KR20110133843A - 복제몰딩에 의한 ｄｎａ-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 분석 방법 - Google Patents

복제몰딩에 의한 ｄｎａ-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소량의 샘플을 사용하여 DNA가 컨쥬게이트된 하이드로겔 마이크로입자를 균일한 형상과 크기로 제조할 수 있으며, 구형에 제한되지 않고 필요에 따라 다양한 형상으로 제조할 수 있는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법은 (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드를 제조하는 단계; (B) 상기 복제 몰드에, 폴리아크릴레이트 모노머, 일말단이 상기 모노머와 공중합가능하도록 아크릴레이트기로 수식화된 프로브 DNA 및 광개시제를 포함하는 조성물을 충진하는 단계; 및 (C) 상기 복제 몰드에 자외선을 조사하여 상기 조성물을 광중합하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

Description

복제몰딩에 의한 ＤＮＡ-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 분석 방법{Fabrication of DNA-conjugated hydrogel microparticles via replica molding and DNA hybridization assay using the microparticles}
본 발명은 소량의 샘플을 사용하여 DNA가 컨쥬게이트된 하이드로겔 마이크로입자를 균일한 형상과 크기로 제조할 수 있으며, 구형에 제한되지 않고 필요에 따라 다양한 형상으로 제조할 수 있는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 사용한 DNA의 혼성화 문석 방법에 관한 것이다.
핵산의 혼성화 분석 방법은 병원균이나 생물학적 위험물질의 검출, 질병의 진단 등에 매우 유용하다. 평평한 표면에 프로브(probe) DNA들의 마이크로어레이가 형성된 DNA 칩은 혼성화 분석에 널리 사용되고 있으나, 배양시간이 오래걸리고 프로브의 역가가 낮으며 값비싼 장비와 소프트웨어를 필요로 한다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하여 프로브 DNA가 컨쥬게이션된 하이드로겔 마이크로입자를 이용한 DNA의 혼성화 분석 방법이 제안되었다. 하이드로겔은 다량의 수분과 유전자, 펩타이드, 단백질 및 세포 등을 쉽게 함유할 수 있는 3차원 입체 구조를 지닌 친수성 고분자로 고유의 생체친화성 및 친수성 성질로 인해 바이오 센서에 활용가치가 매우 높다. 기존 DNA 칩의 경우 2차원 평면상에서 혼성화 분석이 이루어지는 것에 반해, DNA에 컨쥬게이션된 다공성 하이드로겔 마이크로입자를 이용하면 다공성 3차원 네트워크 상에서 혼성화 분석이 이루어지기 때문에 적은 샘플량으로도 스캐닝을 통해 DNA의 혼성화를 빠르게 분석할 수 있다.
종래기술에 의한 마이크로입자는 마이크로입자를 생성하고자 하는 모노머와, 모노머와 섞이지 않는 유체를 혼합한 후 교반을 통하여 모노머 액적을 형성하고, 자외선 조사나 가열에 의해 이를 경화시키는 유화중합의 방법에 의해 제조되었다. 그러나 이러한 방법으로는 입자의 형상과 크기가 균일한 단분산성 입자를 얻는 것이 어렵다.
형상과 크기가 균일한 단분산성 마이크로입자를 얻기 위해 본 발명자들은 대한민국 등록특허 957200호 및 대한민국 공개특허 10-2010-16799호에서 미세유체칩에 모노머와 모노머와 섞이지 않는 연속상 용액을 함께 주입함으로써 구형의 모노머 액적을 형성시키고 여기에 자외선을 조사하여 구형의 마이크로입자를 제조하는 방법을 제시하였다. 마이크로플루이딕스 기술을 이용한 상기 방법에 의해 입자의 형상과 크기가 균일한 단분산성 입자를 제조할 수 있으나, 표면 장력에 의해 모노머가 연속상 중에서 액적을 형성하기 때문에 구형에서 크게 벗어나지 못한다는 한계가 있다. 또한, 미세유체 장비 내에서 형성된 액적이 흐르는 과정에서 광중합이 일어나야 하므로 복잡한 장비와 고광도의 UV 램프가 필요하며 실험조건을 세밀하게 조절해야 한다. 제조된 마이크로입자는 미처 반응하지 않은 모노머와 연속상 용매와 혼합된 상태로 존재하므로 이들을 제거하기 위한 세척과정이 매우 중요하다.
