineal como ramificado, a menos que se especifique lo contrario. En ciertas realizaciones, el alquilo es un radical hidrocarburo saturado lineal que tiene de 1 a 6 (C^1-6) o 1 a 3 (C^1-3) átomos de carbono, o un radical hidrocarburo saturado ramificado de 3 a 6 (C^3-6) átomos de carbón. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, propilo (incluyendo todas las formas isoméricas), n-propilo, isopropilo, butilo (incluyendo todas las formas isoméricas), nbutilo, isobutilo, t-butilo, pentilo (incluyendo todas las formas isoméricas) y hexilo (incluyendo todas las formas isoméricas). El alquilo puede estar sustituido o no sustituido con uno o más sustituyentes. Como se usa en la presente memoria, el alquilo puede ser un radical monovalente o un radical multivalente (por ejemplo, un alquileno) cuando se describe que está unido a más de un grupo o resto.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "alquenilo" se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado, que contiene uno o más, en una realización, de uno a cinco dobles enlaces carbono-carbono. El término "alquenilo" también abarca radicales que tienen configuraciones "cis" y "trans" , o alternativamente, configuraciones "E" y "Z", como apreciarán los expertos en la materia. Como se usa en la presente memoria, el término "alquenilo" abarca tanto alquenilo lineal como ramificado, a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo, alquenilo de C^2-6se refiere a un radical hidrocarburo insaturado lineal de 2 a 6 átomos de carbono o un radical hidrocarburo insaturado ramificado de 3 a 6 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, el alquenilo es un radical hidrocarburo lineal de 2 a 6 (C^2-6) o de 2 a 3 (C^2-3) átomos de carbono, o un radical hidrocarburo ramificado de 3 a 10 (C^3-10) o de 3 a 6 (C^3-6) átomos de carbón. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, etenilo, propen-1-ilo, propen-2-ilo, alilo, butenilo y 4-metilbutenilo. El alquenilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes. Como se usa en la presente memoria, el alquenilo puede ser un radical monovalente o un radical multivalente (por ejemplo, un alquenileno) cuando se describe que está unido a más de un grupo o resto.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "alquinilo" se refiere a un radical hidrocarbonado lineal o ramificado, que contiene uno o más, en una realización, de uno a cinco triples enlaces carbono-carbono. El término "alquinilo" también abarca tanto alquinilo lineal como ramificado, a menos que se especifique lo contrario. En ciertas realizaciones, el alquinilo es un radical hidrocarburo lineal de 2 a 6 (C^2-6) o de 2 a 3 (C^2-3) átomos de carbono, o un radical hidrocarburo ramificado de 3 a 10 (C^3-10) o de 3 a 6 (C^3-6) átomos de carbón. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, pero no se limitan a, etinilo (-C=CH) y propargilo (-CH²CECH). Por ejemplo, alquinilo de C^2-6se refiere a un radical hidrocarburo insaturado lineal de 2 a 6 átomos de carbono o un radical hidrocarburo insaturado ramificado de 3 a 6 átomos de carbono. El alquinilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes. Como se usa en la presente memoria, el alquinilo puede ser un radical monovalente o un radical multivalente (por ejemplo, un alquinileno) cuando se describe que está unido a más de un grupo o resto.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "amino" se refiere a -N(R°)(R°), en el que cada R° puede ser independientemente, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. Cuando un grupo -N(R°)(R°) tiene dos R° distintos del hidrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo. En una realización, el anillo es un anillo de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. En una realización, uno o más átomos del anillo son heteroátomos seleccionados independientemente de O, S o N. Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "amino primario" se refiere a -NH². El término "amino" también incluye N-óxido -N⁺(R°)(R°)O\ En ciertas realizaciones, cada R° o el anillo formado por -N(R°)(R°) independientemente puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "amida" o "amido" se refiere a -C(O)N(R°)²o -NR°C(O)R°, en donde cada R° puede ser independientemente, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. Cuando un grupo -C(O)N(R°)²tiene dos R° distintos del hidrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo. En una realización, el anillo es un anillo de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. En una realización, uno o más átomos del anillo son heteroátomos seleccionados independientemente de O, S o N. En ciertas realizaciones, cada R° o el anillo formado por -N(R°)(R°) independientemente puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "azida" o "azido" se refiere a -N - N+eN.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "nitrona" se refiere a

en donde cada R° puede ser independientemente, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. En ciertas realizaciones, cada R° es hidrógeno.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "fosforotioamidato" y similares se refiere a

, en donde cada R° puede ser independientemente, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. En ciertas realizaciones, cada R° es hidrógeno.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "fosforoamidato" y similares se refiere a

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "fosforotioato" y similares se refiere a

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "sulfanilo", "sulfuro" o "tio" se refiere a -S-R^t, en donde R^tpuede ser, pero no se limita a, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. En ciertas realizaciones, R^tpuede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "sulfóxido" se refiere a -S(O)-R^t, en donde R^tpuede ser, pero no se limita a, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. En ciertas realizaciones, R^tpuede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "sulfonilo" o "sulfona" se refiere a -S(O)²-R^t, donde R^tpuede ser, pero no se limita a, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. En ciertas realizaciones, R^apuede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "sulfonamido" o "sulfonamida" se refiere a -S(=O)²-N(R°)²o -N(R°)-S(=O)²-R°, en el que cada R° puede ser independientemente, pero no se limita a, hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, cicloalquilo, heteroarilo, heterociclilo, cada uno de los cuales se define anteriormente. Cuando un grupo -S(=O)²-N(R°)²tiene dos R° distintos del hidrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo. En una realización, el anillo es un anillo de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. En una realización, uno o más átomos del anillo son heteroátomos seleccionados independientemente de O, S o N. En ciertas realizaciones, cada R° o el anillo formado por -N(R°)(R°) independientemente puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes.

Cuando se dice que los grupos descritos en la presente memoria están "sustituidos", pueden estar sustituidos con cualquier sustituyente o sustituyentes apropiados. Los ejemplos ilustrativos de sustituyentes incluyen, pero no se limitan a, los que se encuentran en los ejemplos de compuestos y realizaciones descritos en la presente memoria, así como halógeno (cloro, yodo, bromo o flúor); alquilo; alquenilo; alquinilo; hidroxilo; alcoxi; alcoxialquilo; amino; alquilamino; carboxi; nitro; ciano; tiol; tioéter; imina; imida; amidina; guanidina; enamina; aminocarbonilo; acilamino; fosfonato; fosfina; tiocarbonilo; sulfinilo; sulfona; sulfonamida; cetona; aldehído; éster; urea; uretano; oxima; hidroxilamina; alcoxiamina; ariloxiamina, aralcoxiamina; N-óxido; hidrazina; hidrazida; hidrazona; azida; isocianato; isotiocianato; cianato; tiocianato; oxo (=O); B(OH)², O(alquil)aminocarbonilo. Otros ejemplos ilustrativos incluyen cicloalquilo, que puede ser monocíclico o policíclico condensado o no condensado (por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo), o un heterociclilo, que puede ser monocíclico o policíclico condensado o no condensado (por ejemplo, pirrolidilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo o tiazinilo); arilo o heteroarilo monocíclico o policíclico condensado o no condensado (por ejemplo, fenilo, naftilo, pirrolilo, indolilo, furanilo, tiofenilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, piridinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, acridinilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, bencimidazolilo, benzotiofenilo o benzofuranilo) ariloxi ; aralquiloxi; heterocicliloxi; y heterociclil alcoxi.

Como se usa en la presente memoria, y a menos que se especifique lo contrario, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa un error aceptable para un valor particular determinado por un experto en la materia, que depende en parte de cómo se mide o determina el valor. En ciertas realizaciones, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de 1,2, 3 o 4 desviaciones estándar. En ciertas realizaciones, el término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro del 50 %, 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % , 1%, 0,5% o 0,05% de un valor o intervalo dado.

