CN109370906B - 一种原始生殖细胞爬片的制备方法 - Google Patents

一种原始生殖细胞爬片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，其中固定步骤为：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有半胱氨酸的PFA‑PBS溶液中，室温固定，然后吸除PFA‑PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片。有益效果为：本发明制备方法具有用材简单、节约成本、爬片效果好、爬片后的细胞分布均匀、操作方便、节约用时等优点。

Description

一种原始生殖细胞爬片的制备方法
技术领域
本发明涉及头足类胚胎整体原位杂交技术领域，尤其是涉及一种原始生殖细胞爬片的制备方法。
技术背景
原始生殖细胞(Primordial germ cell，PGC)是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞，其在胚胎发育的早期，短时间的分布于胚胎中。可将其分离出来后体外接种到饲养层上进行培养并使之转变成成胚胎生殖细胞(Embryonic germ cell，EG)。它是一种多潜能细胞，具有无限增殖、自我更新以及分化成代表3个胚层组织细胞的能力，并且还可以对该细胞进行遗传操作、选择和冻存而不失其多能性。家禽作为卵生动物，单个胚胎较难获得，因此PGCs细胞的研究尤为重要，随着PGCs细胞体外培养体系的建立，以PGCs细胞为基础的现代保种技术研究以及转基因技术研究得以迅速发展。PGCs细胞可用于以PGCs细胞为基础的基因表达调控研究、现代育种保种研究以及转基因研究，具有一定的科研价值。
细胞爬片是观察细胞形态结构最常用的一种实验手段，利用细胞爬片进行体外实验可排除体内诸多干扰因素的影响，并方便对细胞进行各种干预处理。现有的原始生殖细胞的爬片方法为：将载玻片放于培养皿中，加入饲养层细胞，待饲养层细胞在载玻片上生长成单层后，使用丝裂霉素或γ-射线处理终止其分裂后，加入PGCs细胞，经过约24小时的培养，PGCs细胞吸附于饲养层细胞上，完成细胞爬片，取出载玻片，PBS洗涤后，使用4％的多聚甲醛或其它固定液进行固定并进行后续的实验，整个过程需2天以上的时间，耗时费力，整个过程操作起来比较繁琐，且存在许多缺陷。随着研究的深入，细胞检测指标日渐丰富，对细胞爬片的需求逐渐增大，传统的方法需要逐一对每张爬片进行染色，不但操作繁琐，效率低，制作成本高，且每张细胞爬片处理过程难免会有差异，导致相互之间可比性差，实验结果分析困难。因此，需要寻找一种节约大量试剂及相关材料、成本较低、时间短、提高细胞爬片的制作效率的原始生殖细胞爬片的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有用材简单、节约成本、爬片效果好、爬片后的细胞分布均匀、操作方便、节约用时等优点的原始生殖细胞爬片的制备方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，具体包括如下步骤：
玻璃爬片预处理：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗2-4次，每次8-12min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，70-90℃下反应20-30min，再用水和乙醇各超声清洗2-4次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应15-20h，再用乙醇超声清洗2-4次，至于110-130℃下交联反应3-5h，即得原始生殖细胞爬片，盐酸乙醇洗液能除去霉斑，有杀菌作用，操作简便，成本低廉，腐蚀性、环境污染都小，高效率低损耗，该步骤所用食人鱼溶液有很强的氧化性，可以彻底的清除玻璃爬片上的几乎所有有机质，而且用它处理过的玻片表面会带羟基，利于后续修饰，得到氨基改性玻璃爬片，进而使得玻璃爬片具有高度亲水的性能，提高玻璃爬片和固定液之间的粘结性，进而提高PGCs细胞在爬片上的固定性，解决纯化的PGCs细胞在玻璃爬片上难以爬片的问题，同时能够提高PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀，没有明显的脱片情况；
PGCs细胞纯化：PGCs细胞采用Nycodenz密度梯度离心或Percoll密度梯度离心或流式分选方法进行纯化，然后采用PBS洗涤2-4次，在4000-6000rpm下离心3-5min，收集PGCs细胞，备用；
洗涤：显微镜下拣取100-200个PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的PBS液滴中洗涤，然后拣取细胞，置于氨基改性玻璃爬片上浓度4％的PFA溶液中洗涤，备用；
固定：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有半胱氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片，与传统爬片方法相比，本发明细胞爬片的制备方法具有用材简单、节约成本、爬片效果好、爬片后的细胞分布均匀、操作方便、节约用时等优点。
作为优选，玻璃爬片预处理步骤中食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1:2.0-2.5。该配比的食人鱼溶液浸泡处理的玻璃爬片的前进角最小，可低至9.2°，且后退角为7.6°，更有利于玻璃爬片表面羟基的形成，进而改性玻璃爬片的亲水性。
作为优选，玻璃爬片预处理步骤中食人鱼溶液中含有0.25-0.30％的草酸和0.12-0.15％的D-纤维二糖。食人鱼溶液的清洗效果很好，作用迅速，但因腐蚀性极强，而草酸和D-纤维二糖的加入能够缓解食人鱼溶液的腐蚀性，降低玻璃爬片的损伤，同时草酸分子和D-纤维二糖分子能与水分子形成氢键网络结构，能够提高玻璃爬片表面羟基的数量，进而能够提高玻璃爬片的氨基改性率，得到更多的氨基改性玻璃爬片，降低其表面的摩擦系数，进而提高后续PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀，没有明显的脱片情况。
作为优选，固定步骤中PFA-PBS溶液浓度中含有0.01％的半胱氨酸。