이러한 문제를 해결하기 위하여, 배치(batch) 공정에 의해 마이크로입자를 제조하는 방법들이 제안되었다. 복제 몰딩(Replica molding)을 이용한 최근의 연구는 Rolland 등(J. Amer. Chem. Soc 2005, 127, 10096-10100)이 제안하는 것과 같은 인쇄기법에 의한 것으로, 주로 의약 전달 시스템에 사용하기 위한 나노스케일의 하이드로겔 입자를 제조하는 데 이용된다. 이 방법에서는 젖음성이 없는 기판상에 모노머 용액을 떨어뜨리고 역시 젖음성이 었는 몰드를 용액 위에 올려 압착하여 인쇄한다. 이후, 몰드 위에 접착성이 있는 물질을 코팅하여 몰드로부터 마이크로 입자를 회수한 후 접착성 물질을 제거하여 마이크로입자를 수득한다. 이러한 인쇄기법은 희석된 시료나 증발이 잘되는 시료를 사용하는 경우 불량이 많이 발생하며, 제조된 마이크로입자의 수거가 복잡하고 제조된 마이크로입자가 접착물질로 오염될 우려가 있다. 또한 입자의 크기가 nm 크기인 경우에 비해 비교적 크기가 큰 본 발명에서 요구되는 10~200㎛ 크기의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조에 적용하는 데는 문제가 있다. Carlos J. Hernandez 등(J. Phys. Chem. 2007, 111 (12), pp 4477~4480)은 실리콘 웨이퍼 상에 모노머 용액을 스핀코팅한 후 광마스크를 사용하여 UV를 조사하는 것에 의해 원하는 형상에만 광중합반응이 일어나도록 하여 다양한 2차원 구조의 마이크로입자를 제조하였다. Nature materials 2006, 5, 365-369와 Science 2007, 315, 1393-1396에서는 마이크로플루이딕스를 이용하면서도 다양한 형상의 마이크로 입자를 제조하는 방법을 제안하였다. 보다 구체적으로는, 미세유체 칩에서 반응성이 매우 빠른 모노머를 채널 내부로 흘리면서 하부로부터 UV를 조사하여 광중합을 유도하는 한편, 자외선이 조사되는 경로에 다양한 형상의 포토마스트를 올려놓아 해당 모양으로만 자외선이 투과되도록 함으로써 포토마스크와 동일한 형상을 갖는 마이크로입자를 제조하는 것이다. 이때 미세유체 칩의 채널의 바닥면을 산소투과가 가능한 PDMS 표면을 사용함으로써 광중합 시 PDMS 표면 부근에서의 광중합을 저해하는 것에 의해 PDMS 표면과의 유착을 방지하여야 한다. 이 방법에서는 별도의 이동상을 사용하지 않는다는 장점이 있으나, 제조된 마이크로입자가 모노머에 현탁되어 있는 상태므로 역시 세척과정이 중요하다.
상기와 같은 복제 몰딩을 사용하는 종래의 방법들은 모노머 용액 중 일부만이 마이크로입자의 제조에 사용되고 나머지는 버려지기 때문에, 값비싼 시료의 사용이 요구되는 바이오응용분야에서는 적용이 어렵다. 따라서, 시료의 사용을 최소로 하면서도 간단한 방법에 의해 다양한 형상의 마이크로입자를 제조할 수 있는 방법이 요구된다.
대한민국 등록특허 957200호 대한민국 공개특허 10-2010-16799호
J. Amer. Chem. Soc 2005, 127, 10096~10100. J. Phys. Chem. C, 2007, 111 (12), pp 4477~4480. Nature materials 2006, 5, 365~369. Science 2007, 315, 1393~1396.
종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 다양한 형상의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 균일한 크기와 모양으로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 시료의 낭비가 없어 경제적으로 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 이용하여 2차원 몰드에서 또는 3차원 현탁용액에서의 핵산의 혼성화 분석 방법을 제공하는 것이다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드를 제조하는 단계; (B) 상기 복제 몰드에, 폴리아크릴레이트 모노머, 일말단이 상기 모노머와 공중합가능하도록 아크릴레이트기로 수식화된 프로브 DNA 및 광개시제를 포함하는 조성물을 충진하는 단계; 및 (C) 상기 복제 몰드에 자외선을 조사하여 상기 조성물을 광중합하는 단계; 를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법에 관한 것이다. 도 1은 본 발명에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법을 보여주는 개념도이다.
본 발명에서 프로브 DNA란 표적 DNA와 혼성화될 수 있도록 표적 DNA와 상보적인 서열을 갖는 유전자 단편을 의미한다. 따라서, 본 발명에 의해 제조된 마이크로입자의 용도에 따라, 즉 검출하고자 하는 표적 DNA의 서열에 따라 그 서열이 정해지는 것이므로 본 발명이 특정 서열에 한정되는 것은 아니다.
상기 (A)단계에서 제조되는 복제 몰드의 재질은 접촉각이 100~110도인 소수성 물질로서 실리콘 웨이퍼로부터 쉽게 몰딩을 얻을 수 있는 유연한 재질인 것이 바람직하다. 특히, 재질이 유연한 경우 복제 몰드는 구부리는 것에 의해 마이크로 입자를 복제 몰드로부터 분리하고 이를 물에 분산시키는 것에 의해 용이하게 회수할 수 있으나, 재질이 유연하지 못한 경우 sonication이나 접착성 물질의 코팅과 같은 추가의 공정이 필요하므로 유연한 재질을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 PDMS(Polydimethylsiloxane)를 사용하여 복제 몰드를 제작하였으나, 폴리이소부틸렌과 같은 합성 고무를 사용할 수도 있다. 복제 몰드 내 마이크로몰드의 크기와 형상은 필요에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, DNA 혼성화 분석에 사용하기 위해서는 변의 길이 또는 직경이 10~200㎛ 정도의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 제조되는 마이크로입자의 크기가 너무 작은 경우 형광 현미경을 통해 형광 강도를 식별하기 어려운 문제가 있으며, 크기가 너무 큰 경우 마이크로입자의 표면적이 너무 작아지므로 유용성이 떨어진다.
