JP2020527159A - Ｅｇｆ（ａ）類似体、その製造、製剤および使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、LDL-RのEGF(A)ドメインから誘導される化合物、特に野生型EGF(A)(LDL-R(293-332))配列のペプチド類似体および少なくとも一つの脂肪酸基を含む置換基を含む化合物に関する。本発明はまた、その医薬組成物および医薬の使用に関する。本発明の新規性のあるEGF(A)化合物は、たとえばコレステロール降下、異脂肪血症および心血管疾患の分野において有用である。

Description

本発明は、EGF(A)ペプチド類似体およびその誘導体に関し、より具体的には、脂肪酸置換基を有するEGF(A)ペプチド類似体およびそれらの製薬用途に関する。本発明は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)誘導体を含むEGF(A)類似体を含むEGF(A)化合物を製造する方法にさらに関する。
本発明は、EGF(A)化合物およびEGF(A)誘導体を含む医薬組成物およびEGF(A)ペプチド類似体にさらに関する。
高LDL-C（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルおよび異脂肪血症は、心血管疾患に至らせるものとして周知である。
スタチンは、25年の間、異脂肪血症の治療用に承認されてきた。このクラスでは、許容可能な安全性特性を有する心血管事象の実質的かつ安定した減少が示されてきた。最も販売されているスタチンであるアトルバスタチン（Lipitor（商標））は、これまでに世界で最も多く販売された薬剤であり、1996年から2012年までの販売高が1,250億ドルを超えている。
スタチンおよびその他の高脂血症治療薬の有効性および幅広い使用にもかかわらず、多くの患者では、その標的LDL-Cレベルに達せず、心血管疾患の発症については高リスクのままである。PCSK9（プロタンパク質転換酵素サブチリシン/Kexinタイプ9）は、肝臓のLDL-R（LDL受容体）分解を促進し、それによって肝臓のLDL-Rの表面発現を減少させ、その結果としてLDL粒子のクリアランスを減少させる。逆に、PCSK9を遮断すると、LDL-Cのクリアランスおよび他のアテローム性リポタンパク質のクリアランスが増加する。実際に、LDL受容体は、中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子などのLDL以外のアテローム性リポタンパク質のクリアランスに寄与する。中間密度リポタンパク質および還元粒子のクリアランスの増加は、LDL低減によってもたらされる治療上の利益を有しうる。
スタチンは、SREBP2転写因子を介してLDL-RとPCSK9の両方の発現を増加する。PCSK9の発現の増加は、循環からのLDL-Cクリアランスに対するスタチンの効果を減少しうる。LDL-Rに対するPCSK9の結合を阻害し、それによってLDL-Rの分解を阻止することにより、スタチンの有効性が強化される。まとめると、PCSK9阻害は、脂質管理に対する新たなアプローチを提供する。
最近、二つの抗PCSK9抗体、アリロクマブ/プラルエント（Praluent）（登録商標）およびエボロクマブ/レパーサ（Repatha）（登録商標）が高LDL-Cレベルの治療用に承認された。これらは、2週間毎に1ｍｌ皮下注射によって投与される。しかしながら、この皮下投与薬剤の投与計画を遵守することは、特に無症候性状態について疑問の余地がある。
LDL-RのEGF(A)（上皮細胞増殖因子様ドメインA）配列（40アミノ酸）（LDL-R-（293-332））は、PCSK9結合のための部位として周知である。単離された野生型EGF(A)ペプチドは、LDL-Rに対するPCSK9の結合を低いμM範囲におけるIC50で阻害することが示されてきた（Biochemical and Biophysical Research Communications 375 (2008) 69-73）。この不十分な効力のため、EGF(A)ペプチドの実用的な医薬使用が妨げられる。さらに、こうしたペプチドの半減期は、治療用途には短すぎると予想されることになる。
WO2012177741およびJ. Mol. Biol. (2012) 422, 685-696は、EGF(A)の類似体およびそのFc−融合を開示する。
なおも、たとえば、有効性の観点から、また、あるいは利便性、投与様式の快適性および利便性などの患者の快適性、およびそれによる服薬遵守などの観点から、患者治療を改善することに対する需要がある。
一つの態様において本発明は、EGF(A)ペプチド類似体、本明細書に記載されたEGF(A)誘導体などのEGF(A)類似体を含むEGF(A)化合物を製造する方法に関する。さらなる態様において本発明は、EGF(A)化合物およびEGF(A)誘導体を含む、EGF(A)ペプチド類似体を含む医薬組成物に関する。
