CN111164098A

CN111164098A - Egf(a)类似物、其制品、制剂和用途

Info

Publication number: CN111164098A
Application number: CN201880047324.7A
Authority: CN
Inventors: J·F·劳; F·迪斯梅尔; K·V·安德森; B·普雷姆德吉
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2020-05-15
Also published as: MA49617A; WO2019016300A1; US20200165313A1; JP2020527159A; EP3655426A1

Abstract

本发明涉及由LDL‑R的EGF(A)结构域衍生的化合物，特别是包含野生型EGF(A)(LDL‑R(293‑332))序列的肽类似物和至少一个包含至少一个脂肪酸基团的取代基的化合物。本发明还涉及其药物组合物和作为药物的用途。本发明的新型EGF(A)化合物可用于治疗，例如在胆固醇降低、血脂异常和心血管疾病的领域中。

Description

EGF(A)类似物、其制品、制剂和用途

技术领域

本发明涉及EGF(A)肽类似物及其衍生物，更具体地涉及具有脂肪酸取代基的EGF(A)肽类似物，及其药学用途。本发明进一步涉及制备EGF(A)肽类似物、包含EGF(A)类似物(包括EGF(A)衍生物)的EGF(A)化合物的方法。本发明进一步涉及包含包括EGF(A)化合物和EGF(A)衍生物在内的EGF(A)肽类似物的药物组合物。

背景

高LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平和血脂异常是公认的心血管疾病的驱动因素。

他汀类药物已被批准用于治疗血脂异常25年。已经证实这类药物能大幅度地且持续地减少心血管事件，具有可接受的安全性特征。最畅销的他汀类药物，即阿托伐他汀(Lipitor^TM)，一直是世界上最畅销的药物，其从1996年至2012年的销售额超过1250亿美元。

尽管他汀类药物和其它降脂药物可以获得并广泛应用，但许多患者并未达到他们的目标LDL-C水平并且仍处于患心血管疾病的高风险中。PCSK9(9型前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin)促进肝LDL-R(LDL受体)降解，由此降低肝LDL-R表面表达并因此降低LDL颗粒的清除率。相反，阻断PCSK9增加了LDL-C以及其它致动脉粥样硬化脂蛋白的清除率。事实上，LDL受体有助于清除LDL之外的致动脉粥样硬化脂蛋白，如中密度脂蛋白和残余颗粒。增加的中密度脂蛋白和残余颗粒清除率可能具有超出由LDL降低所提供的治疗益处。

经由SREBP2转录因子，他汀类药物增加LDL-R和PCSK9两者的表达。增加的PCSK9表达可减少他汀类药物对从循环中清除LDL-C的作用。通过抑制PCSK9与LDL-R的结合从而防止LDL-R降解，他汀类药物的功效得到增强。综上所述，PCSK9抑制为脂质管理提供了一种新方法。

最近，阿利库单抗

和依伏库单抗

这两种抗PCSK9抗体已被批准用于高LDL-C水平的治疗。这些抗体通过每两周皮下注射1ml来施用。然而，对这种皮下施用药物的剂量方案的依从性可能受到质疑，尤其是对于无症状的状况。

LDL-R(LDL-R-(293-332))的EGF(A)(表皮生长因子样结构域A)序列(40个氨基酸)被公认为PCSK9结合的位点。已经显示分离的野生型EGF(A)肽以低μM范围的IC₅₀抑制PCSK9与LDL-R的结合(Biochemical and Biophysical Research Communications 375(2008)69-73)。这种较差的效力将阻碍EGF(A)肽的实际药物用途。此外，预期这类肽的半衰期太短而无法在治疗上使用。

WO2012177741和J.Mol.Biol.(2012)422,685-696公开了EGF(A)的类似物及其Fc融合体。

仍然需要改善对患者的治疗，例如在功效方面，另外或备选地，在便利性、患者的舒适性方面，如给药方式的舒适性和便利性，并由此在依从性方面。

发明内容

在一个方面，本发明涉及制备EGF(A)肽类似物、包含EGF(A)类似物如本文所述EGF(A)衍生物的EGF(A)化合物的方法。本发明在另一方面涉及包含包括EGF(A)化合物和EGF(A)衍生物在内的EGF(A)肽类似物的药物组合物。

发明人已经发现，在本文所述的EGF(A)肽类似物和化合物的溶液中包含阳离子，特别是二价阳离子，如Ca²⁺是非常有吸引力的。此类离子的使用可能有助于改善制备此类化合物的过程，并且可以包括在肽的表达或合成和/或一个或多个取代基与EGF(A)类似物连接的整个过程中。

本发明涉及具有改善患者治疗的潜力的EGF(A)化合物，尤其在胆固醇降低、血脂异常和心血管疾病的领域中。

在一个方面，本发明提供具有改善的药代动力学(PK)性质的化合物的制剂。具体地，该化合物具有长半衰期，并且仍然显示出良好的抑制PCSK9与LDL-R结合的能力。

另外或备选地，在另一个方面，本发明提供具有改善的抑制PCSK9与LDL-R结合的能力的EGF(A)化合物的制备方法，或者备选地，在另一个方面，本发明提供具有改善的对PCSK9的结合能力的化合物的制备方法。另外或备选地，在另一个方面，本发明提供具有延长的半衰期的EGF(A)化合物的制备方法。另外或备选地，在另一个方面，本发明提供具有延长的半衰期并且不丧失或基本不丧失抑制PCSK9与LDL-R结合的能力的EGF(A)化合物的制备方法。另外或备选地，在另一个方面，本发明提供具有延长的半衰期和持久的结合能力的EGF(A)化合物的制备方法。

在一个方面，本发明提供具有适用于液体制剂的高液体稳定性的EGF(A)化合物的组合物。另外或备选地，在另一个方面，本发明提供对患者具有更便利治疗潜力的EGF(A)化合物的组合物。另外或备选地，在另一个方面，本发明提供具有改善的患者依从性潜力的制剂。本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其它问题。

在一个方面，本发明涉及包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物和二价阳离子的药物组合物。在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物包含由下列序列SEQ ID NO:1定义的EGF(A)肽的EGF(A)肽类似物的化合物：Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu，其中该肽类似物包含301Leu。在一个实施方案中，所述EGF(A)衍生物包含EGF(A)肽类似物，该EGF(A)肽类似物包含301Leu和至少一个包含至少一个脂肪酸基团的取代基。在一个实施方案中，所述EGF(A)衍生物包含EGF(A)肽类似物，其中如上所述，氨基酸301为Leu(L)，而所述肽进一步在位置295(Asn/N)、296(Glu/E)、298(Leu/L)、302(Gly/G)和310(Asp/D)中的一个或多个处包含野生型残基。在进一步的实施方案中，与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)衍生物的EGF(A)肽类似物具有1-15个氨基酸置换。在进一步的实施方案中，所述EGF(A)衍生物的取代基不经由位置295、298、301、302、307和310任一处的氨基酸残基连接至EGF(A)肽类似物。在进一步的实施方案中，所述取代基经由除位置295、298、301、302、307和310处之外的氨基酸残基连接至EGF(A)肽类似物。在进一步的实施方案中，由SEQ ID NO.:1定义的LDL-R的EGF(A)结构域的EGF(A)肽类似物，其中该肽类似物包含301Leu和310Asp，并且其中该肽类似物具有312Lys的氨基酸置换，或者其中该肽类似物不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物具有一个、两个、三个、四个或全部五个下列(野生型)氨基酸残基：295Asn、296Glu、298Leu、302Gly和310Asp/D。在进一步的实施方案中，所述肽类似物在位置297Cys-308Cys、304Cys-317Cys和319Cys-331Cys处包含三个二硫桥。

在另一个方面，本发明涉及如本文所述的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的制备方法，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物在二价阳离子如钙离子的存在下进行至少一步处理。

在另一个方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的组合物。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物的医学用途。

附图简述

图1示出了通过Western印迹法测量的，以各个动物的散点图呈现的，小鼠中的肝LDL-R表达水平。

图2示出了用媒介物或用实施例2的作用延长的EGF(A)化合物处理的仓鼠中的血浆LDL胆固醇。

图3示出了通过Western印迹法测量的，用媒介物或用实施例2的作用延长的EGF(A)化合物处理的仓鼠肝脏中的肝LDL-R表达。

图4示出了EGF(A)骨架肽在反相柱上的纯化运行色谱图。4A显示了在不存在钙的情况下进行纯化时的色谱图。4B显示了在纯化过程中包含10mM钙时的色谱图。

图5示出了EGF(A)类似物的主要同种型在不同pH和乙醇浓度下在室温下孵育3天后的稳定性。阴影(shadings)示出了EGF(A)类似物的主要同种型的百分比。图5显示了在不存在钙的情况下的稳定性，而图5B显示了当包含25mM钙时的稳定性。

图6A示出了具有301L、309R、312E、313K和333K(SEQ ID 32)的EGF(A)类似物在液体组合物中在不同钙浓度下在酰化条件(pH 11.5)下的稳定性。

图6B示出了EGF(A)骨架具有301L、309R、312E、313K和333K且取代基连接至313K和333K上的EGF(A)衍生物(实施例化合物128)在液体组合物中在不同钙浓度下在酰化条件(pH 11.5)下的稳定性。

图7示出了在存在或不存在CaCl₂的情况下，在骨架肽seq ID 32的酰化反应期间，实施例化合物128的产物形成的时间线。

图8示出了在钙离子的存在下，在骨架肽的酰化期间，实施例化合物133、143、144、151和153随时间的产物形成的时间线。这些曲线显示了在pH 11.5下随时间的产物形成。

图9示出了基于来自在37℃下静态保存样品的稳定性研究的数据，纯度损失的拟合曲线。这些曲线呈现了纯度损失相对于钙离子与EGF(A)化合物的摩尔比。

图10示出了对于两种浓度的EGF(A)类似物，通过RP-UPLC-UV215测定的，实施例化合物133、143、144、151和153响应于热应激的％纯度损失。

图11示出了在37℃下静态保存56天的加速稳定性研究期间，通过SEC-UPLC测量的高分子量肽含量(HMWP％)。五种化合物——实施例化合物133、143、144、151和153——各自在四种不同的制剂中测试。实心符号(■)具有1.0mg/ml的化合物，空心符号(□)具有20mg/ml的化合物。虚线不添加钙，实线具有5.0mM CaCl₂。另外，所有制剂均含有20mM Tris，pH7.4，13mg/ml丙二醇，58mM苯酚。

序列表简述

野生型EGF(A)(LDL-R(293-332))的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1包含于序列表中。SEQ ID NO 2-114是各种EGF(A)肽类似物的氨基酸序列。标题为“序列表”的序列表为48KB，创建于2017年7月12日，通过引用并入本文。

详述

在下文中，希腊字母可用其符号或相应的书面名称表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；δ＝delta；ω＝omega；等等。另外，希腊字母μ也可用“u”表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。

在下文中，“一”表示“一个或多个”。

除非说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。

化学式中的星号(*)表示i)连接点，ii)基团，和/或iii)未共享的电子。

在第一方面，本发明涉及药物组合物，其包含含有SEQ ID NO.:1的肽类似物的化合物和阳离子，如二价阳离子，如钙离子。

在其第二方面，本发明涉及药物组合物，其包含含有SEQ ID NO.:1的肽类似物和至少一个包含至少一个脂肪酸基团的取代基的化合物，以及阳离子，如二价阳离子，如钙离子。在其第三方面，本发明涉及包含本发明化合物、钙离子和药学上可接受的辅料的药物组合物。

在进一步的方面，本发明涉及包含SEQ ID NO.:1的类似物和至少一个包含至少一个脂肪酸基团的取代基的化合物的制备方法，其中该取代基包含脂肪酸基团。

在下文中描述了本发明的其它方面和实施方案。

结构特征

EGF(A)化合物

本文使用术语“EGF(A)化合物”来泛指包含EGF(A)肽的化合物，其涵盖如SEQ IDNO:1所定义的wt-LDL-R(293-332)及其类似物。术语EGF(A)化合物涵盖EGF(A)肽的衍生物及其类似物，即，具有如本文所述取代基的EGF(A)肽类似物是EGF(A)化合物的典型实例，而替代的EGF(A)化合物可以是包含EGF(A)类似物的任何化合物，如包含本文所述EGF(A)类似物的融合蛋白。

EGF(A)肽类似物

例如在本发明的背景下使用的术语“肽”是指包含通过酰胺(或肽)键相互连接的一系列氨基酸的化合物。在特定的实施方案中，该肽由通过肽键相互连接的氨基酸组成。

本发明的肽包含至少35个，如36、37、38、39个或至少40个氨基酸。在特定的实施方案中，该肽由36个，如38个或40个氨基酸组成。在另外的特定实施方案中，该肽由35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。

在存在氨基酸添加(在本文中称为N-端和C-端延长)的情况下，本发明的肽可包含至多140个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的肽可包含41个氨基酸残基或可由41个氨基酸残基组成。在特定的实施方案中，其包含40-140、40-120、40-100、40-80、40-60或40-50个氨基酸。

如本文使用的术语“LDL-R的EGF(A)结构域”、“LDL-R(293-332)”、“天然LDL-R(293-332)、“EGF(A)(293-332)”、“野生型EGF(A)”、“wt-EGF(A)”或“天然EGF(A)”是指由序列SEQ ID NO:1组成的肽。

SEQ ID NO:1为：

Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Glu。

在该式中，氨基酸残基的编号遵循LDL-R(LDL-R-(293-332))的EGF(A)结构域的编号，其中第一个(N-端)氨基酸残基被编号为第293号或被给予第293号的位置，并且后续的朝向C-端的氨基酸残基被编号为294、295、296等，直到LDL-R的EGF(A)结构域中的最后一个(C-端)氨基酸残基是编号为332的Glu。

在序列表中进行不同的编号，其中SEQ ID NO:1的第一个氨基酸残基(Gly)被指定为第1号，并且最后一个(Glu)被指定为第40号。这同样适用于序列表中的其它序列，即所指定的N-端氨基酸为第1号，而不考虑其相对于293Gly或参照LDL-R(293-332)置换氨基酸残基的293如何定位。然而，如上所说明的，本文中氨基酸位置的编号是参照LDL-R(293-332)的。

本发明涉及由SEQ ID NO:1所确定的EGF(A)肽的类似物以及由SEQ ID NO:1定义的LDL-R的野生型EGF(A)结构域的这类EGF(A)肽类似物的衍生物。

术语“类似物”通常是指这样的肽，其序列与参照氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸变化。

如本文使用的术语“本发明的类似物”、“本发明的肽类似物”、“LDL-R(293-332)类似物”、“EGF(A)类似物”、“EGF(A)肽类似物”或“SEQ ID NO:1的类似物”可以指这样的肽，其序列包含相对于序列SEQ ID NO:1的氨基酸置换，即氨基酸替换。“类似物”还可包括N-端和/或C-端位置的氨基酸延长和/或N-端和/或C-端位置的截短。

与SEQ ID NO.:1的同一性水平可以通过确定相对于SEQ ID NO 1没有改变的氨基酸的数目来计算。SEQ ID NO:1由40个氨基酸残基组成，并且如果引入三个氨基酸置换，则同一性水平为37/40％＝92.5％。如果5个氨基酸残基发生改变，则同一性水平为87.5％。如果所述肽在N-端或C-端延长，则该部分通常不包括在该比较中，而一个或多个氨基酸的缺失缩短了该比较物。例如，在上述实例中，如果N-端氨基酸缺失，则同一性水平分别略微降低至36/39×100％和34/39×100％。当讨论衍生物的骨架序列的同一性时，取代基的氨基酸残基(例如该取代基所连接的残基，也称为该取代基的氨基酸残基)可以是野生型(wt)或置换的氨基酸。如果该取代基的氨基酸残基为野生型残基，如N-端Gly或312K，则该残基包括于同一性水平的计算中，而从293至332的任何其它位置处的Lys将是氨基酸置换，且不包括在与SEQ ID NO.:1的氨基酸同一性的计算中。

在一个实施方案中，与SEQ ID NO.:1相比，所述EGF(A)肽类似物具有1-15个氨基酸置换。在一个实施方案中，与SEQ ID NO.:1相比，该EGF(A)肽类似物具有1-10个氨基酸置换。在一个实施方案中，与SEQ ID NO.:1相比，该EGF(A)肽类似物具有1-8个氨基酸置换，诸如与SEQ ID NO.:1相比具有1-7、1-6、1-5个氨基酸置换。在特定的实施方案中，在该EGF(A)肽类似物中可存在至多7个氨基酸置换，例如可存在至多6、5、4、3、2或1个氨基酸置换。

在一个实施方案中，本发明的类似物具有与SEQ ID NO.:1至少75％的同一性，如80％、如85％、如90％或甚至95％的同一性，在没有截短的情况下分别对应于至多10、8、6、4和2个相对于SEQ ID NO 1的氨基酸置换。

本发明的每种肽类似物可参照以下两方面来描述：i)天然EGF(A)(LDL-R(293-332))中与改变的氨基酸残基相对应的氨基酸残基的编号(即天然LDL-R(293-332)EGF(A)中的相应位置)，和ii)实际改变。

换言之，可参照天然LDL-R(293-332)EGF(A)肽来描述本发明的肽类似物，也就是当与天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO:1)相比时其中许多氨基酸残基已经改变的其变体。这些变化可独立地代表一个或多个氨基酸置换。

以下是合适的类似物命名法的非限制性实例：

并入本文实施例2衍生物中的EGF(A)肽类似物可被称为以下LDL-R(293-332)EGF(A)肽类似物：(301Leu,309Arg)LDL-R(293-332)EGF(A)，或(Leu301,Arg309)-LDL-R(293-332)EGF(A)或(301L,309R)LDL-R(293-332)或(L301,R309)LDL-R(293-332)。这意味着当这种类似物与天然LDL-R(293-332)比对时，其i)在该类似物中根据该比对与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置301相对应的位置处具有Leu，ii)在该类似物中与天然LDL-R(293-332)EGF(A)的位置309相对应的位置处具有Arg。

与SEQ ID NO:1相比，“包含”某些指定改变的类似物可包含进一步的改变。

在特定的实施方案中，所述类似物“具有”或“包含”指定改变。在特定的实施方案中，该类似物由这类改变“组成”。当对于类似物使用术语“由...组成”或“组成”时，例如类似物由一组指定的氨基酸置换组成或由一组指定的氨基酸置换组成的类似物，应当理解该指定的氨基酸置换是该肽类似物中仅有的氨基酸置换。相反，“包含”一组指定的氨基酸置换的类似物可具有另外的置换。

由以上实例可以明显看出，氨基酸残基可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效。

通过参考参比序列天然LDL-R(293-332)EGF(A)(SEQ ID NO:1)，表述“与…等同的位置”或“相应位置”可用来表征变异LDL-R(293-332)EGF(A)序列中发生变化的位点。等同或相应位置，以及改变的编号，例如通过简单的书写和目测来容易地推断；以及/或者可使用标准蛋白质或肽比对程序，如基于Needleman-Wunsch算法的“align”。。

在下文中，可能发生以下情况：定义化学式，使得两个后续的化学基团均可被选择为“键”。在这类情况下，这两个后续的化学基团实际上将不存在，并且只有一个键会连接周围的化学基团。

氨基酸是含有氨基和羧酸基团并任选地含有一个或多个常常被称为侧链的额外基团的分子。

术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(20种标准氨基酸中的)，以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的那些氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸。非蛋白型氨基酸或者未见于蛋白质中，或者不通过标准细胞机器产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非蛋白型氨基酸的非限制性实例是Aib(α-氨基异丁酸或2-氨基异丁酸)、正亮氨酸、正缬氨酸以及蛋白型氨基酸的D-异构体。

在下文中，未说明其光学异构体的本发明肽的每个氨基酸应当被理解为是指L-异构体(除非另有说明)。

本发明的肽类似物

本发明的一个方面涉及SEQ ID NO:1的肽的类似物。

本发明的肽类似物可被定义为包含作为SEQ ID NO:1的类似物的氨基酸序列的肽。本发明的肽类似物具有结合PCSK9的能力。在具体的实施方案中，本发明的类似物具有例如与天然LDL-R(293-332)(天然EGF(A))或其它PCSK9结合化合物相比改善的结合PCSK9的能力。

本发明的肽类似物具有抑制PCSK9结合LDL-R的能力。在一个实施方案中，该肽为PCSK9抑制剂。在一个实施方案中，该肽抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。可使用本文实施例D.1.1中描述的试验来评估这样的结合。在一个实施方案中，本发明的肽类似物和肽衍生物为PCSK9抑制剂肽或简称为PCSK9抑制剂。在一个实施方案中，本发明涉及SEQ ID NO.:1的肽类似物，其中该肽类似物能够抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。

在一个实施方案中，与EGF(A)、LDL-R(293-332)(SEQ ID 1)相比，本发明的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂具有改善的结合PCSK9的能力。

在一个实施方案中，与实施例48(SEQ ID 2)相比，本发明的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂具有改善的结合PCSK9的能力。

在一个实施方案中，如在PCSK9-LDL-R结合竞争性ELISA测定中测量的，本文所述的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂的K_i低于10nM，如低于8nM或如低于5nM。

如本文实施例D1.2中所述，本文的EGF(A)类似物及其衍生物的功能性可进一步通过它们改善LDL摄取的能力来表征。在一个实施方案中，本发明的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂在PCSK9的存在下增加LDL摄取。在一个实施方案中，本发明的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂能够逆转或减低PCSK9介导的LDL摄取减少。

在一个实施方案中，如在LDL摄取试验中测量的，本发明的肽类似物、化合物或PCSK9抑制剂具有低于1500nM，如低于1000nM或如低于500nM的EC₅₀。

在一个实施方案中，本发明的肽类似物可被定义为与SEQ ID NO:1相比包含至少1个氨基酸置换，并且任选地包含延长。在一个实施方案中，本发明的肽类似物可被定义为与SEQ ID NO:1相比包含至多15个、至多14个、至多13个、至多12个、至多11个、至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或1个氨基酸置换，并且任选地包含延长。这意味着包含N-端和/或C-端延长的肽除所述延长外还可在位置293至332处包含至多15个氨基酸置换。

氨基酸“延长”也可被称为“延伸”。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含延长。所述延长可以是在SEQ ID NO:1或其类似物的N-端位置处添加至多50个氨基酸残基，也被称为N-端延长，意味着本发明的肽可从位置292向下直至例如位置242处包含至多50个氨基酸。另外或备选地，所述延长可以是在SEQ ID NO:1或其类似物的C-端位置处添加至多50个氨基酸残基，也被称为C-端延长，意味着本发明的肽可从位置333向上直至例如位置383处包含至多50个氨基酸。

所述延长可存在于N-端、C-端或存在于两者。所述延长也可以是彼此独立地在每一侧0至50个氨基酸之间的任何长度的延长。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含1-50、1-40、10-40、1-30、10-30、20-30、20-40、20-50、30-50、1-10、11-20、21-30、31-40或41-50个氨基酸残基的或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基的N-端延长。另外或备选地，本发明的肽类似物可包含1-50、1-40、10-40、1-30、10-30、20-30、20-40、20-50、30-50、1-10、11-20、21-30、31-40或41-50个氨基酸残基的或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸残基的C-端延长。

在某些情况下，延长可被称为置换，因为引入了新的氨基酸残基，如本文示例的292A、292Lys或333Lys。

EGF(A)肽的N-端和/或C-端处的较小截短可存在于该EGF(A)肽类似物中。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽包含至少35个氨基酸残基，如36个氨基酸残基，如37个氨基酸残基，如38个氨基酸残基或如39个氨基酸残基。在一个实施方案中，该EGF(A)肽类似物相应地包含1-2个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，一个或两个N-端氨基酸残基缺失。在进一步的实施方案中，该EGF(A)肽类似物相应地包含至少缺失或特定缺失氨基酸293Gly的N-端截短。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含至少缺失或特定缺失293Gly-294Thr的N-端截短。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含1个氨基酸残基的C-端截短。在一个实施方案中，单个C-端氨基酸残基缺失。在一个实施方案中，该肽类似物包含特定缺失氨基酸332Glu的C-端截短。

另外或备选地，本发明的肽类似物在N-端或C-端，例如在位置292和/或333处可包含至少一个氨基酸延长。

本发明的EGF(A)肽类似物包含氨基酸残基301从Asn至Leu的氨基酸置换，还描述为Asn301Leu或简单地描述为301Leu。在特定的实施方案中，该EGF(A)肽类似物包含置换301Leu。

另外或备选地，所述EGF(A)肽类似物包含氨基酸残基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys和331Cys。这些Cys残基是可参与二硫桥的野生型残基，如297Cys与308Cys之间、304Cys与317Cys之间以及319Cys与331Cys之间的二硫桥。

在一个实施方案中，如上所述，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu和多个其它氨基酸置换。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu、310Asp，以及312Lys的氨基酸置换。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu和310Asp，并且其中该肽类似物不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu、309Arg和312Glu。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu和309Arg，条件是该肽类似物不具有310Asp至310Lys的置换，或者

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含301Leu和309Arg，条件是该肽类似物不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。

在进一步的实施方案中，所述肽类似物不具有D310K、D310N、D310Q、D310Q、D310R和D310A中的任何置换或甚至不具有310Asp的任意置换。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含一个、两个、三个或全部四个野生型残基：295Asn、296Glu、298Leu和302Gly。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物包含一个、两个、三个、四个或全部五个野生型残基：295Asn、296Glu、298Leu、302Gly和310Asp。

在一个实施方案中，所述肽具有295Asn。

在一个实施方案中，所述肽类似物具有296Glu。在一个实施方案中，该肽类似物具有298Leu。在一个实施方案中，该肽类似物具有302Gly。在一个实施方案中，该肽类似物具有310Asp。

在一个实施方案中，所述肽类似物具有310Asp、295Asn和296Glu中的两个或更多个。在一个实施方案中，该肽类似物具有310Asp、295Asn和296Glu中的全部3个。

如本文所述，所述EGF(A)肽类似物可包含其它氨基酸置换。在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。

在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、331和332。

在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330和332。

在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：299、300、309、313、316、318、321、322、323、324、326、328、329、330和332。

在一个实施方案中，本发明的类似物可进一步在选自以下位置的位置处包含一个或多个进一步的氨基酸置换：309、312、313、321、324、328和332。

在进一步的实施方案中，除上文指定的氨基酸残基之外，所述肽类似物还在某些特定位置处包含野生型氨基酸残基或者不同的残基，即氨基酸置换。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置293处包含氨基酸残基Gly(G)或Asn(N)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置294处包含氨基酸残基Trp(W)、Thr(T)或Gly(G)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)或Tyr(Y)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)或Ala(A)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置300处包含氨基酸残基His(H)或Asn(N)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)或Ile(I)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置307处包含Ile(I)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Glu(E)、His(H)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)或Ser(S)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)或Arg(R)。

在一个这样的实施方案中，本发明的类似物在位置309处包含氨基酸残基Lys(K)或Arg(R)。

所述EGF(A)肽类似物可包含若干如本文所述的氨基酸置换，如选自299Ala、307Ile和321Glu的一个或多个氨基酸置换。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)、Lys(K)或Glu(E)。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)或Glu(E)。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Glu(E)。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物在位置324处包含氨基酸残基Gln(Q)或Gly(G)。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物在位置329处包含氨基酸残基Arg(R)或His(H)。

在进一步的实施方案中，所述EGF(A)肽类似物不具有300Asn(N)至Pro(P)的置换。

LDL-R的EGF(A)结构域在位置312处包含赖氨酸，该赖氨酸可用于如本文所述的置换。在不希望将该取代基连接至312的实施方案中，312Lys可被如本文所述的另一种氨基酸置换。

在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Gly、Pro、Asp、Glu、Arg、His、Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Gly、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Ile、Leu、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，位置312处的Lys被选自Asp、Glu、Thr、Asn、Ile、Leu、Phe和Tyr的氨基酸残基置换。在一个实施方案中，312Lys被312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile或312Phe置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Asp、312Gln或312Arg置换。

在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Phe或312Tyr置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu、312Asn或312Ile置换。

在一个实施方案中，312Lys被312Glu或312Arg置换。在一个实施方案中，312Lys被312Arg置换。在一个实施方案中，312Lys被312Glu置换。