마이크로입자의 제조를 위한 조성물은 프로브 DNA가 광중합에 의해 모노머와 가교를 형성할 수 있는 조성을 갖춰야 한다. 즉, 광중합에 의해 가교를 형성할 수 있는 폴리아크릴레이트 모노머와 일말단이 폴리아크릴레이트 모노머와 광중합가능하도록 수식화된 프로브 DNA 및 광개시제를 기본 조성으로 한다. 이외에 상기 조성물은 필요에 따라 폴리에틸렌글리콜이나 포로겐(porogen)을 추가로 함유할 수 있다. PEG나 porogen은 폴리아크릴레이트 모노머와 및 물에 분산이 잘되며 마이크로입자의 제조 후 물에 의해 세척시 녹아나와 해당 부분에 다공성 구조를 형성하므로 표적 DNA의 혼성화 시 보다 효과적으로 표적 DNA의 침투할 수 있도록 한다. 또한 DNA를 안정화 할 수 있도록 pH 조절을 위한 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
이 때, 프로브 DNA는 말단이 폴리아크릴레이트 모노머와 공중합에 의해 가교를 형성할 수 있도록 일말단이 수식화되어 있어야 하는데, 이는 종래 기술에 의해 DNA의 5'-말단을 AcryditeTM(Matrix Technologies)로 수식화하는 것에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. AcryditeTM(Matrix Technologies)를 사용한 수식화 과정은 Matrix Technologies사에서 제공하는 매뉴얼에 상세히 설명되어 있으므로 기재를 생략한다. 그러나 프로브 DNA의 수식화가 AcryditeTM에 의한 것으로 한정되는 것은 아니며, 말단이 아크릴레이트기를 가질 수 있도록 수식화되는 것이라면 본 발명의 범주에 포함된다고 할 수 있다. 상기 조성물 중 프로브 DNA의 농도는 1~75μM인 것이 바람직하다. 프로브 DNA의 농도가 너무 낮으면 마이크로입자 내 프로브 DNA가 너무 소량으로 존재하게 되므로 응용성이 저하되며, 프로브 DNA의 농도가 상기 범위보다 높더라도 실시예에서 확인할 수 있듯이 높은 농도로 인한 추가의 장점이 없으므로 경제성을 고려하면 상기 범위인 것이 좋다.
폴리아크릴레이트 모노머로는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEG-DA), 폴리에틸린 글리콜 디메타아크릴레이트, 4-Hydroxybutyl acrylate (4-HBA), 아크릴아마이드 또는 N-이소프로필아크릴아마이드 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 PEG-DA만을 사용한 예만을 기재하였으나, 본 발명의 주된 개념은 복제 몰드를 사용하여 마이크로 입자를 제조한다는 것이므로 하기 실시예를 참조하여 본 발명의 방법에 의해 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하는 것은 용이할 것이다. 특히, 상기 모노머들은 치환체들은 상이하나 모두 아크릴기가 광중합 반응에서 작용기로서 PEG-DA와 동일한 원리에 의해 반응하는 것이므로, 본 발명의 마이크로입자 제조방법을 성공적으로 적용할 수 있음은 당연하다. 통상 마이크로플루이딕스를 응용하는 경우에는 모노머의 반응성이 높아서 빠른 시간 내에 광중합이 완료되어야 하므로 PEG-DA를 선호하지만, 본 발명의 경우에는 유체가 흐르는 상태에서 광중합이 일어나는 것이 아니라 복제 몰드 내에서 광중합이 이루어지므로 모노머의 반응성이 반드시 높아야 할 필요는 없다. 상기 조성물 중 폴리아크릴레이트 모노머의 농도는 30~60%(v/v)인 것이 바람직하다. 폴리아크릴레이트 모노머의 농도가 너무 낮으면 마이크로입자의 형성이 불완전하며, 폴리아크릴레이트 모노머의 농도가 너무 높은 경우 광중합에 의한 가교형성이 너무 치밀하게 일어나 생성된 마이크로입자의 공극이 너무 작아지는 문제가 있다.
상기 광개시제는 자외선의 조사에 의해 라디칼을 형성할 수 있는 것으로서, 1-Hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone, 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone, 4-(2-hydroxyethoxy)phenyl-(2-hydroxy-2-propyl)ketone, 2-Methyl-1[4-(methylthio)phenyl]-2-morpholinopropan-1-one, 1-Hydroxy-cyclohexyl-phenyl-ketone 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 광개시제의 농도는 1~2%(v/v)인 것이 바람직하다. 광개시제의 농도가 너무 낮으면 광중합반응이 효율적으로 진행되지 않아 마이크로입자가 불완전하게 형성되며, 광개시제의 농도가 너무 높으면 광중합반응이 너무 급격히 진행되어 마이크로입자의 공극의 크기가 너무 작아져 그 응용성이 제한된다. 상기 광개시제의 농도는 사용하는 모노머의 반응성에 따라서도 변할 수 있다. 즉, 모노머의 반응성이 낮다면, 상기 범위보다 많은 양의 광개시제를 필요로 함은 당연하다.