作为优选，固定步骤中半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的比例为100:2.8-4.2。半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的合理存在使得含有半胱氨酸的PFA-PBS溶液对原始生殖细胞的固定渗透效果较佳，可使得细胞膜的蛋白质发生变性，增强细胞膜的透过性，提高了固定剂对原始生殖细胞的固定渗透效果，能得到组织形态完整、具有合适硬度的爬片，便于后续显色的进行，使得细胞固定的同时完成细胞的爬片，节约用时，节约成本，省去现有技术中培养及处理细胞过程中产生的相关费用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明细胞爬片的制备方法具有用材简单、节约成本、爬片效果好、爬片后的细胞分布均匀、操作方便、节约用时等优点；2)本发明制备方法的固定方法对原始生殖细胞的固定渗透效果较佳，能得到组织形态完整、具有合适硬度的爬片，便于后续显色的进行，使得细胞固定的同时完成细胞的爬片，节约用时，节约成本，省去现有技术中培养及处理细胞过程中产生的相关费用；3)本发明用玻璃爬片为氨基改性玻璃爬片，具有高度亲水的性能，能提高PGCs细胞在爬片上的固定性，解决纯化的PGCs细胞在玻璃爬片上难以爬片的问题，同时能够提高PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀。
附图说明
图1是本发明实施例1中原始生殖细胞爬片的AKP染色照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，具体包括如下步骤：
1)玻璃爬片预处理：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗2次，每次8min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，70℃下反应20min，再用水和乙醇各超声清洗2次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应15h，再用乙醇超声清洗2次，至于110℃下交联反应3h，即得原始生殖细胞爬片，盐酸乙醇洗液能除去霉斑，有杀菌作用，操作简便，成本低廉，腐蚀性、环境污染都小，高效率低损耗，该步骤所用食人鱼溶液有很强的氧化性，可以彻底的清除玻璃爬片上的几乎所有有机质，而且用它处理过的玻片表面会带羟基，利于后续修饰，得到氨基改性玻璃爬片，进而使得玻璃爬片具有高度亲水的性能，提高玻璃爬片和固定液之间的粘结性，进而提高PGCs细胞在爬片上的固定性，解决纯化的PGCs细胞在玻璃爬片上难以爬片的问题，同时能够提高PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀，没有明显的脱片情况；
2)PGCs细胞纯化：PGCs细胞采用Nycodenz密度梯度离心方法进行纯化，然后采用PBS洗涤2次，在4000rpm下离心3min，收集PGCs细胞，备用；
3)洗涤：显微镜下拣取100个PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的PBS液滴中洗涤，然后拣取细胞，置于氨基改性玻璃爬片上浓度4％的PFA溶液中洗涤，备用；
4)固定：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有半胱氨酸的4％PFA-PBS溶液中，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片，与传统爬片方法相比，该细胞爬片的制备方法具有用材简单、节约成本、爬片效果好、爬片后的细胞分布均匀、操作方便、节约用时等优点；
玻璃爬片预处理步骤中食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1:2.0。该配比的食人鱼溶液浸泡处理的玻璃爬片的前进角最小，可低至9.2°，且后退角为7.6°，更有利于玻璃爬片表面羟基的形成，进而改性玻璃爬片的亲水性。
玻璃爬片预处理步骤中食人鱼溶液中含有0.25％的草酸和0.12％的D-纤维二糖。食人鱼溶液的清洗效果很好，作用迅速，但因腐蚀性极强，而草酸和D-纤维二糖的加入能够缓解食人鱼溶液的腐蚀性，降低玻璃爬片的损伤，同时草酸分子和D-纤维二糖分子能与水分子形成氢键网络结构，能够提高玻璃爬片表面羟基的数量，进而能够提高玻璃爬片的氨基改性率，得到更多的氨基改性玻璃爬片，降低其表面的摩擦系数，进而提高后续PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀，没有明显的脱片情况。
固定步骤中PFA-PBS溶液浓度中含有0.01％的半胱氨酸。
固定步骤中半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的比例为100:2.8。半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的合理存在使得含有半胱氨酸的PFA-PBS溶液对原始生殖细胞的固定渗透效果较佳，可使得胚胎细胞膜的蛋白质发生变性，增强细胞膜的透过性，提高了固定剂对原始生殖细胞的固定渗透效果，能得到组织形态完整、具有合适硬度的爬片，便于后续显色的进行，使得细胞固定的同时完成细胞的爬片，节约用时，节约成本，省去现有技术中培养及处理细胞过程中产生的相关费用。
实施例2：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，具体包括如下步骤：
1)玻璃爬片预处理：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗3次，每次10min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1:2.2，食人鱼溶液中含有0.28％的草酸和0.14％的D-纤维二糖，80℃下反应25min，再用水和乙醇各超声清洗3次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应18h，再用乙醇超声清洗3次，至于120℃下交联反应4h，即得原始生殖细胞爬片；
2)PGCs细胞纯化：PGCs细胞采用Percoll密度梯度离心方法进行纯化，然后采用PBS洗涤3次，在5000rpm下离心4min，收集PGCs细胞，备用；
3)洗涤：显微镜下拣取150个PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的PBS液滴中洗涤，然后拣取细胞，置于氨基改性玻璃爬片上浓度4％的PFA溶液中洗涤，备用；