在一个实施方案中，所述EGF(A)肽类似物中不包含其它Lys。

为了包括将取代基在各个位置连接的选项(进一步参见下文)，可以通过SEQ IDNO.:1的野生型残基的氨基酸置换或通过SEQ ID NO.:1的肽延长如292Lys或333Lys来引入Lys。

在需要多于一个取代基的情况下，一个可以经由312Lys，而第二个是经由通过肽延长或SEQ ID NO.:1中的置换所引入的Lys。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的肽类似物包含至少一个在选自下组的位置处的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

另外或备选地，本发明的肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含至少一个选自下组的氨基酸置换：292Lys、293Lys、294Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任意置换：296K、298K、301K、302K和307K。

在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任意置换：296K、298K、301K、302K、307K和310K。

在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任意置换：296K、298K、301K、302K、307K和295K。

在一个实施方案中，本发明的肽类似物不包含以下任意置换：296K、298K、301K、302K、307K和295D。

在特定的实施方案中，本发明的肽类似物包含零个Lys置换。在特定的实施方案中，本发明的肽类似物不包含Lys残基。

在特定的实施方案中，本发明的肽类似物包含1或2个这样的Lys置换。

另外或备选地，本发明的肽可以包含312Lys。

在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含两个Lys残基。在一个实施方案中，本发明的肽类似物包含两个Lys残基，这两个Lys残基选自由以下组成的对：

如上所述，本发明提供各种肽类似物。在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)肽类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示i-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换。

在更进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物由如下所示i-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换组成。

在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)肽类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示i-xvi组中的任一个所表示的氨基酸置换。

在更进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物由如下所示i-xvi组中的任一个所表示的氨基酸置换组成：

i.301Leu和309Arg

ii.301Leu、309Arg、312Glu

iii.301Leu、307Ile和309Arg

iv.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu

v.301Leu、309Arg和321Glu

vi.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu

vii.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala

viii.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu

ix.301Leu和309Arg和至少一个Lys置换

x.301Leu、309Arg、312Glu和至少一个Lys置换

xi.301Leu、307Ile和309Arg和至少一个Lys置换

xii.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu和至少一个Lys置换xiii.301Leu、309Arg和321Glu和至少一个Lys置换

xiv.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu和至少一个Lys置换

xv.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala和至少一个Lys置换，或者xvi.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu和至少一个Lys置换。

在一个实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物包含由以下任一项所表示的氨基酸置换或由其组成：

v.301Leu、309Arg和321Glu

vi.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu，或者

xiii.301Leu、309Arg、312Glu和至少一个Lys置换

xiv.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu和至少一个Lys置换。

在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)肽类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示xvii-xx组中的任一个所表示的氨基酸置换。

在更进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物由如下所示xvii-xx组中的任一个所表示的氨基酸置换组成：

xvii.301Leu和309Lys

xviii.301Leu、309Lys和312Glu

xix.301Leu和309Lys和至少一个其它Lys置换

xx.301Leu、309Lys和312Glu和至少一个其它Lys置换。

在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)肽类似物与SEQ ID NO.:1相比包含至少两个由以下所示xxi-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换。

在更进一步的实施方案中，本发明的EGF(A)肽类似物由如下所示xxi-xxiv组中的任一个所表示的氨基酸置换组成：

xxi.301Leu和307Ile

xxii.301Leu、307Ile和312Glu

xxiii.301Leu和307Ile和至少一个其它Lys置换，和

xxiv.301Leu、307Ile和312Glu和至少一个其它Lys置换。

在进一步的具体实施方案中，根据本发明的肽类似物或化合物的肽类似物包含由SEQ ID 1至114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID1至114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-47和49-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-47和49-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-44、46、47和49-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-44、46、47和49-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-109和111-114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-109和111-114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:19、21、73、107、108、109、110、111、112、113和114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:19、21、73、107、108、109、110、111、112、113和114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:2、5、6、23、26、49、50、62、81、107、108、109、110和111所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:2、5、6、23、26、49、50、62、81、107、108、109、110和111所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:107、108、109、110、111、112、113和114所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:107、108、109、110、111、112、113和114所表示的任一个氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:107、108、109、110和111所表示的任一个氨基酸序列或由SEQ ID NO.:107、108、109、110和111所表示的任一个氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述肽类似物包含由SEQ ID NO.:107所表示的氨基酸序列或由SEQ ID NO.:107所表示的氨基酸序列组成。

下表中包括具体的EGF(A)肽类似物，包括关于氨基酸置换的信息和SEQ ID NO。

中间体化合物

本发明还涉及可以并入本发明衍生物的肽类似物。这类肽类似物可被称为“中间产物”或“中间体化合物”。它们为新型LDL-R(293-332)类似物的形式，如上所述其可以如下文进一步描述的并入本发明的EGF(A)衍生物中。这类肽类似物如以上部分所定义。

特别是，根据本发明的肽类似物或中间肽可被称为序列SEQ ID NO:1的肽类似物。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的用于制备EGF(A)化合物如EGF(A)衍生物的EGF(A)肽类似物。

如本文所述的EGF(A)肽类似物可以备选地用作其它蛋白质元件的融合配偶体，从而产生具有本发明EGF(A)肽类似物的有益作用的另外的替代EGF(A)化合物。在这样的实施方案中，该EGF(A)肽可具有零个、一个或两个Lys残基。

本文中针对本发明肽类似物公开的其它特征、定义、方面和实施方案也可适用于本发明的中间产物。

EGF(A)衍生物

本发明的肽类似物可进一步包含取代基并由此成为衍生化合物。

术语“衍生物”通常是指可通过化学修饰、尤其是通过一个或两个取代基的共价连接由天然肽或其类似物制备的化合物。

如本文使用的术语“本发明的衍生物”、“EGF(A)衍生物”、“EGF(A)衍生物”或“LDL-R(293-332)衍生物”或“LDL-R(293-332)类似物的衍生物”是指连接有一个或两个取代基的肽。另外或备选地，这些中的每一个可被称为侧链。换言之，“本发明的衍生物”包含肽(即在此为EGF(A)肽类似物的肽序列)和至少一个(包括诸如一个或两个)取代基。

术语“取代基”用来描述与EGF(A)肽共价键合的部分，例如该取代基为并非该EGF(A)肽本身一部分的部分。

在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物的氮原子。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物的氨基。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸或连接至EGF(A)肽类似物的Lys残基。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸残基的α-氮。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物中的Lys残基。在一个实施方案中，一个或多个取代基连接至EGF(A)肽类似物中的Lys残基的ε-氮。

取代基的实例是多种多样的，并于以下进一步描述。

在一个方面，本发明涉及包含EGF(A)肽类似物和至少一个取代基的EGF(A)衍生物。在一个实施方案中，该衍生物的取代基包含至少一个脂肪酸基团。对于所有的实施方案，术语EGF(A)衍生物还涵盖其任何药学上可接受的盐、酰胺或酯。

取代基

取代基是连接至EGF(A)肽类似物的部分。根据本发明，优选的是该部分，例如取代基，对EGF(A)肽的功能性没有影响或具有最小的影响，同时增加其它有益性质，如较长的半衰期和/或改善的口服给药后暴露。

由此得出，所述衍生物以及以上描述的本发明类似物具有结合PCSK9的能力。这种与PCSK9的结合抑制了PCSK9与LDL-R的结合，从而防止了LDL-R降解，因此增加LDL-C和致动脉粥样硬化脂蛋白的清除率。

在具体的实施方案中，本发明的衍生物和类似物具有例如与天然LDL-R(293-332)或其它PCSK9结合化合物相比改善的结合PCSK9的能力。例如，使用本文实施例D.1.1所述的试验可测试本发明的类似物和衍生物抑制PCSK9结合LDL-R的能力。

在一个实施方案中，所述取代基旨在改善肽的功能性。

在一个实施方案中，所述取代基以如下方式延长肽类似物的半衰期：包含骨架肽和取代基的衍生物的血浆半衰期具有与骨架肽的半衰期相比延长的半衰期，如实施例1和48所述(D2部分，表7)。用于确定在不同物种中的半衰期的方法在本领域中公知，并且在此以小鼠和狗为例来说明(D2和D5部分)。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物具有超过4小时的半衰期。

在一个实施方案中，如在皮下或静脉内给药后测量的，根据本发明的EGF(A)衍生物在小鼠中具有超过6小时，如超过8小时或者如超过10小时的半衰期。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物在狗中具有超过25小时的半衰期。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物在狗中具有超过50小时，如超过100小时或者如超过150小时的半衰期。

在一个实施方案中，半衰期延长取代基为蛋白质部分。在进一步的这类实施方案中，该蛋白质部分可包括人白蛋白、Fc结构域或非结构化的蛋白质延伸。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分可以与肽类似物融合。在进一步的实施方案中，该蛋白质部分为Fc结构域并且该Fc结构域与肽类似物融合。当制备Fc融合体时，所得化合物将通常是二价的，因为两个Fc多肽将形成一个Fc结构域。

在一个实施方案中，所述取代基不是蛋白质部分。在一个实施方案中，该取代基不是与EGF(A)肽类似物融合的蛋白质部分。在一个实施方案中，该蛋白质部分不是Fc结构域。

在另一个实施方案中，所述取代基是非蛋白质部分。

在特定的实施方案中，所述取代基能够与白蛋白形成非共价复合物，从而促进衍生物在血流内的循环，并且还具有延长衍生物的作用时间的效果。在特定的实施方案中，该取代基能够延长EGF(A)化合物的作用时间，而基本上不降低其与PCSK9的结合能力。

在一个实施方案中，所述EGF(A)衍生物包含半衰期延长取代基。多种半衰期延长取代基在本领域中是公知的，并具体包括如下文进一步描述的包含脂肪酸基团的白蛋白结合物，并且这类白蛋白结合物是非蛋白质取代基。

所述取代基包含至少一个脂肪酸基团。

在特定的实施方案中，所述脂肪酸基团包含含有至少8个连续-CH₂-基团的碳链。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含至少10个连续的-CH₂-基团，如至少12个连续的-CH₂-基团、至少14个连续的-CH₂-基团、至少16个连续的-CH₂-基团、至少18个连续的-CH₂-基团。

在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含8-20个连续的-CH₂-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含10-18个连续的-CH₂-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含12-18个连续的-CH₂-基团。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含14-18个连续的-CH₂-基团。

在衍生物包含两个取代基的情况下，用较短的脂肪酸基团可以获得延长的半衰期，因此在衍生物包含两个取代基的实施方案中，该脂肪酸基团可包含至少8个连续的-CH₂-基团，如至少10个连续的-CH₂-基团，如至少12个连续的-CH₂-基团，至少14个连续的-CH₂-基团，至少16个连续的-CH₂-基团。

在衍生物包含两个取代基的进一步的实施方案中，每个取代基包含含有8-18个连续-CH₂-基团的脂肪酸基团。在进一步的这类实施方案中，该脂肪酸基团包含10-18个连续的-CH₂-基团，如12-18个连续的-CH₂-基团，如14-18个连续的-CH₂-基团。

如本文使用的术语“脂肪酸基团”可被称为包含至少一个官能团的化学基团，该官能团为pKa<7的

酸。作为

酸的这类官能团的非限制性实例包括羧酸(还包括羧基苯氧基)、磺酸、四唑部分。

在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含选自羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基氨基甲酰基氨基(MSU)部分和3-羟基-异噁唑部分的官能团。因此，本发明的半衰期延长取代基在一个实施方案中包含羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基氨基甲酰基氨基部分或羟基-异噁唑部分，其进一步包含8-20个连续的-CH₂-基团，如下所定义：

化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为C(n+2)二酸或者被称为

化学式1b：

其中n为8-20范围内的整数，

化学式2：5-四唑基-(CH₂)_n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为

化学式2b：

其中n为8-20范围内的整数。

化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为

化学式3b：

其中羧基在化学式3的(C₆H₄)基团的位置2、3或4处，并且其中m为8-11范围内的整数。

化学式4：HO-S(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为

化学式4b：

其中n为8-20范围内的整数，

化学式5：MeS(O)₂NH(CO)NH-(CH₂)_n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为

化学式5b：

其中n为8-20范围内的整数，化学式6：3-HO-异噁唑-(CH₂)_n-CO-*，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为

化学式6b：

其中n为8-20范围内的整数。

术语官能团在其酸性形式时被称为FG-H，并且其共轭碱形式被称为FG^-。本文使用的术语“pKa<7的官能团”可被称为

酸，其在水溶液中的甲基衍生物(CH₃-FG-H)形式具有低于7的平衡pKa，其中pKa为以下所示平衡的平衡常数(Ka)的-log：

本领域公知测定pKa的方法。例如Reijenga等人在Anal Chem Insights 2013(2013；8:53-71)中描述了这样的方法。

在一个实施方案中，根据本发明的取代基包含一个或多个连接体元件。该连接体元件可通过酰胺键与脂肪酸基团连接并被称为Z₂-Z₁₀。如下文进一步定义的，连接体元件的数目可以至多为10个。

在具体的实施方案中，所述取代基为式I的取代基：

Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-[I]，其中

Z₁选自：

化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，或

化学式1b：

化学式2：5-四唑基-(CH₂)_n-CO-*，或

化学式2b：

化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，或

化学式3b：

其中羧基在-(C₆H₄)-的位置2、3或4处，

化学式4：HOS(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，或

化学式4b：

化学式5：MeS(O)₂NH₂N(CO)NHN-(CH₂)_n-CO-*，或

化学式5b：

和

化学式6：3-HO-异噁唑-(CH₂)_n-CO-*，或

化学式6b：

其中n为8-20范围内的整数，并且m为8-11范围内的整数。

在特定的实施方案中，在化学式1或1b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定的实施方案中，在化学式2或2b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定的实施方案中，在化学式4或4b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在特定的实施方案中，在化学式3或3b中m为8、9、10或11。

在特定的实施方案中，在化学式5或5b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在特定的实施方案中，在化学式6或6b中n为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

在特定的实施方案中，符号*表示与Z₂中的氮的连接点。在另一个实施方案中，其中Z₂为键，符号*表示与相邻Z元件的氮的连接点。

在式I的背景中使用的术语“键”意为共价键。当式I(Z₁-Z₁₀)的组分被定义为键时，其相当于其中不存在所述组分的式I。

本文下文中的表述Z₂-Z₁₀中的任一个为键也可以被解读为Z₂-Z₁₀中的任一个不存在。在逻辑上“键”不能跟随“键”。因此本文的表述“键”意指在前的Z元件共价连接至不是“键”(或不存在)的下一个Z元件。

连接体元件Z₂-Z₁₀选自能够形成酰胺键的化学部分，包括氨基酸样部分，如Glu、γGlu(也被称为gammal Glu或gGlu，并由*-NH-CH-(COOH)-CH₂-CH₂-CO-*定义)、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep和TtdSuc，和以下定义的其它部分。

Z₂选自

化学式7：*-NH-SO₂-(CH₂)₃-CO-*，或

化学式7b：

化学式8：*-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-*，或

化学式8b：

和

键。

Z₃选自γGlu、Glu或键。

当Z₂为化学式7或化学式7b时，Z₃选自γGlu、Glu或键。

Z₃选自γGlu、Glu或键，条件是当Z₂为化学式8时，Z₃选自γGlu、Glu。

当Z₂为化学式8时，Z₃选自γGlu和Glu。

Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉彼此独立地选自Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep、TtdSuc和键。

本领域公知Glu、Gly、Ser、Ala、Thr为氨基酸残基。

γGlu为化学式9：*-NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO-*，其与化学式9b相同：

并且也可以被称为gGlu。

TtdSuc为化学式10：

*-NH-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂O-(CH₂)₃-NHCO*，或

*-NH-CH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂NHCO*，其与化学式10b相同：

Ado为化学式11：*-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-*，也可被称为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，并且其与化学式11b相同：

Aeep为化学式12：*NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CO*，其还可被称为

化学式12b：

Aeeep为化学式13：*NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CO*，其还可被称为

化学式13b：

Z₁₀选自键，和化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*，其还可被称为化学式14b：

在特定的实施方案中，当Z₁₀为化学式14时，所述取代基连接至所述肽的N-端氨基。

在另一个实施方案中，当Z₁₀为键时，所述取代基连接至存在于所述肽中的Lys残基的ε位置或连接至所述肽的N-端氨基酸残基。

在一个实施方案中，所述衍生物包含两个取代基。在一个这样的实施方案中，这两个取代基是相同的。在一个这样的实施方案中，这两个取代基是不同的。在一个实施方案中，这两个取代基连接至EGF(A)肽类似物的氮原子。在一个实施方案中，这两个取代基连接至EGF(A)肽类似物的氨基。在一个实施方案中，这两个取代基连接至N-端氨基酸EGF(A)且连接至EGF(A)肽类似物的Lys残基。在一个实施方案中，一个取代基连接至EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸残基的α-氮，并且一个取代基连接至该EGF(A)肽类似物的Lys残基。在一个实施方案中，两个取代基连接至EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸。在一个实施方案中，这两个取代基连接至EGF(A)肽类似物的不同Lys残基。在一个实施方案中，这两个取代基连接至EGF(A)肽类似物中不同Lys残基的ε-氮。

在存在两个取代基的一个实施方案中，Z₁₀为连接至肽类似物的N-端氨基的一个取代基中的化学式14，并且Z₁₀为连接至存在于所述肽类似物中的Lys残基的ε位置的另一个取代基中的键。

在存在两个取代基的另一个实施方案中，Z₁₀为连接至肽类似物的N-端氨基的一个取代基中的键，并且Z₁₀为连接至存在于所述肽类似物中的Lys残基的ε位置的另一个取代基中的键。

在存在两个取代基的另一个实施方案中，Z₁₀是两个取代基中的键，并且这两个取代基中的每一个都连接至存在于肽类似物中的不同Lys残基的ε位置。

在特定的实施方案中，可以通过一个或两个取代基的共价连接由EGF(A)肽类似物制备本发明的衍生物。

在特定的实施方案中，所述两个取代基为式I：Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-[I]。Z₁至Z₁₀如上所定义。在特定的实施方案中，这两个取代基为式I并且是相同的，这意味着选定的Z₁至Z₁₀在两个取代基中是相同的。在另一实施方案中，这两个取代基为式I并且是不同的，这意味着一个或多个选定的Z₁至Z₁₀在一个取代基与另一个取代基之间不同。

具体取代基

如上所见，各种取代基可以由本领域技术人员制备。本申请中包括的取代基因此不被认为是对本发明的限制。

在一个实施方案中，所述一个或两个取代基选自：

HOOC-(CH₂)₁₈-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₈-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu-2xADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-2xADO-

HOOC-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-3xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-2xgGlu

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-3xGly

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-2xgGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-TtdSuc

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-4xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO-gGlu-2xADO

3-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO-gGlu-2xADO

3-HO-异噁唑-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

HOS(O)₂-(CH₂)₁₅-CO-gGlu-2xADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

HOS(O)₂-(CH₂)₁₃-CO-gGlu-2xADO

四唑基

-(CH₂)₁₅-CO-NH-SO₂-(CH₂)₃-CO-ADO-ADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

四唑基-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

四唑基-(CH₂)₁₅-CO-gGlu-2xADO和

MeS(O)₂NH(CO)NH-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为14或16；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且所有Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16或18；Z₂为化学式8(Trx)；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式2：四唑基-(CH₂)_n-CO-*，其中n为15；Z₂为化学式7(磺酰亚胺)；Z₃为键；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式2：四唑基-(CH₂)_n-CO-*，其中n为15；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式2：四唑基-(CH₂)_n-CO-*，其中n为12；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为键；并且所有Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且所有Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的一个为γGlu，并且其余五个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的一个为γGlu，并且其中的两个为Ado，并且其余三个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的三个为Gly，并且其余三个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，该取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的三个为Ado，并且其余三个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的四个为Ado，并且其余两个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的一个为TtdSuc，并且其余五个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为化学式8(Trx)；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为9；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的一个为TtdSuc，并且其余五个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；并且Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式4：HO-S(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，其中n为15；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式4：HO-S(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，其中n为15；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式5：MeS(O)₂NH(CO)NH-(CH₂)_n-CO-*，其中n为12；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，所述取代基为式I，其中Z₁为化学式6：3-OH-异噁唑-(CH₂)₁₂-CO-*，其中n为12；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

具体取代基组合：

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式I的取代基，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式I的取代基，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为14；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式I的取代基，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为14；Z₂为键；Z₃为γGlu；所有Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个式I的取代基，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*；另一个取代基为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*；另一个取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键；另一个取代基为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式I，其中Z₁为化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，其中n为16；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉中的两个为Ado，并且其余四个为键；Z₁₀为键；并且另一个取代基为式I，其中Z₁为化学式4：HOS(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，其中m为15；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*。

在一个实施方案中，本发明的化合物包含或具有两个取代基，一个为式I，其中Z₁为化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，其中m为10；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为键；另一个取代基为式I，其中Z₁为化学式4：HOS(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，其中m为15；Z₂为键；Z₃为γGlu；Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈和Z₉中的两个为Ado，其余四个为键；Z₁₀为化学式14：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*。

肽和连接位点

根据本发明的EGF(A)衍生物或化合物包含由SEQ ID NO.:1所定义的LDL-R的EGF(A)结构域的EGF(A)肽类似物。这样的肽序列已经在上文详细描述，并且本发明的衍生物或化合物的肽可通过相同术语来描述和定义。该EGF(A)衍生物或化合物进一步具有至少一个与肽序列连接的、如本文以上描述的取代基。

在本发明的化合物中，所述取代基与肽共价连接，意思是连接至肽序列的一个氨基酸残基。

在一个实施方案中，本发明的EGF(A)衍生物包含不连接至以下位置中的任一个的取代基：295、296、298、301、302和307。在进一步的实施方案中，该取代基不连接至以下位置中的任一个：295、296、298、301、302、307和310。在进一步的这类实施方案中，它也不连接至以下位置中的任一个：299和320。

在特定的实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置297、304、308、317、319和331中任一个之外的任一个位置连接。

在特定的实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置297、298、301、302、304、307、308、317、319和331中任一个之外的任一个位置连接。

在特定的实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、317、319和331中任一个之外的任一个位置连接。在特定的实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、310、317、319、320和331中任一个之外的任一个位置连接。在特定的实施方案中，取代基经由位置292至333中除了位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、309、310、317、319、320和331中任一个之外的任一个位置连接。

在一个实施方案中，所述取代基连接至EGF(A)肽类似物的位置292、293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。

在一个实施方案中，所述取代基连接至EGF(A)肽类似物的位置292、293、294、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。

在一个实施方案中，所述取代基连接至EGF(A)肽类似物的位置292、293、294、300、303、305、306、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332和333中的任意一个或两个。

在一个实施方案中，所述取代基连接至肽序列的N-端氨基酸。在特定的实施方案中，该N-端氨基酸为Gly。在特定的实施方案中，该N-端氨基酸为293Gly。在特定的实施方案中，该N-端氨基酸为293Lys。在特定的实施方案中，该N-端氨基酸为292Lys。它也可以是N-端位置的Lys或Gly或另一个氨基酸残基，该N-端位置可以是293或从N-端进一步向下的任何位置，如294Thr、294Gly或294Lys或295Asn。在特定的实施方案中，该取代基连接至肽类似物的N-端氨基酸残基的α-氮。在另一个实施方案中，如果N-端氨基酸残基为Lys，则该取代基可共价连接至该赖氨酸残基的α-氮或ε氨基。

在特定的实施方案中，取代基连接至存在于肽中的Lys残基的ε-氨基。

在另一个实施方案中，取代基连接至C-端位置的Lys，该位置可以是位置332、333或进一步朝向C-端的任何位置。

在本发明的肽包含N-端或C-端延长的实施方案中，所述取代基可以连接至所述延长的氨基酸残基上。在存在N-端延长的情况下，取代基可连接至所述延长的N-端氨基酸或连接至存在于延长序列内的Lys。在存在C-端延长的情况下，取代基可连接至C-端位置的Lys残基或连接至存在于延长序列内的Lys。

在又一个实施方案中，所述取代基连接至存在于肽序列中的氨基酸。在特定的实施方案中，该取代基连接至存在于肽中的赖氨酸残基。在特定的实施方案中，该取代基连接至存在于肽中的赖氨酸残基的ε氨基。与该取代基连接的赖氨酸残基可位于LDL-R(293-332)EGF(A)肽类似物的任何位置，包括肽的N-端位置或C-端位置、N-端延长(如果存在)的N-端残基之内或之处的任何位置、C-端延长(如果存在)的C-端残基之内或之处的任何位置。

如上文所述，所述EGF(A)肽类似物可具有一个或多个Lys残基；并且这些残基可用于取代基的连接。

在特定的实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在特定的实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在特定的实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293Lys、294Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在另一个实施方案中，所述取代基所连接的赖氨酸选自：293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

在所述取代基连接至C-端延长的实施方案中，该取代基所连接的赖氨酸可以选自333Lys至242Lys位置中的任一个和/或333Lys至383Lys位置中的任一个。

在本发明化合物具有两个取代基的实施方案中，该取代基可以如上所述彼此独立地连接，这意味着任一个可连接至肽的N-端氨基酸，连接至肽的C-端氨基酸，或连接至肽的氨基酸序列内的氨基酸。

在Lys存在于N-端位置的实施方案中，两个取代基可以均与肽的N-端Lys连接。一个可与所述Lys的N-端α-胺连接，而另一个可与所述Lys的ε-氮连接。当存在两个取代基时，一个取代基可与肽的N-端氨基酸连接，而另一个取代基与肽内的氨基酸如Lys连接。或者，一个取代基可与肽的C-端位置的Lys连接，而另一个取代基与肽内的氨基酸如Lys连接。或者，一个取代基可与肽(包括延长)内的氨基酸残基如Lys连接，另一个取代基与肽(包括延长)内的另一个氨基酸残基如Lys连接。

在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基在N-端与肽连接；或者所述取代基在位置292Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置293Lys处与肽连接，或者所述取代基在位置299Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置300Lys与肽连接；或者所述取代基在位置309Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置311Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置312Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置313Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置314Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置315Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置316Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置318Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置320Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置321Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置322Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置323Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置324Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置325Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置326Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置328Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置329Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置330Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置332Lys处与肽连接；或者所述取代基在位置333Lys处与肽连接。

在本发明的衍生物具有两个取代基的实施方案中，所述取代基可经由N-端和以上提及的任意Lys位置如293Lys、309Lys、313Lys、324Lys、328Lys、330Lys、332Lys和333Lys与肽连接。

在衍生物包含两个取代基的进一步的实施方案中，它们可与两个不同的Lys残基连接，如以下任意Lys残基对：

在一个实施方案中，所述两个取代基经由333Lys和选自293Lys、309Lys、312Lys、313Lys、314Lys、321Lys、324Lys、328Lys、330Lys和332Lys的Lys连接。

在一个实施方案中，所述两个取代基经由333Lys和选自312Lys、313Lys、314Lys、321Lys、324Lys、328Lys和330Lys的Lys连接。

在一个实施方案中，所述两个取代基经由333Lys和选自313Lys、324Lys和328Lys的Lys连接。

如上所述，所述肽可具有一个或多个可与如本文所述特定位置上的特定氨基酸残基组合的氨基酸置换。这类特定氨基酸残基可以是应该被保持的野生型氨基酸残基，如半胱氨酸，其在一系列优选实施方案中，例如与本文所述的其它特征组合，可存在于肽类似物中。在这类实施方案中，该肽类似物在位置297Cys-308Cys、304Cys-317Cys和319Cys-331Cys处包含三个二硫桥。在这类实施方案的另一个实例中，肽衍生物的肽类似物包含在位置297Cys-308Cys、304Cys-317Cys和319Cys-331Cys处的三个二硫桥和至少一个取代基，其中该取代基不与选自所述肽类似物的295、296、298、301、302和307的位置连接。本领域技术人员将会理解，肽序列信息的组合可与取代基的位置和身份信息组合以定义本发明的各种具体实施方案。

在一个实施方案中，所述肽类似物在除取代基所连接的位置外的其它位置不包含Lys。

在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基在N-端位置连接或者连接至任何位置的Lys，并且所述肽类似物在所有其它位置不包含Lys。在一个实施方案中，本发明的化合物具有一个取代基，所述取代基连接至除位置312以外的任何位置的Lys，并且所述肽类似物在位置312Arg处包含Arg。