상기 조성물을 복제 몰드에 충진한 후 과량의 조성물은 피펫으로 간단하게 회수하여 다음 반응에 사용할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 의하면 조성물이 다른 용매나 이동상과 혼합되거나 오염되지 않은 상태에서 회수가 가능하며, 마이크로입자의 사용에 필요한 양만큼만 사용하게 되므로 시료의 낭비가 없다. 또한, 조성물의 충분한 광중합 반응이 진행되기 위해 이동상의 속도와 같은 변수를 세밀하게 조정하거나, 짧은 시간에 광중합이 완료되기 위한 고광도의 UV 광원을 사용할 필요가 없으므로 보다 편리하고 경제적으로 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조할 수 있다.
상기 (C) 단계의 광중합 과정 중 조성물이 증발되면 생성되는 입자가 균일하게 제조되지 않는다. 특히, 복제 몰드에 형성된 마이크로몰드의 체적은 nℓ 단위로 매우 작기 때문에 광중합이 일어나는 짧은 시간동안에도 증발이 영향을 미칠 수 있다. 따라서 상기 복제 몰드는 광중합 동안 조성물의 증발을 최소화할 수 있도록 덮개가 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이와 더불어, 광중합 시의 상대습도를 50~90%로 조절하는 것이 바람직하다. 하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 상대습도가 50% 미만인 경우에는 조성물의 증발로 인하여 제조된 마이크로입자가 균일하지 못했다.
상기 방법에 의해 제조된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자는 세척 단계를 거친 후 몰드 내에서 종래의 DNA 칩과 마찬가지로 2D로 사용될 수 있다. 또는 상기 (C) 단계 이후에 복제 몰드로부터 광중합된 마이크로입자를 수집하는 단계를 추가로 포함한 후 제조된 마이크로입자를 회수하고 세척하여 현탁액 상태인 3D 어레이로 사용할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 제조된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 사용한 DNA 혼성화 분석방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 DNA 혼성화 분석 방법은 (A) 프로브 DNA가 함유된 제 1 항에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 준비하는 단계; (B) 표적 DNA를 표지하는 단계; 및 (C) 상기 표지된 DNA와 (A)의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 혼합하여 혼성화하는 단계; (D) 혼성화된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 세척하는 단계; 및 (E) 세척된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 표지의 세기를 측정하는 단계;를 포함하여 이루어 지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하면, 혼성화에 요구되는 인큐베이션 시간을 30분 이하로 크게 단축할 수 있으며 10nm 농도의 미량의 DNA도 혼성화 분석에 의해 특이적으로 검출이 가능하다.
상기 표적 DNA의 표지는 혼성화 여부를 검출할 수 있도록 하기 위한 것으로, 본 발명의 실시예에서는 형광물질을 사용하여 표지하였으나 이외에도 염료를 사용하여 표지한 후 색을 관찰하거나 방사성 물질을 표지하여 방사능을 검출할 수도 있어 당업자라면 기존 표지 방법을 사용하여 용이하게 변형 가능할 것이다.
또한, 상기 (F) 단계에서 표지가 검출되는 경우 표지의 세기를 측정하여 표준 곡선과 비교하는 것에 의해 정량적으로 혼성화 분석할 수 있다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 다양한 형상의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 최소의 시료만 사용하여 균일한 크기와 형상으로 간단하게 제조할 수 있다.
본 발명에 의해 제조된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자는 마이크로플루이딕스를 응용하여 제조한 마이크로입자와는 달리 표면에 프로브 DNA의 다공성 네트워크가 형성되어 있으므로 낮은 농도의 표적 DNA를 사용하여도 혼성화분석이 가능하다. 따라서, 유전자 조작 물질의 검출이나 암과 같은 표지 유전자 등을 미량으로 검출이 가능하므로 질병의 진단이나 생물학적 위험 물질의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자는 다양한 형상으로 제조가 가능하기 때문에 여러 가지 프로브 DNA에 대한 표적 DNA의 혼성화를 한번에 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조과정 및 응용을 보여주는 개념도.
도 2 및 도 3은 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 시 상대 습도의 영향을 보여주는 brightfield 및 형광 현미경이미지.
도 4는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 시 PEG-DA 농도의 영향을 보여주는 형광 현미경이미지, 공촛점 이미지 및 이들로부터 측정한 형광 강도와 표적 DNA의 침투 깊이를 보여주는 그래프.
도 5는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 시 프로브 DNA 농도의 영향을 보여주는 형광 현미경이미지 및 이들로부터 측정한 형광 강도를 보여주는 그래프.
도 6은 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 시 광개시제 농도의 영향을 보여주는 brightfield 및 형광 현미경이미지와 이들로부터 측정한 형광 강도를 보여주는 그래프.
도 7은 본 발명의 일실시예에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 이용한 표적 DNA와의 혼성화 시 서열특이성이 있음을 보여주는 brightfield 및 형광 현미경이미지와 이들로부터 측정한 형광 강도를 보여주는 그래프.
도 8은 본 발명의 일실시예에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 이용한 표적 DNA와의 혼성화 시 표적 DNA의 농도에 따른 형광 강도의 차이를 보여주는 형광 현미경이미지와 이들로부터 측정한 형광 강도를 보여주는 그래프.