発明者らは、本明細書に記載したとおりのEGF(A)ペプチド類似体および化合物の溶液中に、陽イオン、特にCa2+などの二価陽イオンを含むことが非常に魅力的であることを見出した。こうしたイオンの使用は、こうした化合物を製造する工程を改善するのに役立ちうるし、ペプチドの発現もしくは合成および／また一つまたは複数の置換基の付着からはEGF(A)類似体までの全体を含みうる。
本発明は、特にコレステロール降下、異脂肪血症および心血管疾患の分野において、患者治療が改善される可能性を有するEGF(A)化合物に関する。
一つの実施態様において、本発明は、薬物動態（PK）特性が改善された化合物の製剤を提供する。特に、化合物は長い半減期を有しながらも、PCSK9がLDL-Rに結合することを阻害する良好な能力を示す。
また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、半減期が長く、PCSK9がLDL-Rに結合することを阻害する能力が改善されたEGF(A)化合物を製造する方法を提供し、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、PCSK9に対する結合能力が改善された化合物を製造する方法を提供する。また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、半減期が長いEGF(A)化合物を製造する方法を提供する。また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、半減期が長く、LDL-Rに対するPCSK9結合を阻害する能力の損失がないか、または実質的に損失がないEGF(A)化合物を製造する方法を提供する。また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、半減期が長く、結合能力が維持されたEGF(A)化合物を調整する方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、液体製剤に適した高い液体安定性を有するEGF(A)化合物の組成物を提供する。また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、患者にとってより便利な治療の可能性を有するEGF(A)化合物の組成物を提供する。また、またはあるいは、もう一つの側面において、本発明は、患者の服用順守が改善される可能性を有する製剤を提供する。本発明はまた、例示的態様の開示から明らかであろうさらなる問題を解決しうる。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体および二価陽イオンを含む医薬組成物に関する。一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体は、1：Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Gluによって定義され、ペプチド類似体は、301Leu含むEGF(A)ペプチドのEGF(A)ペプチド類似体を含む。一つの態様において、EGF(A)誘導体は、301Leuを含むEGF(A)ペプチド類似体と少なくとも一つの脂肪酸基を含む少なくとも一つの置換基とを含む。一つの態様において、EGF(A)誘導体は、上記のとおりアミノ酸301がLeu(L)であり、一方でペプチドが位置295(Asn/N)、296 (Glu/E)、298 (Leu/L)、302(Gly/G)および310(Asp/D)の一つまたは複数に野生型残基をさらに含むEGF(A)ペプチド類似体を含む。さらなる態様において、EGF(A)誘導体のEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して1〜15アミノ酸置換を有する。さらなる態様において、EGF(A)誘導体の置換基は、位置295、298、301、302、307および310のいずれかにあるアミノ酸残基を介してEGF(A)ペプチド類似体に付着されない。さらなる態様において、置換基は、位置295、298、301、302、307および310以外にあるアミノ酸残基を介してEGF(A)ペプチド類似体に付着される。さらなる態様において、LDL-RのEGF(A)ドメインのEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1によって定義され、式中ペプチド類似体は、301Leuおよび310Aspを含み、かつペプチド類似体は、312Lysのアミノ酸置換を有するか、またはペプチド類似体は、Glu、ValまたはHisに対する299Aspの置換を有さない。さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、以下の(野生型)アミノ酸残基295Asn、296Glu、298Leu、302Glyおよび310Asp/Dのうち一つ、二つ、三つ、四つまたは五つ全てを有する。さらなる態様において、前記ペプチド類似体は位置、297Cys〜308Cys、304Cys〜317Cysおよび319Cys〜331Cysに三つのジスルフィド架橋を含む。