在一个实施方案中，本发明的化合物具有两个取代基，并且所述肽类似物在除取代基所连接的位置外的位置不包含Lys。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物选自以下EGF(A)衍生物：实施例1-47、51-102和106-159。

在进一步的实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物单独地选自以下EGF(A)衍生物：实施例1-47、51-102和106-159。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物选自以下EGF(A)衍生物：实施例1-44、46-47、51-55、57、60-64、66-69、71-102和106-159。

在一个实施方案中，根据本发明的EGF(A)衍生物选自以下EGF(A)衍生物：实施例31、95、128、133、143、144、150、151、152和153。

制备EGF(A)化合物的方法

本发明在另一方面涉及制备EGF(A)化合物的方法。

发明人惊讶地发现，二价阳离子的存在提高了制备本发明EGF(A)化合物所涉及的各种工艺步骤的产率，特别是在液相中进行的所有步骤，包括在水溶液中进行的步骤，以及在采用有机溶剂的溶液中进行的步骤。当进行各种实验室操作时，具有多个允许在不同溶液中储存和溶解而不损害稳定性的可用选项非常有吸引力。

如本文所述，可以通过不同路径制备包括EGF(A)衍生物的EGF(A)化合物。可以合成EGF(A)肽类似物，并且在这样的合成过程中连接一个或多个取代基。或者，可以在两步法中制备EGF(A)衍生物，该方法包括制备EGF(A)肽类似物的第一步和将取代基连接到EGF(A)肽类似物上的第二步。发明人发现，当进行后一种方法时，当包含二价阳离子时，该工艺的产率增加。在特定的实施方案中，诸如钙离子等二价阳离子可以包含在包含EGF(A)化合物的任何溶液中，如包含EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物的水溶液中。

在一个实施方案中，本发明涉及制备EGF(A)肽类似物的方法，其中该EGF(A)肽类似物在阳离子如钙离子的存在下进行处理。

在进一步的实施方案中，所述方法包括在二价阳离子如钙离子的存在下纯化EGF(A)肽类似物。独立于制备EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的方法，在一个实施方案中，可以在二价阳离子如钙离子的存在下纯化该分子。在一个这样的实施方案中，纯化在4-10的pH下，如5-10，如5-9，如5-8，或如6-8的pH下进行。

在一个实施方案中，本发明涉及制备EGF(A)衍生物的方法，其中在二价阳离子的存在下，至少一个取代基连接至EGF(A)肽类似物。如上文所述，该取代基可以是半衰期延长部分，包括但不限于上文所述且由本文具体公开的取代基举例说明的包含脂肪酸基团的取代基。

在一个实施方案中，本发明涉及制备EGF(A)化合物的方法，其包括以下步骤：

i.提供EGF(A)肽类似物

ii.提供取代基

iii.在二价阳离子的存在下，将所述半衰期延长部分连接到所述EGF(A)肽类似物上，

由此获得EGF(A)化合物。

在进一步的实施方案中，本发明涉及制备EGF(A)衍生物的方法，其包括以下步骤：

i.提供EGF(A)肽类似物

ii.提供取代基

iii.在二价阳离子的存在下混合所述EGF(A)肽类似物和所述半衰期延长部分

由此获得EGF(A)衍生物。

从本文的公开内容中可以明显看出，如果例如在以上步骤i中采用的EGF(A)肽类似物制品中包括阳离子，则二价阳离子可存在于整个制备EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的方法中。如果在步骤iii中稀释该制品，则包括另外的二价阳离子可能是有利的。还应注意，对EGF(A)肽类似物的任何处理优选在二价阳离子如钙离子的存在下进行。

在一个实施方案中，在钙离子的存在下纯化EGF(A)肽类似物。

在一个实施方案中，所述方法包括包含二价阳离子的盐。在一个实施方案中，该方法包括包含诸如Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺和Sr²⁺等二价阳离子的盐。在一个实施方案中，该盐是乙酸盐或氯化物盐。在一个实施方案中，该盐是钙盐。在一个实施方案中，该方法包括钙盐，其中该盐是CaCl₂或Ca(OAc)₂。在进一步的实施方案中，该盐是CaCl₂。

在一个实施方案中，所述二价阳离子如钙的浓度为至少1mM，如至少2mM或如至少5mM。在一个实施方案中，钙离子的浓度为至少5mM，如10mM，如20mM，如30mM，如40mM，如50mM，如60mM，如80mM，或如至少100mM。

在一个实施方案中，钙离子的浓度为至多100mM，如至多75mM，如至多50mM。在一个实施方案中，二价阳离子的浓度为2-100mM，如5-75mM或如10-50mM。

在一个实施方案中，二价阳离子的浓度为10-100mM，如10-75mM或如10-50mM。

如本文其它地方所述，钙与EGF(A)化合物的浓度比可以以当量描述，当制备EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物时，当量也可用于定义阳离子，特别是钙离子的量。

在一个实施方案中，相对于EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度，钙离子的浓度为至少0.5，如至少1，如至少2，如至少3，如至少4或至少5当量。

在一个实施方案中，钙离子的浓度为EGF(A)肽类似物浓度的至少0.5当量，如至少1，如至少2，如至少3，如至少4当量。

在一个实施方案中，钙离子的浓度为EGF(A)肽类似物浓度的至多100当量，如75，如50，如至多40，如至多30，如至多20，如至多10当量。

在一个实施方案中，钙离子的浓度为EGF(A)肽类似物浓度的0.5-50当量，如1-40，如2-40，如2-30，如5-25当量。

如本文所述，根据将要生产的化合物，可以应用各种策略。

如实施例中所示，具有连接至N-端上的取代基的衍生物通过直接合成和还原烷基化获得，而具有经由赖氨酸残基，即经由赖氨酸残基的ε-氨基连接的取代基的衍生物的制备则通过直接合成或通过在上述溶液中进行酰化来完成。本领域技术人员可以另外找到适合于制备EGF(A)化合物的替代方法。

当进行两步法时，对赖氨酸的选择性可能是一个问题，因为活化的取代基也可以与N-端氨基反应。本发明进一步提供了在两步法中将取代基选择性地连接到赖氨酸残基上的方法。

在一个实施方案中，本发明涉及制备上述EGF(A)衍生物的方法，其中升高pH。在一个实施方案中，通过添加NaOH来升高pH。在一个实施方案中，用NaOH将pH升高至高于10，如高于11。为了提高反应产率，还可以在将取代基(酰化试剂)与EGF(A)肽类似物混合的反应步骤中也调节pH，以确保在升高的pH下进行该工艺步骤。

可以包括各种溶剂，例如与水混溶的有机溶剂及其混合物，以确保试剂的溶解性。这类溶剂可以被包括在一个或多个步骤中。溶剂的实例是N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、乙腈、二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺。

在进一步的实施方案中，在将取代基连接至EGF(A)肽类似物的步骤中包括N-甲基吡咯烷酮。甲基吡咯烷酮可以与EGF(A)肽类似物制品和/或取代基一起包括在内。

在形成EGF(A)衍生物后，可以通过添加酸来中和反应混合物。在特定的实施方案中，该中和通过添加三氟乙酸来实现。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的化合物，包括例如本发明的肽类似物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯，以及药学上可接受的辅料。这类组合物可如本领域所知的那样制备。

术语“辅料”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非医药活性物质。辅料可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。辅料的非限制性实例是：溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和稳定剂。药学活性成分与各种辅料的配制是本领域已知的，参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。

本发明的组合物可以是液体制剂的形式，即包含水的水性制剂。液体制剂可以是溶液或悬浮液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50％w/w水的制剂。类似地，术语“水溶液”被定义为包含至少50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”被定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。

或者，它可以是固体制剂，例如冷冻干燥的或喷雾干燥的组合物。

所述药物制剂可包含浓度为0.1-200mg/mL，如1mg/mL至100mg/mL的化合物。所述制剂可进一步包含缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。

本发明的药物组合物可进一步包含第二活性成分，如治疗剂，其可在联合治疗的情况下简化给药。

本发明的组合物可以是口服组合物，并且给药途径为口服。本发明的化合物，特别是作用延长的化合物，即衍生化合物，适用于口服给药。本发明的肽和化合物根据本发明可包含于口服制剂，即适用于口服给药并且能够提供适当水平的生物利用度的组合物。可以使用本领域已知的口服制剂技术。这包括使用N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸的盐，特别是如WO96/30036和WO2008/028859中所述的N-(8-(2-羟基苯甲酰基)氨基)辛酸钠(SNAC)，以及如EP1154761和US 8053429中所述的包括癸酸钠的GIPET制剂。

为了提供用于口服组合物的化合物，本发明人证实了本发明的EGF(A)肽衍生物在大鼠中表现出胃肠吸收(表10)。

或者，本发明的组合物可以用于肠胃外给药，例如通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行。当然，目标在于皮下给药的化合物可能不需要表现出胃肠吸收，而可能需要其它特征，如在液体制剂中的高稳定性。

在一个方面，本发明涉及用于皮下给药的药物组合物，其中该组合物包含如本文所述的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物。

在一个这样的实施方案中，所述药物组合物为液体制剂的形式，即包含水的水性制剂。在一个实施方案中，所述药物组合物是包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的液体制剂。在一个实施方案中，该液体制剂另外包含一种或多种辅料，如溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和/或稳定剂中的一种或多种。在一个实施方案中，该液体制剂不含缓冲液。在一个实施方案中，该液体制剂另外包含一种或多种辅料，如溶剂、稀释剂、防腐剂、张度调节剂、螯合剂和/或稳定剂。

在进一步的实施方案中，包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的药物组合物包含二价阳离子，如选自Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺或Si²⁺的二价阳离子。在一个实施方案中，该药物组合物包含盐。在一个实施方案中，该药物组合物包含Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺或Si²⁺的盐。在一个实施方案中，该药物组合物包含钙离子(Ca²⁺)。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐或氯化物盐。在一个实施方案中，所述药物组合物包含磷酸盐，该磷酸盐包含例如H₂PO^4-、HPO₄ ^2-或PO₄ ^3-。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含乙酸盐(OAc)或氯化物(Cl)的盐。在一个实施方案中，该盐是钙盐。在一个实施方案中，所述药物组合物包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物和盐，其中该盐为CaCl₂或CaOAc。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含CaCl₂。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物和盐。在一个实施方案中，所述药物组合物包含盐，其中该盐是诸如Mg²⁺、Ba²⁺、Ca² ⁺和Sr²⁺等二价阳离子的盐。在一个实施方案中，该盐是CaCl₂。在一个实施方案中，二价阳离子的浓度为至少1mM，如至少2mM或如至少5mM，如至少10mM，如至少25mM，如至少50mM，如至少为75mM，或如至少100mM。

在一个实施方案中，二价阳离子的浓度为至多200mM，如至多150mM，如至多100mM，如至多75mM或如至多50mM。在一个实施方案中，二价阳离子的浓度为2-200mM，如5-150mM，如10-100mM，如5-75mM或如10-50mM。

在一个实施方案中，所述组合物包含0.1-200mg/ml的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物和如上所述的阳离子。在一个实施方案中，所述组合物包含0.5-100mg/ml，如1-50mg/ml，如2-25mg/ml的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物。

在一个实施方案中，EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度以摩尔浓度如0.01-50mM提供。

本发明的发明人得出以下结论，以钙举例说明的阳离子的稳定作用取决于EGF(A)肽类似物与阳离子的浓度比，因此优选通过使用摩尔浓度比，相对于EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的量调节阳离子的量。

在一个实施方案中，EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的摩尔浓度应为阳离子浓度的至多10倍。在一个实施方案中，EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的摩尔浓度至少等于阳离子的浓度。

所述浓度比可以被称为当量，使得当阳离子和EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度相同时，所述组合物包含相对于EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物为一(1)当量的阳离子。如果如上所述，阳离子的浓度为EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度的至少1/10，则包含至少0.1当量的阳离子。在一个实施方案中，相对于EGF(A)肽、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，所述组合物包含至少0.1当量，如至少0.2当量，如至少0.5当量的阳离子或盐。

在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含至少0.5当量的阳离子。在这样的实施方案中，所述盐可以以EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的至少0.5当量存在。为避免疑问，这意味着该盐的摩尔浓度至少为EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度的一半。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少1.0当量的阳离子。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含相对于EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物为至少1当量，如2或3当量的阳离子。

在进一步的实施方案中，所述阳离子或盐的浓度为EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的至少4当量，如至少6，如至少8或如至少10当量。在一个实施方案中，所述阳离子或盐的浓度为EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的1-20，如2-18，如5-15当量。

本领域技术人员将会知道，在药物组合物中可以使用另外的辅料，如溶剂、稀释剂、缓冲液、防腐剂、张度调节剂、螯合剂、表面活性剂和/或稳定剂。

在一个实施方案中，本发明涉及如上文所述的药物组合物，其进一步包含缓冲液、防腐剂、张度剂和螯合剂中的一种或多种。

在一个实施方案中，本发明涉及如上文所述的药物组合物，其进一步包含防腐剂、张度剂和螯合剂中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含缓冲剂。该缓冲液可选自乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、HEPES和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、琥珀酸盐、天冬氨酸、天冬酰胺或其混合物。

在一个实施方案中，所述组合物包含缓冲剂，该缓冲剂选自：Tris和HEPES。在一个实施方案中，该缓冲液是Tris缓冲液。在一个实施方案中，所述组合物包含5-50mM Tris。

在一个实施方案中，所述组合物的pH为5-10，如6-9，如7-8，如7.2-7.8，如7.3-7.6，如大约7.4。

在本发明进一步的实施方案中，所述制剂进一步包含药学上可接受的防腐剂。在本发明进一步的实施方案中，该防腐剂选自苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、苄醇、氯丁醇、苯甲酸、咪脲、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苄索氯铵或其混合物。防腐剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。

在一个实施方案中，所述组合物包含选自苯酚或间甲酚的防腐剂。

在一个实施方案中，所述防腐剂是苯酚。在一个实施方案中，所述组合物包含10-100mM苯酚，如20-80mM，如25-75mM，如40-60mM，如50-70mM。

在本发明进一步的实施方案中，所述制剂进一步包含等渗剂。该等渗剂可选自盐(例如氯化钠)，糖，如单糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖(包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐)，或糖醇，如氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)，醛醇(例如甘油(丙三醇)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)，聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物。糖醇包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿糖醇。

在进一步的这类实施方案中，所述组合物包含等渗剂，该等渗剂选自：丙二醇和甘油。在一个实施方案中，所述稳定剂是丙二醇。

等渗剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。

在本发明进一步的实施方案中，所述制剂进一步包含螯合剂。在本发明进一步的实施方案中，该螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸、EGTA的盐，及其混合物。

如上所述，所述制剂可包含盐，其包含二价阳离子，如起稳定剂作用的Ca²⁺。在本发明进一步的实施方案中，所述制剂可包含备选的或另外的稳定剂。稳定剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第19版,1995。

在进一步的这类实施方案中，所述制剂进一步包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。

在进一步的这类实施方案中，所述稳定剂选自聚乙二醇(例如，PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如，HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、巯基乙酸和2-甲基硫代乙醇，以及不同的盐(例如氯化钠)。

在本发明进一步的实施方案中，所述制剂进一步包含表面活性剂。典型的表面活性剂(其中商品名的实例在方括号[]中给出)为聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯[吐温20]、聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯[吐温40]或聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯[吐温80]、泊洛沙姆如聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物[普朗尼克(Pluronic)F68/泊洛沙姆188]、聚乙二醇辛基苯基醚[Triton X-100]或聚氧乙二醇十二烷基醚[Brij 35]。表面活性剂在药物组合物中的应用是技术人员公知的。为方便起见，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版,1995。

在本发明的肽药物制剂中可能存在其它成分。这类附加成分可以包括湿润剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒介物、蛋白质(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

本发明的组合物可进一步混入或连接至(例如通过共价、疏水和静电相互作用)药物载体、药物递送系统和先进药物递送系统，以便进一步增强化合物的稳定性、增加生物利用度、增加溶解度、降低不良反应、实现本领域技术人员公知的时间疗法，以及增加患者依从性，或其任何组合。载体、药物递送系统和先进药物递送系统的实例包括但不限于：聚合物，例如纤维素和衍生物；多糖，例如葡聚糖和衍生物；淀粉和衍生物；聚(乙烯醇)；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物；聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物；聚乙二醇；载体蛋白质，例如白蛋白；凝胶，例如热胶凝体系，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚体系；胶束；脂质体；微粒；纳米颗粒；液晶及其分散体；本领域技术人员公知的脂质-水体系中的相行为的L2相及其分散体；聚合物胶束；多重乳液；自乳化；自微乳化；环糊精及其衍生物；和树状聚体。

在一个实施方案中，所述药物组合物用于肠胃外给药。可借助于注射器，任选地借助于笔式注射器，通过皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射进行肠胃外给药。或者，可借助于输注泵进行肠胃外给药。进一步的选项是可以是用于以鼻或肺喷雾的形式施用化合物的溶液或悬浮液的组合物。

联合治疗

使用根据本发明的EGF(A)肽类似物或其衍生物进行的治疗还可以联合一种或多种额外的药理学活性物质，例如选自抗糖尿病剂、抗肥胖剂、食欲调节剂、抗高血压剂、用于治疗和/或预防由糖尿病导致或与糖尿病相关的并发症的药剂，以及用于治疗和/或预防由肥胖症导致或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。

这些药理学活性物质的实例为：GLP-1受体激动剂、胰岛素、DPP-IV(二肽基肽酶-IV)抑制剂、胰淀素(amylin)激动剂和瘦蛋白受体激动剂。这类活性物质的具体实例为GLP-1受体激动剂利拉鲁肽(liraglutide)、索马鲁肽(semaglutide)以及德谷胰岛素(insulindegludec)。

药物适应症

在一个方面，本发明涉及如本文所述的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物用于制备药物的用途。

本发明还涉及用作药物或用于制备药物的本发明化合物，例如根据本发明的肽类似物或衍生物，或其药物组合物。

在一个实施方案中，本发明的化合物或其组合物可用于(i)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；降低LDL-C，增加HDL；降低小而密的LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；(ii)预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病。

本发明还涉及用于以下目的的方法：(i)改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质；增加HDL-C；降低LDL-C，降低小而密的LDL-C；降低VLDL-C；降低甘油三酯；降低胆固醇；降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平；抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；(ii)预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病；其中施用药物活性量的根据本发明的化合物，例如根据本发明的肽类似物或衍生物。

虽然本文已经阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附实施方案涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。

实施方案

1.由SEQ ID NO 1定义的LDL-R的EGF(A)结构域的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含301Leu。

2.根据实施方案1的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含野生型cys残基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys和331Cys。

3.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含一个或多个(野生型)氨基酸残基295Asn、296Glu、298Leu、302Gly和310Asp。

4.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置295处包含残基Asn(N)。

5.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置296处包含残基Glu(E)。

6.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置298处包含残基Leu(L)。

7.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置302处包含残基Gly(G)。

8.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置310处包含残基Asp(D)。

9.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置295(Asn/N)和310(Asp/D)处包含野生型残基。

10.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽与SEQ ID NO.:1相比具有1-15个氨基酸置换。

11.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330、332。

12.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在选自以下位置的位置处包含一个或多个氨基酸置换：294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、332。

13.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在选自以下位置的位置处包含一个或多个其它氨基酸置换：309、312、313、321、324、328、332。

14.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置293处包含氨基酸残基Gly(G)或Asn(N)。

15.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置294处包含氨基酸残基Thr(T)或Gly(G)。

16.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。

17.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)或Trp(W)。

18.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)或Tyr(Y)。

19.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置299处包含氨基酸残基Asp(D)或Ala(A)。

20.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置300处包含氨基酸残基His(H)或Asn(N)。

21.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。

22.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置307处包含氨基酸残基Val(V)或Ile(I)。

23.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置307处包含Ser(S)、Thr(T)或Ile(I)。

24.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置307处包含Ile(I)。

25.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Glu(E)、His(H)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。

26.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)、Ser(S)或Lys(K)。

27.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)、Arg(R)或Ser(S)。

28.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Asn(N)或Arg(R)。

29.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Lys(K)或Arg(R)。

30.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置309处包含氨基酸残基Arg(R)。

31.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含氨基酸残基Lys(K)、Glu(E)、Asp(D)、Gln(Q)或Arg(R)。

32.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含Lys(K)的氨基酸置换。

33.根据实施方案32的EGF(A)肽类似物，其中312Lys被选自下组的氨基酸置换：312Gly、312Pro、312Asp、312Glu、312Arg、312His、312Ser、312Thr、312Asn、312Gln、312Ala、312Val、312Ile、312Leu、312Met、312Phe和312Tyr。

34.根据实施方案32的EGF(A)肽类似物，其中312Lys被选自下组的氨基酸置换：312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Phe和312Tyr。

35.根据实施方案32的EGF(A)肽类似物，其中312Lys被选自下组的氨基酸置换：312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile和312Phe。

36.根据实施方案32的EGF(A)肽类似物，其中312Lys被选自以下的氨基酸置换：312Glu、312Asp、312Gln和312Arg。

37.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)、Lys(K)或Glu(E)。

38.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Asp(D)或Glu(E)。

39.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置321处包含氨基酸残基Glu(E)。

40.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置324处包含氨基酸残基Gln(Q)或Gly(G)。

41.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置329处包含氨基酸残基Arg(R)或His(H)。

42.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽不具有299Asp(D)至Glu(E)、Val(V)或His(H)的置换。

43.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽不具有300Asn(N)至Pro(P)的置换。

44.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含零个Lys氨基酸残基。

45.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个Lys氨基酸残基。

46.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含Lys置换。

47.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含Lys置换和野生型Lys。

48.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含Lys置换和非Lys氨基酸残基。

49.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含Lys置换和Glu(E)、Asp(D)、Gln(Q)或Arg(R)。

50.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物在位置312处包含Lys置换和Glu(E)。

51.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含一个或多个Lys置换。

52.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽具有至少两个包含以下的和/或由以下组成的氨基酸置换：

i.301Leu和309Arg

ii.301Leu、309Arg、312Glu

iii.301Leu、307Ile和309Arg

iv.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu

v.301Leu、309Arg和321Glu

vi.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu

vii.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala

viii.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu

ix.301Leu和309Arg和至少一个Lys置换

x.301Leu、309Arg、312Glu和至少一个Lys置换

xi.301Leu、307Ile和309Arg和至少一个Lys置换

xii.301Leu、307Ile、309Arg和312Glu和至少一个Lys置换

xiii.301Leu、309Arg和321Glu和至少一个Lys置换

xiv.301Leu、309Arg、321Glu和312Glu和至少一个Lys置换

xv.301Leu、307Ile、309Arg和299Ala和至少一个Lys置换，或

xvi.301Leu、307Ile、309Arg、299Ala和312Glu和至少一个Lys置换。

53.根据前述实施方案1-51中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽具有至少两个包含以下的和/或由以下组成的氨基酸置换：

xvii.301Leu和309Lys

xviii.301Leu、309Lys和312Glu

xix.301Leu和309Lys和至少一个其它Lys置换，或

xx.301Leu、309Lys和312Glu和至少一个其它Lys置换。

54.根据前述实施方案1-51中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽具有至少两个包含以下的和/或由以下组成的氨基酸置换：

xxi.301Leu和307Ile

xxii.301Leu、307Ile和312Glu

xxiii.301Leu和307Ile和至少一个其它Lys置换，或

xxiv.301Leu、3307Ile和312Glu和至少一个其它Lys置换。

55.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含N-端和/或C-端延长。

56.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含1-10个氨基酸残基的N-端延长。

57.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含N-端延长，该N-端延长包含在位置292处的氨基酸残基，如292Ala(A)或292(K)。

58.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含1-10个氨基酸残基的C-端延长。

59.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含C-端延长，该C-端延长包含在位置333处的氨基酸残基，如333Ala(A)或333(K)。

60.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

61.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

62.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

63.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys,、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

64.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys,、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

65.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少一个选自下组的Lys残基：313Lys、324Lys、328Lys和333Lys。

66.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含两个选自在实施方案60-66中定义的任意组的Lys残基。

67.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含两个Lys残基，这两个Lys残基选自由以下组成的对：

68.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含N-端或C-端截短。

69.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含1-10个氨基酸残基的N-端截短。

70.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少缺失或特定缺失氨基酸293Gly的N-端截短。

71.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含1-2个氨基酸残基的C-端截短。

72.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽类似物包含至少缺失或特定缺失氨基酸332Glu的C-端截短。

73.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ ID 2-114中的任一个表示。

74.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ IDNO.:2-47和49-114中的任一个表示。

75.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ IDNO.:2-44、46、47和49-114中的任一个表示。

76.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ IDNO.:2-44、46、47、49-53、55、58-114中的任一个表示。

77.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ IDNO.:2-4、6-44、46、47、49-53、55、58-114中的任一个表示。

78.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物，其中所述肽序列由SEQ IDNO.:2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114中的任一个表示。

79.包含根据前述实施方案1-78中任一项的EGF(A)肽类似物的EGF(A)化合物。

80.包含EGF(A)肽类似物和取代基的EGF(A)衍生物。

81.根据实施方案79的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物包含至少一个取代基。

82.根据实施方案79或81的EGF(A)衍生物，其中所述取代基为半衰期延长取代基。

83.根据实施方案79或82的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)肽类似物由上述实施方案1-78中的任一项所定义。

84.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的氮原子。

85.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽的氨基。

86.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或多个取代基连接至EGF(A)肽的N-端氨基酸或连接至EGF(A)肽的Lys残基。

87.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽的N-端氨基酸。

88.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽的N-端氨基酸残基的α-氮。

89.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽中的Lys残基。

90.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至所述EGF(A)肽中的Lys残基的ε-氮。

91.根据实施方案79-83中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物包含两个取代基。

92.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基是相同的。

93.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的氮原子。

94.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的氨基。

95.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽的N-端氨基酸和连接至所述EGF(A)肽类似物的Lys残基。

96.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中一个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸残基的α-氮，并且一个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的Lys残基。

97.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的N-端氨基酸。

98.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的Lys残基。

99.根据实施方案91的EGF(A)衍生物，其中所述两个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物中的Lys残基的ε-氮。

100.根据实施方案79-99中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或多个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

101.根据实施方案中79-99中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或多个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

102.根据实施方案79-99中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或多个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

103.根据实施方案79-102中任一项的EGF(A)衍生物，其中取代基连接至所述EGF(A)肽类似物中的312K。

104.根据实施方案79-102中任一项的EGF(A)衍生物，其中取代基连接至所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基。

105.根据实施方案104的EGF(A)衍生物，其中所述衍生物包含两个取代基，并且一个连接至取代的Lys残基，而一个连接至所述EGF(A)肽类似物中的312K。

106.根据实施方案104和105中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述衍生物包含两个取代基，并且两个取代基均连接至所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基。

107.根据实施方案104-106中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

108.根据实施方案104-106中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

109.根据实施方案104-106中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

110.根据实施方案104-106中任一项的EGF(A)衍生物，其中一个或两个取代基连接至选自下组的所述EGF(A)肽类似物中的取代的Lys残基：313Lys、324Lys、328Lys和333Lys。

111.根据实施方案79-109中任一项的EGF(A)衍生物，其中取代基不经由位置295、298、301、302、307和310中任一个的氨基酸残基连接至所述EGF(A)肽类似物。

112.根据实施方案79-109中任一项的EGF(A)衍生物，其中取代基不经由位置295、296、298、301、302、307、310中任一个的氨基酸残基连接至所述EGF(A)肽类似物。

113.根据实施方案79-112中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述取代基不是Fc结构域。

114.根据实施方案79-112中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述取代基不与EGF(A)肽融合。

115.根据实施方案79-114中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述取代基包含至少一个脂肪酸基团。

116.根据实施方案115的EGF(A)衍生物，其中所述脂肪酸基团是包含至少一个pKa<7的官能团(FG)和含有至少8个连续-CH₂-基团的碳链的化学基团。

117.根据实施方案115的EGF(A)衍生物，其中所述脂肪酸基团包含选自羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基氨基甲酰基氨基部分或3-羟基-异噁唑部分的官能团。