이하 첨부된 도면과 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
실시예 1 : 복제 몰드의 제작
복제 몰드는 1cm × 1cm 당 직경이 50~100㎛인 1600개의 마이크로 몰드를 갖도록 제조하였다. 실리콘 웨이퍼 위에 네가티브형 감광제(SU-8, Microchem Co., USA)를 고르게 도포한 후, 2,000rpm으로 스핀 코팅하여 50 ㎛ 높이로 감광제를 코팅하였다. 마스크는 AutoCAD 프로그램을 사용하여 1cm × 1cm 당 1600개의 직경이 50~100㎛인 원, 삼각형 또는 사각형 패턴이 배치되도록 제조하였다. 상기 마스크를 통해 실리콘 웨이퍼 상에 코팅된 감광제 코팅층에 UV를 조사하여 상기 패턴이 양각으로 형성된 마스터 몰드를 제작하였다. 이후, PDMS(Polydimethylsiloxane) (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI)를 제작된 마스터 몰드에 부어준 후 65℃에서 48시간 경화시켜 복제 몰드를 제작하였다.
한편 슬라이드 글라스에 PDMS를 2000rpm에서 30초간 스핀코팅하였다. 이후 복제 몰드의 상면과 슬라이드 글라스 덮개와 소정 간격을 형성하기 위하여 스핀코팅된 슬라이드 글라스에서 상기 복제 몰드의 마이크로 몰드가 생성된 영역에 해당하는 만큼의 사각형 영역의 PDMS를 제거하여 복제 몰드의 덮개를 제작하였다.
실시예 2 : DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조
1) DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 및 혼성화
하기 실시예에서 사용되는 표준화된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법 및 혼성화 방법은 다음과 같다.
DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하기 위하여 30%(v/v) Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEG-DA, Mn=700, Sigma-Aldrich), 10%(v/v) Poly(ethylene glycol) (PEG, Mw=200, Sigma-Aldrich), 2%(v/v) 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (Darocur 1173, photoinitiator (PI), Sigma-Aldrich), 50μM 5'-말단이 AcryditeTM로 수식화(modity)된 프로브 DNA(Integrated DNA Technologies), and 58 %(v/v) TE Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, Sigma-Aldrich and 1 mM EDTA, Sigma-Aldrich) containing 0.02% (v/v) of 10% (w/w) sodium dodecyl sulfate (SDS, Sigma-Aldrich)로 이루어진 전구체 조성물을 제조하였다. 표 1은 하기 실시예에서 사용된 복제 몰드의 단면 형상과 프로브 DNA의 서열을 나타낸다.
Figure pat00001
상기 전구체 조성물 약 75㎕를 실시예 1에서 제조한 PDMS 복제 몰드의 표면에 떨어뜨리고, 일회용 플라스틱 피펫의 끝을 사용하여 마이크로 몰드 내의 공기 방울이 제거되도록 가볍게 두드려 주었다. 몰드를 채우고 남은 과량의 전구체 용액은 피펫을 사용하여 다시 회수하였다. 전구체 용액이 채워진 복제 몰드는 역시 실시예 1에서 제작한 PDMS가 코팅된 슬라이드 글라스 덮개로 덮었다.
덮개로 덮은 복제 몰드를 알루미늄 미러(Thorlabs, Newton, NJ) 위에 놓고 8 W 소형 UV 램프(Spectronics Corp., Westbury, NY)를 사용하여 365nm 자외선을 15분간 조사하였다. 이후, 몰드를 구부려서 광중합된 마이크로입자를 복제 몰드로부터 분리하고, 0.5% (v/v) Tween 20 수용액을 떨어뜨린 후 피펫으로 수집하여 바이알에 담았다. 마이크로입자를 모두 회수할 때까지 Tween 20 수용액을 사용하여 반복하여 수집하였다.
마이크로입자의 형광이미지를 측정하여 제조된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 균일성을 확인하기 위하여 상기 방법에 의해 형광물질이 표지된 표적 DNA를 사용하여 표지하였다. 표적 DNA의 혼성화를 위하여, 상기 기재된 방법에 의해 회수된 약 1000개의 마이크로입자에 0.05%(v/v) Tween 20을 함유하는 5× SSC buffer (75mM sodium citrate, 750 mM sodium chloride, pH 7.0)를 넣고 교반한 후 상등액을 제거하는 방식으로 4회 반복하여 세척하였다. 상등액을 제거한 잔사에 하기 표 2에 기재된 서열의 200nM 표적 DNA 100㎕를 넣고 상온에서 30분간 혼성화하였다. 표적 DNA는 5'-말단이 fluorescein isothiocyanate(FTTC)로 수식화 되어 있는 것으로, Gene 프로브 Technologies로부터 구매하여 사용하였다. 혼성화되지 않은 표적 DNA는 Tween 20을 함유하는 5× SSC buffer (75mM sodium citrate, 750 mM sodium chloride, pH 7.0)를 넣고 교반한 후 상등액을 제거하는 방식으로 세척하여 제거하였다.