もう一つの側面において、本発明は、本明細書に記載したとおりのEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を製造する方法であって、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体は、少なくとも一つの工程においてカルシウムイオンなどの二価陽イオンの存在下で処理される方法に関する。
もう一つの側面において、本発明は、医薬として使用するための本発明による組成物に関する。
もう一つの側面において、本発明は、本発明による組成物の医薬用途に関する。
図1は、個々の動物について散布図として提示した、ウエスタンブロットによって測定されたマウスにおける肝臓LDL-R発現レベルを示す。 図2は、媒体で、または実施例2の遅延性EGF(A)化合物で処理したハムスターにおける血漿LDLコレステロールを示す。 図3は、ウエスタンブロットによって測定した媒体で、または実施例2の遅延性EGF(A)化合物で処置したハムスターの肝臓における肝臓LDL-R発現を示す。 図4は、逆相カラムでのEGF(A)バックボーンペプチドの精製実施のクロマトグラムを示す。4Aは、精製がカルシウムの非存在下において実施されたときのクロマトグラムを示す。4Bは、10mMのカルシウムを精製中に含めたときのクロマトグラムを示す。 図5は、異なるpHおよびエタノール濃度で室温にて3日間培養した後のEGF(A)類似体の主なアイソフォームの安定性を示す。陰影は、EGF(A)類似体の主なアイソフォームの割合を示す。図5は、カルシウムの非存在下における安定性を示し、一方で図5Bは、25mMのカルシウムを含めたときの安定性を示す。 図6Aは、異なるカルシウム濃度でのアシル化条件（pH11.5）下での液体組成物中の301L、309R、312E、313Kおよび333K（配列番号：32）を持つEGF(A)類似体の安定性を示す。図6Bは、異なるカルシウム濃度でのアシル化条件（pH11.5）下の液体組成物中の313Kおよび333K（例示的な化合物128）に付着された置換基を持つ301L、309R、312E、313Kおよび333Kを持つEGF(A)バックボーンを有するEGF(A)誘導体の安定性を示す。 図7は、CaCl2の存在または非存在下におけるバックボーンペプチド配列番号：32のアシル化反応の間の実施例化合物128の生成物形成のタイムラインを示す。 図8は、カルシウムイオンの存在下におけるバックボーンペプチドのアシル化中の実施例化合物133、143、144、151および153の経時的な生成物形成のタイムラインを示す。グラフは、pH11.5での経時的な生成物形成を示す。 図9は、37℃にて無活性状態で試料を貯蔵する安定性研究からのデータに基づく純度損失の適合曲線を示す。曲線は、カルシウムイオン対EGF(A)化合物のモル比に対する純度損失を示す。 図10は、熱応力に応答する際の二つの濃度のEGF(A)類似体についてRP-UPLC-UV215によって決定した実施例化合物133、143、144、151および153についての純度損失を％で示す。 図11は、37℃で56日の無活性状態での貯蔵の間の安定性試験中にSEC-UPLCによって測定したときの高分子量ペプチド含量（HMWP%）を示す。五つの化合物、実施例化合物133、143、144、151および153をそれぞれ四つの異なる製剤で試験した。黒べたの記号（■）は、1.0mg/mlの化合物を有し、白抜きの記号（□）は、20mg/mlの化合物を有する。破線は、カルシウムが添加されておらず、実線は、5.0mMのCaCl2を有する。さらに、すべての製剤は、20mMTris、pH7.4、13mg/mlプロピレングリコール、58mMフェノールを含んだ。 前記［図１１−１］参照。 前記［図１１−１］参照。
配列表の簡単な説明
野生型EGF(A)(LDL-R(293-332))のアミノ酸配列は、配列番号：1として配列表に含まれる。配列番号：2〜114は、様々のEGF(A)ペプチド類似体のアミノ酸配列である。
「SEQUENCE LISTING」の表題の配列表は、48KBであり、2017年7月12日に作成され、参照により本明細書に援用される。
明細
下文において、ギリシャ文字は、その記号または対応する名称、たとえば:α=アルファ、β=ベータ、ε=イプシロン、γ=ガンマ、ω=オメガ、δ=デルタなどによって表されうる。また、μのギリシャ文字は、「u」によって表され得るし、たとえばμl=ulまたはμＭ＝uＭである。
下文において、「一つの」は「一つまたは複数」を意味する。
本明細書に別途示されていない限り、単数形で示した用語は、複数の状態も含む。
化学式における星印（*）は、i）結合点、ii）ラジカルおよび／またはiii）非共有電子を示す。
第一の態様において、本発明は、配列番号：1のペプチド類似体およびカルシウムイオンなどの二価陽イオンなどの陽イオンを含む化合物を含む医薬組成物に関する。