En un aspecto de la invención hay un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra, como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el método comprende: (i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados, y (ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

En otra realización, el método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra comprende (i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción de ligadura química, en la que el ddNTP modificado en 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción de ligadura química con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y (ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

En otra realización, el método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra comprende: (i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora a cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores unidos a un soporte, en la que cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados, y (ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

En determinadas realizaciones, el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde. En una realización, la polimerasa independiente del molde puede ser una nucleotidil transferasa específica de RNA. Las nucleotidiltransferasas específicas de RNA ejemplares útiles en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, poli(A) polimerasa polimerasas, enzimas de adición de CCA, uridililtransferasas terminales y poli(U) polimerasas. En otra realización, la polimerasa independiente del molde es una nucleotidil transferasa específica de DNA. Los ejemplos de nucleotidil transferasas específicas de DNA incluyen, pero no se limitan a, polimerasa lambda (pol A), polimerasa mu (pol p) y desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). En una realización, la polimerasa independiente del molde se selecciona del grupo que consiste en poli(A) polimerasa polimerasas, enzimas de adición de CCA, uridilil transferasas terminales, poli(U) polimerasas y desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). En una realización, la polimerasa independiente del molde es la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), la polimerasa poliA o la polimerasa de RNA de adición de CCA. En una realización particular, la polimerasa independiente del molde es TdT.

En determinadas realizaciones, la polimerasa independiente del molde es una polimerasa independiente del molde mutante (por ejemplo, una polimerasa independiente del molde que comprende uno o más cambios de aminoácidos de la secuencia nativa). Las polimerasas independientes del molde mutante pueden incluir cualquier número de mutaciones, como entienden los expertos en la materia, siempre que la polimerasa independiente del molde mutante conserve la función de la secuencia polipeptídica nativa. En una realización, la polimerasa independiente del molde mutante tenga menor actividad pero mejor estabilidad (por ejemplo, mayor estabilidad a temperaturas más altas o más bajas que la polimerasa independiente del molde nativa). En una realización, la polimerasa independiente del molde mutante tiene una actividad al menos equivalente a la polimerasa independiente del molde nativa. En otra realización más, la polimerasa independiente del molde mutante tiene mayor actividad que la polimerasa independiente del molde nativa. En otra realización más, la polimerasa independiente del molde mutante tiene una estabilidad equivalente o mejor y una actividad equivalente o mejor que la polimerasa independiente del molde nativa.

La polimerasa independiente del molde puede incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más (por ejemplo, en relación con el porcentaje del número total de secuencias o relacionadas a una determinada especie). En una realización, la polimerasa independiente del molde puede incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos el 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o más.

En determinadas realizaciones, la polimerasa independiente del molde está presente en una cantidad de al menos 0,05 pM, 0,1 pM, 0,2 pM, 0,3 pM, 0,4 pM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 5 pM, 7 pM, 10 pM, o más. En otras realizaciones, la polimerasa independiente del molde está presente en una cantidad de al menos 0,05 pM a al menos 50 pM, de 0,05 pM a al menos 40 pM, de 0,05 pM a al menos 30 pM, de 0,05 pM a al menos 25 pM, de 0,05 pM a al menos 20 pM, de 0,05 pM a al menos 10 pM, o de 0,05 pM a al menos 5 pM. En otras realizaciones, la polimerasa independiente del molde está presente en una cantidad de al menos 0,5 pM a al menos 50 pM, de 0,5 pM a al menos 40 pM, de 0,5 pM a al menos 30 pM, de 0,5 pM a al menos 25 pM, de 0,5 pM a al menos 20 pM, de 0,5 pM a al menos 10 pM, o de 0,5 pM a al menos 5 pM. En otras realizaciones, la polimerasa independiente del molde está presente en una cantidad de al menos 1 pM a al menos 50 pM, al menos 5 pM a al menos 50 pM, o al menos 10 pM a al menos 50 pM.

En una realización, el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora mediante la polimerasa independiente del molde en una reacción realizada a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C. En otra realización, el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora mediante la polimerasa independiente del molde en una reacción realizada a una temperatura de aproximadamente 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o 55°C. En otra realización, el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora mediante la polimerasa independiente del molde en una reacción realizada durante un tiempo de aproximadamente 15 min, 20 min, 30 min 60 min, 90 min, 120 min o más.

En una realización, la TdT puede incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más (por ejemplo, en relación al porcentaje del número total de secuencias o relacionado con una determinada especie). En una realización, TdT puede incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos 30 % a 90 %, 30 % a 95 % o 30 % a aproximadamente 100 %. En una realización, la TdT puede incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % o más (por ejemplo, en relación con el porcentaje del número total de secuencias o relacionado con una determinada especie). En otra realización, incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más ( por ejemplo, en relación con el porcentaje del número total de secuencias o relacionado con una especie determinada).

En determinadas realizaciones, la TdT está presente en una cantidad de al menos 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 5 pM, 7 pM, 10 pM o más. En otras realizaciones, la TdT está presente en una cantidad de al menos 0,5 pM a al menos 50 pM, 0,5 pM a al menos 40 pM, 0,5 pM a al menos 30 pM, 0,5 pM a al menos 25 pM, 0,5 pM a al menos 20 pM, 0,5 pM a al menos 10 pM o 0,5 pM a al menos 5 pM. En otras realizaciones, TdT está presente en una cantidad de al menos 1 pM a al menos 50 pM, al menos 5 pM a al menos 50 pM, o al menos 10 pM a al menos 50 pM.

El resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' se puede seleccionar del grupo que consiste en una azida, alquinilo, alquenilo, un tiol o una nitrona. En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede ser una azida o un alquinilo. En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede ser una azida. En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede ser un alquinilo.

El resto funcional en 5' del ddNTP modificado en el extremo 5' se puede seleccionar del grupo que consiste en una azida, alquinilo, alquenilo, un tiol o una nitrona. En una realización, el resto funcional en 5' del ddNTP modificado en el extremo 5' puede ser una azida o un alquinilo. En una realización, el resto funcional en 5' del ddNTP modificado en el extremo 5' puede ser una azida. En una realización, el resto funcional en 5' del ddNTP modificado en el extremo 5' puede ser un alquinilo.

En una realización, el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' se seleccionan de los siguientes pares:

(i) 3'-azido/5'-alquinilo;

(ii) 3'-alquinilo/5' azido;

(iii) 3'-tiol/5'-alquinilo;

(iv) 3'-tiol/5'-alquenilo;

(v) 3'-alquinilo/5'-tiol;

(vi) 3'-alquenilo/5'-tiol;

(vii) 3'-azido/5'-ciclooctinilo;

(viii) 3'-ciclooctino/5'-azido;

(ix) 3'-nitrona/5'-ciclooctinilo; o

(x) 3'-ciclooctinilo/5'-nitrona.

En una realización, el resto funcional en 3' comprende un azido en 3' y el resto funcional en 5' comprende un alquinilo en 5' (por ejemplo, el par (i)). En otra realización, el par es el par (ii). En una realización, el resto funcional en 5' es diferente y compatible con el resto funcional en 3'. En una realización, el resto funcional en 5' es diferente y compatible con el resto funcional en 3' y se selecciona del grupo que consiste en una azida, alquinilo, alquenilo, un tiol o una nitrona. En una realización, el resto funcional en 5' es diferente e incompatible con el resto funcional en 3', pero puede ser compatible con un segundo resto funcional en 3'.

En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede incorporarse mediante la polimerasa independiente del molde en menos de 10, 20, 30, 60, 120 min. En otra realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede incorporarse mediante la polimerasa independiente del molde en menos de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 o 12 horas. En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede incorporarse mediante la polimerasa independiente del molde en una tasa igual a la eficacia de incorporar el ddNTP natural correspondiente. En una realización, el resto funcional en 3' del ddNTP modificado en el extremo 3' puede incorporarse mediante la polimerasa independiente del molde en una tasa mayor que la eficiencia de incorporar el ddNTP natural correspondiente.