118.根据实施方案115的EGF(A)衍生物，其中所述取代基包含羧酸、磺酸、四唑部分、甲基磺酰基氨基甲酰基氨基部分或3-羟基-异噁唑部分，其含有8-20个连续的-CH₂-基团。

119.根据实施方案115的EGF(A)衍生物，其中所述取代基具有式I：

Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-[I]

其中

Z₁选自：

化学式1：HOOC-(CH₂)_n-CO-*，

化学式2：四唑基-(CH₂)_n-CO-*，

化学式3：HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)_m-CO-*，

化学式4：HOS(O)₂-(CH₂)_n-CO-*，

化学式5：MeS(O)₂NH(CO)NH-(CH₂)_n-CO-*，和

化学式6：3-HO-异噁唑-(CH₂)_n-CO-*

其中

n为8-20范围内的整数，

m为8-11范围内的整数，

化学式3中的-COOH基团可连接至苯环上的位置2、3或4，

符号*表示与Z₂中的氮的连接点，或者，如果Z₂为键，则符号*表示与相邻Z元件上的氮的连接点；

Z₂选自：

化学式7：*-NH-SO₂-(CH₂)₃-CO-*，

化学式8：*-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-*，和

键；

Z₃选自：

γGlu、Glu和键；

Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉彼此独立地选自：

Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep、TtdSuc和键；

Z₁₀选自：

化学式7：*-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂-*和键。

120.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中

γGlu为化学式9：*NH-CH(COOH)-(CH₂)₂-CO-*，

TtdSuc为化学式10：

*NH-CH₂CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂NHCO*，

Ado为化学式11：*NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-*，

Aeep为化学式12：*NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CO*，并且

Aeeep为化学式13：*NH-CH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂CO*。

121.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中所述取代基具有式I：

Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉-Z₁₀-[I]

其中

Z₁选自：

化学式1b：

化学式2b：

化学式3b：

化学式4b：

化学式5b：

和

化学式6b：

其中

化学式1b、2b、4b、5b或6b中的n为8-20范围内的整数，

化学式3b中的m为8-11范围内的整数，化学式3b中的-COOH基团可连接至苯环上的位置2、3或4，

Z₂选自：

化学式7b：

化学式8b：

和

键；

Z₃选自：

γGlu、Glu和键；

Z₄、Z₅、Z₆、Z₇、Z₈、Z₉彼此独立地选自：

Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、TtdSuc和键；

Z₁₀选自：

化学式14b：

和键；

条件是：

当Z₁₀为化学式14b时，所述取代基连接至所述肽的N-端氨基的α-氮；并且

当Z₁₀为键时，所述取代基连接至存在于所述肽中的Lys残基的ε位置或连接至所述肽的N-端氨基酸残基的α-氮。

122.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式1b：

并且其中n为8-20范围内的整数。

123.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式2b：

并且其中n为8-20范围内的整数。

124.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式4b：

并且其中n为8-20范围内的整数。

125.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式5b：

并且其中n为8-20范围内的整数。

126.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式6b：

并且其中n为8-20范围内的整数。

127.根据实施方案119的EGF(A)衍生物，其中Z₁为下式

化学式3b：

并且其中m为8-11范围内的整数。

128.根据实施方案127的EGF(A)衍生物，其中m为8、9、10或11。

129.根据实施方案127的EGF(A)衍生物，其中m为10或11。

130.根据实施方案122-126中任一项的EGF(A)衍生物，其中n为10-18、10-14、15-18、8-15或16-20范围内的整数。

131.根据实施方案122-126中任一项的EGF(A)衍生物，其中n为8、9、10、11或12。

132.根据实施方案122-126中任一项的EGF(A)衍生物，其中n为13、14、15或16。

133.根据实施方案122-126中任一项的EGF(A)衍生物，其中n为14、15、16、17或18。

134.根据实施方案122-126中任一项的EGF(A)衍生物，其中n为17、18、19或20。

135.根据实施方案119和134中任一项的EGF(A)衍生物，其中Z₂为化学式7或化学式7b，并且Z₃选自γGlu、Glu和键。

136.根据实施方案119和134中任一项的EGF(A)衍生物，其中Z₂为化学式8或化学式8b，并且Z₃选自γGlu和Glu。

137.根据实施方案119和136中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述衍生物具有一个或两个选自下组的取代基：

HOOC-(CH₂)₁₈-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₈-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu-2xADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-gGlu

HOOC-(CH₂)₁₆-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-2xADO

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-

HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-2xADO-

HOOC-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-3xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-2xgGlu

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-3xGly

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-2xgGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-TtdSuc

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-gGlu-4xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₁₀-CO-NH-CH₂-(C₆H₁₀)-CO-gGlu-2xADO

4-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO-gGlu-2xADO

3-HOOC-(C₆H₄)-O-(CH₂)₉-CO-gGlu-2xADO

3-HO-异噁唑-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

HOS(O)₂-(CH₂)₁₅-CO-gGlu-2xADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

HOS(O)₂-(CH₂)₁₃-CO-gGlu-2xADO

四唑基

-(CH₂)₁₅-CO-NH-SO₂-(CH₂)₃-CO-ADO-ADO-NH-CH₂-(C₆H₄)-CH₂

四唑基-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO

四唑基-(CH₂)₁₅-CO-gGlu-2xADO和

MeS(O)₂NH(CO)NH-(CH₂)₁₂-CO-gGlu-2xADO。

138.根据实施方案79的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物选自由实施例化合物1-47、51-102和106-159组成的EGF(A)衍生物。

139.根据实施方案79的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物选自由实施例化合物1-44、46-47、51-55、57、60-64、66-69、71-102和106-159组成的EGF(A)衍生物。

140.根据实施方案79的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物选自由实施例化合物31、95、128、133、143、144、150、151、152和153组成的EGF(A)衍生物。

141.根据实施方案79的EGF(A)衍生物，其中所述EGF(A)衍生物选自由实施例1-47、51-102和106-159组成的EGF(A)衍生物。

142.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物，其中所述肽或衍生物为PCSK9抑制剂。

143.根据实施方案137的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物，其中所述PCSK9抑制剂能够抑制PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。

144.根据实施方案137的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物，其中所述PCSK9抑制剂降低PCSK9与人低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合。

145.根据实施方案137的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物，其中如在竞争性ELISA中所测量的，所述PCSK9抑制剂具有低于10nM，如低于8nM、6nM、5nM、4nM、3nM或如低于2nM的表观结合亲和力(K_i)。

146.根据实施方案137的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物，其中如在D1.1所述的竞争性ELISA中所测量的，所述PCSK9抑制剂具有低于10nM，如低于8nM、6nM、5nM、4nM、3nM或如低于2nM的表观结合亲和力(K_i)。

147.根据前述实施方案中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述衍生物在小鼠中具有6小时以上，如8小时或如10小时的半衰期。根据前述实施方案中任一项的EGF(A)衍生物，其中所述衍生物在狗中具有50小时以上，如100小时或如150小时的半衰期。

148.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其用作药物。

149.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其用于治疗方法中。

150.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其用于预防或治疗心血管疾病的方法中。

151.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其用于改善脂质参数的方法中。

152.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其用于以下治疗方法中：

i.改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质，增加HDL-C，降低LDL-C，降低小而密的LDL-C，降低VLDL-C，降低甘油三酯，降低胆固醇，降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平或抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；

ii.预防和/或治疗心血管疾病，如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压；治疗心血管疾病。

153.根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物在以下方面的用途：

i.改善脂质参数，如预防和/或治疗血脂异常，降低总血清脂质，增加HDL-C，降低LDL-C，降低小而密的LDL-C，降低VLDL-C，非-HDL-C，降低甘油三酯，降低胆固醇，降低脂蛋白a(Lp(a))的血浆水平，抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生；

154.包含根据前述实施方案中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物以及药学上可接受的辅料的药物组合物。

155.根据实施方案154的药物组合物，其包含根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其中所述组合物为液体制剂。

156.根据实施方案154或155的药物组合物，其包含根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物，其中所述组合物包含二价阳离子。

157.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含选自Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺和Sr²⁺的二价阳离子。

158.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含盐和二价阳离子。

159.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含选自Mg²⁺、Ba²⁺、Ca²⁺和Sr²⁺的二价阳离子的盐。

160.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含钙离子(Ca²⁺)。

161.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含钙盐(Ca²⁺)。

162.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物进一步包含磷酸盐、硫酸盐、乙酸盐或氯化物的盐。

163.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含选自CaCl₂和Ca(OAc)₂的钙盐。

164.根据实施方案156的药物组合物，其中所述组合物包含CaCl₂。

165.根据实施方案156-164中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含至少2mM，如至少3mM，如至少4mM或如至少5mM，如至少10mM，如至少25mM，如至少50mM，如至少75mM或如至少100mM的所述二价阳离子。

166.根据实施方案156-164的药物组合物，其中所述组合物包含至多200mM，如至多100mM或如至多50mM的所述二价阳离子。

167.根据实施方案156-164的药物组合物，其中所述组合物包含1-200mM，如2-100mM，如5-75mM或如10-50mM的所述二价阳离子。

168.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度为0.1-200mg/ml。

169.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度为0.01-50mM。

170.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述EGF(A)肽类似物与所述阳离子或盐的摩尔比至多为2。

171.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述阳离子或盐与所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的摩尔比为至少0.1，如至少0.2，如至少0.5。

172.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含相对于所述EGF(A)肽、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物为至少0.1，如至少0.2，如至少0.5当量的阳离子或盐。

173.根据实施方案156-167中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含相对于所述EGF(A)肽、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物为至少2，如至少4，如至少6当量的阳离子或盐。

174.根据实施方案156-173中任一项的药物组合物，其进一步包含缓冲液、防腐剂、张度剂和螯合剂中的一种或多种。

175.根据实施方案174的药物组合物，其中所述组合物包含缓冲剂。

176.根据实施方案174的药物组合物，其中所述组合物包含选自Tris和HEPES的缓冲剂。

177.根据实施方案174的药物组合物，其中所述组合物包含Tris缓冲液。

178.根据实施方案174的药物组合物，其中所述组合物包含5-50mM Tris。

179.根据实施方案174-0中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含防腐剂。

180.根据实施方案179的药物组合物，其中所述组合物包含选自苯酚或间甲酚的防腐剂。

181.根据实施方案179的药物组合物，其中所述组合物包含苯酚。

182.根据实施方案179的药物组合物，其中所述组合物包含58mM苯酚。

183.根据实施方案174-182中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含等渗剂。

184.根据实施方案174-183中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含稳定剂。

185.根据实施方案184的药物组合物，其中所述组合物包含选自丙二醇和甘油的稳定剂。

186.根据实施方案184的药物组合物，其中所述组合物包含丙二醇。

187.根据实施方案174-0中任一项的药物组合物，其中所述组合物的pH为5-10，如6-9，如7-8，如7.2-7.8，如7.3-7.6，如大约7.4。

188.根据实施方案154-187中任一项的药物组合物，其用于皮下给药。

189.根据实施方案154的药物组合物，其用于口服给药。

190.用于改善脂质参数的方法，其包括施用药物活性量的根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物或药物活性量的根据实施方案154-189中任一项的药物组合物的步骤。

191.用于改善脂质参数的方法，其包括施用药物活性量的根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物或药物活性量的根据实施方案154-189中任一项的药物组合物的步骤，其中改善脂质参数是例如预防和/或治疗血脂异常；降低总血清脂质；增加HDL；降低LDL-C；降低小而密的LDL；降低VLDL；非-HDL-C；降低甘油三酯、降低胆固醇、降低脂蛋白血浆水平(Lp(a))、抑制载脂蛋白A(apo(A))的产生。

192.用于预防和/或治疗心血管疾病的方法，其包括施用药物活性量的根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物或药物活性量的根据实施方案154-189中任一项的药物组合物的步骤。

193.用于预防和/或治疗心血管疾病的方法，其包括施用药物活性量的根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物或EGF(A)衍生物或药物活性量的根据实施方案154-189中任一项的药物组合物的步骤，其中心血管疾病是例如心脏综合征X、动脉粥样硬化、心肌梗死、冠心病、再灌注损伤、中风、脑缺血、早期心脏病或早期心血管疾病、左心室肥大、冠状动脉病、高血压、原发性高血压、急性高血压急症、心肌病、心功能不全、运动不耐受、急性和/或慢性心力衰竭、心律不齐、心律失常、晕厥、心绞痛、心脏搭桥和/或支架再闭塞、间歇性跛行(闭塞性动脉硬化)、舒张期功能障碍和/或收缩期功能障碍；和/或降低血压，如降低收缩压。

194.制备根据前述实施方案1-147中任一项的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的方法，其中产生EGF(A)肽类似物并任选地与至少一个取代基连接。

195.根据实施方案194的方法，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物在二价阳离子如钙离子的存在下进行至少一步处理。

196.根据实施方案194或195的方法，其中纯化所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物。

197.根据实施方案196的方法，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的纯化在钙离子的存在下进行。

198.根据前述实施方案196-197中任一项的方法，其中所述纯化在高于4的pH下进行，如在5-8的pH下进行。

199.根据前述实施方案196-198中任一项的方法，其中纯化期间的钙浓度高于5mM，如至少7mM，如至少10mM。

200.根据前述实施方案196-199中任一项的方法，其中纯化EGF(A)肽类似物。

201.根据实施方案194的方法，其中所述方法用于通过将至少一个取代基连接至EGF(A)肽类似物来制备EGF(A)衍生物。

202.根据实施方案201的方法，其中所述至少一个取代基与所述EGF(A)肽类似物的连接在钙离子的存在下进行。

203.根据实施方案194-202中任一项所述的方法，其中所述方法包括pH大于8，如大于9，如大于10或如大于11的方法步骤。

204.根据实施方案194-202中任一项所述的方法，其中所述方法包括pH大于8，如大于9，如大于10或如大于11的方法步骤，并且其中所述步骤在钙离子的存在下进行。

205.根据实施方案201-204中任一项的方法，其中所述至少一个取代基通过EGF(A)肽类似物的赖氨酸残基的酰化连接。

206.根据实施方案201-204中任一项的方法，其中所述取代基通过EGF(A)肽类似物的赖氨酸残基的酰化连接，并且其中所述酰化在钙离子的存在下进行。

207.根据实施方案201-204中任一项的方法，其中所述取代基通过在大于8，如大于9，如大于10或如大于11的pH下对EGF(A)肽类似物的赖氨酸残基进行酰化而连接，并且其中所述酰化在钙离子的存在下进行。

208.根据实施方案194-207中任一项的方法，其中所述EGF(A)肽类似物是重组产生的。

209.根据实施方案194-207的方法，其中所述EGF(A)肽类似物通过合成方法产生。

210.制备EGF(A)衍生物的方法，其包括以下步骤：

i.提供EGF(A)肽类似物

ii.提供至少一个取代基

iii.在钙离子的存在下将所述至少一个取代基连接至所述EGF(A)肽类似物，以及

iv.获得EGF(A)衍生物。

211.制备EGF(A)衍生物的方法，其包括以下步骤：

i.提供EGF(A)肽类似物

ii.提供至少一个取代基

iii.在钙离子的存在下使所述EGF(A)肽类似物和所述取代基反应，以及

iv.获得EGF(A)衍生物。

212.根据实施方案201-211中任一项的方法，其中所述方法在溶液如水溶液中进行。

213.根据实施方案201-211中任一项的方法，其中所述至少一个取代基与所述EGF(A)肽类似物的连接在溶液中，如在水溶液中进行。

214.根据实施方案201-211中任一项的方法，其中所述EGF(A)肽类似物制品包含钙离子。

215.根据实施方案201-214中任一项的方法，其中钙作为钙盐如CaCl₂提供。

216.根据实施方案201-215中任一项的方法，其中钙离子的浓度为至少5mM，如7mM，如10mM，如20mM，或如至少25mM。

217.根据实施方案201-215中任一项的方法，其中钙离子相对于所述EGF(A)肽类似物浓度的浓度比为至少0.5，如至少1，如至少2，如至少3，如至少4。

218.根据实施方案201-215中任一项的方法，其中钙离子的浓度为所述EGF(A)肽类似物浓度的至少0.5当量，如至少1，如至少2，如至少3，如至少4当量。

219.根据实施方案201-215中任一项的方法，其中钙离子的浓度为所述EGF(A)肽类似物浓度的0.5-50当量，如1.0-40，如2.0-30，如5.0-25或如2-40当量。

220.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中所述至少一个取代基经由赖氨酸残基连接至所述EGF(A)肽类似物。

221.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中所述至少一个取代基通过赖氨酸残基经由其ε氨基连接至所述EGF(A)肽类似物。

222.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中用NaOH升高所述EGF(A)肽类似物制品的pH。

223.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中用NaOH将所述EGF(A)肽类似物制品的pH升高至10以上，如11以上。

224.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中用NaOH升高包含所述EGF(A)肽类似物的溶液的pH。

225.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中用NaOH将包含所述EGF(A)肽类似物的溶液的pH升高至10以上，如11以上。

226.根据实施方案201-225中任一项的方法，其中在将所述取代基连接至所述EGF(A)肽类似物的步骤中包括N-甲基吡咯烷酮。

227.根据实施方案226的方法，其中N-甲基吡咯烷酮与所述EGF(A)肽类似物制品和/或所述取代基一起包括在内。

228.根据实施方案226的方法，其中N-甲基吡咯烷酮与所述EGF(A)肽类似物制品一起包括在内。

229.根据实施方案226的方法，其中N-甲基吡咯烷酮与所述取代基一起包括在内。

230.根据实施方案201-229中任一项的方法，其中所述方法包括中和所获得的EGF(A)衍生物的步骤。

231.根据实施方案230的方法，其中将酸添加到所获得的EGF(A)衍生物中。

232.根据实施方案230的方法，其中将三氟乙酸添加到所获得的EGF(A)衍生物中。

实施例

该实验部分从缩写列表开始，随后是包含用于合成和表征本发明类似物和衍生物的通用方法的部分。然后是涉及制备本发明的具体EGF(A)化合物(包括类似物和衍生物)的多个实施例，最后包括涉及这些化合物的活性和性质的多个实施例(标题为药理学方法的部分)。

这些实施例用来说明本发明。

缩写列表

AcOH：乙酸

Ado：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸

Aeep：9-氨基-4,7-二氧杂壬酸

Aeeep：12-氨基-4,7,10-三氧杂-十二烷酸

Alloc：烯丙氧羰基

API：活性药物成分

AUC：曲线下面积

BG：血糖

Boc：叔丁氧羰基

bs：宽单峰

BSA：牛血清白蛋白

CLND：化学发光氮检测

Clt：2-氯三苯甲基

可力丁(collidine)：2,4,6-三甲基吡啶

d：双峰

DCC：N,N-二环己基碳二亚胺

DCM：二氯甲烷

Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基

DIC：二异丙基碳二亚胺

DIPEA：二异丙基乙胺

DMAP：4-二甲基氨基吡啶

DMF：二甲基甲酰胺

DMSO：二甲基亚砜

DTT：二硫苏糖醇

EDC·HCl：N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐

EDT：1,2-乙二硫醇

EGF：表皮生长因子样

EGF(A)：表皮生长因子样结构域A

F(表5)：生物利用度

Fmoc：9-芴基甲氧羰基

HDL：高密度脂蛋白

HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HFIP：1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇

HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑

HOBt：1-羟基苯并三唑

hPCSK9：人PCSK9

HPLC：高效液相色谱法

h：小时

HSA：人血清白蛋白

IC₅₀：半数最大抑制浓度

Inp：异哌啶酸

IPA：异丙醇

i.v.：静脉内

ivDde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)-3-甲基丁基

LCMS：液相色谱质谱法

LDL-R或LDLr：LDL受体

LDL：低密度脂蛋白

LDL-C：LDL胆固醇

m：多峰

MeOH：甲醇

min：分钟

Mmt：4-甲氧基三苯甲基

Mtt：4-甲基三苯甲基

MRT：平均停留时间

MSU：甲基磺酰基氨基甲酰基氨基

MQ：MilliQ水

NMP：N-甲基吡咯烷酮

OBz：苯甲酰酯

OSu：O-琥珀酰亚胺酯(羟基琥珀酰亚胺酯)

OtBu：叔丁酯

Oxyma

：氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

PBS：磷酸盐缓冲盐水

PD：药效学

PK：药代动力学

quint：五峰

QC：质量控制

RP：反相

RP-HPLC：反相高效液相色谱法

RT：室温

Rt：停留时间

s：单峰

s.c.：皮下

SD：标准偏差

SEM：平均值的标准误差

SPPS：固相肽合成

t：三峰

tBu：叔丁基

TCTU：O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐

TFA：三氟乙酸

THA-SBA-OH：4-(N-(16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基)氨磺酰基)丁酸

TIS或TIPS：三异丙基硅烷

Tmax：到达C_max的时间

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇

Trt：三苯基甲基(三苯甲基)

Trx：氨甲环酸

UPLC：超高效液相色谱法

TBS-T：Tris缓冲盐水

化学方法

该部分分为三块：部分A涉及制备本发明化合物的通用方法，部分B涉及本发明大量具体化合物的制备，部分C涉及本发明化合物的检测方法和表征方法以及大量具体实施例化合物的结果。

A.制备方法

本发明的化合物可以通过本领域已知且如下描述并在部分B中进一步详细说明的方法制备。

肽即SEQ ID NO:1的EGF(A)肽或其类似物的制备：SPPS通用方法：

待使用的Fmoc保护的氨基酸是推荐的标准品：例如由Anaspec、Bachem、IrisBiotech或NovabioChem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Alloc)-OH。可以在来自Protein Technologies(Tucson,AZ85714U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上利用基于Fmoc的化学法进行SPPS。用于制备C-端羧酸的合适的树脂为预先加载氨基酸的Wang树脂，如Fmoc-Glu(tBu)-Wang树脂(低负载，0.35mmol/g)。在取代基连接至C-端赖氨酸的情况下，合适的树脂是预先加载的Fmoc-Lys(Mtt)-Wang。用于制备C-端肽酰胺的合适的树脂为H-RinkAmide-ChemMatrix树脂(加载例如0.52nmol/g)或Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(Novabiochem，加载例如0.62mmol/g)等。用NMP中的20％哌啶实现Fmoc脱保护。通过使用DIC/HOAt/可力丁或者含有或不含可力丁的DIC/Oxyma Pure，经过或不经预活化，或者通过使用DEPBt(3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮)/DIPEA抑制偶联过程中例如His的差向异构化(epimization)，来进行肽偶联。将氨基酸/HOAt或氨基酸/Oxyma Pure溶液(在NMP中0.3M/0.3M，3-10倍摩尔过量)添加至该树脂，随后添加相同摩尔当量的DIC(在NMP中3M)，随后添加可力丁(在NMP中3M)。例如，对于以下规模的反应，每次偶联可使用以下量的0.3M氨基酸/HOAt溶液：规模/mL，0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。

如果使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH，则可如下除去Mtt基团：用HFIP/DCM(75:25)洗涤树脂(2×2min)，用DCM洗涤，并将树脂悬浮在HFIP/DCM(75:25)中(2×20min)，随后在可能将取代基引入到赖氨酸部分的ε-位置处之前洗涤。

如果使用Fmoc-Lys(Alloc)-OH，则可如下除去Alloc基团：在一种或多种清除剂组合，例如吗啉(6.0当量)和/或二甲基硼烷络合物(18.0当量)的存在下，用Pd(PPh₃)₄(0.02当量)处理树脂(30min)。然后分别用MeOH、NMP或DMF和IPA(异丙醇)洗涤树脂，之后可在赖氨酸部分的ε-位置处引入取代基。

取代基的连接(酰化——在合成过程中)

可通过上述Prelude肽合成仪，使用适当保护的结构单元，如上述标准氨基酸、Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸或Fmoc-Glu-OtBu，在分步过程中引入取代基。可使用结构单元，例如但不限于十八烷二酸单叔丁酯，来实现取代基的引入。在每个偶联步骤后，可使用过量的乙酸酐和可力丁(>10当量)对未反应的肽中间体加帽。

使用经Mtt保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(Mtt)-OH)、经Alloc保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(Alloc)-OH)或经ivDde基团保护的赖氨酸(Fmoc-Lys(ivDde)-OH)来实现取代基向赖氨酸的ε-氮上的引入。可通过与氨基酸Fmoc-Glu-OtBu偶联来实现取代基中γGlu部分的并入。

可使用延长的偶联时间(1×6小时)来实现取代基中每一部分的引入，随后用乙酸酐或备选地用乙酸/DIC/HOAt/可力丁加帽。

从树脂上切割

在合成后，用DCM洗涤树脂，并通过用TFA/TIPS/水(95/2.5/2.5)或TFA/EDT(1,2-乙二硫醇)/水(90/5/5)处理2-3小时从树脂上切下肽，随后用Et₂O(乙醚)沉淀。用Et₂O洗涤该沉淀物。

氧化折叠

将来自以上步骤的沉淀物溶解于DMSO中并添加至由以下成分组成的溶液中：

在MQ水中的50mM TRIS

5mM CaCl₂

3mM半胱氨酸

0.3mM胱氨酸

pH 8至8.8

将反应混合物在室温下保持过夜或直至LCMS显示反应完全。

纯化和定量

将粗肽(衍生物)用TFA酸化至pH 2-3，并在包含C8-硅胶或C18-硅胶的柱上通过反相制备型HPLC(Waters Deltaprep 4000或Gilson)纯化。用梯度渐增的包含0.1％TFA的MeCN水溶液进行洗脱。通过分析型HPLC或UPLC检查相关级分。将包含纯目标肽衍生物的级分混合。可使用另一梯度，例如含有0.05M NH₄HCO₃，来引入额外的纯化步骤。分析(HPLC、LCMS)所得到的溶液，并使用化学发光氮特异性HPLC检测器(Antek 8060HPLC-CLND)或通过测量280nm处的UV吸光度对产物(即衍生物)进行定量。将产物分装到玻璃小瓶中。小瓶用Millipore玻璃纤维预过滤器封盖。冷冻干燥得到呈白色固体的肽三氟乙酸盐。

肽即SEQ ID NO:1的EGF(A)肽或其类似物的制备：重组通用方法：

或者，可以通过本领域已知的重组方法来产生EGF(A)肽类似物，并使用一个或多个柱色谱步骤，即例如阳离子或阴离子交换色谱法进行纯化。以这种方式产生的材料可含有数种同种型以及与表达有关的杂质。为了能够使用EGF(A)肽类似物作为骨架进行酰化，可以使用另外的纯化步骤来提供具有高纯度的材料，通常含有>90％的主要同种型。

取代基的连接(还原烷基化——N-端)

可以使用经醛官能团衍生的合适的白蛋白结合取代基，对纯化的肽类似物进行还原烷基化。

将肽类似物溶解于pH＝5.5的柠檬酸中，并将适当的醛溶解于可含有环糊精的水中以增加溶解度。添加溶解于MeOH中的还原剂，如硼烷吡啶复合物，并轻柔振摇该混合物过夜。为达到最佳产率，可能需要随后添加过量的醛和还原剂。使用上述程序纯化该混合物。

取代基的连接(通过Lys酰化——在溶液中)

可以对纯化的肽类似物进行在升高的pH下使肽骨架与取代基反应的方法，从而获得Lys残基的选择性取代。该反应包括N-甲基吡咯烷酮和添加氢氧化钠直至pH达到10.5-12。可以将酰化试剂溶解于水或N-甲基吡咯烷酮中。通过滴加三氟乙酸中和反应混合物。

B.本发明化合物的制备

本发明的化合物通过与下述通用方法没有本质区别的方法制备。

方法A

LDL-R(293-332)肽类似物(不含取代基)的合成

所使用的Fmoc保护的氨基酸是推荐的标准品：例如由Anaspec、Bachem、IrisBiotech或NovabioChem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、BOC-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Lys(Mtt)-OH。在来自Protein Technologies(Tucson,AZ 85714U.S.A.)的Prelude固相肽合成仪上利用基于Fmoc的化学法进行SPPS。使用预先加载氨基酸的Wang树脂，如Fmoc-Glu(tBu)-Wang树脂(低负载，0.35mmol/g)等。用NMP中的20％哌啶实现Fmoc脱保护。通过使用含有可力丁的DIC/Oxyma Pure进行肽偶联。将氨基酸/Oxyma Pure溶液(在DMF中0.3M/0.3M，3-10倍摩尔过量)添加至该树脂，随后添加相同摩尔当量的DIC(在NMP中3M)，随后添加可力丁(在NMP中3M)。