Figure pat00002
2) 습도에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조
마이크로입자의 제조 과정에서 전구체 조성물의 증발에 의한 영향을 최소화할 수 있도록 15%, 30%, 50%, 70% 또는 90%의 다양한 상대습도 조건에서 상기 방법에 따라 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하였다. 보다 구체적으로, 1)에 기재된 방법에 의해 전구체 조성물이 충진된 복제 몰드의 덮개를 덮은 후 플라스틱 글로브 박스(Thermo Fisher Scientific) 안에 넣고, 표준 TraceableTM 습도/온도계(VWR)로 습도를 확인하며 0.5 갤런 초음파 가습기를 사용하여 수동으로 습도를 조절·유지하며 광중합 반응을 실시하였다. 가습기로 습도를 조절하지 않은 상태의 습도는 15%였으며, 반응 시 온도는 21℃였다.
1)의 방법에 의해 혼성화된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자에 대해 U-N31001 표준 green filter가 장착된 Olympus BX51 현미경을 사용하여 brightfield 현미경이미지를 측정하였으며, 형광 현미경이미지는 DP70 현미경 디지털 카메라를 사용하여 캡쳐하였다. 또한, 마이크로입자를 복제 몰드로부터 회수하지 않고 몰드에 있는 상태에서 표적 DNA에 상기와 동일한 방법에 의해 혼성화한 후 형광 현미경이미지를 얻었다.
도 2는 상대습도가 15%와 90%인 조건에서 각각 측정된 brightfiled 현미경이미지(a, d)와 현미경이미지(b, c, e, f)로 도면에서 노란 막대는 500㎛를 나타낸다. 도 2의 (a)와 (d)는 15%와 90% 상대습도에서 각각 제조된 마이크로입자의 brightfield 현미경이미지로 15%와 90% 상대습도 조건에서 모두 유사하게 균일한 입자가 제조되었음을 확인할 수 있다. 그러나, 15%와 90% 조건에서 제조된 마이크로입자의 형광이미지를 각각 보여주는 (b)와 (e)를 비교하면, 90% 상대습도 조건에서는 매우 균일한 마이크로입자가 제조된 것에 반해, 15% 상대습도조건에서는 마이크로입자의 크기와 형상은 균일하지만 형광의 세기가 균일하지 않은 것을 확인할 수 있다.
도 2의 (c)와 (f)는 복제 몰드내 위치에 따라 제조된 마이크로입자의 균일성이 차이가 있는 지를 확인하기 위하여 제조된 마이크로입자를 수집하지 않고, 복제 몰드 내에서 혼성화 시킨 것으로 (c)는 15%, (f)는 90%의 상대습도에서 제조된 마이크로입자의 혼성화 후의 복제 몰드의 말단부분의 형광 현미경이미지이다. 도 2의 (f)의 형광이미지는 균일한 형광세기를 나타내는 것에 반해, (c)의 경우 몰드의 바깥부분에서 형광의 세기가 크게 감소하는 것을 볼 수 있다. 이는 복제 몰드에서 마이크로몰드의 부피가 매우 작기 때문에 습도가 낮은 경우에는 광중합 도중에 전구체 조성물이 미량 증발하더라도 그 영향의 커서 하이드로겔의 형성이 효과적으로 이루어지지 않는 판단된다.
도 3은 각 습도조건에서 제조된 마이크로입자를 몰드 내에서 표적 DNA와 혼성화한 후 형광 현미경이미지를 측정한 결과를 보여준다. 도 3으로부터 상대습도가 50% 이상인 경우 마이크로입자가 균일하게 제조되는 것을 확인할 수 있다.
3) PEG-DA 농도에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조
PEG-DA 농도에 따라 제조된 마이크로입자를 사용하여 표적 DNA로 혼성화하는 경우 형광의 세기와 표적 DNA의 침투 깊이에 차이가 있는 지를 확인하기 위하여 PEG-DA의 농도를 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%를 사용한 것을 제외하고는 1)과 동일한 방법에 의해 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하고 표적 DNA와 혼성화하였다.
표적 DNA가 혼성화된 마이크로입자의 63x (NA 1.2) 수침(water immersion)시킨 후 TCS SP2 scanner가 장착된 Leica DMIRE2 현미경(Wetzlar, 독일)을 사용하여 공촛점 이미지를 수집하였다. 이때 여기파장은 488nm, 발광 측정 파장은 500~530nm이었다. z-scan 이미지에 대한 depth scan increment는 3㎛이었다. PEG-DA 농도에 따라 측정된 공촛점 이미지(e-h)를 형광 현미경이미지(a-d)와 함께 도 4에 도시하였다. 또한 측정된 형광이미지로부터 ImageJ software를 사용하여 형광 강도를 측정하고 그 결과를 도 4의 (i)에 함께 나타내었다.
도 4로부터 확인할 수 있듯이, PEG-DA의 농도가 낮을수록 형광 강도가 높아 30% PEG-DA에서 제조한 마이크로입자는 가장 밝은 형광을 나타내었으나, 60% PEG-DA에서 제조한 마이크로입자의 형광은 매우 약하게 나타났다. 형광의 강도와는 무관하게 30~60% PEG-DA 범위에서 제조된 마이크로입자의 형상, 크기와 형광은 모두 균일하였다. 도 4의 (a)~(d)의 노란 막대는 100㎛를 나타내며 붉은 원은 (i)의 형광 강도 측정에 사용된 면적을 나타낸다. 20% PEG-DA를 사용한 경우에는 마이크로입자의 형성이 불완전하여 형광 현미경이미지를 도시하지 않았다.