La química de clic utilizada en los métodos descritos incluye todos los tipos y variaciones conocidos de la realización de la química clic tal como la conocen y entienden los expertos en la técnica. Por ejemplo, la química clic útil en los métodos descritos en la presente memoria puede comprender la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC), formando un enlace de cadena principal modificado que comprende un triazolilo. Cuando se usa la CuAAC en los métodos descritos en la presente memoria, la reacción de CuAAC puede incluir además un ligando estabilizador de Cu(I). Los ligandos de CuAAC son bien conocidos en la técnica y emplean varios tipos de restos y heteroátomos.

En una realización, el ligando estabilizador de Cu(I) se selecciona del grupo que consiste en: 3-[4-({bis[(1-terc-butil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amino}metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il]propanol (BTTP); hidrogenosulfato de 3-[4-({bis[(1-tercbutil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amino}metil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il]propilo (BTTPS); hidrogenosulfato de 2-[4-({bis[(1-terc-butil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amino}metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il]etilo (BTTES); sal disódica de disulfonato de batofenantrolina (BTTAA); NE-((1R,2R)-2-azidociclopentiloxi)carbonil)-L-lisina (BPS); pentametildietilentriamina (PMDETA); tris(2-bencimidazolilmetil)amina ((BimH)3) tris-(benciltriazolilmetil)amina (TBTA); y tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA). En otra realización, el ligando estabilizador de Cu(I) puede ser TBTA, PMDETA o THPTA. En aún otra realización, el ligando estabilizador de Cu(I) puede ser TBTA o THPTA.

La reacción química clic puede comprender cicloadición de azida-alquino promovida por tensión anular (SPAAC) para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende un cicloocta-triazolilo. En una realización, la reacción de química clic comprende la hidrotiolación de alquinos para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende un sulfuro de alquenilo. En otra realización, la reacción química clic comprende la hidrotiolación de alquenos para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende un sulfuro de alquilo. En otra realización, la reacción química clic comprende la cicloadición de alquino-nitrona promovida por tensión anular (SPANC) para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende un octahidroocicloocta-isoxazolilo. El ciclooctinilo puede ser cualquier compuesto conocido en la técnica útil en dichos tipos de reacciones químicas clic. En una realización, el ciclooctinilo es dibencilciclooctino (DBCO) o un derivado del mismo. En una realización, el ciclooctinilo es DBCO. Varios derivados de ciclooctinilo son conocidos y útiles en la técnica. Por ejemplo, el derivado de DBCO puede incluir restos funcionales tales como ésteres, aminas, maleimidas, alcoholes, ácidos y conjugados (por ejemplo, biotina/avidina). En otros ejemplos, los derivados de DBCO pueden incluir conectores y moléculas informadoras. En ciertas realizaciones, SPAAC se puede usar para hacer las bibliotecas descritas en la presente memoria, en las que una enzima (por ejemplo, una polimerasa) puede leer la cadena principal modificada de los ácidos nucleicos ligados.

En una realización, la reacción química clic tiene un mayor rendimiento de ácidos nucleicos ligados que en comparación con los ácidos nucleicos ligados a enzimas. El rendimiento puede ser del 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 100 % o un porcentaje mayor cuando se usan los métodos descritos en la presente memoria en comparación con los ácidos nucleicos ligados a enzimas. El rendimiento puede ser 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 veces mayor cuando se utilizan los métodos descritos en la presente memoria en comparación con los ácidos nucleicos ligados a enzimas.

En una realización, la reacción química clic produce al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más ácidos nucleicos ligados. En una realización, la reacción química clic produce al menos 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 65 % o más ácidos nucleicos ligados. El porcentaje de ácidos nucleicos ligados puede ser una medida basada, por ejemplo, en la concentración o, por ejemplo, en lecturas satisfactorias de los polinucleótidos en el momento de la secuenciación.

Las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria pueden ser biocompatibles. En ciertas realizaciones, las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria, se pueden realizar a una temperatura predeterminada. Es decir, las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria, se pueden realizar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C; aproximadamente de 20°C a aproximadamente 65°C; aproximadamente de 20°C a aproximadamente 75°C; aproximadamente de 10°C a aproximadamente 60°C; aproximadamente, o aproximadamente de 10°C a aproximadamente 40°C.

Sorprendentemente, también se descubrió que las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria eran eficientes a bajas temperaturas, por ejemplo, temperaturas consideradas más bajas que las de la ligadura enzimática viable. En una realización, las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria se pueden realizar a una temperatura inferior a 0°C. En ciertas realizaciones, la reacción química clic se puede realizar a una temperatura de aproximadamente -4°C a aproximadamente -20°C.

El tiempo de la reacción química clic también puede aumentar la eficiencia de la formación de ácidos nucleicos ligados. Por ejemplo, tiempos más largos pueden en algunas realizaciones proporcionar tiempo suficiente para que se completen las reacciones, pero en otras realizaciones pueden disminuir el rendimiento como resultado de otros factores tales como la degradación del producto/reactivo. Las reacciones químicas clic descritas en la presente memoria, se pueden realizar en tiempos tan cortos como aproximadamente 10 minutos hasta tiempos mayores de aproximadamente 5, 10, 16 o 24 horas. En una realización, la reacción química clic se realiza durante 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h o más.

La eficiencia de la reacción química clic también puede depender de las concentraciones relativas y la cinética de los reactivos. Sin estar ligado a teorías particulares, mediante el andamiaje o "entablillado" de los polinucleótidos que comprenden independientemente el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5', se puede aumentar la eficacia de la reacción. En una realización, una reacción química clic útil en los métodos descritos en la presente memoria incluye una férula que comprende una secuencia de polinucleótidos complementaria al sitio de la química clic. La férula puede tener una longitud de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40 o 50 nucleótidos. En otra realización, la férula puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 50; de aproximadamente 5 a aproximadamente 30; de aproximadamente 5 a aproximadamente 25; de aproximadamente 5 a aproximadamente 20, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10; de aproximadamente 10 a aproximadamente 30; o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 nucleótidos de longitud.

En ciertas realizaciones, puede ser deseable tener un enlace de cadena principal modificado para el cual una polimerasa independiente del molde o dependiente del molde pueda leer. Se sabe en la técnica, por ejemplo, que los polinucleótidos enlazados con CuAAC que tienen un resto triazolilo para un enlace de cadena principal modificado tienen lectura permisible por polimerasas. En particular, cuando los métodos descritos en la presente memoria se usan para amplificar un ácido nucleico ligado que tiene un enlace de cadena principal modificado, puede ser particularmente ventajoso que una polimerasa sea capaz de leer a través del ácido nucleico ligado. En ciertas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos ligados puede amplificarse mediante una polimerasa.

En otra realización, los enlaces pueden ser útiles para inmovilizar los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria, donde puede no ser necesaria la amplificación. En ciertas realizaciones, donde no se necesita la amplificación, el método incluye una reacción química clic adicional para ligar dos o más polinucleótidos usando un enlace que no se puede amplificar o que de otro modo detiene la lectura a través de una polimerasa. En otra realización, los ácidos nucleicos pueden incluir restos funcionales en 3' y 5' ortogonales que pueden reaccionar en reacciones químicas clic separadas. Dichos restos pueden co-sintetizarse, por ejemplo, de modo que ambos restos estén presentes en el polinucleótido simultáneamente en el momento de una primera reacción química clic. Alternativamente, se puede realizar una primera reacción química clic, después de lo cual se puede añadir el resto ortogonal después de la reacción. En una realización, un grupo ortogonal, después de la química clic, produce un polinucleótido que tiene un enlace de cadena principal modificado que puede ser leído por una polimerasa y el segundo grupo ortogonal después de la química clic produce un polinucleótido que tiene un enlace de cadena principal modificado que puede ser sin lectura o con lectura completa para una polimerasa.