从树脂上切割

在合成后，用DCM洗涤树脂，并通过用TFA/TIPS/DTT/水(92.5/2.5/2.5/2.5)处理2-3小时从树脂上切下肽，随后用乙醚沉淀。随后用乙醚洗涤该沉淀物。

氧化折叠

在MQ水中的

50mM TRIS

5mM CaCl₂

3mM半胱氨酸

0.3mM胱氨酸

pH 8.0至8.8

将反应混合物在室温下保持过夜或直至LCMS显示反应完全。

纯化和定量

将粗肽(衍生物)用TFA酸化至pH 2-3，并在包含C8-硅胶或C18-硅胶的柱上通过反相制备型HPLC(Waters Deltaprep 4000或Gilson)纯化。用梯度渐增的包含0.1％TFA的MeCN水溶液进行洗脱。使用HPLC分析相关级分。合并包含纯目标肽的级分。分析(HPLC、LCMS)所得到的溶液，并使用化学发光氮特异性HPLC检测器(Antek 8060HPLC-CLND)或通过测量280nm处的UV吸光度对肽衍生物进行定量。将产物分装到玻璃小瓶中。小瓶用Millipore玻璃纤维预过滤器封盖。冷冻干燥得到呈白色固体的该肽的三氟乙酸盐。

方法B

LDL-R(293-332)EGF(A)类似物(含取代基)的衍生物的合成(在树脂上)

如上所述进行树脂结合的EGF(A)肽的合成。

使用Boc-Lys(Fmoc)-OH实现在序列的N-端中赖氨酸的ε-氮上引入取代基。使用标准的Fmoc保护的氨基酸，即Fmoc-Gly-OH，完成在N-端氨基酸的α-位置引入取代基。

为了在其它位置的赖氨酸的ε-氮上引入取代基，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH。通过用HFIP/DCM(75:25)处理(2×2分钟)去除Mtt基团，随后用DCM洗涤。然后将树脂重悬浮于HFIP/DCM(75:25)(2×20分钟或2×30分钟)，随后用DCM洗涤，之后将取代基引入赖氨酸部分的ε-位置。

使用适当保护的结构单元，如方法A中描述的标准Fmoc保护的氨基酸、Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸或Fmoc-Glu-OtBu，如方法A所述通过Prelude肽合成仪在逐步程序中引入取代基部分。使用适当的结构单元，例如但不限于十八烷二酸单叔丁酯，实现脂肪酸基团的引入。在某些情况下，增加偶联时间或重复每个结构单元的偶联步骤。

如方法A所述进行切割、氧化折叠、纯化和定量。

方法C

溶液中取代基的连接(经由还原烷基化)

使用经醛官能团衍生的适当取代基，对从方法A获得的纯化的肽进行还原烷基化。

将冷冻干燥的肽粉末溶解于柠檬酸缓冲液(40mM，pH 5.55；肽浓度：4mg/mL)。将在40％(w/v)环糊精水溶液中包含选定取代基(10当量，10mg/mL)的溶液添加至肽溶液中，并通过倒置反应小瓶轻柔混合。向该溶液中以小份添加硼烷吡啶复合物(100当量，在MeOH中的80mg/mL溶液)，随后轻柔倒置反应小瓶。将反应溶液在室温下轻柔振摇过夜。通过LC-MS监测反应进程。第二天早上，使用TFA将反应溶液酸化至pH 2-3，并使用以上方法A中描述的程序进行纯化。

方法D

取代基的连接(溶液中折叠肽的N-端酰化)

将冷冻干燥的肽粉末溶解于K₂HPO₄缓冲液(20mM，pH 8.15)至5mg/mL的目标浓度。将18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八烷酸在DMSO中的溶液(4当量，4mg/mL)分四份添加。添加每份后，通过倒置反应小瓶轻柔地混合肽溶液。随后，测量反应溶液的pH值并通过添加小部分的N,N-二异丙基乙胺调节至pH 8.0-8.3，之后将溶液在室温下静置。通过LC-MS跟踪反应进程。3小时后，用TFA将该溶液酸化至pH 5.9，并使用上述程序进行纯化。

方法E

取代基的连接(经由Lys——在溶液中)

可以对纯化的肽类似物进行如下所述的使肽骨架与取代基反应的方法。

在搅拌下向折叠的EGF(A)肽类似物(10-40mg/mL，20mM Tris，pH7.5，5-10mM氯化钙)的溶液中添加N-甲基吡咯烷酮(0.25×体积的肽溶液)。为了获得选择性反应条件，通过缓慢添加氢氧化钠水溶液使pH升高，直到pH达到10.5-12。

将酰化试剂(与EGF(A)肽类似物相比为2-4摩尔当量)溶解于N-甲基吡咯烷酮或水中，如果使用水，则通过添加氢氧化钠水溶液将pH调节至pH 4-7。在2-60min内将酰化试剂溶液加入到搅拌的肽溶液中，同时通过添加氢氧化钠水溶液将pH连续调节至10.5-12。将最终反应混合物在室温、恒定pH下搅拌，直到酰化试剂耗尽(0-4h)。通过滴加三氟乙酸中和反应混合物。

B.1.延长体和连接体元件的合成

关于十八烷二酸单叔丁酯的合成：参见专利申请WO 2010102886。可由此制备相应的十四烷二酸、十六烷二酸和二十烷二酸的单叔丁酯。关于14-磺基-十四烷酸和16-磺基-十六烷酸的合成，参见WO2015071355。关于16-(1H-四唑-5-基)十六烷酸和13-(1H-四唑-5-基)十三烷酸的合成，参见WO2006005667。关于4-(N-(16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基)氨磺酰基)丁酸的合成，参见US 2012/0088716。

13-(甲基磺酰基氨基甲酰基氨基)十三烷酸

化学式6-OH，其中n＝12：

该分子使用来自Luckhurst等人Tetrahedron Letters第48卷,第50期,2007,8878–8882页,http://dx.doi.org/10.1016/j.tetlet.2007.10.046的改良程序制成。

随后在0℃下将三乙胺(4.46mL，32.0mmol)和氯甲酸乙酯(3.05mL，32.0mmol)添加至14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酸(6.29g，20.0mmol)在丙酮(176mL)中的溶液中。在0℃下30分钟后，添加叠氮化钠(2.60g，40.0mmol)的水(12mL)溶液，并将该混合物在0℃下搅拌2小时。将混合物真空浓缩(30℃)并倾入冰水(300mL)中。所得混合物用乙酸乙酯(3×250mL)萃取；将有机萃取物合并并用水(200mL)、10％碳酸氢钠水溶液(200mL)和水(200mL)洗涤；用无水硫酸镁干燥并蒸发至干，得到呈淡黄色油状物的14-叠氮基-14-氧代十四烷酸叔丁酯和14-异氰酸-14-氧代十四烷酸叔丁酯的混合物。

将甲烷磺酰胺(1.52g，16.0mmol)、碳酸钾(6.63g，48.0mmol)添加至14-叠氮基-14-氧代十四烷酸叔丁酯和14-异氰酸-14-氧代十四烷酸叔丁酯的混合物(5.43g，16.0mmol)在无水甲苯(50mL)中的溶液中。将反应混合物在85℃下加热过夜。添加水(100mL)，然后添加1M盐酸水溶液(调节pH至pH＝4)。该混合物用乙醚(4×150mL)萃取，用无水硫酸镁干燥并真空蒸发，得到13-(3-(甲基磺酰基)脲基)十三烷酸叔丁酯。

1H NMR谱(300MHz,DMSO,dH):10.01(s,1H)；6.42(t,J＝4.7Hz,1H)；3.20(s,3H)；3.02(q,J＝6.7Hz,2H)；2.16(t,J＝7.3Hz,2H)；1.52-1.33(m,13H)；1.30-1.11(m,16H)。

将三氟乙酸(21.0mL)和水(2.50mL)滴加至13-(3-(甲基磺酰基)脲基)十三烷酸叔丁酯(3，6.30g，15.5mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。减压蒸发溶剂，得到13-(3-(甲基磺酰基)脲基)十三烷酸。

1H NMR谱(300MHz,DMSO,dH):10.02(s,1H)；6.43(t,J＝4.5Hz,1H)；3.20(s,3H)；3.02(q,J＝6.6Hz,2H)；2.18(t,J＝7.3Hz,2H)；1.56-1.33(m,4H)；1.24(s,16H)。

13-(3-羟基异噁唑-5-基)十三烷酸

化学式5-OH，其中n＝12：

该分子使用来自

等人J.Org.Chem.,2000,65(4),pp 1003–1007.DOI:10.1021/jo991409d的改良程序制成。

将14-(叔丁氧基)-14-氧代十四烷酸(1，30.0g，95.4mmol)、N,N'-二环己基碳二亚胺(43.3g，209mmol)和4-二甲基氨基吡啶(25.6g，20.9mmol)溶解于无水二氯甲烷(700mL)中，并将2,2-二甲基-1,3-二氧杂环己烷-4,6-二酮(2，20.6g，143mmol)添加至该溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后蒸发挥发物，用乙醚(500mL)稀释该混合物并滤出白色沉淀物。减压浓缩滤液，用乙醚(300mL)稀释并用1M盐酸水溶液(3×100mL)和盐水(1×100mL)萃取。有机部分经硫酸钠干燥并减压蒸发，得到呈黄色油状物的14-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二噁烷-5-基)-14-氧代十四烷酸叔丁酯。该粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):3.07(t,J＝7.5Hz,2H)；2.20(t,J＝7.5Hz,2H)；1.74(s,6H)；1.71-1.51(m,4H)；1.45(s,9H)；1.36-1.23(m,16H)。

将来自以上的粗产物溶解于乙醇(300mL)中，并将所得溶液在80℃下搅拌3小时，然后在室温下过夜。减压去除溶剂，通过快速柱色谱法纯化残余物(硅胶60，0.040-0.063mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯9:1)，得到呈无色油状物的16-甲基-3-氧代十六烷二酸1-乙酯。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):4.21(q,J＝7.2Hz,2H)；3.44(s,2H)；2.54(t,J＝7.5Hz,2H)；2.21(t,J＝7.5Hz,2H)；1.67-1.51(m,4H)；1.45(s,9H)；1.38-1.21(m,19H)。

在-30℃、氩气气氛下将氢氧化钠(1.09g，27.3mmol)溶解于甲醇(40.0mL)和水(10.0mL)中。将上述酯(4，10.0g，26.0mmol)溶解于甲醇(40mL)和二甲氧基乙烷(50mL)中，并在-30℃下滴加至该反应混合物中。20分钟后，滴加盐酸羟胺(3.61g，52.0mmol)和氢氧化钠(2.18g，54.6mmol)在二甲氧基乙烷(10mL)和水(10.0mL)中的溶液，并将该反应混合物在-30℃下搅拌3小时。然后用丙酮(5mL)猝灭该混合物，5分钟后立即倾入浓盐酸(70mL)中并加热至80℃ 70分钟。然后减压去除所有挥发物，将固体用二氯甲烷(400mL)溶解并用蒸馏水(100mL)和盐水(70mL)萃取。用硫酸钠干燥有机部分。通过快速柱色谱法(硅胶60，0.040-0.063mm；洗脱液：环己烷/乙酸乙酯3:1)纯化粗产物，得到呈白色固体的13-(3-羟基异噁唑-5-基)十三烷酸甲酯。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):5.66(s,1H)；3.67(s,3H)；2.63(t,J＝7.6Hz,2H)；2.31(t,J＝7.6Hz,1H)；1.72-1.55(m,4H)；1.40-1.19(m,16H)。

将13-(3-羟基异噁唑-5-基)十三烷酸甲酯(5，6.20g，19.9mmol)溶解于甲醇(60.0mL)和水(20.0mL)中，添加氢氧化锂一水合物(4.04g，96.3mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌16小时。然后减压去除挥发物并添加水(50.0mL)，随后添加1M盐酸水溶液(50.0mL)。滤出沉淀物并用水(2×100mL)洗涤，然后减压干燥，得到呈米色固体的13-(3-羟基异噁唑-5-基)十三烷酸。

1H NMR谱(300MHz,DMSO-d6,dH):5.74(s,1H)；2.57(t,J＝7.5Hz,2H)；2.18(t,J＝7.5Hz,2H)；1.63-1.41(m,4H)；1.34-1.14(m,16H)。

B.2用于还原烷基化的中间体取代基前体的合成

18-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-甲酰基苯基)甲基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代-丁基]氨基]-18-氧代-十八烷酸

将2-氯三苯甲基树脂100-200目(42.6g，42.6mmol)在无水二氯甲烷(205mL)中溶胀20分钟。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(13.7g，35.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(23.5mL，135mmol)在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液添加至树脂，并将该混合物振摇3小时。将树脂过滤并用N,N-二异丙基乙胺(12.4mL，70.9mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，250mL，2×5min)中的溶液处理。然后用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)洗涤树脂。通过用二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5mL，1×30mL，2×150mL)处理去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(200mL，2×150mL)洗涤树脂。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(20.5g，53.2mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，18.9g，53.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(16.7mL，95.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)和二氯甲烷(50mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(155mL)洗涤。通过用二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×150mL)处理去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(200mL，2×150mL)洗涤树脂。将Fmoc-Glu-OtBu(22.6g，53.2mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，18.9g，53.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(16.7mL，95.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(155mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇1小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(150mL)洗涤。通过用二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×150mL)处理去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(2×150mL)和二氯甲烷(200mL，2×150mL)洗涤树脂。将十八烷二酸单叔丁酯(19.7g，53.2mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，18.9g，53.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(16.7mL，95.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷混合物(1:4，200mL)中的溶液添加至树脂。将树脂振摇2小时、过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、二氯甲烷(2×150mL)、甲醇(2×150mL)和二氯甲烷(300mL，6×150mL)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(200mL)处理19小时从树脂上切下产物。将树脂滤出并用二氯甲烷(2×150mL)、2-丙醇/二氯甲烷混合物(1:1，2×150mL)、2-丙醇(150mL)和二氯甲烷(2×150mL)洗涤。合并溶液；蒸发溶剂，并通过快速柱色谱法(硅胶60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇1:0-9:1)纯化粗产物。将纯产物真空干燥，得到黄色油状物。

17-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}-十七烷酸叔丁酯的产量：25.85g(86％)。

RF(SiO₂，氯仿/甲醇85:15)：0.25。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.38(bs,1H)；7.08(bs,1H)；6.61(d,J＝7.5Hz,1H)；4.43(m,1H)；4.15(s,2H)；4.01(s,2H)；3.78-3.39(m,16H)；2.31(t,J＝6.9Hz,2H)；2.27-2.09(m,5H)；2.01-1.84(m,1H)；1.69-1.50(m,4H)；1.46(s,9H)；1.43(s,9H)；1.24(bs,24H)。

LC-MS m/z：846.6(M+H)+。

将(4-甲酰基-苄基)-氨基甲酸叔丁酯(Boc-氨基甲基苯甲醛，1.54g，6.60mmol)溶解于二氯甲烷(50mL)，并添加盐酸在二氧杂环己烷(3.8M，20mL，76mmol)中的溶液。将混合物搅拌16小时，并从溶液中沉淀出固体物质。通过蒸发去除所有溶剂。添加17-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲酰基}-十七烷酸叔丁酯(5.08g，6.00mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，1.73g，9.00mmol)、N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP，0.037g，0.30mmol)和二氯甲烷(50mL)。搅拌该混合物，并分3份添加二异丙基乙胺(2mL，11.6mmol)。将反应混合物搅拌2小时，并蒸发溶剂。将残余物溶解于二氯甲烷(10mL)，并滴加盐酸溶液直至pH低于5。对溶液进行柱色谱法(硅胶60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇95:5)以提供呈黄色油状物的取代基。

产量：3.15g(54％)。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):9.99(s,1H)；7.85(d,J＝7.9Hz,2H)；7.54-7.43(m,3H)；7.06(t,J＝5.5Hz,1H)；6.86(t,J＝5.6Hz,1H)；6.48(d,J＝7.7Hz,1H)；4.58(d,J＝6.2Hz,2H)；4.45-4.36(m,1H)；4.09(s,2H)；3.94(s,2H)；3.73-3.37(m,16H)；2.32-2.05(m,7H)；1.99-1.80(m,1H)；1.69-1.51(m,4H)；1.45(s,9H)；1.44(s,9H)；1.33-1.20(m,24H)。

LC-MS m/z：963.5(M+H)+。

(2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-甲酰基苯基)甲基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代-乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-5-氧代-2-(16-磺基十六碳酰基氨基)戊酸

将2-氯三苯甲基树脂100-200目1.8mmol/g(1，8.40g，14.3mmol)在无水二氯甲烷(150mL)中溶胀30分钟。将Fmoc-Ado-OH(2.82g，9.50mmol)和N,N-二异丙基乙胺(6.30mL，36.1mmol)在无水二氯甲烷(约150mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇24小时。将树脂过滤，并用N,N-二异丙基乙胺(3.30mL，19.0mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4:1，2×150mL，2×5min)中的溶液处理。然后用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)洗涤树脂。通过用在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×150mL)处理去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(3×150mL)和二氯甲烷(3×150mL)洗涤树脂。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，4.80g，16.2mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，5.74g，16.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.47mL，25.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)洗涤。通过用在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×150mL)处理来去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(3×150mL)和二氯甲烷(3×150mL)洗涤树脂。将(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-Glu-OtBu，6.87g，16.2mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，5.74g，16.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.47mL，25.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(150mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、二氯甲烷(3×150mL)和N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)洗涤。通过用在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×150mL)处理去除Fmoc基团。用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、2-丙醇(3×150mL)和二氯甲烷(3×150mL)洗涤树脂。将16-((4-((叔丁氧羰基)氨基)-2,2-二甲基丁氧基)磺酰基)十六烷酸(6.62g，12.4mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TCTU，4.39g，12.4mmol)和N,N-二异丙基乙胺(4.47mL，25.7mmol)在N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷混合物(1/1，150mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(3×150mL)、甲醇(5×150mL)和二氯甲烷(10×150mL)洗涤。通过用2,2,2-三氟乙醇(150mL)处理24小时从树脂上切下产物。将树脂过滤并用二氯甲烷(3×150mL)洗涤。合并溶液，蒸发溶剂，通过快速柱色谱法(硅胶60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇100:2至二氯甲烷/甲醇100:10)纯化粗产物(7.80g)，得到呈白色固体的中间体化合物。

产量：4.00g(42％)。

RF(SiO₂，二氯甲烷/甲醇8:1)：0.50。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):7.79-7.65(m,1H)；7.36-7.20(m,1H)；6.86(d,J＝7.5Hz,1H)；4.49-4.63(m,1H)；4.44-4.29(m,1H)；4.07-3.93(m,4H)；3.90(s,2H)；3.77-3.35(m,16H)；3.25-3.02(m,4H)；2.44-1.75(m,8H)；1.72-1.38(m,22H)；1.38-1.18(m,22H)；1.00(m,6H)。

LC-MS m/z：1012.3(M+H)+。

将来自以上的中间体化合物(3.77g，3.73mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)、[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-1-醇(HOAt，0.51g，3.73mmol)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，1.43g，7.46mmol)溶解于二氯甲烷(120mL)。添加4-甲酰基-苄基-氯化铵(5，0.77g，4.48mmol)。将混合物在室温下搅拌24小时。随后蒸发反应混合物，将其溶解于乙酸乙酯(300mL)，并用0.5M盐酸水溶液(200mL)洗涤。分离有机相，用水(200mL)洗涤，并用硫酸镁干燥。蒸发乙酸乙酯，并将粗混合物通过快速柱色谱法(硅胶60，0.040-0.060mm；洗脱液：二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇100:5)纯化，得到呈白色固体的受保护的醛。

产量：3.00g(71％)。

RF(SiO₂，二氯甲烷/甲醇10:1)：0.70。

1H NMR谱(300MHz,CDCl3,dH):9.99(s,1H)；7.85(d,J＝8.1Hz,2H)；7.64-7.38(m,3H)；7.14-6.97(m,1H)；6.91-6.76(m,1H)；6.54-6.43(m,1H)；4.58(d,J＝6.2Hz,2H)；4.47-4.32(m,1H)；4.09(s,2H)；3.88(s,2H)；3.81-3.30(m,16H)；3.22-3.02(m,4H)；2.38-2.08(m,4H)；1.96-1.71(m,5H)；1.71-1.16(m,41H)；0.99(m,6H)。

LC-MS m/z：1129.5(M+H)+。

将来自以上的受保护的醛(3.00g，2.66mmol)与三氟乙酸(15mL)和水(1mL)的混合物搅拌3小时。此后，该混合物在减压下用二氯甲烷和甲苯蒸发数次。将残余物倾入水/乙腈混合物(1/1，15mL)。用磷酸三钠的饱和水溶液调节pH至8.0，并将所得溶液在50℃下搅拌20分钟。用硫酸氢钾的饱和水溶液调节pH至6.0。残余物通过反相色谱法(DeltaPak，C18，15mm50mm×500mm，乙腈/水5-15％/15min，5-55％/180min+0.05％TFA)脱盐。通过冷冻干燥去除溶剂，得到呈白色粉末的取代基。

产量：0.66g(28％)。

H NMR谱(300MHz,D2O,dH):9.81(s,1H)；7.79(d,J＝7.7Hz,2H)；7.41(d,J＝7.9Hz,2H)；4.44(s,2H)；4.32-4.19(m,1H)；4.05(s,2H)；3.90(s,2H)；3.74-3.43(m,12H)；3.38-3.18(m,4H)；2.83-2.60(m,2H)；2.37-1.76(m,6H)；1.76-1.37(m,4H)；1.34-0.91(m,22H)。

LC-MS m/z：873.8(M+H)+。

N-((1-(4-甲酰基苯基)-3,12,21-三氧代-5,8,14,17-四氧杂-2,11,20-三氮杂二十四烷-24-基)磺酰基)-16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰胺

反应方案：

将Wang树脂0.68mmol/g(20.5g，13.9mmol)在四氢呋喃(200mL)中溶胀20分钟。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，16.1g，41.8mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.17g，1.39mmol)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC，6.47mL，41.8mmol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇18小时。然后将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)洗涤。用乙酸酐(13.2mL，139mmol)和吡啶(11.3mL，139mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(180mL)中的溶液处理树脂。然后将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)洗涤。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×180mL)处理来去除Fmoc基团。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)洗涤。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基-氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-Ado-OH，10.8g，27.9mmol)、5-氯-1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1H-苯并[d][1,2,3]三唑3-氧化物四氟硼酸盐(TCTU，9.91g，27.9mmol)和N,N-二异丙基乙胺(7.28mL，41.8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(180mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2小时。然后将树脂过滤，并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)洗涤。通过用在N,N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶(1×5min，1×30min，2×180mL)处理去除Fmoc基团。将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)和N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)洗涤。将4-(N-(16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基)氨磺酰基)丁酸(THA-SBA-OH，8.91g，18.8mmol)、1-((二甲基氨基)(二甲基亚氨基)甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(HATU，7.16g，18.8mmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.71mL，32.8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(90mL)和二氯甲烷(90mL)的混合物中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇18小时。

将树脂过滤并用N,N-二甲基甲酰胺(2×180mL)、二氯甲烷(2×180mL)、2-丙醇(2×180mL)和二氯甲烷(10×180mL)洗涤。通过用三氟乙酸(150mL)和水(7.5mL)的混合物处理1小时从树脂上切下产物。将树脂过滤并用二氯甲烷(2×150mL)洗涤。减压去除溶剂，用乙醚(100mL)处理残余物。向中间体(7.90g，10.3mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液中添加在水(100mL)中的氢氧化锂一水合物(1.74g，41.4mmol)。将该溶液搅拌18小时。将溶液用10％硫酸氢钾水溶液酸化至pH＝3，然后用氯化钠饱和。去除有机相，用乙酸乙酯(1×300mL)萃取水相。将合并的有机相用无水硫酸钠干燥。减压去除溶剂，得到呈白色粉末的中间体。

产量：5.50g(52％)。

1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):4.22(s,2H)；4.12(s,2H)；3.83-3.61(m,12H)；3.59-3.43(m,6H)；3.02(t,J＝7.4Hz,2H)；2.49(t,J＝7.3Hz,2H)；2.41(t,J＝7.5Hz,2H)；2.22-2.09(m,2H)；1.89-1.75(m,2H)；1.74-1.60(m,2H)；1.47-1.26(m,22H)。

将上述化合物(2.90g，3.80mmol)、4-氨基甲基苯甲醛盐酸盐(0.78g，4.56mmol)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC，0.78g，3.80mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，1.02g，8.35mmol)在无水二氯甲烷(100mL)中的溶液搅拌18小时。过滤出沉淀物，并将溶液用10％硫酸氢钾水溶液(2×100mL)洗涤。减压去除溶剂，并且将残余物从四氢呋喃(30mL)中结晶。通过快速柱色谱法(硅胶60，0.040-0.063mm；洗脱液：二氯甲烷/甲醇，20:1-5:1)纯化，得到呈淡黄色粉末的最终产物。

产量：1.51g(45％)。

1H NMR谱(300MHz,AcOD-d4,dH):9.96(s,1H)；7.91(d,J＝7.9Hz,2H)；7.92(d,J＝7.9Hz,2H)；4.63(s,2H)；4.21(s,2H)；4.08(s,2H)；3.81-3.57(m,12H)；3.54-3.41(m,6H)；3.02(t,J＝7.4Hz,2H)；2.47(t,J＝7.3Hz,2H)；2.38(t,J＝7.4Hz,2H)；2.19-2.07(m,2H)；1.86-1.72(m,2H)；1.70-1.57(m,2H)；1.43-1.23(m,22H)。

LC-MS纯度：100％。

LC-MS Rt(Kinetex 4.6mm×50mm，乙腈/水20:50至100:0+0.1％FA)：3.58min。

LC-MS m/z：882.0(M+H)+。

B.3用于液体酰化的中间体取代基前体的合成

酰化试剂A：16-{[(1S)-1-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2,4-二氯-6-磺基-苯氧基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基}乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基}乙基氨基)-4-氧代-丁基]氨基}-16-氧代-十六烷酸

让2-氯三苯甲基树脂100-200目(3.4g，5mmol)在二氯甲烷(50mL)中溶胀45min。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(9.63g，25mmol)和2,4,6-可力丁(6.6mL，50mmol)在二氯甲烷(50mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇2h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(2×50mL)洗涤。向树脂中两次加入甲醇(2×3.75mL)、二氯甲烷(2×20mL)和2,4,6-可力丁(2×1.25mL)的混合物，并将混合物振摇2×10min。然后用N,N-二甲基甲酰胺(3×25mL)洗涤树脂。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×60mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×60mL)洗涤树脂。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(3.08g，8mmol)、Oxyma Pure(1，14g，8mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(1.24mL，8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(53mL)中的溶液搅拌10min并添加到树脂中，并将混合物振摇2小时。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(4×60mL)洗涤。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×60mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×60mL)洗涤树脂。将(4S)-5-叔丁基氧基-4-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-氧代-戊酸(3.40g,8mmol)、Oxyma Pure(1,14g，8mmol)和N,N-二异丙基-碳二亚胺(1.24mL，8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(53mL)中的溶液搅拌10min并添加到树脂中，并将混合物振摇2h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(6×60mL)洗涤。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×60mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×60mL)洗涤树脂。将十六烷二酸单叔丁酯(2.74g，8mmol)、Oxyma Pure(1.14g，8mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(1.24mL，8mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(53mL)中的溶液搅拌10min并添加到树脂中，并将混合物振摇2h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(2×60mL)和二氯甲烷(2×60mL)洗涤。

为了从树脂上切下产物，将其用2,2,2-三氟乙醇(50mL)处理18h。将混合物用二氯甲烷(50mL)稀释，并将树脂过滤。再次用2,2,2-三氟乙醇(50mL)处理树脂0.5h。过滤树脂，并真空浓缩合并的滤液，得到1.14g浅黄色油状物。

