CN1159458C - 用于多样本检测的基因芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可用于多样本检测的试剂盒，它由多样本检测芯片(包括芯片基片和芯片盖玻片)、杂交盒、标记试剂、预杂交液、杂交液和说明书组成，其中盖玻片上具有多个凸起的独立反应单元，这些反应单元区的位置对应于多样本检测基因芯片上的样品检测区，因而可同时实现多个样本的检测。本发明还提供了利用这种试剂盒进行多样本检测的方法，以及将此方法利用至临床疾病诊断的应用手段。
Description
技术领域
本发明属于基因芯片技术领域，更具体地涉及一种新的用于多样本检测的基因芯片盖玻片和基因芯片，以及利用这项技术进行多份样本检测的方法。本发明还涉及了含有该新型基因芯片的试剂盒。
背景技术
基因芯片是二十世纪九十年代发展起来的一项前沿生物技术。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500微米)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。基因芯片从制作上可分为两大类：原位合成法(DNAchip)和微矩阵法(DNA mircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等发明，他们将半导体中的光蚀刻技术运用到DNA合成化学中，用单核苷酸或其它生物大分子为底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循环都有特定的核苷酸结合上去，直到设定的寡核苷酸长度，每个寡核苷酸片段代表了一种特定的基因，存在于DNA芯片的特定位置上。微矩阵法最早由Stanford大学的P.Brown等发明，将PCR等方法得到的cDNA用针点或喷点的方法直接排列到玻片等介质上，从而制备成芯片。
基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因芯片的概念可追溯到Southern印迹杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出Northern印迹杂交和点杂交技术。这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。
美国Affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在约1平方厘米的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描和计算机分析等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。
原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片。
基因芯片最早是由于高通量、大规模研究基因功能的需求而产生的，但随着基因芯片技术的日渐成熟，人们惊喜地发现基因芯片在传染性疾病和遗传病的诊断上有独特的应用前景和巨大的商业市场。感染性病原体诊断芯片就是将待测病原体的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成芯片，将从病人血清中抽提出病原体的DNA或RNA经扩增标记萤光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机分析，判断阴阳性。诊断芯片区别于其他检测手段的优越性在于：
(1)检测样品为各类致病基因片段，提高了检测效率；
(2)因无需机体免疫反应，能及早诊断，且待测样品用量较少；
(3)诊断芯片技术是DNA杂交技术和荧光标记技术相结合的分子诊断方法，有极高的灵敏度、特异性和可靠性；
(4)自动化程度高，利于大规模推广应用。
在疾病诊断方面，已有一些单一疾病基因诊断芯片产品上市，例如美国的Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病病毒(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。
利用基因芯片的技术特征和优势为临床诊断进行服务已成为当今一个重要课题。然而，目前仍缺乏有效的同时进行多样本检测的基因芯片技术。
发明内容
本发明的目的就是提供了一种适用于多疾病和/或多份样本检测的基因芯片，以及用于多样本检测的基因芯片的盖玻片。
本发明的另一目的是提供含有上述基因芯片的试剂盒及其相关生产制备技术。