Cuando se realiza la amplificación de los ácidos nucleicos ligados, la polimerasa puede ser una polimerasa mutada. Dichas polimerasas son bien conocidas en la técnica e incluyen al menos una mutación de aminoácidos de la secuencia polipeptídica nativa. Las polimerasas mutadas pueden tener diversas propiedades con respecto a sus contrapartes nativas que incluyen, pero no se limitan a, mayor estabilidad, mayor procesividad, mayor afinidad de unión o cualquier combinación de las mismas.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos celulares usados en los métodos descritos en la presente memoria comprenden fragmentos de ácido nucleico. La fragmentación se puede realizar como entienden los expertos en la técnica. La fragmentación también puede ocurrir de manera natural (es decir, antes de la extracción de la muestra). En ciertos casos, es ventajoso fragmentar los ácidos nucleicos en la muestra antes de realizar una reacción química clic. En otros casos, los ácidos nucleicos celulares se fragmentan en el momento de la recogida o aislamiento de la muestra. Los ácidos nucleicos celulares y los fragmentos de ácidos nucleicos celulares descritos en la presente memoria, se pueden obtener a partir de una muestra obtenida de cualquier fuente (por ejemplo, bacteriana, vírica, de levadura o de mamífero). La muestra se puede tomar de un mamífero. En algunas realizaciones, la muestra se toma de un ser humano. El humano puede ser un paciente humano (por ejemplo, un humano diagnosticado con una enfermedad o afección particular). Los ácidos nucleicos celulares y los fragmentos de ácidos nucleicos celulares también se pueden obtener a partir de varias "fuentes" en la propia célula, como, por ejemplo, DNA genómico (gDNA), DNA mitocondrial o DNA plastómico. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos celulares y los fragmentos de ácidos nucleicos celulares se obtienen a partir de gDNA. En una realización, los ácidos nucleicos celulares se pueden obtener a partir de gDNA humano. En otra realización, los ácidos nucleicos celulares pueden obtenerse a partir de gDNA microbiano.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos celulares se unen a un soporte sólido antes de la incorporación del ddNTP modificado en el extremo 3'. En otra realización, los ácidos nucleicos celulares se unen a un soporte sólido antes de que se realice la reacción química clic. En un ejemplo, los métodos descritos en la presente memoria comprenden: (a) unir los ácidos nucleicos celulares a un soporte sólido antes de realizar las etapas (i) y (ii) de los métodos descritos en la presente memoria para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos.

En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria comprenden: (a) unir la pluralidad de ácidos nucleicos ligados a un soporte sólido en condiciones de hibridación donde el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores y (2) una pluralidad de cebadores universales en 3'. Los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir además la extensión de la pluralidad de cebadores de captura de la etapa (1) anterior para producir una pluralidad de ácidos nucleicos ligados inmovilizados. La pluralidad de cebadores universales en 3' se puede hibridar a los ácidos nucleicos ligados inmovilizados.

En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria comprenden (a) unir la pluralidad de ácidos nucleicos celulares a un soporte sólido en condiciones de hibridación donde el soporte sólido comprende (A) una pluralidad de cebadores de captura, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores y (B) una pluralidad de cebadores universales en 3'; (b) extender la pluralidad de cebadores de captura de la etapa (A) anterior para producir una pluralidad de ácidos nucleicos celulares inmovilizados; (c) incorporar un ddNTP modificado en el extremo 3' en los ácidos nucleicos celulares formando así una pluralidad de ácidos nucleicos celulares modificados en 3'; y (d) hacer reaccionar los ácidos nucleicos celulares modificados en 3' con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores que comprenden un ddNTP modificado en 5' como se describe en la presente memoria, formando una pluralidad de ácidos nucleicos ligados inmovilizados. En una realización, los ácidos nucleicos ligados inmovilizados se secuencian según las técnicas conocidas en la técnica, tal como por ejemplo, SBS.

En una realización, los ácidos nucleicos celulares de los métodos descritos en la presente memoria, comprenden un ddNTP modificado en el extremo 3' que sufre una reacción química clic con un resto unido a un soporte sólido. En dichas realizaciones, los ácidos nucleicos celulares inmovilizados sobre un soporte sólido pueden sufrir modificaciones adicionales utilizando los métodos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto, los métodos descritos en la presente memoria, son aplicables a la secuenciación de nanoporos tal como la descrita en en las Patentes U.S. Patent Publication No. 2015-0344945 y U.S. Patent Publication No. 2015 015245. En una realización, en la presente memoria se proporcionan métodos para unir un anclaje como se describe en la presente memoria a una barrera que comprende uno o más nanoporos. Se pretende que una "barrera" signifique una estructura que normalmente inhibe el paso de moléculas desde un lado de la barrera al otro lado de la barrera. Las moléculas para las que se inhibe el paso pueden incluir, por ejemplo, iones o moléculas solubles en agua tales como ácidos nucleicos, proteínas, nucleótidos y aminoácidos. Se puede disponer un poro (por ejemplo, un nanoporo o una pluralidad de nanoporos como se describe en la presente memoria) dentro de una barrera, y la abertura del poro puede permitir el paso de moléculas desde un lado de la barrera al otro lado de la barrera. Las barreras incluyen membranas de origen biológico y barreras no biológicas tales como membranas de estado sólido.

El anclaje puede comprender opcionalmente una secuencia de polinucleótidos. Los métodos pueden incluir la extensión de un anclaje al ponerlo en contacto con una polimerasa independiente del molde como se describe en la presente memoria, después de lo cual la polimerasa independiente del molde incorpora un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic en el anclaje. El resto funcional en 3' se puede hacer reaccionar con un resto funcional en 5' situado en la barrera que comprende uno o más nanoporos. En ciertas realizaciones, el resto funcional en 5' se une a un resto en el nanoporo o la barrera adyacente a un nanoporo. El resto puede ser una molécula que forma la propia barrera, por ejemplo, un lípido o colesterol en el caso de nanoporos biológicos, o el soporte sólido/polímero en el caso de nanoporos no biológicos. En una realización, el resto funcional en 3' se puede hacer reaccionar con una etiqueta que contiene colesterol para su uso en la translocación de un polinucleótido a través de un nanoporo como se describe en la presente memoria y se proporciona, por ejemplo, en la Publicación de Patente Americana U.S. Patent Publication No. 2015/015245, Publicación de Patente Internacional International Patent Publication No. WO2015/081211, y Solicitud de Patente Internacional International Patent Application No. PCT/US2014/067560.

En otro aspecto, los métodos descritos en la presente memoria pueden aplicarse a la secuenciación de nanoporos anclando o uniendo una pluralidad de ácidos nucleicos celulares a una barrera que comprende una pluralidad de nanoporos. En una realización, una muestra que comprende la pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, se hace reaccionar con una barrera que comprende una pluralidad de nanoporos, en donde la barrera o el nanoporo comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados. En una realización, la barrera o nanoporo comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' como se describe en la presente memoria. En una realización, la pluralidad de ácidos nucleicos ligados se amplifica preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

Como se usa en la presente memoria, el término "poro" pretende significar una estructura que incluye una abertura que permite que las moléculas crucen desde un primer lado del poro hasta un segundo lado del poro. Es decir, la abertura se extiende a través de los lados primero y segundo del poro. Las moléculas que pueden atravesar una abertura de un poro pueden incluir, por ejemplo, iones o moléculas solubles en agua tales como ácidos nucleicos, proteínas, nucleótidos y aminoácidos. El poro se puede disponer dentro de una barrera. Cuando al menos una parte de la abertura de un poro tiene un ancho de 100 nm o menos, por ejemplo, 10 nm o menos, o 2 nm o menos, el poro puede denominarse, aunque no necesariamente, como un "nanoporo". Opcionalmente, una parte de la abertura puede ser más estrecha que uno o ambos lados primero y segundo del poro, en cuyo caso esa parte de la abertura puede denominarse "constricción". Alternativa o adicionalmente, la abertura de un poro, o la constricción de un poro (si está presente), o ambas, pueden ser mayores de 0,1 nm, 0,5 nm, 1 nm, 10 nm o más. Un poro puede incluir múltiples constricciones, por ejemplo, al menos dos, o tres, o cuatro, o cinco o más de cinco constricciones.