将上述油状物(1.14g，估计为1.4mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，并向其中加入三乙胺(0.77mL，5.6mmol)。在15min内向其中滴加3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯(0.44g，1.7mmol)溶解于2-丙醇(2mL)和二氯甲烷(1mL)的混合物中的溶液。然后将反应混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物用二氯甲烷(40mL)稀释，并用5w/v％碳酸氢钠水溶液(50mL)和10w/v％硫酸氢钾(50mL)的混合物洗涤，然后用10w/v％硫酸氢钾(50mL)洗涤，最后用盐水(50mL)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，真空除去溶剂，得到油状物。将粗产物重新溶解在少量二氯甲烷中，并通过正相制备型色谱法(Combiflash Rf)在RediSep Rf正相硅胶柱上纯化。用梯度逐渐增加的甲醇的二氯甲烷溶液进行洗脱，并在214nm处检测洗脱。合并相关级分并真空浓缩，得到澄清的无色油状物。

将上述油状物溶解于三氟乙酸(4mL)中，并向其中加入三异丙基硅烷(0.1mL)。将混合物搅拌1h，然后在氮气流下除去溶剂。添加乙醚(40mL)，并将混合物冷却至-18℃。过滤混合物，得到白色粘性固体。通过反相制备型HPLC(Gilson)在包含C18-硅胶的柱上纯化粗产物。用梯度逐渐增加的包含0.1v/v％三氟乙酸的乙腈水溶液进行洗脱。使用UPLC分析相关级分，合并包含纯目标产物的级分，并用水稀释至500mL。通过冻干除去溶剂，得到呈白色固体的目标产物。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ8.03(d,J＝7.4Hz,1H),7.90(t,J＝5.6Hz,1H),7.77(d,J＝2.5Hz,1H),7.69(t,J＝5.8Hz,1H),7.65(d,J＝2.5Hz,1H),4.39(bs,2H),4.13(td,J＝8.0,5.2Hz,1H),3.88(s,2H),3.70-3.67(m.2H),3.62-3.51(m,6H),3.46(t,J＝6.0Hz,2H),3.41(t,J＝6.0Hz,2H),3.28(q,J＝5.8Hz,2H),3.20((q,J＝5.8Hz,2H),2.20-2.09(m.6H),1.97-1.89(m.1H),1.80-1.70(m,1H),1.52-1.44(m.4H),1.27-1.21(m,20H)。

LC-MS m/z：[M]⁺计算值930.9，实测值930.6。

11-(4-苄氧羰基苯氧基)十一烷酸的合成

将11-溴十一烷酸(80.0g，300mmol)溶解在叔丁醇(450mL)中，与炭(5.00g)混合并过滤。添加二碳酸二叔丁酯(130g，600mmol)在叔丁醇(450mL)和4-二甲基氨基吡啶(3.60g，30.0mmol)中的溶液，并将所得溶液在室温下搅拌15小时。将混合物用水(300mL)稀释，并加入环己烷(1.5L)。将混合物用10％盐酸溶液(500mL)、水(500mL)和水溶液(500mL)洗涤，并添加盐水以破坏乳液。用无水硫酸镁干燥有机层，并在真空中除去溶剂，得到作为油状物的11-溴十一烷酸叔丁酯。粗产物含有痕量的二碳酸二叔丁酯(根据¹H-NMR)。

产量：119g(100％，含有二碳酸二叔丁酯，对纯产物重新计算为96.3g)。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ3.36(t,J＝6.8Hz,2H)；2.16(t,J＝7.5Hz,2H)；1.86-1.76(m,2H)；1.60-1.48(m,2H)；1.43(s,2H)；1.40(s,9H)；1.25(bs,10H)。

将4-羟基苯甲酸苄酯(62.0g，272mmol)和上述11-溴十一烷酸甲酯(96.3g，300mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(1L)中，并添加碳酸钾(87.0g，1.58mol)。将混合物加热至80℃保持20小时，添加环己烷(2L)和乙酸乙酯(675mL)。滤出固体，并用水(6×500mL)洗涤滤液。用无水硫酸镁干燥有机层，真空除去溶剂，得到呈红色油状物的粗品4-(11-叔丁氧基-11-氧代-十一烷基氧基)苯甲酸苄酯。

产量：147.3g

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.01(d,J＝8.4Hz,2H)；7.49-7.30(m,5H)；6.90(d,J＝8.6Hz,2H)；5.34(s,2H)；4.00(t,J＝6.6Hz,2H)；2.21(t,J＝7.4Hz,2H)；1.80(m,2H)；1.89-1.69(m,2H)；1.60-1.55(m,2H)；1.45(s,9H)；1.30(bs,10H)。

将上述酯(所有物质；300mmol)溶解在甲苯(800mL)中，并添加三氟乙酸(200mL)。将溶液搅拌20小时，然后添加乙酸乙酯(1L)，并将混合物用水(6×500mL)洗涤。将有机层蒸发至干。将残余物溶解于环己烷/乙酸乙酯的混合物(1L)中，并通过二氧化硅垫过滤。蒸发有机溶剂，并将该物质从乙腈中结晶，然后从二氯甲烷/环己烷混合物中结晶，得到呈白色固体的标题产物。

产量：56.5g。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ8.08-7.96(m,2H)；7.48-7.32(m,5H)；6.94-6.83(m,2H)；5.35(s,2H)；4.01(t,J＝6.6Hz,2H)；2.36(t,J＝7.4Hz,2H)；1.85-1.58(m,2H)；1.67-1.60(m,2H)；1.50-1.30(m,12H)。

LC-MS m/z：[M+Na]⁺计算值435.2，实测值435.5。

酰化试剂B:4-(11-{[(1S)-1-羧基-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2,4-二氯-6-磺基-苯氧基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基}乙基氨基)-2-氧代-乙氧基]乙氧基}乙基氨基)-4-氧代-丁基]氨基}-11-氧代-十一烷氧基)苯甲酸

让2-氯三苯甲基树脂100-200目(20.0g，32mmol)在二氯甲烷(3×200mL)中溶胀3×20min。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(37.0g，96mmol)和N,N-二异丙基乙胺(33mL，192mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液添加至树脂，并将混合物振摇16.5h。向树脂中加入甲醇(43mL，1063mmol)，并将混合物振摇4.5h。然后将树脂用二氯甲烷(6×200mL)、N,N-二甲基甲酰胺(3×200mL)、二氯甲烷(8×200mL)洗涤，并在室温下真空干燥。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×250mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×200mL)洗涤树脂。将{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(37g，96mmol)、Oxyma Pure(13.64g，96mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(14.9mL，96mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(120mL)中的溶液搅拌15min并添加到树脂中，并将混合物振摇3.6h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(7×200mL)洗涤。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×250mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×200mL)洗涤树脂。将(4S)-5-苄氧基-4-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-氧代-戊酸(44.11g,96mmol)、Oxyma Pure(13.64g，96mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(14.9mL，96mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(140mL)中的溶液搅拌15min并添加到树脂中，并将混合物振摇4.6h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(7×200mL)洗涤。

通过用N,N-二甲基甲酰胺(2×200mL)中的20v/v％哌啶处理2×15min来使一部分树脂(相当于24mmol)脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(7×200mL)洗涤树脂。将11-(4-苄氧羰基苯氧基)十一烷酸(19.8g，48mmol)、Oxyma Pure(6.82g，48mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(7.5mL，48mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(105mL)中的溶液搅拌15min并添加至树脂中，并将混合物振摇3h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(6×200mL)和二氯甲烷(8×200mL)洗涤。将该树脂真空干燥3天。

为了从树脂上切下产物，将一部分树脂(30.4g，23.4mmol)用2,2,2-三氟乙醇(120mL)和二氯甲烷(30mL)的混合物处理2h。过滤树脂，并再次用2,2,2-三氟乙醇(60mL)和二氯甲烷(15mL)的混合物处理1.5h。过滤树脂，并用二氯甲烷(150mL)和2,2,2-三氟乙醇(75mL)洗涤。合并的滤液和洗涤液在真空中缩减为黄色油状物。将该油状物溶解于乙腈(120mL)中，并真空浓缩，得到黄色蜡状物。将该蜡状物溶解于二氯甲烷中并真空浓缩，得到16.5g稠黄色油状物。

将上述油状物(5.0g，5.1mmol)溶解于2-甲基四氢呋喃(40mL)中，并添加三乙胺(2.1mL，15.3mmol)。在15min内向其中滴加溶解于2-甲基四氢呋喃(10mL)中的3,5-二氯-2-羟基苯磺酰氯(1.4g，5.4mmol)的溶液。然后将反应混合物在室温下搅拌2.5h。将反应混合物用5w/v％硫酸氢钾水溶液(3×32mL)和盐水(3×8mL)的混合物洗涤三次，然后用盐水(2×20mL)和水(2×20mL)的混合物洗涤两次。用无水硫酸镁干燥有机相，真空除去溶剂，得到6.0g半固体。

将残余物(1.8g)溶解于四氢呋喃(40mL)中，将烧瓶抽空三次，并填充惰性氮气气氛。然后将10％活性炭上的钯(0.2g)加入到反应混合物中，并将烧瓶抽空两次，并填充氢气氛。将反应在室温下搅拌。16h后，补充氢气氛，并将反应再搅拌2h。反应混合物通过celite垫过滤，然后通过玻璃纤维过滤器过滤。将滤液真空浓缩。将残余物重新溶解于0.2M磷酸钠缓冲液pH 7.8(50mL)中，并用2-甲基四氢呋喃(40mL+25mL)洗涤两次。向水相中逐滴加入1MHCl(10mL)直至pH在2与3之间，然后添加盐水(50mL)。用2-甲基四氢呋喃(50mL)萃取水相。有机相用2-甲基四氢呋喃(50mL)稀释，用无水硫酸镁干燥，并真空浓缩，得到1.4g白色固体。

¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO):δ8.04(d,J＝7.5Hz,1H),7.88(s,1H),7.87(d,J＝8.5Hz,2H),7.77(d,J＝1.8Hz,1H),7.69(t,J＝5.6Hz,1H),7.65(d,J＝1.8Hz,1H),7.00(d,J＝8.5Hz,2H),4.40(br s,2H),4.16-4.11(m,1H),4.03(t,J＝6.2Hz,2H),3.88(s,2H),3.71-3.67(m,2H),3.49-3.38(m,10H),3.32-3.25(m,2H),3.23-3.17(m,2H),2.17-2.07(m,4H),1.98-1.89(m,1H),1.73-1.67(m,3H),1.52-1.44(m,2H),1.29-1.22(m,12H)。

LC-MS m/z：[M+H]⁺计算值966.3，实测值966.3。

酰化试剂C:4-(11-{[(1S)-1-羧基-4-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-4-氧代-丁基]氨基}-11-氧代-十一烷氧基)苯甲酸

让2-氯三苯甲基树脂100-200目(20.0g，32mmol)在二氯甲烷(3×200mL)中溶胀3×20min。将(4S)-5-苄氧基-4-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-5-氧代-戊酸(44.11g，96mmol)和N,N-二异丙基乙胺(33mL，192mmol)在二氯甲烷(200mL)中的溶液加入到树脂中，并将混合物振摇18h。向树脂中加入甲醇(43mL，1063mmol)，并将混合物振摇4.5h。然后将树脂用二氯甲烷(6×200mL)、N,N-二甲基甲酰胺(3×200mL)、二氯甲烷(8×200mL)洗涤，并在室温下真空干燥。通过用N,N-二甲基甲酰胺中的20v/v％哌啶(2×250mL)处理2×15min来完成脱保护。用N,N-二甲基甲酰胺(6×200mL)洗涤树脂。将11-(4-苄氧羰基苯氧基)十一烷酸(26.4g，64mmol)、Oxyma Pure(9.1g，64mmol)和N,N-二异丙基碳二亚胺(9.9mL，64mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(140mL)中的溶液搅拌15min并添加至树脂中，并将混合物振摇4h。过滤树脂，并用N,N-二甲基甲酰胺(6×200mL)和二氯甲烷(8×200mL)洗涤，并在室温下真空干燥。

为了从树脂上切下产物，将一部分树脂(27.3g，20.6mmol)用2,2,2-三氟乙醇(96mL)和二氯甲烷(24mL)的混合物处理18h。过滤树脂，并再次用2,2,2-三氟乙醇(48mL)和二氯甲烷(12mL)的混合物处理0.5h。过滤树脂，并用二氯甲烷(120+60mL)洗涤两次。将合并的滤液和洗涤液在真空中缩减为油状物。将该油状物重新溶解在乙腈(2×20mL)中两次，并真空浓缩，得到9.59g黄色油状物，其含有8.78g产物。

向上述油状物(4.4g，6.95mmol)的甲苯(32mL)溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.88g，7.64mmol)和四氢呋喃(9mL)，并将混合物加热至45℃直至几乎溶解。向该混合物中缓慢加入N,N-二环己基碳二亚胺(1.58g，7.64mmol)的甲苯(3.4mL)溶液。将反应在40℃下搅拌1h。将反应混合物过滤，并将滤饼用甲苯(10mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液在真空中缩减至体积的50％。将该溶液用甲苯(25mL)稀释，并用5w/v％盐水(2×50mL)洗涤两次。有机相用无水硫酸镁干燥，真空浓缩，得到黄色胶状物。将残余物重新溶解于45℃的温热乙酸乙酯(10mL)中，并向其中加入正庚烷(15mL)，并通过过滤分离所得到的沉淀物。滤饼用正庚烷(15mL)洗涤。得到4.6g呈浅黄色固体的产物。

将上述固体(2.19g，3mmol)溶解于2-甲基四氢呋喃中，并用氮气吹扫该溶液。向溶液中加入活性炭上的钯5％(0.22g)，并用氮气吹扫混合物。然后将烧瓶中的气氛更换成氢气，并将反应在室温下搅拌3h。将反应混合物通过玻璃纤维过滤器过滤，并将滤饼用2-甲基四氢呋喃(15mL)洗涤。将合并的滤液和洗涤液真空浓缩，得到1.2g白色粉末。

¹H NMR(1:1.6:3.3旋转异构体比例，星号表示次要旋转异构体峰，400MHz,d₆-DMSO):δ8.46*(d,J＝7.5Hz,1H)；8.41*(d,J＝8.0Hz,1H),8.11(d,J＝7.6Hz,1H),7.87(d,J＝8.7Hz,2H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),4.78-4.66*(m,1H),4.26(td,J＝8.3,5.0Hz,1H),4.03(t,J＝6.4Hz,2H),3.03-2.93*(m,2H),2.81(s,4H),2.78-2.64(m,2H),2.20-2.02(m,3H),1.98-1.85(m,1H),1.72(quint,J＝6.7Hz,2H),1.54-1.47(m,2H),1.43-1.36(m,2H),1.35-1.23(m,10H)。

LC-MS m/z：[M+H]⁺计算值549.2，实测值549.2。

制备了总计29个取代基，并且在下文中列出，指明各个取代基的Z1-Z10元件。需注意，最终的EGF(A)衍生物中不包括的任何化学基团不包括在各个取代基的描述中。

B.4检测和表征方法

LCMS法

LCMS01(参见表1)

表1：LC-系统：Waters Acquity UPLC。线性梯度：5％至95％B。

LCMS027(参见表2)

表2：Agilent 1290infinity系列UPLC，LC/MSD TOF，6min，5％至95％B，100-3200amu，C18

LCMS029(参见表3):

表3：Waters Acquity UPLC系统，6min(3.5min)，5-(15-35)-100-100-5％B

UPLC法(用于纯度测定)

UPLC01：

UPLC C11：

UPLC C12:

RP-UPLC-01

通过基于CSH C18柱和60mM Na₂SO₄、40mM NH₄PO₄ pH 2.3和乙腈9:1v/v(A缓冲液)/80％乙腈(B缓冲液)溶剂体系的指示稳定性纯度方法评价化学稳定性(即纯度损失)。使用以下条件：柱温：45℃；流速：0.250mL/min，波长：215nm。梯度为50.5min内从38％B到46％B。该纯度方法显示与在类似物溶液中存在5mM Ca²⁺相容，并且在存在和不存在5mM Ca² ⁺的情况下在37℃孵育4周后，在1mg/mL和20mg/mL起始样品中未观察到含量损失(数据未示出)。

由起始样品和在37℃下孵育2或4周的样品的主峰面积的积分确定纯度损失(％)。

RP-UPLC-02

通过基于CSH C18柱(2.1x150mm)和0.1％甲酸(A缓冲液)/100％乙腈(B缓冲液))溶剂体系的指示稳定性纯度方法(在钙的存在下)评价化学稳定性(即纯度损失)。使用以下条件：柱温：55℃；流速：0.250mL/min，波长：215nm。梯度为52min内从25％B到42％B。该纯度方法显示与在类似物溶液中存在Ca²⁺相容，并且未观察到含量/类似物损失(数据未示出)。由各种样品(即起始样品和在37℃下孵育2、4和6周的样品)的主峰面积的积分确定类似物的纯度。

工艺开发方法

RP01

B.5实施例化合物

实施例1

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基

-[Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:2。

通过通用方法A和C制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1743.9；实测m/4＝1308.1；实测m/5＝1046.7；计算质量＝5229.1；实测质量＝5229.6。

实施例2

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:3。

通过通用方法A和C制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1749.5；实测m/4＝1312.4；实测m/5＝1050.1；计算质量＝5246.0；实测质量＝5246.4。

实施例3

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:4。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1314.6；实测m/5＝1052.1；计算质量＝5255.9。

实施例4

N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:3。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1282.3；实测m/5＝1026.3；计算质量＝5126.8。

实施例5

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法A和C制备化合物。

LCMS029：计算质量＝5246.92；实测质量＝5247.37。

实施例6

N{ε-299}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys299,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:7。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1714.2；实测m/4＝1286.1；计算质量＝5140.85。

实施例7

N{ε-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:8。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1700.8；实测m/4＝1275.8；实测m/5＝1020.9，计算质量5099.7；实测质量＝5099.75。

实施例8

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(16-磺基十六碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

23：该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法A和C制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1757.1；实测m/4＝1318.04；计算质量＝5268.95；实测质量＝5269.39。

实施例9

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-肽

24：该肽为SEQ ID NO:8。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1939.2；实测m/4＝1454.2；计算质量＝5815.6；实测质量＝5816.1。

实施例10

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:11。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1282.6；实测m/5＝1026.3；计算质量＝5126.8。

实施例11

N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:12。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1300.6；实测m/5＝1040.5；计算质量＝5198.9。

实施例12

N{α}(N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:13。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝3022.4；实测m/3＝2015.3；实测m/4＝1511.8；实测m/5＝1209.6；实测质量＝6043.6；计算质量＝6042.9。

实施例13

N{α}(N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:13。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝3030.4；实测m/3＝2020.7；实测m/4＝1515.7；实测m/5＝1212.8；实测质量＝6059.7；计算质量＝6058.8。

实施例14

N{α}(N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:15。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1497.4；实测m/5＝1198.3；计算质量＝5986.7。

实施例15

N{α}(N{ε-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:16。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1987.7；实测m/4＝1491.0；实测m/5＝1193.0；计算质量＝5959.7。

实施例16

N{α}(N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:17。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1500.9；实测m/5＝1201.2；计算质量＝6000.8。

实施例17

N{α}(N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:18。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1498.2；实测m/5＝1198.7；计算质量＝5986.7。

实施例18

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:19。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/2＝2635.7；实测m/3＝1757.5；实测m/4＝1318.4；实测m/5＝1054.9；计算质量＝5270.0；实测质量＝5270.5。

实施例19

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法A和D制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5127.8；实测m/3＝1710.0；实测m/4＝1282.3；实测m/5＝1026.5；计算质量＝5127.8。

实施例20

N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:21。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1286.1；实测m/5＝1029.1；计算质量＝5140.9。

实施例21

N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:22。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1282.9；实测m/5＝1026.5；计算质量＝5127.8。

实施例22

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Gln312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:23。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1709.8；实测m/4＝1282.6；计算质量＝5126.8；实测质量＝5127.3。

实施例23

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:24。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝2571.2；实测m/3＝1714.5；实测m/4＝1286.1；实测m/z＝5141.4；计算质量＝5140.9。

实施例24

N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:25。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝2607.2；实测m/3＝1738.5；实测m/4＝1304.1；实测质量＝5213.5；计算质量＝5212.9。

实施例25

N{α-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:26。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1479.7；计算质量＝5914.8Da；实测质量＝5914.3。

实施例26

N{ε-300}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:27。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1286.9；实测m/5＝1029.7；计算质量＝5141.8。

实施例27

N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:28。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5957.6；实测m/4＝1490.4；实测m/5＝1192.3；Calc m/1＝5957.7。

实施例28

N{ε-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys293,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:29。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5929.4；实测m/4＝1483.3；实测m/5＝1186.8；计算m/1＝5929.7。

实施例29

N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:30。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1700.8；实测m/4＝1275.8；实测m/5＝1020.9；计算质量＝5099.8(1A)。

实施例30

N{ε-318}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys318]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:31。

LCMS01：实测m/4＝1286.5；实测m/5＝1029.5；计算质量＝5142.8。

实施例31

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝6002.8；实测m/4＝1501.6；实测m/5＝1201.5；计算m/1＝6002.7。

通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和5mM氯化钙的肽Seq.ID32(4mL，37.4mg/mL，150mg，0.033mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(1.43mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(0.165mL)直到pH达到11.5，然后加入5mM氯化钙(1.58mL)。

将酰化试剂B(350mg，31.5w/w％，0.115mmol)溶解于水(0.3mL)中，并添加1M氢氧化钠(0.5mL)。在搅拌下于15min内将该酰化试剂溶液添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加0.5M氢氧化钠以使pH保持在11.5。完全添加侧链后，继续添加0.5M氢氧化钠，以使pH保持在11.5。通过UPLC跟踪反应，直到所有活性侧链被耗尽。总反应时间为3.5h。通过滴加三氟乙酸(0.03mL)将反应混合物中和至pH 7.5。

通过UPLC01，获得79.6％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+5H]⁵⁺计算值1200.7，实测值1201.7。

实施例32

N{ε-326}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys326]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:33。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1719.8；实测m/4＝1290.1；实测m/5＝1032.3；计算质量＝5156.8。

实施例33

N{ε-325}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys325]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:34。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1715.1；实测m/4＝1286.6；实测m/5＝1029.5；计算质量＝5142.8。

实施例34

N{ε-323}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys323]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:35。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5108.8；实测m/3＝1703.8；实测m/4＝1278.1；实测m/5＝1022.5。

实施例35

N{ε-322}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys322]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:36。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5198.9；实测m/3＝1733.8；实测m/4＝1300.6；实测m/5＝1040.7。

实施例36

N{ε-320}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys320]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:37。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1720.4；实测m/4＝1290.3；实测m/5＝1032.5；计算质量＝5158.8。

实施例37

N{ε-329}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys329]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:38。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝2550.7；实测m/3＝1700.8；实测m/4＝1275.9；计算质量＝5099.8；实测质量＝5100.5。

实施例38

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:39。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5143.0；实测m/4＝1286.0；实测m/5＝1029.0；计算m/1＝5142.8。

实施例39

N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:40。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/2＝2564.7；实测m/3＝1710.2；实测m/4＝1282.9；实测5127.8；计算质量＝5128.5。

实施例40

N{ε-316}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys316]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:41。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1709.7；实测m/4＝1282.3；实测m/5＝1026.1；计算质量＝5126.8。

实施例41

N{ε-315}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys315]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:42。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1698.3；实测m/4＝1273.8；实测m/5＝1019.3；计算m/1＝5092.8。

实施例42

N{α}([His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:43。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5306.3；实测m/3＝1768.7；实测m/4＝1327.1；实测m/5＝1061.7。

实施例43

N{ε-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:44。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1300.2；实测m/5＝1040.2；计算质量＝5198.9。

实施例44

N{ε-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:45。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1714.9；实测m/4＝1286.2；实测m/5＝1029.2；计算质量＝5142.8。

实施例45

N{ε-307}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:46。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1919.8；实测m/4＝1290.1；实测m/5＝1032.3；计算质量＝5156.8。

实施例46

N{α}([Leu301,Ser309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:47。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1738.8；实测m/4＝1304.1；实测m/5＝1043.5；实测质量＝5214.3。

实施例47

N{α}([Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:48。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/1＝5187.2；实测m/3＝1729.7；实测m/4＝1297.2；实测m/5＝1038.4；计算m/1＝5186.8。

实施例48

Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:2。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1465.3；实测m/4＝1099.3；实测m/5＝879.6；计算＝4391.0。

实施例49

[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:3。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1470.3；实测m/4＝1103.0；实测m/5＝882.6；计算＝4407.9。

实施例50

[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1471.3；实测m/4＝1103.7；实测m/5＝883.2；计算＝4411.9。

实施例51

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Tyr306,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:49。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1695.8；计算质量＝5085.1。

实施例52

N{α-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Asn293,Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:50。

LCMS29：实测m/3＝1706.1，计算质量＝5115.7。

通过通用方法B制备化合物。

实施例53

N{ε-306}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:51。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1707.0；实测m/4＝1280.3；实测m/5＝1024.4；计算质量＝5118.8。

实施例54

N{ε-305}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys305,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:52。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1723.8；实测m/4＝1292.8；实测m/5＝1034.4；计算质量＝5168.8。

实施例55

N{ε-303}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys303,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:53。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1733.7；实测m/4＝1300.3；实测m/5＝1040.5；计算质量＝5198.9。

实施例56

N{ε-302}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys302,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:54。

通过通用方法B制备化合物。

实施例57

N{α}([Asn293,His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys；

该肽为SEQ ID NO:55。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1341.5；实测m/5＝1073.3；计算质量＝5363。

实施例58

N{ε-301}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:56。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1715.2；实测m/4＝1286.6；实测m/5＝1029.5；计算质量＝5142.8。

实施例59

N{ε-298}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys298,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:57。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1715.1；实测m/4＝1286.3；实测m/5＝1029.3；计算m/z＝5142.8。

实施例60

N{α}([Asn293,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:58。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1780.7；实测m/4＝1335.5；实测m/5＝1068.4；计算质量＝5340.1。

实施例61

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Ile307,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:59。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1700.0；实测m/4＝1275.1；实测m/5＝1020.3；计算质量＝5097.8。

实施例62

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:60。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1704.3；实测m/4＝1278.5；实测m/5＝1030.4；计算m/z＝5110.8。

实施例63

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Ile307,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:61。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1700.3；实测m/4＝1275.2；实测m/5＝计算质量＝5098.8。

实施例64

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:62。

通过通用方法A+C制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1757.1；实测m/4＝1318.1；实测m/5＝1054.2；计算质量＝5269.0。

实施例65

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Pro300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该

该肽为SEQ ID NO:5。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1709.1；计算质量＝5124.8。

实施例66

N{α}([Asn293,Leu301,Ile307,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该

该肽为SEQ ID NO:9。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1329.1；计算质量＝5313.0。

实施例67

N{α}([Asn293,Leu301,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:10。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1325.6；计算质量＝5299.0。

实施例68

N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基氨磺酰基]丁酰基氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]甲基]苯基]甲基-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法C制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1320.1；计算质量＝5276.98。

实施例69

N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328,His329]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:6。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1278.09；计算质量＝5108.8Da。

实施例70

N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Asp295,Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:20。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1282.84；计算质量＝5127.8Da。

实施例71

N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:62。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1717.5，实测m/4＝1288.2，实测m/5＝1030.4，计算质量＝5149.9。

实施例72

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:26。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/4＝1292.1；计算质量＝5164.8Da。

实施例73

N{ε-296}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys296,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:63。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1709.9；实测m/4＝1282.6；计算质量5126.8。

实施例74

N{ε-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:64。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1289.7；实测m/5＝1031.7；计算质量＝5154.8。

实施例75

N{ε}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:65。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1752.9；实测m/4＝1315.0；计算质量＝5255.9。

实施例76

N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Gly294,Leu301,Arg309,Glu312,Lys328],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:66。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1676.6，实测m/4＝1257.7，实测m/5＝1006，计算质量＝5026.7。