4)固定：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有0.01％半胱氨酸的4％PFA-PBS溶液中，其中半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的比例为100:3.5，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片。
实施例3：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，具体包括如下步骤：
1)玻璃爬片预处理：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗4次，每次12min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1:2.5，食人鱼溶液中含有0.30％的草酸和0.15％的D-纤维二糖，90℃下反应30min，再用水和乙醇各超声清洗4次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应20h，再用乙醇超声清洗4次，至于130℃下交联反应5h，即得原始生殖细胞爬片；
2)PGCs细胞纯化：PGCs细胞采用流式分选方法进行纯化，然后采用PBS洗涤4次，在6000rpm下离心5min，收集PGCs细胞，备用；
3)洗涤：显微镜下拣取200个PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的PBS液滴中洗涤，然后拣取细胞，置于氨基改性玻璃爬片上浓度4％的PFA溶液中洗涤，备用；
4)固定：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有0.01％半胱氨酸的4％PFA-PBS溶液中，其中半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的比例为100:4.2，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片。
对比例1：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，其中固定步骤为：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的4％PFA-PBS溶液中，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片。其余步骤和实施例2完全一致。
对比例2：
一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，其中玻璃爬片预处理步骤为：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗3次，每次10min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1:2.2，80℃下反应25min，再用水和乙醇各超声清洗3次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应18h，再用乙醇超声清洗3次，至于120℃下交联反应4h，即得原始生殖细胞爬片。其余步骤和实施例2完全一致。
实施例4：
原始生殖细胞爬片的AKP染色
选择实施例2爬片为试验组，对比例1爬片为对照组1，对比例2爬片为对照组2。
AKP染色：取出爬片，使用200μL PBS洗涤3次，每次5分钟；加入BCIP/NBT染液，室温湿润环境中孵育1h；洗片后，倒置显微镜下观察，拍照，如图1所示。
对比试验组和对比例1可发现，试验组上的细胞数量远多于对比例1，说明半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的合理存在使得含有半胱氨酸的PFA-PBS溶液对原始生殖细胞的固定渗透效果较佳，且便于后续显色的进行。
对比试验组和对比例2可发现，试验组上的细胞分布均匀性好于对比例2，说明食人鱼溶液中草酸和D-纤维二糖的加入能够提高后续PGCs细胞在玻璃爬片上的分散性，使爬片后的细胞分布均匀。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种原始生殖细胞爬片的制备方法，包括玻璃爬片预处理、PGCs细胞纯化、洗涤、固定，其特征在于：所述固定步骤为：将洗涤过的PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的含有半胱氨酸的PFA-PBS溶液中，室温固定，然后吸除PFA-PBS溶液，细胞固定的同时完成细胞的爬片；
所述PFA-PBS溶液浓度中含有0.01%的半胱氨酸；
所述半胱氨酸中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸的比例为100：2.8-4.2；
所述玻璃爬片采用食人鱼溶液进行处理，所述食人鱼溶液中含有0.25-0.30%的草酸和0.12-0.15%的D-纤维二糖；所述食人鱼溶液中浓H2SO4和H2O2的体积比为1：2.0-2.5。
2.根据权利要求1所述的一种原始生殖细胞爬片的制备方法，其特征在于：所述玻璃爬片预处理：将玻璃爬片分别用水和盐酸乙醇超声清洗2-4次，每次8-12min，然后将玻璃爬片置于食人鱼溶液中，70-90℃下反应20-30min，再用水和乙醇各超声清洗2-4次，然后置于3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液中反应15-20h，再用乙醇超声清洗2-4次，置于110-130℃下交联反应3-5h，即得原始生殖细胞爬片。
3.根据权利要求1所述的一种原始生殖细胞爬片的制备方法，其特征在于：所述PGCs细胞纯化：PGCs细胞采用Nycodenz密度梯度离心或Percoll密度梯度离心或流式分选方法进行纯化，然后采用PBS洗涤2-4次，离心，收集PGCs细胞，备用。
4.根据权利要求1所述的一种原始生殖细胞爬片的制备方法，其特征在于：所述洗涤：显微镜下拣取100-200个PGCs细胞置于氨基改性玻璃爬片上的PBS液滴中洗涤，然后拣取细胞，置于氨基改性玻璃爬片上浓度4%的PFA溶液中洗涤，备用。
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