Los nanoporos útiles en la invención descrita en la presente memoria incluyen un primer y segundo lados y una abertura que se extiende a través del primer y segundo lados. En una realización, el resto funcional en 3' reacciona con el primer lado (por ejemplo, "fuera" del nanoporo). En otra realización, el resto funcional en 3' se une al segundo lado (por ejemplo, "dentro" del nanoporo). El anclaje puede ser un anclaje permanente según lo dispuesto en la Publicación de Patente Americana U.S. Patent Publication No. 2015-0344945. Tal como se usa en la presente memoria, "anclaje" pretende significar un miembro alargado que tiene una región de cabeza, una región de cola y un cuerpo alargado entre ellas. Un anclaje puede incluir una molécula. Un anclaje puede estar, pero no necesariamente tiene que estar, en un estado alargado, por ejemplo, puede incluir una molécula alargada. Por ejemplo, un cuerpo alargado de un anclaje puede tener configuraciones secundarias o terciarias tales como horquillas, pliegues, configuraciones helicoidales o similares. Los anclajes pueden incluir polímeros tales como polinucleótidos o polímeros sintéticos. Los anclajes pueden tener longitudes (por ejemplo, medidas en un estado estirado o extendido al máximo) que oscilan, por ejemplo, desde aproximadamente 5 nm hasta aproximadamente 500 nm, por ejemplo, desde aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 100 nm. Los anclajes pueden tener anchos que varían, por ejemplo, desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 50 nm, por ejemplo, desde aproximadamente 2 nm hasta aproximadamente 20 nm. Los anclajes pueden ser lineales o ramificados. Se puede considerar que un anclaje es "permanente" cuando no se retira durante un método de detección.

Tal como se usa en la presente memoria, una "región de cabeza" de un anclaje pretende significar un grupo funcional del anclaje que está unido a otro miembro. En una realización, la región de la cabeza comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic como se describe en la presente memoria. En una realización, dicha unión se puede formar a través de la hibridación de un ddNTP modificado en el extremo 3' descrito en la presente memoria que comprende la región de cabeza a una molécula que comprende ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3'.

Como se usa en la presente memoria, una "región de cola" de un anclaje pretende significar una parte del anclaje que está dispuesta distalmente de la región de la cabeza. La región de la cola puede extenderse libremente alejándose de la región de cabeza, por ejemplo, puede estar separada de cualquier otro miembro. En una realización, la región de cola comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic como se describe en la presente memoria. En una realización, dicha unión se puede formar a través de la hibridación de un ddNTP modificado en el extremo 3' descrito en la presente memoria que comprende la región de cola con una molécula que comprende ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3'.

Como se usa en la presente memoria, un "cuerpo alargado" pretende significar una parte de un miembro, tal como un anclaje, que es suficientemente largo y estrecho para estar dispuesto dentro de al menos una parte de una abertura de un poro. Un cuerpo alargado puede estar formado por cualquier material adecuado de origen biológico u origen no biológico, o una combinación de los mismos. En un ejemplo, el cuerpo alargado incluye un polímero como se describe en la presente memoria.

En una realización, el ddNTP modificado en el extremo 3' es un componente de un anclaje permanente como se proporciona en la Publicación de Patente Americana U.S. Patent Publication No. 2015-0344945. En una realización, el anclaje que contiene el ddNTP modificado en el extremo 3' se une a uno de los lados del nanoporo a través de una región de cabeza. En una realización, el anclaje que contiene el ddNTP modificado en extremo 3' se une a uno de los lados del nanoporo a través de una región de cola. Los anclajes útiles en las invenciones descritas en la presente memoria, pueden incluir un cuerpo alargado dispuesto entre ellos como se proporciona en la Publicación de Patente Americana U.S. Patent Publication No. 2015-0344945. El anclaje puede incluir una o más características (por ejemplo, región(es) informadora(s)) que facilitan la detección de un suceso. En ciertas realizaciones, la detección del suceso es la detección de uno o más ácidos nucleicos y puede facilitar la secuenciación de un polinucleótido. En una realización, el suceso ocurre como resultado de la aplicación de corriente o flujo. En ciertas realizaciones, la detección del suceso depende del movimiento de la molécula informadora dentro del nanoporo como se describe en 12957-178 999.

En algunas realizaciones, el anclaje se ancla a una proteína. En una realización, el suceso se produce como resultado de un primer cambio conformacional de la proteína que puede mover la región de cabeza, y el movimiento de la región de cabeza puede mover traductivamente la región informadora. En algunas realizaciones, la proteína incluye una enzima. Por ejemplo, la enzima puede incluir una polimerasa. El primer cambio conformacional puede ocurrir en respuesta a la acción de la polimerasa sobre un primer nucleótido. En algunas realizaciones, el ddNTP modificado en el extremo 3' une la proteína a un nanoporo.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden usar en métodos de secuenciación de moléculas sencillas. Por ejemplo, en una realización, una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, puede unirse a una barrera que comprende una pluralidad de nanoporos para contener o guiar los ácidos nucleicos celulares durante la secuenciación mediante secuenciación de nanoporos.

En otras realizaciones, los métodos incluyen hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, con una pluralidad de polímeros cada uno de los cuales comprende un resto funcional en 5' capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados. En una realización, los ácidos nucleicos ligados se amplifican como se describe en la presente memoria. En una realización, el polímero es una molécula que forma una barrera que comprende una pluralidad de nanoporos como se describe en la presente memoria.

Los polímeros útiles en las invenciones descritas en la presente memoria pueden ser polímeros biológicos o sintéticos. Los ejemplos de polímeros biológicos incluyen polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos, análogos de polinucleótidos y análogos de polipéptidos. Los ejemplos de polinucleótidos y análogos de polinucleótidos incluyen DNA, DNA ^{enantiomérico,} RⁿA, ^{PNA (péptido-ácido nucleico), morfolinos y LNA (ácido nucleico bloqueado). Los polipéptidos}sintéticos ejemplares pueden incluir aminoácidos cargados así como residuos hidrófilos y neutros. Los ejemplos de polímeros sintéticos incluyen PEG (polietilenglicol), PPG (polipropilenglicol), PVA (alcohol polivinílico), PE (polietileno), LDPE (polietileno de baja densidad), HDPE (polietileno de alta densidad), polipropileno, PVC (cloruro de polivinilo), PS (poliestireno), NYLON (poliamidas alifáticas), TEFLON® (tetrafluoroetileno), poliuretanos termoplásticos, polialdehídos, poliolefinas, poli(óxidos de etileno), poli(ésteres de ácido w-alquenoico), poli(metacrilatos de alquilo) y otros conectores químicos y biológicos poliméricos tales como los descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Third edition, Academic Press, Londres (2013).

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos adaptadores se unen a un soporte sólido antes de la reacción. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es un nanoporo o una perla (por ejemplo, una perla polimérica). En otra realización, los ácidos nucleicos adaptadores se unen a un soporte sólido antes de que el didesoxinucleótido modificado en el extremo 5' (ddNTP) se incorpore a los ácidos nucleicos celulares.