实施例77

N{α}([Leu301,Asp306,Arg309,Glu312,Gly324]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:67。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1721.8；计算质量＝5162.8Da。

实施例78

N{α}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Asp306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:68。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS029：实测m/3＝1528.7；计算质量＝6110.8Da。

实施例79

N{α}(N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:17。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1493.9；实测m/5＝1195.5；计算质量＝5972.7。

实施例80

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:4。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1743.6；实测m/4＝1307.9；实测m/5＝1046.4计算质量＝5227.9。

实施例81

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:4。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1762.3；实测m/4＝1321.7；实测m/5＝1057.8；计算质量＝5284.0。

实施例82

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:4。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1656.2；实测m/4＝1242.4；实测m/5＝994.0；计算质量＝4965.6。

实施例83

N{α}(N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:17。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1958.5；实测m/4＝1468.9；实测m/5＝1175.3；计算质量＝5872.7。

实施例84

N{α}(N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:17。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1483.1；实测m/5＝1186.6；计算质量＝5928.8。

实施例85

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:69。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1500.1；实测m/5＝1200.3；实测m/z＝1000；计算质量＝5997.7。

实施例86

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:70。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1469.3；实测m/5＝1175.8；计算质量＝5874.6。

实施例87

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:71。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1469.1；实测m/5＝1175.5；计算质量＝5874.6。

实施例88

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:39。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1469.3；实测m/5＝1175.7；计算质量＝5874.5。

实施例89

N{α}(N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:72。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1497.6；实测m/5＝1198.3；计算质量＝5987.7。

实施例90

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:73。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1472.6；实测m/5＝1178.3；计算质量＝5887.6。

实施例91

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:74。

通过通用方法B制备化合物。

LC-MS：实测m/3＝1981，m/4＝1486；计算质量＝5940.6。

实施例92

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:39。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1507.3；实测m/5＝1205.9；计算质量＝6025.7。

实施例93

N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:75。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1487.1；实测m/5＝1190.0；计算质量＝5945.6。

实施例94

N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:76。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1455.1；计算质量＝5817.5。

实施例95

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:76。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1272.4；实测m/5＝1017.9；计算质量＝5085.7。

实施例96

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:77。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1469.1；实测m/5＝1175.5；计算质量＝5873.6。

实施例97

N{α}(N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:78。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS28：实测m/3＝1996.9；实测m/4＝1497.9；计算质量＝5987.7。

实施例98

N{α}(N{ε-313}-[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1808.1；实测m/4＝1356.4；实测m/5＝1085.3；计算质量＝5422.1。

实施例99

N{α}(N{ε-313}-[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丁酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1894.2；实测m/4＝1420.9；实测m/5＝1136.9；计算质量＝5680.3。

实施例100

N{α}(N{ε-313}-[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1922.2；实测m/4＝1441.9；实测m/5＝1153.7；计算质量＝5764.4。

实施例101

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1566.2；实测m/5＝1252.9；计算质量＝6260.9。

实施例102

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(3-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1494.6；m/5＝1195.9；计算质量＝5974.6。

实施例103

Ala299,Leu301,Ile307,Arg309-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:79。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/2＝2191.4；实测m/3＝1461.0；计算＝4381.0。

实施例104

Leu301,Arg309,Lys310-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:80。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1475.3；实测m/4＝1107.0；计算＝4424.0。

实施例105

Leu301-LDL-R-(293-332)-肽

该肽为SEQ ID NO:81。

通过通用方法A制备化合物。

LCMS01：实测m/3＝1456.3；实测m/4＝1217.0；计算＝4368.9。

实施例106

N{α}([His300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:82。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/3＝1760.5；实测m/4＝1320.6；实测m/5＝1056.7；计算质量＝5279.0。

实施例107

N{α}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:4。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1996.9；实测m/4＝1497.9；实测m/5＝1198.6；计算质量＝5987.7。

实施例108

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(295-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:83。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1460.8；实测m/5＝1168.7；计算质量＝5839.5。

实施例109

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(3-羟基-1,2-噁唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(3-羟基-1,2-噁唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:69。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1495.0；实测m/5＝1196.0；计算质量＝5975.7。

实施例110

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(3-羟基-1,2-噁唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(3-羟基-1,2-噁唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1489.0；实测m/5＝1191.0；计算质量＝5952.7。

实施例111

N{α}(N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:84。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1987.6；实测m/4＝1490.9；实测m/5＝1193.0；计算质量＝5959.7。

实施例112

N{α}(N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:85。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1991.6；实测m/4＝1493.9；实测m/5＝1195.1；计算质量＝5971.7。

实施例113

N{α}(N{ε-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:86。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2028.3；实测m/4＝1521.5；计算质量＝6081.8。

实施例114

N{α}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Trp294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:87。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2025.3；实测m/4＝1519.2；实测m/5＝1215.6；计算质量＝6072.8。

实施例115

N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:88。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/2＝2916.7；实测m/3＝1944.9；实测m/4＝1458.9；计算质量＝5831.5。

实施例116

N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:89。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2924.1；实测m/3＝1949.6；实测m/4＝1462.4；计算质量＝5846.5。

实施例117

N{α}(N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:90。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1977.6；实测m/4＝1483.5；实测m/5＝1187.2；计算质量＝5930.6。

实施例118

N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:91。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/2＝2930.4；实测m/3＝1953.9；实测m/4＝1465.7；计算质量＝5859.6。

实施例119

N{α}(N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:92。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2020.6；实测m/4＝1515.7；实测m/5＝1212.8；计算质量＝6058.8。

实施例120

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Tyr306,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:93。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2010.2；实测m/4＝1508.2；实测m/5＝1206.8；计算质量＝6028.7。

实施例121

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:11。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/2＝2930.3；实测m/3＝1953.7；实测m/4＝1465.8；计算质量＝5858.6。

实施例122

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:40。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/2＝2930.1；实测m/3＝1953.9；实测m/4＝1465.7；计算质量＝5859.6。

实施例123

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:22。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2930.9；实测m/3＝1954.3；实测m/4＝1465.9；计算质量＝5859.6。

实施例124

N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:94。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2916.1；实测m/3＝1944.2；实测m/4＝1458.4；计算质量＝5830.6。

实施例125

N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:106。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2916.6；实测m/3＝1944.5；实测m/4＝1458.9；计算质量＝5831.5。

实施例126

N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:30。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2916.7；实测m/3＝1944.6；实测m/4＝1458.7；计算质量＝5831.5。

实施例127

N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:95。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1958.3；实测m/4＝1469.0；计算质量＝5871.6。

实施例128

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2966.28；实测m/3＝1978.0；实测m/4＝1483.5；计算质量＝5930.7。

实施例129

N{α}(N{ε-313}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2676.0；实测m/3＝1784.2；实测m/4＝1338.4；计算质量＝5330.1。

实施例130

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:96。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1966.7；实测m/4＝1475.0；计算质量＝5896.6。

实施例131

N{α}(N{ε-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丙氧基]乙氧基)乙氧基]丙基氨基]-4-氧代丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丙氧基]乙氧基)乙氧基]丙基氨基]-4-氧代丁酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2009.9；实测m/4＝1507.7；计算质量＝6026.8。

实施例132

N{ε-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丙氧基]乙氧基)乙氧基]丙基氨基]-4-氧代丁酰基],N{ε-332}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]丙氧基]乙氧基)乙氧基]丙基氨基]-4-氧代丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:97。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1971.3；实测m/4＝1478.9；计算质量＝5911.7。

实施例133

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:98。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1505.0；实测m/5＝1204.3；计算质量＝6016.7。

通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和5mM氯化钙的肽Seq.ID98(1.69mL，29.6mg/mL，50mg，0.011mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(0.476mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(0.054mL)直到pH达到11.5，然后加入5mM氯化钙(0.15mL)。

将酰化试剂B(32.7mg，78.5w/w％，0.026mmol)溶解于水(0.075mL)中，并添加1M氢氧化钠(0.06mL)。在搅拌下于9min内将该酰化试剂溶液添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加0.5M氢氧化钠以使pH保持在11.5。完全添加侧链后，继续添加0.5M氢氧化钠，以使pH保持在11.5。通过UPLC跟踪反应，直到所有活性侧链被耗尽。总反应时间为2h。通过滴加三氟乙酸(0.01mL)将反应混合物中和至pH 7.5。

通过UPLC01，获得84.6％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+5H]⁵⁺计算值1203.6，实测值1204.4。

实施例134

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:19。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1766.7；实测m/5＝1325.3；计算质量＝5258.0。

实施例135

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys314]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:99。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1487.3；实测m/5＝1190.0；计算质量＝5945.6。

实施例136

N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:100。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1469.3；实测m/5＝1175.5；计算质量＝5873.6。

实施例137

N{ε-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Lys314]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:101。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1483.3；实测m/5＝1186.8；计算质量＝5929.7。

实施例138

N{ε-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:102。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1473.0；实测m/5＝1178.6；计算质量＝5889.5。

实施例139

N{α}(N{ε-313}-11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基

-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:69。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1297.4；实测m/5＝1038.2；计算质量＝5186.9。

实施例140

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(1H-四唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(1H-四唑-5-基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1481.6；实测m/5＝1185.3；计算质量＝5922.7。

实施例141

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(14-磺基十四碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(14-磺基十四碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/3＝1992.6；实测m/4＝1494.7；实测m/5＝1196.0；计算质量＝5974.8。

实施例142

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(甲基磺酰基氨基甲酰基氨基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[13-(甲基磺酰基氨基甲酰基氨基)十三碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/3＝2020.7；实测m/4＝1515.8；实测m/5＝1212.8；计算质量＝6058.8。

实施例143

N{α}(N{ε-313}-[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:98。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝2719.0；实测m/3＝1812.8；实测m/4＝1359.8；计算质量＝5436.1。

通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和5mM氯化钙的肽Seq.ID98(1.69mL，29.6mg/mL，50mg，0.011mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(0.476mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(0.060mL)直到pH达到11.3，然后加入5mM氯化钙(0.15mL)。

将酰化试剂C(25.9mg，92.7w/w％，0.044mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(0.08mL)中。在搅拌下于60min内将该酰化试剂溶液添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加0.5M氢氧化钠以使pH保持在11.3。完全添加侧链后，继续添加0.5M氢氧化钠，以使pH保持在11.3。通过UPLC跟踪反应，直到没有进一步的产物形成。总反应时间为1.5h。

通过UPLC C11，获得84.0％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+5H]⁵⁺计算值1087.5，实测值1088.2。

实施例144

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:98。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1982.2；实测m/4＝1486.9；实测m/5＝1189.7；计算质量＝5944.7。

通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和5或10mM氯化钙的肽Seq.ID 98(1.69mL，29.6mg/mL，50mg，0.011mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(0.476mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(0.05mL)直到pH达到11.5，然后加入5mM氯化钙(0.15mL)。

将酰化试剂A(25.5mg，96.6w/w％，0.026mmol)溶解于水(0.15mL)中，并添加1M氢氧化钠(0.05mL)。在搅拌下于9min内将该酰化试剂溶液添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加0.5M氢氧化钠以使pH保持在11.5。完全添加侧链后，继续添加0.5M氢氧化钠，以使pH保持在11.5。通过UPLC跟踪反应，直到所有活性侧链被耗尽。总反应时间为2h。

通过UPLC01，获得85.1％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+5H]⁵⁺计算值1189.2，实测值1189.9。

实施例145

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[16-(1H-四唑-5-基)十六碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝2003.3；实测m/4＝1502.7；实测m/5＝1202.2；计算质量＝6006.8。

实施例146

N{α}(N{ε-313}-[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:98。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/3＝1788.8；实测m/4＝1341.9；实测m/5＝1073.7；计算质量＝5364.1。

实施例147

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰

基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:103。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS29：实测m/2＝3020.8；实测m/3＝2014.3；实测m/4＝1510.9；计算质量＝6039.8。

实施例148

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/3＝2195.5；实测m/4＝1646.9；实测m/5＝1317.7；计算质量＝6583.3。

实施例149

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:74。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS027：实测m/3＝1990.6；实测m/4＝1493.2；实测m/5＝1191.1；计算质量＝5968.7。

实施例150

N{α}(N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:78。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/2＝2958.7；实测m/3＝1973.0；实测m/4＝1480.0；计算质量＝5915.7。

实施例151

N{α}(N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:104。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1483.2；实测m/5＝1186.8；计算质量＝5930.0。

通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和10mM氯化钙的肽Seq.ID104(106mL，27.5mg/mL，2.91g，0.639mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(26.5mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(6mL)直到pH达到11.5。

将酰化试剂A(2023.3mg，96.3w/w％，2.09mmol)溶解于水(5mL)中，得到浑浊的溶液。在搅拌下，缓慢加入1M氢氧化钠直至pH 6-7，并且溶液变得澄清。将该溶液用水稀释至15mL。于10min内(1.1mL/min)将该酰化试剂溶液(11mL，1.53mmol)添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加1M氢氧化钠(3mL)以使pH保持在11.5。完全添加侧链后，继续添加氢氧化钠(1.1mL)，以使pH保持在11.5。通过UPLC跟踪反应，直到所有活性侧链被耗尽。总反应时间为2h。通过滴加三氟乙酸(0.3mL)将反应混合物中和至pH 7.5，得到不澄清的溶液。

通过UPLC01，获得85.4％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+3H]³⁺计算值1976.3，实测值1976.6，[M+4H]⁴⁺计算值1482.5，实测值1483.0，[M+5H]⁵⁺计算值1186.2，实测值1186.2。

实施例152

N{α}(N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:72。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS34：实测m/4＝1974.6；实测m/5＝1183.9；计算质量＝5915.7。

实施例153

N{α}(N{ε-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys324]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:105。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1483.3；实测m/5＝1186.8；计算质量＝5929.8。通过通用方法E制备的化合物。

在搅拌下，向含有20mM Tris，pH 7.5和10mM氯化钙的肽Seq.ID105(3.54mL，14.1mg/mL，50mg，0.011mmol)溶液中加入N-甲基吡咯烷酮(0.884mL)。向混合物中缓慢加入1M氢氧化钠(0.070mL)直到pH达到11.5。

将酰化试剂A(31.6mg，96.6w/w％，0.033mmol)溶解于水(0.10mL)中，添加1M氢氧化钠(0.035mL)，然后添加水(0.05mL)。在搅拌下于9min内将该酰化试剂溶液添加至肽溶液。同时，以一定的速率添加0.5M氢氧化钠以使pH保持在11.5。完全添加侧链后，继续添加0.5M氢氧化钠，以使pH保持在11.5。通过UPLC跟踪反应，直到所有活性侧链被耗尽。总反应时间为3h。

通过UPLC C11，获得75.6％的目标产物。

LC-MS m/z：[M+5H]⁵⁺计算值1186.2，实测值1187.0。

实施例154

N{α}(N{ε-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:104。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1497.3；实测m/5＝1198.2；计算质量＝5985.9。

实施例155

N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基],N{ε-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-肽

该肽骨架为SEQ ID NO:72。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS01：实测m/4＝1454.7；实测m/5＝1164.0；计算质量＝5815.6。

实施例156

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:32。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/3＝2094.6；实测m/4＝1571.2；计算质量＝6281.1。

实施例157

N{α}(N{ε-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[[11-(4-羧基苯氧基)十一碳酰基氨基]甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:98。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/3＝2099.3；实测m/4＝1574.7；计算质量＝6295.1。

实施例158

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:19。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/3＝1813.2；实测m/4＝1360.2；实测m/5＝1088.3；计算质量＝5437.2。

实施例159

N{α}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(17-羧基十七碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰基]Lys

该肽骨架为SEQ ID NO:19。

通过通用方法B制备化合物。

LCMS27：实测m/3＝1803.9；实测m/4＝1353.1；实测m/5＝1082.7；计算质量＝5409.2。

表4.实施例化合物1-159的汇总表

D.通用表征方法

D.1.1PCSK9-LDL-R结合竞争(ELISA)

该试验的目的是测量EGF(A)化合物对PCSK9的表观结合亲和力。

由于它们抑制PCSK9与LDL-R相互作用的能力，本发明化合物也可以被称为PCSK9抑制剂。

实验前一天，将重组人低密度脂蛋白受体(rhLDL-R；NSO-衍生的；R&Dsystems#2148-LD)以1μg/ml溶解于50mM碳酸钠，pH 9.6中，然后向测定板(Maxisorp 96，NUNC#439454)的每个孔中添加100μl的该溶液，并在4℃下包被过夜。在实验当天，一式两份制作含生物素化PCSK9(0.5ug/ml，BioSite/BPSBioscience目录号71304)的EGF(A)化合物的八点浓度曲线。制备EGF(A)化合物和生物素化PCSK9的混合物，并于室温下在含有25mMHepes，pH 7.2(15630-056，100ml，1M)、150mM NaCl(Emsure 1.06404.1000)、1％HSA(SigmaA1887-25G)、0.05％吐温20(Calbiochem 655205)、2mM CaCl₂(Sigma 223506-500G)的测定缓冲液中孵育1小时。然后将包被的测定板用200μl测定缓冲液洗涤4次，然后将100μl的EGF(A)化合物和生物素化PCSK9的混合物添加至该板并在室温下孵育2小时。将平板用200μl的测定缓冲液洗涤4次，然后在室温下与链霉亲和素-HRP(25ng/ml；VWR#14-30-00)孵育1小时。通过添加50μl的TMB-on(KEM-EN-TEC)来检测该反应并在黑暗中孵育10分钟。然后通过向混合物中添加(通过电子多次移液添加)50μl的4M H₃PO₄终止该反应。然后在1小时内用Spectramax在450和620nm处读板。620nm读数用于背景减除。使用Graphpad Prism，通过非线性回归对数(抑制剂)对响应变量斜率(四个参数)计算IC₅₀值，并使用以下公式转换成Ki值：Ki＝IC₅₀/(1+(生物素-PCSK9)/(kd(生物素-PCSK9)))，其中生物素-PCSK9的Kd为1.096727714μg/ml，并且[生物素-PCSK9]＝0.5(μg/ml)。

结果在以下表5.1-5.5中示出。较高的Ki值反映较低的对PCSK9的表观结合亲和力，反之亦然。注意到，少数化合物表现出的Ki大大高于针对EGF66测量的值，如高于500nM的值，这表明观察到的结合不是特异性的。肽的氨基酸置换和/或一个或多个侧链衍生化均可导致与LDL-R的结合的丧失。通常，大量测试的EGF(A)化合物表现出抑制PCSK9与hLDL-R结合的能力。

PCSK9抑制剂肽

如D1.1部分所述测试最初一组包含各种氨基酸置换的肽，结果在表5.1中示出。

表5.1-PCSK9肽的表观结合亲和力(Ki)

实施例编号	肽变体	Ki(nM)
			WT	-	-
48	299A,301L,307I,309R,310K	9.4
			103	299A,301L,307I,309R	0.9
104	301L,309R,310K	7.3
			49	301L,309R	1.2
105	301L	2.8
			50	301L,309R,312E	1.1

在WO 2012177741中被确定为最有效的肽变体的EGF66具有5个突变。如上所见，本发明人发现这些突变中有几个对于在D1.1所述的试验中所确定的EC₅₀值并不是特别重要。具体而言，发明人发现在位置310处含有野生型残基Asp(D)的化合物比含有310K的化合物具有更高的效力。还可看出，关键氨基酸置换为301L，优选与309R组合。最后，307I和299A仅适度地有助于对肽的亲和力。

取代基的N-端连接

在随后的实验中，测试了半衰期延长体(例如取代基)与肽的连接是否会影响如通过D.1.1所述试验所确定的EC₅₀。如本文所述，可通过不同的技术连接取代基，发明人最初决定使用肽的N-端氨基酸经由氮原子进行连接。这如在部分B中所述通过酰化(在溶液中或在树脂上)和烷基化完成。

如表5.2所示，所有经测试的化合物都具有低于3.0的Ki值，提示各种延长体和连接体元件被良好地容许。这是不寻常的，因为如先前对于诸如GLP-1的肽所观察到的，侧链的连接对效力通常有负面影响。

表5.2.N-端取代的PCSK9肽的表观Ki

取代基的Lys连接

为了评价取代基与PCSK9抑制剂肽连接的备选位置，制备了一系列化合物。除了在实施例58、29和4中与各个位置上的Lys置换组合外，使用包含以下三个氨基酸置换的骨架肽：N301L、N309R和K312E。所有经测试的化合物在位置297、304、308、317、319、331处包含6个半胱氨酸氨基酸，它们通常参与半胱氨酸二硫桥。包括312E是为了确保位点特异性置换，实施例4除外，其中获得与野生型312K的连接。还测试了肽延伸一个Lys(实施例75和3)。包含C18二酸延长体和gGlu-2xAdo连接体的上述相同取代基在所有化合物中使用并通过酰化连接。结果包括在表5.3中。

表5.3.含有经由Lys残基连接的取代基的PCSK衍生物的表观Ki

该分析显示，大多数PCSK9抑制剂肽保持了功能性。例外为位置298、301、302和307中任一个处的Lys置换和衍生化，其产生非功能性肽。还观察到位置296、299、315和320K处的Lys引入和置换降低了表观亲和力。

因此该数据也证实了表5.1的结果，表明Asn(N)301至Leu(L)的氨基酸置换对结合是必需的。

没有观察到在位置295和310处的Lys引入和置换的数据。如上所述，先前已经发现，在310处保持Asp优于310K置换。如下所见，还发现在位置295处引入Asp(D)消除了结合(实施例70)。

总之，得出以下结论：在位置295、298、302、307和310中任一个位置处不包含连接的取代基或在PCSK9肽的位置295、296、298、299、302、307、310、315和320中任一个位置处不包含连接的取代基的化合物通常是功能性的。进一步得出以下结论：位置295、298、302和310中任意位置处的氨基酸置换通常不具吸引力。从表5.1和5.2可以看出，V307I突变联合301Leu似乎不可接受，甚至没有吸引力。

进一步认为，在位置295、296、298、302、310之一的位置处含有氨基酸置换的肽可能具有较低的功能性，而位置299、315和320处的置换似乎只略微降低了功能性。另一方面，这也提示其余氨基酸残基可能存在高度灵活性，因为Lys置换以及侧链的连接像大多数其它氨基酸置换一样会对肽有影响。

含有两个取代基的PCSK9抑制剂

制备了一系列含有两个取代基的化合物。可通过在N-端或Lys(K)残基处的酰化、烷基化或组合获得双置换。此外，N-端可以是氨基酸293G或变异氨基酸残基，如292A、293G、293K和294T(在293G缺失的情况下)。这些化合物是用不同的取代基制备的，尽管在单个化合物上的两个取代基是相同的。本研究中使用的骨架还包括N301L氨基酸置换与N309R和各种N-端和/或Lys置换的组合，这是获得特定酰化/烷基化所需要的。

表5.4.双取代的PCSK9抑制剂的表观Ki

发明人还得出以下结论：这些取代基在各个位置和组合中被非常良好地容许。

其它PCSK9抑制剂衍生物

为进一步探索各种氨基酸置换在PCSK9肽中的作用，制备了其它化合物并如表5.5所示进行测试。所有化合物都包含一个取代基，该取代基经由通过氨基酸置换或333K延伸引入的Lys残基进行连接。全部骨架肽都包含N301L氨基酸置换，并且任选地包含N309R和I312E中的一个或多个。全部取代基都包含含有16-20个碳原子的脂肪二酸以及连接体，该连接体是单独的gGlu，或延伸出Ado-Ado和/或氨甲环酸(Trx)部分。

表5.5其它PCSK9衍生物的表观Ki

以上表5.5中的结果显示，位置312处的内部野生型赖氨酸可以被Glu(E)以及Gln(Q)、Arg(R)或Asp(D)置换。基于这种变异，预期在位置312处将会容许宽范围的氨基酸残基，而不干扰肽的抑制功能。

几种其它氨基酸置换也被证明能被良好地容许，包括G293N、T294G、D299A、N300H、H306Y、H306D、N309S、Q324G和R329H，而如上所述，N295D和N300P都不是有吸引力的氨基酸置换。

D.1.2在HepG2细胞中的LDL摄取试验

下文描述了用来确定PCSK9肽及其衍生物的抑制效力的替代试验，用于测量HepG2细胞中的LDL摄取。

试验原理：LDL摄取主要由内源表达的hLDLR介导，因此LDL摄取能力是LDLR表达的间接量度。与外源性PCSK9一起孵育可以以剂量依赖性方式下调hLDLR。因此，PCSK9孵育会降低细胞摄取LDL分子的能力。然后可以通过添加能中和或抑制PCSK9/LDLR结合的化合物来拮抗LDL摄取的下调。因此，可以基于PCSK9抑制剂在PCSK9的存在下增加LDL摄取以及例如抵消PCSK9介导的hLDLR下调的能力来表征PCSK9抑制剂。

使用在10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)中生长的HepG2细胞(Sigma Aldrich ECACC：保藏号85011430)进行试验，并且测量细胞摄取BODIPY荧光标记的LDL颗粒(Life technologies Europe BV#L3483)的能力。

试验方案：将96孔板(Perkin Elmer，ViewPlate-96 Black#60005182)在37℃孵箱中用聚-D-赖氨酸(10mg/L，Sigma Aldrich#P6407，溶解于PBS Gibco#14190-094)包被1小时。然后用100μl的PBS(Gibco#14190-094)洗板2次。为获得EGF(A)化合物的8点浓度曲线制备测试组合物，它们全部含有在测定培养基(DMEM(Gibco#31966-021)、10％脂蛋白缺乏的胎牛血清(Sigma Aldrich#S5394)和1％的Pen Strep(Cambrex#DE17-602E))中稀释的PCSK9(10ug/ml)，并且以50ul/孔的体积添加至板上。

30-60分钟后以50ul/孔的体积添加在测定培养基中稀释的50,000个HepG2细胞(Sigma-Aldrich:ECACC：保藏号85011430，批号：13B023)，并将板在CO₂可透性塑料袋(Antalis Team，LDPE袋120/35x 300x0.025mm#281604)中孵育20小时(在37℃、5％CO₂下)。此后将板清空，之后立即向每个孔中添加50μl在测定培养基中浓度为10μg/ml的FL-LDL(Life technologies Europe BV#L3483)，并将板在CO₂可透性塑料袋中孵育2小时(在37℃、5％CO₂下)，用黑色盖子盖上以避光。将板清空并用100μl的PBS(Gibco#14190-094)洗涤2次。然后添加100μl的PBS(Gibco#14190-094)，并在此后的15分钟内在SpecktraMax M4(Molecular Probes,Invitrogen Detection Technologies)上使用以下滤波器Ex(515nm)/Em(520nm)读取平板(底部读取)。

最后，使用GraphPad Prism、非线性回归曲线拟合、S形剂量-响应(可变斜率)计算EC₅₀值。

结果在以下表6中示出。较低的EC₅₀值反映了较高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调的能力，而相反，高EC₅₀值表明化合物具有低的抑制PCSK9介导的LDL摄取下调的能力。

可以看出，大多数化合物在LDL摄取试验中表现出100-500nM的EC₅₀，这表明化合物具有高的逆转PCSK9介导的LDL摄取下调的能力。

表6：在HepG2细胞中的LDL摄取数据(EC₅₀)

D.2.在小鼠中的PK

该研究的目的是测量如上确定的PCSK9抑制剂的PK谱。

方法：

使用来自Taconic(Ry，丹麦)的雌性C57bl/J小鼠。

化合物的给药：化合物以5μL/克体重的量皮下(s.c.，500nmol/kg)或静脉内(i.v.，250nmol/kg)给药。

血液采样：在2min、15min、30min、60min、2小时、4小时、6小时、8小时、18小时、24小时、30小时和48小时进行血液稀疏采样。从舌下静脉取血(200μL)并转移至EDTA包被的管(