第二の態様において、本発明は、配列番号：1のペプチド類似体を含む化合物と、少なくとも一つの脂肪酸基を含む少なくとも一つの置換基と、カルシウムイオンなどの二価陽イオンなどの陽イオンとを含む医薬組成物に関する。第三の態様において、本発明は、本発明の化合物と、カルシウムイオンと、医薬品として容認できる賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、配列番号：1の類似体および少なくとも一つの脂肪酸基を含む少なくとも一つの置換基を含む化合物を製造する方法であって、置換基は、脂肪酸基を含む方法に関する。
本発明のさらなる態様および態様を以下に記載する。
構造的特徴
EGF(A)化合物
本明細書で使用される「EGF(A)化合物」という用語は、一般的にEGF(A)ペプチドを含む化合物をいい、配列番号：1およびその類似体により定義されるwt-LDL-R(293-332)を含む。EGF(A)化合物という用語は、EGF(A)ペプチドおよびその類似体の誘導体を包含し、すなわち本明細書に記載したとおりの置換基を持つEGF(A)ペプチド類似体は、EGF(A)化合物の典型例であり、一方で代替的EGF(A)化合物は、本明細書に記載したとおりのEGF(A)類似体を含む融合タンパク質などのEGF(A)類似体を含む任意の化合物でありうる。
EGF(A)ペプチド類似体
「ペプチド」という用語は、たとえば本発明の文脈で使用される場合、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を意味する。特定の態様において、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
本発明のペプチドは、36個、37個、38個、39個または少なくとも40個のアミノ酸など、少なくとも35個のアミノ酸を含む。特定の態様において、ペプチドは、38個または40個のアミノ酸など、36個のアミノ酸からなる。さらなる特定の態様において、ペプチドは35個、36個、37個、38個、39個または40個のアミノ酸からなる。
本明細書においてN末端伸長およびC末端伸長というアミノ酸付加の存在下において、本発明のペプチドは、140個までのアミノ酸を含みうる。一つの態様において、本発明のペプチドは、41個のアミノ酸残基を含むか、またはそれらからなりうる。特定の態様において、それは40〜140個、40〜120個、40〜100個、40〜80個、40〜60個または40〜50個のアミノ酸を含む。
「LDL-R」、「LDL-R(293-332)」、「天然LDL-R(293-332)」、「EGF(A)(293-332)」、「野生型EGF(A)」、「wt-EGF(A)」または「天然EGF(A)」の「EGF(A)」ドメインという用語は、配列番号：1からなるペプチドを意味する。
配列番号：1は：
Gly-Thr-Asn-Glu-Cys-Leu-Asp-Asn-Asn-Gly-Gly-Cys-Ser-His-Val-Cys-Asn-Asp-Leu-Lys-Ile-Gly-Tyr-Glu-Cys-Leu-Cys-Pro-Asp-Gly-Phe-Gln-Leu-Val-Ala-Gln-Arg-Arg-Cys-Gluである。
この式において、アミノ酸残基の番号付けは、LDL-R（293〜332）のEGF(A)ドメインの番号付けに従い、式中LDL-RのEGF(A)ドメインの最初の（N末端）アミノ酸残基は、位置番号293に番号付けされ、またはその位置と一致され、後続のC末端に向かうアミノ酸残基は、最後の（C末端）アミノ酸残基まで294、295、296などと番号付けされ、これはLDL-RのEGF(A)ドメインでは、番号332がGluである。
番号付けは、配列表では別の方法で行われ、配列番号：1の最初のアミノ酸残基（Gly）には、番号1が割り当てられ、最後の（Glu）は、番号40である。同じことが配列表の他の配列に対しても適用され、すなわちN末端アミノ酸には、LDL-R(293-332)に関して293Glyまたは293置換アミノ酸残基に対するその位置決めに関係なく、番号1が割り当てられる。しかしながら、本明細書では、アミノ酸位置の番号付けは、上で説明したとおりLDL-R(293-332)に関する。
本発明は、配列番号：1によって同定されるEGF(A)ペプチドの類似体および配列番号：1によって定義されるLDLRの野生型EGF(A)ドメインのEGF(A)ペプチド類似体の誘導体に関する。
「類似体」という用語は、一般的に参照アミノ酸配列と比較したときに一つまたは複数のアミノ酸変化を有するペプチドをいう。
本発明で使用される「類似体」、「本発明のペプチド類似体」、「LDL-R(293-332) 類似体」、「EGF(A)」類似体、「EGF(A) ペプチド類似体」または「配列番号：1の類似体」という用語は、ペプチドといわれ、その配列は、配列番号：1と比較してアミノ酸置換、すなわちアミノ酸の置き換えを含む。「類似体」はまた、N末端位置および／もしくはC末端位置におけるアミノ酸の伸長並びに／またはN末端位置および／もしくはC末端位置におけるアミノ酸の切断を含みうる。