En una realización, la pluralidad de ácidos nucleicos celulares se amplifica antes de incorporar un ddNTP modificado en el extremo 3'. La amplificación de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares antes de incorporar un ddNTP modificado en el extremo 3' se puede realizar utilizando técnicas conocidas y comprendidas en la técnica. En una realización, la pluralidad de ácidos nucleicos celulares no se amplifica antes de incorporar un ddNTP modificado en el extremo 3'.

La biblioteca de ácidos nucleicos ligados se puede secuenciar utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la secuenciación se puede realizar usando Secuenciación por Síntesis (SBS) como se conoce en la técnica.

En una realización, los métodos descritos en la presente memoria comprenden además poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados a un soporte sólido en condiciones de hibridación (por ejemplo, incubación durante 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 minutos o menos), en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores y (2) una pluralidad de cebadores universales en 3'. En una realización, después de la captura de los ácidos nucleicos adaptadores, la pluralidad de cebadores de captura se extiende para producir una pluralidad de ácidos nucleicos ligados inmovilizados. En aún otra realización, los métodos descritos en la presente memoria comprenden además hibridar la pluralidad de cebadores universales a los ácidos nucleicos ligados inmovilizados.

En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria, comprenden además poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados con un soporte sólido que comprende una pluralidad de cebadores universales en 3'. En una realización, después de la captura de los ácidos nucleicos adaptadores, la pluralidad de cebadores de captura se extiende para producir una pluralidad de ácidos nucleicos ligados inmovilizados. En aún otra realización, los métodos descritos en la presente memoria comprenden además hibridar la pluralidad de cebadores universales a los ácidos nucleicos ligados inmovilizados.

En otra realización, el método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra comprende: (i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en 3', con una pluralidad de anclajes moleculares, comprendiendo cada una de la pluralidad de anclajes moleculares un resto funcional capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional del anclaje molecular, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos celulares ligados; y (ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos celulares ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

En ciertas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares que comprenden 20 ng, 15 ng, 10 ng, 5 ng, 1 ng o menos de ácido nucleico de entrada.

Los métodos de preparación de una biblioteca de ácidos nucleicos descritos en la presente memoria pueden completarse en un tiempo de principio a fin que comprende 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o menos horas.

También se proporciona en la presente memoria un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra, comprendiendo el método; hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales comprende un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción de ligadura química, en la que el ddNTP modificado en 3' se incorpora a cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción de ligadura química con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados, preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra.

Todavía en otra realización de los métodos para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra cómo se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, hay un método que comprende:

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales comprende un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en la que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados;

(ii) poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados con un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura que tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, y (2) una pluralidad de cebadores universales;

(v) amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la pluralidad de ácidos nucleicos diana inmovilizados.

En otro aspecto de los métodos descritos en la presente memoria hay un método para capturar DNA obtenido de un número limitado de células para la preparación de bibliotecas de DNA. En una realización, el método comprende hacer reaccionar una pluralidad de fragmentos de DNA celular que comprenden un ddNTP modificado en el extremo 3' como se describe en la presente memoria que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic como se describe en la presente memoria, en el que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde proporcionada en la presente memoria, en donde la pluralidad de fragmentos de DNA celular se obtiene de una muestra obtenida de un número limitado de células, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3' como se proporciona en la presente memoria, en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado; y poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados con un soporte sólido como se describe en la presente memoria en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura que tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, capturando así DNA obtenido a partir una célula sencilla.

En otra realización, el método comprende hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de fragmentos de DNA celular que comprenden un ddNTP modificado en el extremo 3' como se describe en la presente memoria que comprende un resto funcional en 3' como se proporciona en la presente memoria capaz de participar en una reacción química clic obtenida a partir de una célula sencilla, en donde el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde como se proporciona anteriormente, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores como se describe en la presente memoria unidos a un soporte sólido como se describe en la presente memoria, en el que cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic como se describe en la presente memoria, con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado.

En otro aspecto de los métodos descritos en la presente memoria, hay un método para escindir selectivamente una cadena sencilla de una secuencia de polinucleótidos de doble cadena. En una realización, el método comprende: (i) preparar una cadena molde mediante la reacción de un primer polinucleótido que comprende un ddNTP modificado en el extremo 3' que comprende un resto funcional en 3' capaz de participar en una reacción química clic, en donde el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora al primer polinucleótido poniendo en contacto el primer polinucleótido con una polimerasa independiente del molde, con un segundo polinucleótido que comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto funcional en 5' compatible capaz de participar en una reacción química clic con el resto funcional en 3', en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan para formar un enlace de cadena principal modificado, en el que la cadena molde comprende un primer sitio de restricción que comprende el enlace de cadena principal modificado; (ii) extender el primer o segundo polinucleótido para producir un ácido nucleico de doble cadena, en el que la cadena complementaria del ácido nucleico de doble cadena comprende un segundo sitio de restricción complementario al primer sitio de restricción; (iii) poner en contacto el ácido nucleico de doble cadena con una enzima de escisión de ácido nucleico; y (iv) escindir el ácido nucleico de doble cadena con la enzima de escisión de ácido nucleico, en el que la enzima de escisión de ácido nucleico reconoce el primer y el segundo sitio de restricción y escinde solo en el segundo sitio de restricción, formando una secuencia de cebador en 5' y una cadena en 3'.

En una realización, el primer polinucleótido es parte de una pluralidad de polinucleótidos.

En una realización, el ácido nucleico de doble cadena se produce por extensión del segundo polinucleótido.

En una realización, la enzima que escinde el DNA es una endonucleasa de restricción (REasa) o una endonucleasa de corte (NEasa). En otra realización, la enzima que escinde el DNA es una endonucleasa de restricción (REasa). Las REasas son bien conocidas en la técnica. Las REasas útiles en los métodos descritos en la presente memoria incluyen REasas capaces de reconocer las secuencias de reconocimiento deseadas para escindir los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, la REasa puede ser una REasa de Tipo I, Tipo II, Tipo III o Tipo IV. Las REasas útiles en los métodos descritos en la presente memoria pueden limpiar el interior de su secuencia de reconocimiento o el exterior de su secuencia de reconocimiento, como se conoce en la técnica. Las NEasas útiles en los métodos descritos en la presente memoria incluyen NEasas capaces de reconocer las secuencias de reconocimiento deseadas para escindir los polinucleótidos descritos en la presente memoria. Las NEasas pueden hidrolizar una cadena sencilla de un polinucleótido de doble cadena dentro o fuera de la secuencia de reconocimiento de la NEasa.

En una realización particular de los métodos para escindir selectivamente una cadena sencilla de una secuencia de polinucleótidos de doble cadena descrita en la presente memoria, la polimerasa independiente del molde es TdT.

En una realización, de los métodos para escindir selectivamente una cadena sencilla de una secuencia de polinucleótidos de doble cadena descrita en la presente memoria, el método comprende además (v) la extensión desde la secuencia del cebador en 5', desplazando así la cadena en 3'.

En otra realización, las etapas (iii) a (v) del método de escisión selectiva de una cadena sencilla de una secuencia de polinucleótidos de doble cadena se repiten iterativamente durante al menos 5, 10, 15, 20, 25, 50 o más ciclos.

Se entiende que las modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta invención también se incluyen dentro de la definición de la divulgación proporcionada en la presente memoria. En consecuencia, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la presente invención.

Ejemplos:

Instalación de modificaciones de azido o alquinilo. El flujo de trabajo para los métodos descritos en la presente memoria se muestra en el Esquema 1. La etapa 1 implica la incorporación de un ddNTP modificado con 3'-azido. Tras la incorporación exitosa, la biblioteca de DNA se modificará con un grupo azido en 3'. Después, este se puede unir químicamente a un adaptador modificado con 5'-alquinilo en una reacción clic asistida por cobre.

Los trifosfatos de 3'-azido nucleótidos están disponibles comercialmente. Los trifosfatos de 3'-alquinil nucleótidos no están fácilmente disponibles comercialmente. Aquí, reportamos la síntesis de estos nuevos nucleótidos como se muestra en los Esquemas 2 y 3.