도 4의 (e)~(h)의 공촛점 이미지에서도 확인할 수 있듯이 표적 DNA의 혼성화 시 표적 DNA의 침투깊이는 마이크로입자 제조 시의 PEG-DA의 농도에 크게 의존하였다. 도 4의 (e)~(h)에서 노란 막대는 100㎛를 나타낸다. 30% PEG-DA를 사용한 경우에는 표적 DNA가 6㎛ 정도 침투하였으나, 60% PEG-DA를 사용한 경우에는 마이크로입자의 표면에서만 혼성화가 일어난 것을 확인할 수 있었다. 이는 PEG-DA의 농도가 높은 경우, 광중합에 의한 가교의 밀도가 높아 공극의 크기가 작아지기 때문에 표적 DNA의 침투가 어려운 것으로 사료된다.
도 4로부터 표적 DNA와 마이크로입자의 혼성화는 표면상에서 대부분 일어나는 것을 확인할 수 있다. 종래 기술에 의해 마이크로플루이딕스를 이용하여 마이크로입자를 제조하는 경우, 연속공정이므로 자외선 조사량에 제한이 생기고, 다공성 PDMS 층을 통한 산소의 투과에 의해 입자 표면에서의 광중합을 저해되므로 표면에 컨쥬게이션된 프로브 DNA 밀도가 제한될 수 밖에 없다. 그러나 본 발명의 복제 몰딩에 의하면 자외선 조사량의 조절이 자유로우므로 표면에서의 광중합이 충분히 진행될 수 있도록 할 수 있으므로 표면에 고밀도의 프로브 DNA를 컨쥬게이션하는 것이 가능하다.
4) 프로브 DNA 농도에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조
마이크로입자의 제조 시 사용한 프로브 DNA 농도에 따라, 제조된 마이크로입자를 사용하여 표적 DNA로 혼성화하는 경우 형광의 세기에 차이가 있는 지를 확인하기 위하여 프로브 DNA의 농도를 도 4에 도시된 바와 같이 1~100μM로 변화시킨 것을 제외하고는 1)과 동일한 방법에 의해 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하고 표적 DNA와 혼성화하였다. 표적 DNA와 혼성화된 마이크로입자의 형광 현미경이미지를 측정하고 그 결과를 도 5에 도시하였다.
도 5의 (a)~(f)는 프로브 DNA 농도 별로 제조된 마이크로입자를 표적 DNA와 혼성한 후 얻은 형광 현미경이미지이며, (g)는 상기 이미지로부터 형광 강도를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 5의 (a)~(f)에서 노란 막대는 200㎛를 나타낸다.
도 5에서 확인할 수 있듯이 표적 DNA와 혼성화된 마이크로입자의 형광 강도는 마이크로입자의 제조시 사용한 프로브 DNA의 농도와 비례하여 증가하다가, 프로브 DNA의 농도가 50μM 이상이 되면 포화되는 양상을 나타내었다.
5) 광개시제(PI) 농도에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조
마이크로입자의 제조 시 사용한 PI 농도에 따라, 제조된 마이크로입자를 사용하여 표적 DNA로 혼성화하는 경우 형광의 세기에 차이가 있는 지를 확인하기 위하여 PI의 농도를 도 5에 도시된 바와 같이 0.5~3%(v/v)로 변화시킨 것을 제외하고는 1)과 동일한 방법에 의해 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 제조하고 표적 DNA와 혼성화하였다. 도 6에 표적 DNA와 혼성화된 마이크로입자의 brightfield 현미경이미지(도 6의 (a), (b))와 형광 현미경이미지(도 6의 (c)~(f)를 측정하고, 형광 강도에 대한 그래프(도 6의 (g))와 함께 그 결과를 도시하였다.
도 6의 (a)와 (d)에서 확인할 수 있듯이 PI의 농도가 0.5%인 경우에는 마이크로입자의 형성이 불완전하였으며 형광 역시 미약하여 광개시제의 농도가 광중합에 충분할 만큼 포함되지 않았음을 알 수 있다. PI의 농도가 1%인 경우에는 마이크로입자의 형성이 완전한 형태를 나타내었으며, 형광 강도도 강하게 나타났으며, PI의 농도가 2%로 증가함에 따라 형광 강도가 크게 증가하였다. 반면 PI의 농도를 3%까지 증가시킨 경우, 형광이 크게 감소하였다. 이는 광개시제의 농도의 증가로 인하여 광중합이 빠르게 진행됨에 따라 마이크로입자에 형성된 공극의 크기가 크게 감소하여 표적 DNA가 공극내로 침투하기가 어렵기 때문으로 사료된다.
실시예 3 : 표적 DNA의 혼성화 분석
1) 표적 서열 특이성 확인
상기 실시예 2의 방법에 의해 제조된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 표적 DNA의 혼성화 분석에 응용하기 위하여 표적 서열에 대한 특이성을 확인하였다.
실시예 2의 1)의 방법에 의해 표 1에 기재된 세가지 프로브 DNA가 각각 컨쥬게이션 된 원형, 세모형 및 사각형의 하이드로겔 마이크로입자를 제조하였다. 제조된 마이크로 입자를 역시 1)에 기재된 방법으로 회수하고 세척하였다.