配列番号：1との同一性レベルは、配列番号：1と比較して変化されていないアミノ酸の数を決定することによって算出されうる。配列番号：1が40個のアミノ酸残基からなり、かつ3個のアミノ酸置換が導入された場合、同一性レベルは、37／40%＝92.5%である。5個のアミノ酸残基が変化された場合、同一性レベルは、87.5%である。ペプチドがN末端またはC末端伸長される場合、その部分は、一般的に比較に含まれないが、一つまたは複数のアミノ酸が欠失では比較するものが短くなる。たとえば、上記の例において、N末端アミノ酸が欠失された場合、同一性レベルは、それぞれ36/39×100%および34/39×100%にわずかに低下する。誘導体のバックボーン配列の同一性について考察するとき、置換基のアミノ酸残基、たとえば置換基に付着されている残基も置換基のアミノ酸残基と名付けられ、これは野生型（wt）または置換されたアミノ酸のいずれでもよい。置換基のアミノ酸残基がN末端Glyまたは312Kなどの野生型残基である場合、この残基は、同一性レベルの計算に含められるが、293〜332の他の任意の位置にあるLysは、アミノ酸置換であり、配列番号：1に対するアミノ酸同一性が計算されるときには含められない。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して1〜15アミノ酸置換を有する。一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して1〜10アミノ酸置換を有する。一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して1〜7個、1〜6個、1〜5アミノ酸置換など、配列番号：1と比較して1〜8アミノ酸置換を有する。特定の態様において、7個のアミノ酸置換までが存在してもよく、たとえば6個、5個、4個、3個、2個または1個のアミノ酸置換までがEGF(A)ペプチド類似体中に存在してもよい。
一つの態様において、本発明の類似体は、切断がない場合に、それぞれ配列番号：1に対して10個、8個、6個、4個および2個のアミノ酸置換までに対応して、配列番号：1に対して80%など、85％など、90％など、またはさらに95％など、少なくとも75%の同一性を有する。
本発明のそれぞれのペプチド類似体は、i）変化したアミノ酸残基に対応する天然EGF(A)（LDL-R(293-332）におけるアミノ酸残基の数（すなわち、天然LDL-R(293-332)における対応する位置）を、およびii）実際の変化を参照することによって記述してもよい。
言い換えれば、本発明のペプチド類似体は、天然LDL-R(293-332)EGF(A)ペプチド、すなわち天然LDL-R(293-332) EGF(A)(配列番号：1)と比較したときに多数のアミノ酸残基が変化されているその変異体を参照することによって記述してもよい。これらの変化は、独立して、一つまたは複数のアミノ酸置換を表しうる。
以下は、適切な類似体命名法の非限定的な例である。
本明細書において実施例2の誘導体に組み込まれたEGF(A)ペプチド類似体は、以下のLDL-R(293-332) EGF(A)ペプチド類似体と呼ばれてもよい:（301Leu、309Arg）LDL-R(293-332) EGF(A)、または(Leu301、Arg309)-LDL-R(293-332) EGF(A)または(301L,309R) LDL-R(293-332)または(L301,R309) LDL-R(293-332)。これは、この類似体が天然LDL-R(293-332)と共に整列されたとき、i）整列に従って、天然LDL-R(293-332) EGF(A)内の位置301に対応する類似体内の位置にあるLeuを、ii）天然LDL-R(293-332) EGF(A)内の位置309に対応する類似体内の位置にあるArgを有することを意味する。
一定の特定された変化を「含む」類似体は、配列番号：1と比較したときに、さらなる変化を含みうる。
特定の態様において、類似体は、特定の変化を「有する」または「含む」。特定の態様において、類似体は、変化「からなる」。「なる」または「なっている」という用語が類似体と関して使用されるとき、たとえば類似体は、特定のアミノ酸置換の群からなるか、からなっており、当然のことながら、特定のアミノ酸置換は、ペプチド類似体における唯一のアミノ酸置換である。対照的に、特定のアミノ酸置換の群を含む類似体は、さらなる置換を有しうる。
上記の例から明らかなように、アミノ酸残基は、その完全な名称、1文字コードおよび／または3文字コードによって同定されうる。これら三つの方法は、完全に等価である。
「等価な位置」または「対応する位置」という表現は、基準配列の天然LDL-R(293-332)EGF(A)（配列番号：1）を参照することによりバリアントLDL-R(293-332)EGF(A)配列の変化の部位を特徴付けるために使用されうる。均等の、または対応する位置、並びに変化の数は、たとえば単純な手書きおよび目測によって簡単に推定され、および／またはNeedleman-Wunschアルゴリズムに基づく「整列」などの標準タンパク質またはペプチド整列プログラムを使用してもよい。
下文において、化学式は、二つの後続の化学基がどちらも「結合」となるように選択されうるように定義されるといったことが生じてもよい。こうした例では、二つの後続の化学基は、実際には存在せず、一つの結合だけが周囲の化学基を接続することになる。
アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、並びに任意に側鎖と呼ばれることの多い一つまたは複数のさらなる基を含む分子である。
「アミノ酸」という用語は、タンパク質原性（または天然）アミノ酸（これらのうち、20の標準アミノ酸）、並びに非タンパク質原性（または非天然）アミノ酸を含む。タンパク質原性アミノ酸は、天然においてタンパク質に組み込まれるものである。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質内に見出されないか、標準的な細胞機構によって産生されない（たとえば、これらは、翻訳後修飾に供されない）。非タンパク質原性アミノ酸の非限定的な例は、Aib（α-アミノイソ酪酸または2-アミノイソ酪酸）、ノルロイシン、ノルバリン、並びにタンパク質原性アミノ酸のD-異性体である。
下文において、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドのそれぞれのアミノ酸は、（別段の指定がない限り）L異性体を意味すると理解されるべきである。
本発明のペプチド類似体
本発明の一態様は、配列番号：1のペプチドの類似体に関連する。
本発明のペプチド類似体は、配列番号：1の類似体であるアミノ酸配列を含むペプチドとして定義されてもよい。本発明のペプチド類似体は、PCSK9に結合する能力を有する。特定の態様において、本発明の類似体は、たとえば天然LDL-R(293-332)(天然EGF(A))と、または他のPCSK9結合化合物と比較して、PCSK9に結合する改善された能力を有する。
本発明のペプチド類似体は、LDL-Rに対するPCSK9結合を阻害する能力を有する。一つの態様において、ペプチドはPCSK9阻害剤である。一つの態様において、ペプチドは、ヒト低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）に対するPCSK9結合を阻害する。こうした結合は、本明細書における実施例D.1.1に記載したアッセイを使用して評価されうる。一つの態様において、本発明のペプチド類似体およびペプチド誘導体は、PCSK9阻害剤ペプチドまたは単にPCSK9阻害剤である。一つの態様において、本発明は、配列番号：1のペプチド類似体であって、ヒト低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）に対するPCSK9結合を阻害する能力を有するペプチド類似体に関する。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤は、EGSK9とEGF(A)、LDL-R(293-332)(配列番号：1)と比較してPCSK9を結合する能力が改善されている。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤は、実施例 48（配列番号：2）と比較してPCSK9に結合する能力が改善されている。
一つの態様において、PCSK9-LDL-R結合競合ELISAアッセイで測定したときの本明細書に記載したとおりのペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤のKiは、8nM未満または5nM未満など、10nM未満である。
本明細書のEGF(A)類似体および誘導体の機能性は、本明細書の実施例D1.2に記載されているものなど、これらがLDL取り込みを改善する能力によってさらに特徴付けられうる。一つの態様において、本発明のペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤は、PCSK9の存在下におけるLDL取り込みを増加する。一つの態様において、本発明のペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤は、PCSK9を媒介したLDL取り込みの減少を逆転または低減することができる。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体、化合物またはPCSK9阻害剤は、1000nM未満など、または500nM未満など、1500nM未満のLDL取り込みアッセイで測定したときのEC50を有する。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、配列番号：1と比較して少なくとも一つのアミノ酸置換、および任意に伸長を含むように定義されうる。一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、配列番号：1と比較して、15個まで、14個まで、13個まで、12個まで、11個まで、10個まで、9個まで、8個まで、7個まで、6個まで、5個まで、4個まで、3個個まで、2個まで、または1個のアミノ酸置換、および任意に伸長を含むように定義されうる。これは、N末端および／またはC末端における伸長を含むペプチドが、前記伸長に加えて293〜332の位置に15個までのアミノ酸置換を含みうることを意味する。