本发明的另一目的是提供了利用这种新的基因芯片试剂盒进行多份样本检测的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于多样本检测基因芯片的盖玻片，所述的盖玻片的一个主平面上具有2-500个凸起的、高度0.01-2mm的独立反应单元区，所述的反应单元区的表面基本平坦，且反应单元区的位置对应于多样本检测基因芯片上的样品检测区。
较佳地，所述的盖玻片是用以下材料制成的：玻璃、塑料、硅片。
在本发明的一个优选例中，反应单元区之间被宽度0.5-50mm的隔离区隔开，较佳地被宽度1-10mm的隔离区隔开，更佳地被宽度2-5mm的隔离区隔开。
在一优选例中，所述的隔离区是用疏水材料制成或经疏水处理。
在一优选例中，所述的反应单元区是透明的，且高度优选为0.025-1.5mm，较佳地为0.05-1mm。
在一优选例中，所述的反应单元区数目为4-384个，更佳地为4-192个。
在本发明的第二方面，提供了一种用于多样本检测的基因芯片，它包括芯片基片和本发明上述的盖玻片，芯片基片上有2-500个点有探针的样品检测区，且盖玻片上的独立反应单元区的位置对应于该芯片基片上的样品检测区。
所述芯片基片上的样品检测区数目通常为2-500个，较佳地为4-384个，更佳地为4-192个。
在本发明的第三方面，提供了一种用于多样本检测的试剂盒，它含有本发明上述的多样本检测基因芯片。
在一优选例中，所述的试剂盒还含有杂交盒、标记试剂、预杂交液、杂交液和说明书。所述的试剂盒用于同时检测2-500个样本。
附图说明
图1是本发明的一种用于多样本检测的基因芯片的盖玻片的俯视图和侧视图。
图2是本发明的一种多人份oligo芯片的检测结果图(放大约4倍)。
图3是本发明的一种多人份cDNA芯片的检测结果图(放大约4倍)。
具体实施方式
本发明的目的是通过一种新型基因芯片实现的，该基因芯片包括两部分：芯片基片和芯片盖玻片。
现参见图1(未按实际尺寸绘制)。图1示出了本发明的一种用于多样本检测基因芯片的盖玻片，图1上方为本发明盖玻片的俯视图，下方为本发明盖玻片的俯视图的侧视图。该盖玻片1在一个主平面上具有多个(通常为2-500个，较佳地为4-384个，更佳地为5-100个)凸起的的独立反应单元区2，所述的反应单元区2的表面基本平坦，且反应单元区2的位置对应于多样本检测基因芯片上的样品检测区(基因芯片上的样品检测区也就是基因芯片上的探针点样区)。
反应单元区2的形状没有限制，可以为矩形、正方形、圆形、椭圆形或其他任何形状。反应单元区的的高度没有特别限制，通常为0.01-2mm，较佳地为0.025-1.5mm，更佳地为0.05-1mm。反应单元区的面积也没有特别限制，只要能够覆盖芯片上的样品检测区即可，以正方形的反应单元区为例，其大小通常约为1×1mm到10×10mm，当然也使用面积更大或更小的反应单元区。
反应单元区2可以是透明的，也可以是不透明的。只要杂交产生的信号能够透过反应单元区并被检测仪器(如扫描仪)所接收即可。一种优选的反应单元区是透明的。
此外，在反应单元区之间为间隔区3。间隔区3的宽度没有特别限制，通常为0.5-100mm。在一优选例中，间隔区3可以用疏水材料来制造，或者经过疏水处理。在一优选例中，间隔区是疏水性的，而反应单元区是亲水性的。
简而言之，为了形成独立反应单元和避免交叉污染，盖玻片表面由两个部分组成，第一部分为凹陷的隔离区(相对于反应单元区而言)，第二部分为凸出的反应单元区(相对于隔离区或盖玻片的主表面而言)。突出部分是独立反应单元；每一反应单元构成一个单份检测系统，可对一个被检样本进行检测。
至于芯片基片部分，与普通的基因芯片基片没有差异，只是由普通的一个点样区变成多个点样区。在芯片基片上与盖玻片突出部分对应的区域为点样区。芯片基片上各样品检测区所点的核酸探针种类可以相同，也可以不同。较佳地，每个点样区的点样方式宜完全一样，并用于检测一个样本。多个点样区各检测多个样本。一块芯片基片加一块芯片盖玻片就构成了本发明的新型的多样本检测基因芯片，该基因芯片可同时进行多疾病、多样本的检测。
在进行检测时，盖玻片朝上，将待测样本分别点在盖玻片的反应单元区，对准芯片的相应位置盖上，进行杂交。下凹的间隔区可以阻断不同样本的扩散，防止样本之间的交叉污染。通常，人们认为由于DNA分子较小，因而在芯片的杂交反应时仅数毫米的间隔区是不足以防止DNA分子的扩散的。本发明人出乎意料地发现，当利用具有上述结构的本发明盖玻片时，即数毫米的间隔区就足以防止在各个样品检测区的杂交反应的相互干扰。如果间隔区经疏水处理，则效果更好。这可能是因为DNA分子的扩散并不如人们想象的那么严重。也可能是因为各反应单元区与样品检测区之间形成了较为稳定的微环境，从而防止了干扰性DNA分子的进入。还可能是因为在反应单元区上待检测的目的DNA分子占绝对优势，因此即使少量干扰性DNA分子进入到样品检测区与反应单元区之间，也基本不会干扰杂交结果。尽管，在此列出了可能的机理，但本发明的多样本检测基因芯片并不受上述机理的限制。