세가지 마이크로입자를 혼합한 후 혼합된 마이크로입자가 약 1000개 정도씩 포함되도록 세 그룹으로 나누고, 각 그룹에 표 2에 기재된 5'-말단이 FTTC로 modify된 200nM 표적 DNA 100㎕를 각각 가하고 상온에서 30분간 혼성화하였다. 이후 혼성화되지 않은 표적 DNA를 Tween 20을 함유하는 5× SSC buffer (75mM sodium citrate, 750 mM sodium chloride, pH 7.0)를 넣고 교반한 후 상등액을 제거하는 방식으로 세척하여 제거하였다.
각 그룹의 혼성화된 마이크로입자에 대해 brightfiled 현미경이미지와 형광 현미경이미지를 측정하고 그 결과를 도 7의 (a)~(c) 및 (d)~(f)에 각각 도시하였다. 또한, 형광 현미경이미지로부터 형광 강도를 측정하고 이를 도 7의 (g)에 도시하였다. 도 7에서 노란 막대는 200㎛를 나타낸다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 각 표적 DNA는 상보 서열의 프로브 DNA가 함유된 마이크로입자와만 혼성화하여 각 군에서 원형, 네모 혹은 세모 형상을 갖는 마이크로입자만이 형광을 나타내었다. 뿐만 아니라, 사용된 표적 DNA의 서열과 무관하게 동일한 농도의 표적 DNA 서열에 대한 검출 감도가 오차범위 내에서 동일함을 나타내었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 핵산의 혼성화 분석에 응용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2) 표적 DNA 농도에 따른 혼성화 분석
표적 DNA 농도에 따른 정량적인 혼성화 분석이 가능한 지 확인하기 위하여 실시예 2의 1)의 방법에 따라 표 1의 서열번호 1의 프로브 DNA를 사용하여 제조한 마이크로입자를 사용하여, 표 2의 서열번호 4의 표적 DNA의 농도를 0~2μM로 변화시켜 가면서 혼성화를 실시하고 형광 현미경이미지로부터 형광 강도를 측정하였다. 도 8은 형광 현미경이미지와 형광 강도의 그래프를 도시한 것이다. 모든 표적 DNA의 농도범위에서 마이크로입자의 형광 현미경이미지가 균일하게 나타난 것을 확인할 수 있다.
도 8로부터 표적 DNA의 농도가 낮은 범위에서는 형광 강도와 표적 DNA의 농도가 선형적으로 비례하지만, 1μM 이상인 경우, 형광 강도가 포화 곡선을 나타냄을 알 수 있다. 도 8에서 높은 표적 DNA 농도에서 형광 강도가 포화상태인 것은 혼성화가 포화상태에 도달한 것으로 장비의 감도가 포화 상태인 것은 아니다.
도 8의 결과로부터 본 발명의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자는 미량의 표적 DNA를 사용하여도 정성적인 표적 DNA의 혼성화 분석 뿐 아니라 정량적인 분석이 가능한 것을 확인할 수 있었다.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Fabrication of DNA-conjugated hydrogel microparticles via replica molding and nucleic acid hybridization assay using the microparticles <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 1 atgatgatga tgatgatg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 2 ctctaccgat acgtactcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 3 tttttcggca ggtcggtaac 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 4 catcatcatc atcatcat 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 5 ctgagtacgt atcggtagtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 6 gttaccgacc tgccgaaaaa 20

Claims (12)

  1. (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드를 제조하는 단계;
    (B) 상기 복제 몰드에 폴리아크릴레이트 모노머, 일말단이 상기 모노머와 공중합가능하도록 아크릴레이트기로 수식화된 프로브 DNA 및 광개시제를 포함하는 조성물을 충진하는 단계; 및
    (C) 상기 복제 몰드에 자외선을 조사하여 상기 조성물을 광중합하는 단계;
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 복제 몰드에는 덮개가 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (C) 단계 이후에,
    (D) 복제 몰드로부터 광중합된 마이크로입자를 수집하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 복제 몰드는 PDMS(Polydimethylsiloxane) 또는 폴리이소부틸렌으로 이루어진 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 광중합 시의 상대습도는 50~90%인 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 폴리에틸렌글리콜 또는 포로겐(porogen)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 중 상기 폴리아크릴레이트 모노머의 농도는 30~60%(v/v)인 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물 중 프로브 DNA의 농도는 1~75μM인 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    광개시제의 농도는 1~2%(v/v)인 것을 특징으로 하는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법.
  10. (A) 프로브 DNA가 함유된 제 1 항에 의한 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 준비하는 단계;
    (B) 표적 DNA를 표지하는 단계; 및
    (C) 상기 표지된 DNA와 (A)의 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 혼합하여 혼성화하는 단계;
    (D) 혼성화된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자를 세척하는 단계; 및
    (E) 세척된 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 표지의 세기를 측정하는 단계;
    를 포함하여 이루어 지는 것을 특징으로 하는 DNA의 혼성화 분석 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자는 복제 몰드 내에 배열된 2D 어레이 또는 현탁액에 현탁되어 있는 3D 어레이 상태인 것을 특징으로 하는 DNA의 혼성화 분석 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 표지의 세기를 측정하여 표준 곡선과 비교하는 것에 정량적으로 분석하는 것을 특징으로 하는 DNA의 혼성화 분석 방법.
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