Esquema 2: Síntesis del 3'-alquinil ddTTP

Síntesis del trifosfato de 3'-alquín dT

M X

Partiendo de timidina, el 5-hidroxilo se protegió utilizando TBDMSCI en piridina/DMF, proporcionando un rendimiento del 57%. El grupo alquinilo se instaló usando bromuro de propargilo y NaH en THF proporcionando un rendimiento del 97% del intermedio alquinilo. Después de la desprotección del hidroxilo y la instalación del trifosfato, se obtuvo el producto final con un rendimiento porcentual total de 3-6%.

Esquema 3: Síntesis del 3 -alquinil ddATP

La síntesis de ddATP se realizó de manera consistente con el Esquema 2.

Incorporación de TdT de 3’ azidonucleótidos y 3’ alquinilnucleótidos. La TdT podría incorporar 3’ azido ddNTPs en DNA monocatenario y dsDNA con ambos extremos romos y con saliente en A como se muestra en la Figura 1. Además, los trifosfatos de 3’ alquinil nucleótidos sintetizados de novo en la presente memoria, también podrían incorporarse mediante TdT como se muestra en la Figura 2. Las eficacias de la incorporación de 3’ alquinil nucleótidos parecían menos eficaces que las de los 3’ azido nucleótidos. Sin estar ligado a ninguna teoría en particular, esto podría deberse probablemente al tamaño más grande del grupo en el 3’-hidroxilo. El bolsillo de unión de la enzima TdT cerca de ese 3' OH es muy ajustado y los grupos más pequeños pueden acomodarse mejor.

Reacción clic y TdT sucesiva para la ligadura clic de moldes de DNA. Dado que los rendimientos de incorporación de TdT de los 3' azido nucleótidos son más altos y casi cuantitativos, los experimentos se realizaron utilizando el formato 3' azido/5' alquino.

Tras la incorporación exitosa del 3' azido ddNTP, la siguiente etapa es realizar la ligadura química con un oligonucleótido modificado con un 5'-alquinilo en una etapa de ligadura clic. Esta etapa se realizó con éxito como se ve en la Figura 3. En el carril 6 de la Figura 2, el producto 3'-azido de la reacción de TdT se hizo reaccionar directamente con un oligonucleótido de 5'-alquinil DNA, en presencia del catalizador de Cu(I) generado in situ a partir de sulfato de cobre (II), ascorbato de sodio y el ligando tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA). En los experimentos de control donde la enzima TdT está ausente (Carril 8), no se observó producto de ligadura. Además, el producto TdT (n+1) también estaba visiblemente ausente. Cuando el catalizador de cobre estuvo ausente (Carril 9), no se observó producto de ligadura. Esto indica que el producto de ligadura se formó de hecho a partir de la ligadura clic asistida por Cu.

Tabla de condiciones para la ligadura que se muestra en la Figura 3.

Concentración reportada:

Reac. de TdT: 0,2 pM

Reac. clic: 200 pM

Nucleótido = 3' N3-ddT

incubación de TdT 30 min

Inactivación por calor durante 20 min a 75°C

Reacción clic a 0°C durante 1 h y temperatura ambiente de 1 h.

Esta ligadura representa la primera demostración de una ligadura clic y TdT sucesivas realizada en moldes de DNA natural. A diferencia de los informes anteriores de la ligadura clic en el DNA que se realizó utilizando DNA sintetizado químicamente con modificaciones de azido o alquinilo, esta ligadura clic se realizó en moldes de DNA natural que se modifican enzimáticamente con la enzima TdT y se pueden aplicar a una biblioteca de DNA natural.

Se investigaron las condiciones para la ligadura clic asistida por TdT para oligonucleótidos de DNA. La concentración de la enzima TdT y el nucleótido 3'-azido dNTP se varió en la Figura 4. Una baja concentración de nucleótidos dio como resultado una cantidad significativamente menor de producto formado. La concentración de la enzima TdT podría reducirse 5 veces sin una pérdida significativa en la eficiencia de la reacción.

Se completaron los experimentos para variar la duración de la reacción de TdT (Figura 5). No se observó un aumento significativo en el rendimiento con un tiempo de incubación de TdT más largo. La reacción se llevó a cabo eficientemente en 1 hora para la incorporación de 3'-azido ddTTP. Sin embargo, la TdT incorporó eficientemente el 3-azido ddNTP dentro de los 30 minutos del tiempo de incubación.

Se realizó la ligadura clic y TdT consecutivas en diferentes cantidades de molde como se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. En la Figura 6, se usaron 1,55 pM de producto TdT y oligonucleótidos de 5' alquinil-DNA en la reacción clic.

Los rendimientos de la reacción de TdT fueron del 73 % al 81 %. El rendimiento de la reacción clic aumentó del 71 % al 91 % cuando la duración de la reacción clic aumentó de 2 h a 4 h. Se logró un rendimiento global del 74 % cuando la reacción de TdT se llevó a cabo durante 1 h y la reacción clic se realizó durante 4 h. Las condiciones del grupo negro dieron como resultado un rendimiento de ligadura clic del 3 %.

Los rendimientos mejoraron aún más cuando la reacción clic se llevó a cabo a una concentración más alta. Cuando la concentración del producto TdT y 5' alquinil-oligo se incrementó a 18,8 ^|jM, el rendimiento total de la reacción de TdT y clic fue superior al 80% (Figura 7). Esta reacción se llevó a cabo en presencia de un oligo de férula. Sin férula, el rendimiento de la reacción fue del 30% en condiciones idénticas. El mayor rendimiento obtenido se completó utilizando el ligando THPTA durante la reacción química clic.

El rendimiento de la reacción clic sin férula se incrementó aún más mediante el uso de condiciones descubiertas inter alia. Las reacciones clic realizadas por debajo de las temperaturas de congelación dieron como resultado rendimientos mucho más altos. Sin estar vinculado por ninguna teoría en particular, esto puede deberse probablemente al aumento en la concentración efectiva del molde de DNA en la solución cuando el agua se cristalizó gradualmente a medida que la reacción se incubaba a -4°C o -20°C (Figura 8). La concentración de DNA utilizada en el experimento fue de 0,9 j M.

Las reacciones también se realizaron usando una secuencia de DNA natural de 50 pb que tenía un grupo funcional alquinilo en 3' y una secuencia adaptadora de 30 pb que tenía un grupo funcional azido. Como se proporciona en la Figura 15B, la reacción transcurrió sin problemas para crear el producto ligado de 80 pb. Se demostraron experimentos similares en las Figuras 16A-16B que muestran la ligadura exitosa por la ligasa T4 de un complemento de 60 pb y 40 pb a una cadena de plantilla que contiene triazolilo ligado.

Se realizaron experimentos para demostrar de manera concluyente que el fragmento de Klenow podía extender un cebador de 24 pb (SEQ ID NO: 1, 3'-GGTCAGTGGAACATTAGAGCATAC-5') a través del conector triazol de la secuencia ligada (SEQ ID NO: 2, 5'-GCTTG CACAG GTGCG TTCG-G-(enlace triazol)-TGATC GGAAG AGCAC ACGTC TGAAC TCCAG TCACC TTGTA ATCTC GTATG CCGTC TTCTG CTTG-3' (Figura 12).

Reacciones de agolpamiento de ácidos nucleicos de biblioteca ligados químicamente. Los métodos descritos en la presente memoria son aplicables a la preparación de bibliotecas y métodos de captura de superficie utilizando una modificación de biblioteca de DNA asistida por TdT. Un ejemplo es la captura directa de la biblioteca de RNA en la superficie de la celda de flujo como se proporciona en la Figura 10. La reacción clic elimina la reacción enzimática para unir los adaptadores necesarios para realizar la SBS como se demuestra en la Figura 10. De manera similar, las reacciones clic descritas en la presente memoria, son aplicables para la captura directa de bibliotecas, como se muestra en la Figura 11. El RNA de cadena sencilla se puede capturar directamente en la superficie de la celda de flujo y los adaptadores de secuenciación se pueden ligar químicamente mediante la ligadura clic, sin necesidad de convertir al cDNA.