具体而言，本发明的多样本检测的基因芯片包括芯片基片和上述的盖玻片，其中芯片基片上有2-500个点有探针的样品检测区(每个样品检测区可点样若干个(例如1-10000个)探针杂交点)，且盖玻片上的独立反应单元区的位置对应于该芯片基片上的样品检测区。在所述的一块芯片上，同时存在多个反应单元，各反应单元形成独立的检测单元(例如包括检测监控系统和疾病诊断系统)；每一独立反应单元可进行单样本检测，反映一个被检样本的检测状况；一个基因芯片就能够同时反映若干反应单元中多个样本的检测状况，因此一个基因芯片就能进行多疾病、多样本的检测。
至于本发明基因芯片基片和盖玻片的材料，没有特别限制。可以使用目前基因芯片领域常用的各种材料，例如玻璃、塑料、硅片、陶瓷等。
在本发明另一方面，提供一种可进行多样本检测的基因芯片试剂盒，它包括本发明的多样本检测基因芯片。此外，该试剂盒还可所述的试剂盒还含有杂交盒、标记试剂、预杂交液、杂交液和说明书。该试剂盒可用于多疾病、多样本的检测。
本发明的用于多样本检测基因芯片的盖玻片可用常规技术进行制备。一种常见的方法是以常规盖玻片为材料，在其一个主表面上划定反应单元区，然后对除反应单元区之外的区域进行打磨，形成凹陷的间隔区。
本发明所提供的新的可进行多样本检测的基因芯片或试剂盒有如下优点：
①节约了耗用基片数量，节约成本。
②节约了杂交液的用量，节约成本。
③简化了杂交中盖盖玻片的方法，方便了初学者操作，增加了杂交实验的成功率。
④多个标本同时杂交，提高了杂交条件的一致性，增加了各组杂交数据之间的平行性和可对比性。
⑤多标本同时杂交，节约了操作时间，简化了操作过程，更适于芯片在临床检测和疾病筛选等方面的实际应用。
⑥一次扫描可同时得到多个杂交图像，节约了扫描成本。
⑦杂交体系减小，提高样本检测灵敏度。
以下将通过实施例对本发明作进一步的阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。有关的技术人员完全可以根据本发明的构思和所公开的技术方案，进行修改和变动，这也在本发明的保护范围之内。
实施例1
多人份oligo芯片(以十人份oligo芯片为例)
1.十人份oligo芯片的制备：
盖玻片的制备。取常规的25×75毫米的盖玻片，根据芯片基片的样品检测区位置，在盖玻片上面划定10个5×5mm见方的反应单元区，各反应单元区之间的间隔区宽度为4毫米。透过打磨法将除反应单元区之外的区域打磨掉一部分，形成间隔区。反应单元区高度约0.1毫米。
使用ProSys-5510a点样仪(Cartesian公司)，以博星公司标准方法(注：以下所指的标准方法皆为博星公司目前采用的芯片制备工艺标准方法)制备十人份oligo芯片。其制备方法与一般的oligo芯片制备方法基本相同，特点在于：同时在一片芯片上点样十个相互隔离的相同矩阵。该十人份oligo芯片的每个矩阵中有400个oligo探针，包括G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)基因缺陷位点探针及其它一些监控探针。每个矩阵占据4.5mm×4.5mm的面积，矩阵与矩阵之间横竖均相距4.5mm。后处理完毕后，按照本专利所提及的杂交盒要求将一片芯片、一片盖玻片装入杂交盒中，备用。
2.样本扩增及荧光标记：
取正常样本及阳性样本(已经测序验证)外周血全基因组DNA，分别进行以下PCR扩增和荧光标记：
在50ul的PCR体系中含1X反应液，10mM Tris-HCl(pH8.0-9.0)，10mMKCl，8mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2；0.4mM dNTP；Taq DNA聚合酶3-5U；基因组DNA 50-100ng；Cy3标记引物10-50pmol。
上述反应体系充分混匀后，置入PCR仪进行以下扩增程序：
变性：95℃，5-10分钟；
扩增：95℃，1分钟；62℃，1分钟；72℃，1分钟；共30-35个循环；
延伸：72℃，10分钟。
然后，采用沉淀法去除杂质，并进行干燥。正常样本和阳性样本各做5份。
3.杂交：
在以上干粉管中加入3.5ul杂交液，充分溶解，95℃变性5分钟，立即置冰上冷却。将每一管标记产物溶液滴加到对应的盖玻片小矩阵平台上，小心将芯片正面向着盖玻片合上，确保每个人份的oligo探针矩阵都与各自所对应的盖玻片小矩阵平台相合。盖上杂交盒盖，小心将整个杂交盒翻转使其正面向下，置48℃杂交箱中杂交4小时。
4.洗片、扫描：
用标准方法进行洗片，晾干后用GenePix Pro 4000B扫描仪(Axon Instrument)进行扫描和数据处理。
结果如图2所示，各个样品(正常的、纯合的、杂合的样品)的杂交图谱与预计结果相符，并且各样品检测区无相互干扰现象。
实施例2
多人份cDNA芯片(以八人份cDNA芯片为例)
1.八人份cDNA芯片的制备：