VetMed200K3E,Sarstedt nr 09.1293.100)中。分离血浆并用于抗PCSK9肽的定量。

定量：使用血浆样品通过LC-MS进行PCSK9抑制剂的定量。

采样和分析：

将血浆移液至干冰上的Micronic管中，并保持于-20℃直到使用LC-MS分析各PCSK9抑制剂的血浆浓度。使用3倍体积的100％甲醇或含1％甲酸的乙腈使血浆样品(包括用于定量未知物的标准曲线和QC样品，其用掺加有0.5-1000nM浓度范围的PCSK9抑制剂的空白血浆制备)蛋白质沉淀(取决于抗PCSK9肽)并离心(16000×g，4℃，20min)。将上清液注入保持于60℃的、由初始Turboflow Cyclone纯化柱0.5×50mm(Thermo FischerScientific)和洗脱Aeris肽3.6μm XB-C18柱2.1×50mm(Phenomenex)组成的色谱系统(TurboFlow Transcend 1250&10阀VIM,Thermo Fisher Scientific)。用色谱梯度洗脱抗PCSK9肽，该色谱梯度的流动相由水和乙腈与0.1％或1％甲酸的混合物组成(取决于EGF(A)类似物或衍生物)。向配备有以正模式ESI+运行的电喷雾界面的LTQ OrbiTrap或QExactive质谱仪(Thermo Fischer Scientific)在线输注LC流后，检测并量化抗PCSK9肽。

PK性质的计算：

使用软件Phoenix WinNonlin 6.4通过非房室药代动力学分析来分析血浆浓度-时间曲线。使用线性梯形线性插值进行静脉内和皮下数据的计算，其具有权重1/Y^Y。通过皮下曲线的AUC/剂量除以静脉内曲线的AUC/剂量来计算生物利用度。

结果：

结果在表7中示出。在表7中，T_max表示所测试的EGF(A)类似物或衍生物达到最大血浆浓度的时间。T1/2是EGF(A)类似物或衍生物的半衰期。MRT是平均停留时间。F(s.c.)是EGF(A)类似物或衍生物在皮下注射后的生物利用度。较高的T1/2值反映了所测试的化合物的较长的半衰期。

结果显示，本发明的PCSK9抑制剂，尤其是用脂肪酸取代基置换的LDL-R(293-332)类似物，显示出延长的半衰期。

表7：LDL-R(293-332)类似物和衍生物在小鼠中的药代动力学性质

D.3.hPCSK9攻击模式

本研究的目的是显示响应于抗PCSK9肽对静脉内注射的hPCSK9的作用的抑制，小鼠肝脏中LDL受体表达水平的变化。

方法

向健康的雄性BalBC或NMRI小鼠(Charles River，德国)皮下或静脉内注射抗PCSK9肽，15-120分钟后以0.4mg/kg的剂量向其尾静脉经静脉内注射hPCSK9(SinoBiologicals，中国)。注射hPCSK9后60分钟，将动物用异氟烷麻醉并通过颈脱位法施以安乐死。然后迅速切下肝脏并在液氮中骤冻。将肝脏保持于-80摄氏度直至分析。

LDL-R Western印迹法：

将肝组织样品(100mg)在含有磷酸酶抑制剂混合物、PhosStop(Roche，04 906 837001)和蛋白酶抑制剂混合物、compelate(Roche，04 693159 001)的500μl裂解缓冲液(LifeTechnology，FNN0011)中均质化。添加1个钢珠后，将组织在30Hz下均质化2.5分钟。以5000×g离心5分钟后，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，23225)测定总蛋白质含量。将样品缓冲液(Life Technology，NP0007)中等量的蛋白质(60μg)煮沸10分钟并以14000rpm旋转2分钟，然后加载至Criterion XT 3-8％Tris-乙酸盐凝胶(BioRad#345-0131)上，并进行SDS-PAGE。根据制造商的说明书(Life Technology)将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(iBlot 2NCRegular stacks，novex#IB23001)。通过膜的Ponceau S(Sigma，P7170)染色证实等量蛋白质转移，并将膜进一步在封闭缓冲液(TBS-T，2％吐温)中封闭。用第一兔抗LDLr抗体(Cayman Chemical Company#10012422)检测LDL-r蛋白质，而使用第一兔抗β-肌动蛋白抗体(abcam#ab6276)检测β-肌动蛋白。使用WesternBright Quantum Chemiluminscent(Advansta#K-12042-D10)，用过氧化物酶缀合的山羊抗兔第二抗体(Biorad#170-6516)将这两种蛋白质进一步可视化，并使用CCD相机(LAS3000,FujiFilm)成像。使用MultiGauge软件(Fujifilm)对来自Western印迹的化学发光信号进行定量分析。

结果

图1显示通过Western印迹法测量的肝LDL-R表达水平，其呈现为各个动物的散点图，n＝3-6。“媒介物-媒介物”为健康对照组(基线水平)，“媒介物-hPCSK9”为仅注射hPCSK9的组。

结果显示，hPCSK9降低了LDL-R的表达水平，并且所测试的PCSK9抑制剂抑制了该效果。

在表8中，数据呈现为相对于健康对照动物基线水平(设定为100％)与单独hPCSK9下调后水平(设定为0％)之间的窗口的变化百分比。

所有6个测试实施例都能够抑制hPCSK9对LDL-R表达水平的作用，并且所观察到的抑制水平类似于使用对照分子阿利库单抗所观察到的抑制水平。

表8：

结论

几个化合物实施例已显示出在抑制LDL-R表达水平被hPCSK9下调方面的功效。

D.4.在仓鼠中的LDL-胆固醇降低

该研究的目的是在喂食标准饮食的金色叙利亚仓鼠(Golden Syrian hamster)中评价PCSK9抑制剂对LDL-C的作用。

方法

本研究中使用6周龄(91-100g)的雄性金色叙利亚仓鼠(Janvier Elevage，SaintIsle，法国)。在适应环境1周后，在大约中午将禁食4小时的仓鼠(大约上午08:00开始禁食)称重，并在异氟烷麻醉下通过眼眶后放血来采血(100μL/EDTA)，以测定总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇。根据它们的1)LDL-胆固醇、2)HDL-胆固醇和3)总胆固醇，将仓鼠随机分成5个均匀的组(n＝10/组)。随机分组后，通过每天一次皮下注射处理仓鼠5天。在处理期间每天测量体重。

在处理3天时，在早晨给药后约1小时(约中午)，将禁食4小时的仓鼠称重并在异氟烷麻醉下通过眼眶后放血来采血(100μL/EDTA)，以测定总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇。

在处理5天时，在早晨给药后约1小时(约中午)，将禁食4小时的仓鼠称重并在异氟烷麻醉下通过眼眶后放血来采血(最大血液体积/EDTA)。

立即分离血浆。对于每个个体，保持约15μL的血浆体积以测定总胆固醇、LDL-胆固醇和HDL-胆固醇。然后使用每个个体的另一血浆体积(约50μL)来制备每个处理组的血浆合并物(即，每组约500μL的1个合并物，5个合并物)，以供分析FPLC总胆固醇分布。然后在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位处死仓鼠并放血。收获肝脏，称重，并将2个肝脏样品(约50mg和约100mg，未记录重量)在液氮中骤冻，然后储存于-80℃下。

使用约50mg样品，通过Western印迹法和密度测定分析法(Image J软件)来评估肝LDL-受体和泛钙黏着蛋白(加载对照)蛋白质表达。数据以平均值+/-SEM表示。分别使用单向或双向ANOVA及Dunnett或Bonferroni后检验进行统计分析。p<0.05被认为具有显著性。

结果

图2显示了仓鼠在处理期间的血浆LDL-胆固醇，这些仓鼠通过每日一次皮下注射媒介物或10nmol/kg、30nmol/kg、100nmol/kg或300nmol/kg实施例2进行处理，持续5天。(**p<0.01和***p<0.001，相对于测试媒介物，双向ANOVA、Dunnetts事后分析)。

图3显示了仓鼠肝脏样品中相比于加样对照泛钙黏着蛋白(pan-cadherin)的肝LDL-R表达，这些仓鼠通过每日一次皮下注射媒介物或10nmol/kg实施例2、30nmol/kg实施例2、100nmol/kg实施例2或300nmol/kg实施例2进行处理，持续5天(*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001，相对于媒介物，单向ANOVA、Dunnetts事后分析)。

与媒介物体重相比，任何处理都不影响体重增加(数据未示出)。所有剂量均降低LDL-胆固醇(参见图2)。对于最低剂量的实施例2，这种效果并不显著，但100nmol/kg和300nmol/kg的较高剂量在第5天使LDL-胆固醇水平降低可达35％。FPLC分析进一步证实了这些趋势，其显示当仓鼠用测试物实施例2处理时，级分中对应于LDL和HDL的总胆固醇水平大幅降低(数据未示出)。还证实了肝脏中LDL-R表达水平的伴随的剂量依赖性增加(参见图2和图3)。

结论

剂量响应研究表明，以至少30nmol/kg的剂量向饲以正常食物的黄金叙利亚仓鼠给药3天和5天后，可能获得对LDL胆固醇的显著效果。对LDL胆固醇的效果伴随着显著更高的肝LDL-受体表达水平。

D.5狗静脉内PK研究

对于狗静脉内PK谱测定，向3-4只比格犬(雄性，10-16kg)静脉内给予(2nmol/kg，0.1ml/kg)在70mM氯化钠、50mM磷酸盐、70ppm聚山梨醇酯20(pH＝7.4)中的单种或多种PCSK9类似物。给药之前，狗禁食过夜，但可自由饮用自来水。通过用针头(20G)单次注射或通过插入式venflon连续给药，经由隐静脉或头静脉给予类似物。在给药后0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、24、48、72、120、144、168、192、216、240、288小时，将0.8ml血液样品收集到每个EDTA包被的管中。对于前4小时的采样，将狗限制在平台上的同时通过插入式venflon采集血液。4小时后的其余采样点通过单针针刺(20G)从颈静脉收集。在血液采集后立即轻柔地颠倒各样品3-4次，并快速转移至冰盒，随后制备血浆(10min，4℃，4000rpm)。在生物分析之前将血浆样品保持在-20℃。给药当天直到给药后120分钟，血液采样的最大偏差为1分钟，对于4-10小时的时间点为5分钟，而对于当天的其余时间为1小时内。

血浆分析：

将来自共同给药研究的血浆移液至干冰上的Micronic管中，并保持于-20℃直至使用液相色谱质谱法(LC-MS)分析相应PCSK9衍生物的血浆浓度。使用三倍体积的甲醇使血浆样品(包括用于定量未知物的标准曲线和QC样品，其由掺加有名义浓度范围为0.5-500nM的PCSK9衍生物的空白血浆制备)蛋白质沉淀(包括作为内部标准品的实施例4)并离心(16000×g，4℃，30min)。将上清液注入保持于60℃的、由初始Turboflow Cyclone纯化柱0.5×50mm(Thermo Fischer Scientific)和洗脱Aeris肽3.6μm XB-C18柱2.1×50mm(Phenomenex)组成的色谱系统(TurboFlow Transcend 1250&10阀VIM,Thermo FisherScientific)。使用色谱梯度洗脱PCSK9衍生物，该色谱梯度的流动相由水和乙腈/甲醇50/50v/v％与1v/v％甲酸的混合物组成。向配备有以正模式ESI+运行的电喷雾界面的QExactive质谱仪(Thermo Fischer Scientific)在线输注LC流后，检测并量化PCSK9衍生物。在血浆样品的生物分析过程中，对于不同的PCSK9衍生物观察到不同程度的异构化。这些异构体均具有相同的单一同位素质量，并且一起定量。

使用Phoenix WinNonlin软件通过非房室分析(NCA)来分析每个测试类似物的PK参数(例如T_1/2)，并且基于具有相同分子量的所有异构体的暴露水平来计算半衰期。

表9：静脉内给药后，EGF(A)衍生物在狗中的半衰期

D.6在大鼠中的经口摄取研究

本研究调查向健康大鼠经口给药的共同配制的肽的胃肠吸收。

动物：

来自丹麦Taconic的雄性Sprague Dawley大鼠，在到达时为250g。在研究之前，大鼠在Novo Nordisk A/S的动物中心适应至少一周。研究开始时的体重约为280-300g。在给药之前，大鼠在格栅上禁食18小时。

肽的共同配制

如下所述进行用于PCSK9i类似物的体内(大鼠)经口共同给药的液体制剂的制备。

目标EGF(A)肽的浓度为每种类似物200μM，在目标浓度为55mg/ml的癸酸钠和水中配制。将五至六种不同的肽类似物一起配制在同一制剂中。

简言之，使用超纯水制备癸酸钠的储备溶液(110mg/mL)，并使用HCl将溶液的pH调节至8.0。

将API转移至20mL玻璃小瓶中并添加5g超纯水(假设密度为1mg/mL)，并在室温下在滚筒混合器上使API溶解。随后用NaOH将溶液的pH调节至8.0直至pH稳定，之后添加6.5g的癸酸钠储备溶液(最终浓度为55mg/mL)，随后将pH调节至pH 8.0。然后将溶液在室温下保持在滚筒混合器上过夜(避光)。第二天如果需要则使用NaOH将pH最终调节至pH 8.0。

使用超纯水将最终制剂的重量设定为13g，随后通过0.22μm过滤器过滤。测定最终制剂中API和癸酸钠的含量以确保精确给药。将制剂储存于4℃直至进一步使用。

根据在215nm处的UV吸光度测定液体制剂中每种API的浓度。开发了LC方法来确保每种共同给药API彼此分开地洗脱下来。将每种API的已知浓度(通过CLND确定)的标准品混合在一起，并且总计使用五个浓度的标准品来生成校准曲线。最终确定的浓度为来自三个样品的平均值，每个样品进行两次重复实验。使用由三种浓度的标准品组成的校准曲线，以类似方式测定液体制剂中的癸酸盐浓度。

给药：

通过强饲向动物经口给予目标剂量为1000nmol/kg的每种肽，在时间＝0时为5ml/kg的量。

血液采样和血浆分离

在以下时间采集血样：给药后15、30、60和120分钟。通过针刺清醒大鼠的舌静脉收集血样(200μl)，并置于EDTA包被的管中。将样品在40℃下以8000G离心5分钟。分离血浆(60-75μl)并移液至micronic管(75μl)中，并立即于-20℃下冷冻。

血浆分析：

将来自共同给药研究的血浆移液至干冰上的Micronic管中，并保持于-20℃直至使用液相色谱质谱法(LC-MS)分析相应PCSK9衍生物的血浆浓度。使用三倍体积的甲醇或含1v/v％甲酸的乙腈使血浆样品(包括用于定量未知物的标准曲线和QC样品，其由掺加有名义浓度范围为0.5-500nM的PCSK9衍生物的空白血浆制备)蛋白质沉淀(包括作为内部标准品的实施例4)并离心(16000×g，4℃，30min)。将上清液注入保持于60℃的、由初始Turboflow Cyclone纯化柱0.5×50mm(Thermo Fischer Scientific)和洗脱Aeris肽3.6μmXB-C18柱2.1×50mm(Phenomenex)组成的色谱系统(TurboFlow Transcend 1250&10阀VIM,Thermo Fisher Scientific)。使用色谱梯度洗脱PCSK9衍生物，该色谱梯度的流动相由水和乙腈/甲醇50/50v/v％与1v/v％甲酸的混合物组成。向配备有以正模式ESI+运行的电喷雾界面的Q Exactive或LTQ OrbiTrap Discovery质谱仪(Thermo Fischer Scientific)在线输注LC流后，检测并量化PCSK9衍生物。在血浆样品的生物分析过程中，对于不同的PCSK9衍生物观察到不同程度的异构化。这些异构体均具有相同的单一同位素质量，并且一起定量。

数据计算：

从通过LC-MS测定的血浆浓度中提取每只大鼠中每种肽的最大血浆浓度(C_max)，并且将C_max/剂量计算为n＝6-8只大鼠的平均值±SD。该剂量计算为注射体积(针对体重调整)乘以肽的实际浓度，单位为pmol/kg。

在每个共同制剂组中包括参照肽(实施例3)。下表中列出了8种不同肽的C_max/剂量(kg/l)，以及参照肽(实施例3)的C_max/剂量(kg/l)。基于具有相同分子量的所有异构体的暴露水平计算C_max。结果表明EGF(A)衍生物通常被良好地吸收。

表10.EGF(A)衍生物在大鼠中经口共同给药后的血浆浓度除以剂量

D.7稳定性研究——EGF(A)类似物纯化

钙对EGF(A)类似物反相纯化过程中峰形和解析度的影响

评价了钙对包含[Leu301,Arg309,Glu312]EGF(A)(SEQ ID NO.:6)的N-端延伸的EGF(A)类似物的反相色谱过程中峰形和分离质量的影响。通过重组方法制备EGF(A)类似物，并将其加样至C18柱上，至每ml柱材料总计有5g EGF(A)类似物，并以线性乙醇梯度洗脱10倍柱体积。用于梯度的缓冲液对于中性运行含有0.6％w/w(50mM)Tris pH 7.5，或者对于酸性运行含有0.5％v/v甲酸。制备含有和不含50％w/w乙醇的缓冲液，并用来获得线性乙醇梯度。在所有缓冲液中不存在或存在25mM氯化钙的情况下进行纯化。所用方法的详细信息在B4 RP01节中进行了描述。

纯化色谱图(图4)显示，钙的存在导致更陡峭的峰，使产物的纯化更加容易。

D.8.1稳定性研究——pH和乙醇的影响

为了评价EGF(A)类似物在不同pH和乙醇浓度下的稳定性，在独立的实验中使用了两种不同的缓冲液浓度来覆盖pH 3.0至pH 11.0的范围。缓冲液体系1覆盖pH 3.0-7.5，而缓冲液体系2覆盖pH 7.5-11.0。对于每个缓冲液体系，按以下方式预混合96种不同的溶剂组成：

1.将低pH缓冲液(调节至pH 3.0或pH 7.5)和高pH缓冲液(调节至pH 7.5或pH11.0)以8种不同的比例混合，以分别获得pH 3.0至pH 7.5或pH 7.5至pH 11.0之间的值。混合后的总体积为300μl。

2.然后将12种不同量的有机调节剂添加至这些缓冲液中，以获得0至70％w/w之间的乙醇浓度。

3.对于含钙的实验，添加一定量的1M CaCl₂储备溶液以获得所述的最终钙浓度。

4.在每个孔中加水以得到1.0g溶剂的总重量。

制备96种不同的溶剂体系后，将每种体系90μl转移到96孔板中，并添加10μl的10mg/ml EGF(A)类似物储备溶液，并将溶液混合。将板在给定温度下在设置为500rpm的旋转振荡器上储存给定时间。从每个孔中取出50μl样品，并用50μl水稀释。然后通过UPLC分析样品以进行纯度测定(B4节：UPLC12)。

用于筛选的缓冲液如下：

在不存在钙和存在25mM钙的情况下，包含由SEQ ID NO.:6表示的EGF(A)类似物的置换Leu301、Arg309和Glu312的N-端延伸EGF(A)类似物的主要同种型浓度(％)在图5中示出。在室温下3天后，进行UPLC分析，并通过增加图的暗度来指示杂质水平。结果表明，在25mM钙的存在下，[Leu301,Arg309,Glu312]EGF(A)的稳定性显著提高，这扩大了主要同种型稳定时的pH范围以及乙醇浓度。

D.9.1稳定性研究——在酰化条件下

在各种浓度的CaCl₂的存在下，在酰化条件下，测试了具有301L、309R、312E、313K、333K的EGF(A)类似物(SEQ ID NO.32)和实施例化合物128(通过体外合成制备)的稳定性。

将EGF(A)类似物及其衍生物以25mg/mL(5.5mM)的浓度溶解于MQ水中，并调节至pH11.5。

用EGF(A)类似物制备包含0mM、1mM、2.5mM、5mM、10mM或25mM CaCl₂的平行样品，同样用实施例化合物128制备包含0mM或10mM CaCl₂的平行样品。

通过将5μL反应混合物加入到95μL 9:9:2水/乙腈/乙酸中来猝灭时间点，然后在UPLC01上进行分析。以UPLC01梯度在4.0与16.0分钟之间的积分面积的因子确定纯化合物的％，并相对于t＝0min时起始材料的纯度进行校正。

对于SEQ ID NO.32的EGF(A)类似物获得的结果在图6A中呈现，实施例化合物128的结果在图6B中呈现，两者均显示出依赖于钙浓度的稳定性，尽管SEQ ID NO.32的肽骨架[301L,309R,312E,313K,333K]EGF(A)比其取代形式明显更容易受到影响。

D.9.2稳定性研究——制备过程中

在实施例化合物128的制备过程中评价了钙对酰化过程的影响。

将SEQ ID NO.32的EGF(A)肽类似物以25mg/mL(5.5mM)的浓度溶解于含有0mM或10mM CaCl₂的MQ水中，并调节至pH 11.5。

在室温下在10分钟内添加提供取代基HOOC-(CH₂)₁₄-CO-gGlu-2xADO-的酰化试剂A(2.4当量)，并通过自动添加0.1M NaOH使整个反应过程中的pH保持恒定。通过将5μL反应混合物添加至95μL 9:9:2水/乙腈/乙酸中来猝灭时间点，然后在UPLC01上进行分析。以UPLC01梯度在4.0与16.0分钟之间的积分面积的因子确定纯产物的％，并相对于t＝-10min时起始材料seq.ID 32的纯度进行校正。

图7中包含的结果表明，在CaCl₂的存在下获得了更快、更完全的酰化反应。

D.9.3稳定性研究——制备过程中

对于一系列化合物的制备评价了酰化反应，这些化合物均如上所述(方法E)在5-10mM CaCl₂的存在下在pH 11.5下制备以供取代基的连接。

除了实施例化合物153的起始浓度为约10mg/mL外，肽骨架的起始浓度均为约20mg/mL。从开始添加酰化试剂开始，通过抽取样品进行UPLC分析(方法UPLC01或UPLCC111)，随时间获得数据。

实施例化合物133、143、144、151和153的制备是通过对SEQ ID NO:98(294W，301L，309R，312E，333K；化合物133、143和144)、SEQ ID NO:104(301L，309R，312E，321E，328K，333K，化合物151)和SEQ ID NO:105(301L，309R，312E，321E，324K，333K；化合物153)的骨架肽进行酰化而获得的。如别处所述，酰化试剂A用于制备实施例化合物144、151和153，酰化试剂B用于133，而酰化试剂C用于143。

图8所示的结果表明，在含有钙离子的反应混合物中有效地产生了实施例化合物133、143、144、151和153。如对于化合物143所见，当肽骨架浓度降低时，观察到略慢的反应。

总之，数据表明，Ca²⁺稳定了所有测试的EGF(A)类似物和衍生物。

D.10.1稳定性研究——保存的制剂

向制剂中添加钙离子的稳定作用，对纯度损失的影响

制备了一系列制剂，以研究将钙离子添加到另外包含20mM Tris(pH 7.4)、13mg/ml丙二醇、58mM苯酚的制剂中的潜在稳定作用(纯度损失减少)。

测试了两种不同浓度，即1.0mg/ml(0.19mM)和6.7mg/ml(1.27mM)的两种EGF(A)化合物。

如下测试实施例化合物3(301L，309R，312E，333K，在333K处具有取代基)。八个钙浓度用于1.0mg/ml的浓度。基于钙离子与化合物的比例，使用0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0和10的比例以CaCl₂形式添加钙离子。对于6.7mg/ml的浓度，仅使用1.0的比例。

如下测试实施例化合物18(301L，309R，312E，321E，333K，在333K处具有取代基)。九种钙浓度用于1.0mg/ml的浓度。基于钙离子与化合物的比例，使用0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0和10的比例以CaCl₂形式添加钙离子。对于6.7mg/ml的浓度，仅使用1.0的比例。

通过按以下顺序混合每种组分的储备溶液来制备制剂：Tris，苯酚，丙二醇，CaCl₂，MQ水(占大部分)，化合物，使用0.1N HCl和0.1N NaOH调节pH，其余为MQ水。

将每种制剂过滤除菌，填充2.0mL玻璃瓶，并静态保存在37℃的温度控制柜中。

通过针对分离指示稳定性的杂质而优化的RP-UPLC-02(B4节——纯度方法)评价了在钙的存在下经历热应激的类似物的化学稳定性(即纯度损失)。指示稳定性纯度方法基于CSH C18柱，并在方法部分中进一步描述。该纯度方法显示与在类似物溶液中存在Ca²⁺相容，并且未观察到含量/类似物损失(数据未示出)。由各种样品(即起始样品和在37℃下孵育2、4和6周的样品)的主峰面积的积分确定类似物的纯度。

表9.1.钙对化学稳定性的影响(实施例化合物3)

表9.2.钙对化学稳定性的影响(实施例化合物18)

对于这两种化合物，当将制剂在37℃下静态保存时，增加的钙:化合物之比减少了纯度损失。化合物浓度为6.7mg/ml的制剂的结果还表明，钙与API之比决定了稳定的程度。

通过数据的线性插值计算了每月的降解，在图9中示出。

对于如上所述制备的实施例化合物133、142、144、151和153进行了类似的研究。

通过针对分离指示稳定性的杂质而优化的RP-UPLC-01(B4节)评价了如上所述制备的经历热应激的类似物的化学稳定性(即纯度损失)。

纯度损失(％)由起始样品和在37℃下孵育2或4周的样品的主峰面积的积分来确定，见图10。

在5mM Ca²⁺的存在下，在低和高类似物浓度下均观察到测试类似物的优异化学稳定性。

D.10.2稳定性研究——保存的制剂-HMWP形成

向制剂中添加钙离子的稳定作用，对HMWP形成的影响。

制备了一系列制剂，以研究将钙离子添加到另外包含20mM Tris(pH 7.4)、13mg/ml丙二醇、58mM苯酚的制剂后的潜在稳定作用(HMWP形成的减少)。

在1.0mg/ml和20mg/ml的浓度下测试了5种化合物(实施例化合物133、143、144、151和153)的稳定性。

在不添加钙离子以及添加5.0mM CaCl₂的情况下测试每种制剂。如以上实施例所述一式两份地制备制剂，但是将其填充在平底玻璃HPLC小瓶中，并静态地储存在37℃的温度控制柜中。通过SEC-UPLC法分析制剂中的HMWP，其检测共价结合的二聚体和寡聚物，在此被定义为HMWP(样品中二聚体/寡聚物的百分比)。共价HMWP法基于

柱和0.15％TFA v/v和60％乙腈v/v的溶剂。使用以下条件：柱温：40℃，流速：0.3mL/min，波长：215nm，洗脱：等度。分别在制备后立即(0天)以及14天、28天和56天后分析样品。

结果表明(图11)，当制剂中包含5mM CaCl₂时，对于所有测试化合物，在37℃下储存时的纯度损失都大大降低。

总之，再次表明Ca²⁺可以增加所有测试化合物的稳定性，而其对某些化合物的效果比对其它化合物的效果更为突出。

虽然本文已经阐明并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。

Claims

1.药物组合物，其包含EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物和二价阳离子，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物包含由SEQ ID NO 1定义的LDL-R的EGF(A)结构域的EGF(A)肽类似物，包含301Leu。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物是液体制剂。

3.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含钙离子。

4.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含CaCl₂。

5.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物包含相对于所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物为0.1-50当量的所述二价阳离子，如Ca²⁺。

6.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含药学上可接受的辅料，如缓冲液、防腐剂、张度剂和螯合剂中的一种或多种。

7.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述EGF(A)肽类似物进一步包含321Glu。

8.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述EGF(A)肽类似物进一步包含

i.310Asp，和312Lys的氨基酸置换，或者

ii.310Asp，并且其中所述肽不具有299Asp至Glu、Val或His的置换。

9.根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述EGF(A)化合物是包含至少一个取代基的EGF(A)衍生物，该取代基包含至少一个脂肪酸基团。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中至少一个取代基连接至选自下组的EGF(A)肽类似物中的Lys残基：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lys和333Lys。

11.用于制备前述权利要求1-10中任一项所限定的EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的方法，其中所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物在二价阳离子如钙离子的存在下进行至少一步处理。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在钙离子的存在下进行纯化步骤。

13.根据权利要求11所述的方法，其中取代基的连接在钙离子的存在下进行。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中钙离子的浓度为所述EGF(A)肽类似物、EGF(A)化合物或EGF(A)衍生物的浓度的0.5-50当量，如1.0-40，如2.0-30，如2.0-40，或如5.0-25当量。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其中当连接所述取代基时，pH增加至10以上。