En un ejemplo particular de una modificación del proceso que se muestra en la Figura 11, se prepara una secuencia de P7 modificada con 3'-azido haciendo reaccionar una secuencia de P7 (2 ^jM; secuencia de P7: SEQ ID NO: 3, 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGC-OH-3') con un dGTP modificado con 3'-azido (preparado como en los ejemplos anteriores; 2 mM) en presencia de TdT (2 j M), tampón TdT y CoCl²(0,25 mM) en agua (20 j L) a 37°C durante 1 h, seguido de la reacción inactivada por inactivación térmica de la enzima a 75°C durante 10 min (rendimiento, aprox. 83 %). Además, un oligonucleótido con una secuencia P5' en el extremo 3' (SEQ ID NO: 4, 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3') y un nucleótido T modificado con alquino terminal en el extremo 5' (preparado como se describe en los ejemplos anteriores SEQ ID NO: 5, 5'-alquino-T GTA CAG TGA CGA GTG ACG ATA CAC ACG CGT CTC TGA CGC GCG CAT AGT ATC GAT CTC GGT CGC CGT ATC ATT-3' (la parte en cursiva es el oligonucleótido 1; la parte subrayada es la secuencia P5'; la parte en negrita comprende un enlace triazol entre un 3'-azido A y un 5'-alquinil T)) se hibrida a secuencias P5 (SEQ ID NO: 6, 5' AAT GAT ACG GCG ACC GA 3') sobre un soporte sólido (tal como una celda de flujo) que comprende los cebadores P5 injertado y P7 modificado (SEQ ID NO: 7, 5' CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGC 3' ). Las unidades de alquino terminal se acoplaron al P7-dGTP modificado en 3' en condiciones de química clic, incluyendo la secuencia P7 modificada en 3'-azido (4 pmol, 2,0 ^jM (concentración de reacción final, 1,8 j M), 0,002 equiv.), Pm DETA (4,2 mmol), CuSO⁴^5H²O (0,16 M, 80 nmol, 400 equiv.) y ascorbato de sodio (400 mg/mL, 2 M, 800 nmol, 4000 equiv.), en un volumen final total de 21,8 j L, a -4°C durante 18 horas (rendimiento, aprox. 53%). También se preparó un constructo de control de 3'-P5'-oligonucleótido 1-P7-OH-3' con un enlace fosfato estándar (rendimiento, aproximadamente 47%). El constructo de control también se hibridó a un soporte sólido modificado con P5/P7.

Las reacciones de generación de grupos se realizaron en los dos constructos y produjeron resultados de imagen comparables a concentraciones de 200, 20, 3 y 1 pM, y después de hasta 56 ciclos de amplificación en la superficie de la celda de flujo. El constructo ligado químicamente también se usó con éxito como molde en un protocolo de secuenciación por síntesis (SBS), que incluye amplificación, linealización, bloqueo, desprotección e incorporación de base mediada por polimerasa en el sitio de triazol. Por lo tanto, la inserción de un enlace triazol modificado no impide la incorporación de bases y la visualización de grupos en un método de secuenciación SBS.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a las realizaciones descritas, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que los ejemplos y estudios específicos detallados anteriormente son únicamente ilustrativos de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de una muestra que comprende;

(i) hacer reaccionar una muestra que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos celulares, cada uno de los cuales tiene un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto 3'-azido, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto 5'-alquinilo, en el que el resto funcional en 3' y el resto funcional en 5' reaccionan en una reacción química clic para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende la estructura

formando así una pluralidad de ácidos nucleicos ligados; y

(ii) amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos ligados preparando así una biblioteca de ácidos nucleicos a partir de la muestra, en donde el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora a cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos celulares poniendo en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos celulares con una polimerasa independiente del molde, y en el que la polimerasa independiente del molde es TdT.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la TdT incorpora el ddNTP modificado en el extremo 3' con un rendimiento de al menos el 70 %.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora mediante la polimerasa independiente del molde en una reacción realizada a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la reacción química clic comprende la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los ácidos nucleicos celulares comprenden fragmentos de ácidos nucleicos celulares, obtenidos opcionalmente a partir de DNA genómico (gDNA), DNA mitocondrial o DNA plastómico.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que los ácidos nucleicos celulares se unen a un soporte sólido antes de la reacción, los ácidos nucleicos adaptadores se unen a un soporte sólido antes de la reacción, los ácidos nucleicos celulares se unen a un soporte sólido antes de que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpore a los ácidos nucleicos celulares, o los ácidos nucleicos adaptadores se unan a un soporte sólido antes de que el ddNTP modificado en el extremo 5' se incorpore a los ácidos nucleicos adaptadores.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además amplificar la pluralidad de ácidos nucleicos celulares mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes de incorporar el ddNTP modificado en el extremo 3'.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados con un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura, cada uno de los cuales tiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores y (2) una pluralidad de cebadores universales en 3' que comprende además opcionalmente extender la pluralidad de cebadores de captura para producir una pluralidad de ácidos nucleicos ligados inmovilizados que comprende además opcionalmente hibridar la pluralidad de cebadores universales con los ácidos nucleicos ligados inmovilizados.

9. Un método para capturar DNA obtenido de un número limitado de células para la preparación de bibliotecas de DNA, comprendiendo el método

(i) hacer reaccionar una muestra obtenida de un número limitado de células, comprendiendo la muestra una pluralidad de fragmentos de DNA celular que comprenden un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto azido en 3’, en el que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora en cada uno de la pluralidad de fragmentos de DNA celular poniendo en contacto la pluralidad de fragmentos de DNA celular con una polimerasa independiente del molde, con una pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, cada uno de los cuales comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto alquinilo en 5’, en el que el resto 3'-azido y el resto 5'-alquinilo reaccionan en una reacción química clic para formar una pluralidad de ácidos nucleicos ligados que comprenden un enlace de cadena principal modificado que comprende la estructura

, y en donde la polimerasa independiente es TdT; y

(ii) poner en contacto la pluralidad de ácidos nucleicos ligados con un soporte sólido en condiciones de hibridación, en el que el soporte sólido comprende (1) una pluralidad de cebadores de captura que tienen una secuencia de ácido nucleico complementaria a la pluralidad de ácidos nucleicos adaptadores, capturando así el DNA obtenido de una célula sencilla.

10. Un método para escindir selectivamente una cadena sencilla de una secuencia de polinucleótidos de doble cadena, comprendiendo el método:

(i) preparar una cadena molde haciendo reaccionar un primer polinucleótido que comprende un didesoxinucleótido modificado en el extremo 3' (ddNTP) que comprende un resto azido en 3' con un segundo polinucleótido que comprende un ddNTP modificado en el extremo 5' que comprende un resto alquinilo en 5', en el que el ddNTP modificado en el extremo 3' se incorpora al primer polinucleótido poniendo en contacto el primer polinucleótido con una polimerasa independiente del molde, en el que el resto 3'-azido y el resto 5'-alquinilo reaccionan en una reacción química clic para formar un enlace de cadena principal modificado que comprende la estructura

en el que la cadena molde comprende un primer sitio de restricción que comprende el enlace de cadena principal modificado y en el que la polimerasa independiente es TdT;

11. El método de la reivindicación 10, en el que el primer polinucleótido es parte de una pluralidad de polinucleótidos y/o en el que el ácido nucleico de doble cadena se produce por extensión del segundo polinucleótido.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que la enzima que escinde el DNA es una endonucleasa de restricción (REasa) o una endonucleasa de corte (NEasa).