盖玻片的制备。取常规的25×75毫米的盖玻片，根据芯片基片的样品检测区位置，在盖玻片上面划定10个5×5mm见方的反应单元区，各反应单元区之间的间隔区宽度为4毫米。透过打磨法将除反应单元区之外的区域打磨掉一部分，形成间隔区。反应单元区高度约0.15毫米。
使用ProSys-5510a点样仪(Cartesian公司)，以博星公司标准方法(注：以下所指的标准方法皆为博星公司目前采用的芯片制备工艺标准方法)制备八人份cDNA芯片。其制备方法与一般的cDNA芯片制备方法基本相同，特点在于：同时在一片芯片上点样八个相互隔离的相同矩阵。该八人份cDNA芯片的每个矩阵中有400个靶cDNA，包括原癌抑癌基因及一部分控制基因。每个矩阵占据4.5mm×4.5mm的面积，矩阵与矩阵之间横竖均相距4.5mm。后处理完毕后，按照本专利所提及的杂交盒要求将一片芯片、一片盖玻片装入杂交盒中，备用。
2.探针制备：
取食管癌，胃癌，直肠癌，结肠癌，膀胱癌，肝癌，胰腺癌，乳腺癌组织各一份及正常组织八份，用标准方法分别抽提RNA并进行反转录标记，癌组织用Cy5标记，正常组织用Cy3标记。标记后产物纯化、抽干备用(注，每一份癌组织标记产物合一份正常组织标记产物混合、在同一eppendorf管中抽干)。
3.预杂交：
从杂交盒中取出芯片，95℃变性2min，立即置无水乙醇中放置30sec，取出晾干。同时准备好40μl的标准方法配制的预杂交液，95℃变性2min，室温自然冷却。在盖玻片的每个小矩阵平台上滴加上3.5μl预杂交液，小心将芯片正面向着盖玻片合上，确保每个人份的靶cDNA矩阵都与各自所对应的盖玻片小矩阵平台相合。盖上杂交盒盖，小心将整个杂交盒翻转使其正面向下，置42℃杂交箱中6hr左右。
4.杂交：
预杂交完毕的芯片从杂交盒中取出，用洗涤液冲洗盖玻片及芯片，盖玻片用75％乙醇擦洗后晾干，仍放入杂交盒中，芯片置95℃变性2min，立即置无水乙醇中30sec，取出晾干。同时在每一组癌组织正常组织混合物的干粉管中加入3.5μl杂交液，充分溶解，95℃变性2min，立即置冰上冷却。将每一管标记产物溶液滴加到对应的盖玻片小矩阵平台上，小心将芯片正面向着盖玻片合上，确保每个人份的靶cDNA矩阵都与各自所对应的盖玻片小矩阵平台相合。盖上杂交盒盖，小心将整个杂交盒翻转使其正面向下，置42℃杂交箱中过夜。
5.洗片、扫描：
用标准方法进行洗片，晾干后用GenePix Pro 4000B扫描仪(Axon Instrument)进行扫描和数据处理。
结果如图3所示，表明不同组织样本的表达存在差异，并且各样品检测区无相互干扰现象。
实施例3
不同规格多样本检测芯片
在基本与实施例2相同的方式，进行cDNA芯片的制备、探针制备、预杂交、杂交以及洗片和扫描操作，不同点仅在于改变反应单元区的数目(4个、20个、50个)、反应单元区的高度(0.1mm、0.5mm、1mm)、隔离区的宽度(1mm、2mm、5mm)。
结果表明，这些不同规格的多样品检测芯片同样可以获得令人满意的检测结果。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种用于多样本检测基因芯片的盖玻片，其特征在于，所述的盖玻片的一个主平面上具有2-500个凸起的、高度0.01-2mm的独立反应单元区，所述的主平面表面由两个部分组成，第一部分为凹陷的隔离区，第二部分为凸出的反应单元区，所述的反应单元区的表面基本平坦，且反应单元区的位置对应于多样本检测基因芯片上的样品检测区。
2.如权利要求1所述的盖玻片，其特征在于，所述的盖玻片是用以下材料制成的：玻璃、塑料、硅片。
3.如权利要求1所述的盖玻片，其特征在于，反应单元区之间被宽度0.5-50mm的隔离区隔开。
4.如权利要求3所述的盖玻片，其特征在于，所述的隔离区是用疏水材料制成或经疏水处理。
5.如权利要求1所述的盖玻片，其特征在于，所述的反应单元区是透明的。
6.如权利要求1所述的盖玻片，其特征在于，所述的反应单元区数目为4-384个。
7.一种用于多样本检测的基因芯片，其特征在于，它包括芯片基片和权利要求1所述的盖玻片，芯片基片上有2-500个点有探针的样品检测区，且盖玻片上的独立反应单元区的位置对应于该芯片基片上的样品检测区。
8.一种用于多样本检测的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求7所述多样本检测基因芯片。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有杂交盒、标记试剂、预杂交液、杂交液和说明书。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于同时检测2-500个样本。
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