アミノ酸の「伸長」は、「延長」とも呼ばれうる。一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、伸長を含む。前記伸長は、配列番号：1またはその類似体のN末端の位置にある50個までのアミノ酸残基の付加でもよく、N末端伸長とも呼ばれ、本発明のペプチドが位置292からたとえば位置242まで、50個までのアミノ酸を含みうることを意味する。加えて、またはあるいは、前記伸長は、配列番号：1またはその類似体のC末端の位置にある50個までのアミノ酸残基の付加でもよく、C末端伸長とも呼ばれ、本発明のペプチドが位置333からたとえば位置383まで50個までのアミノ酸を含みうることを意味する。
前記伸長は、N末端、C末端のいずれかまたは両方に存在してもよい。前記伸長はまた、互いに独立して、それぞれの側に0〜50個の間の任意の長さのアミノ酸であってもよい。一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、1〜50、1〜40、10〜40、1〜30、10〜30、20〜30、20〜40、20〜50、30〜50、1〜10、11〜20、21〜30、31〜40もしくは41〜50アミノ酸残基のN末端伸長または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50アミノ酸残基のN末端伸長を含む。加えて、またはあるいは、本発明のペプチド類似体は、1〜50、1〜40、10〜40、1〜30、10〜30、20〜30、20〜40、20〜50、30〜50、1〜10、11〜20、21〜30、31〜40もしくは41〜50アミノ酸残基のC末端伸長または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49もしくは50アミノ酸残基のC末端伸長を含みうる。
伸長は、一部の状況において、本明細書において例示した292A、292Lysまたは333Lysなどの、新しいアミノ酸残基が導入されるときの置換を意味しうる。
EGF(A)ペプチドのN末端および／またはC末端での小規模の切断は、EGF(A)ペプチド類似体に存在しうる。
一つの態様において、EGF(A)ペプチドは、36個のアミノ酸残基など、37個のアミノ酸残基など、38個のアミノ酸残基など、39個のアミノ酸残基など、少なくとも35個のアミノ酸残基を含む。一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、1〜2個のアミノ酸残基のN末端切断を含む。一つの態様において、一つまたは二つのN末端アミノ酸残基が欠失される。さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、したがって、少なくともまたは特異的にアミノ酸293Glyを欠失するN末端切断を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、少なくともまたは特異的に293Gly〜294Thrを欠失するN末端切断を含む。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、1個のアミノ酸残基のC末端切断を含む。一つの態様において、単一のC末端アミノ酸残基が欠失される。一つの態様において、ペプチド類似体は、アミノ酸332Gluを特異的に欠失するC末端切断を含む。
加えて、またはあるいは、本発明のペプチド類似体は、たとえば位置292および／または333のN末端またはC末端に少なくとも一つのアミノ酸伸長を含みうる。
本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、AsnからLeuまでのアミノ酸残基301のアミノ酸残基のアミノ酸置換を含み、Asn301Leuまたは単に301Leuとも記述される。特定の態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、置換301Leuを含む。
加えて、またはあるいは、EGF(A)ペプチド類似体は、アミノ酸残基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys、331Cysを含む。これらのCys残基は、297Cys〜308Cysの間、304Cys〜317Cysの間、319Cys〜331Cysの間のジスルフィド架橋など、ジスルフィド架橋に関与しうる野生型残基である。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、上述のように301Leuおよび多数のさらなるアミノ酸置換を含む。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、301Leu、310Aspおよび312Lysのアミノ酸置換を含む。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、301Leuおよび310Aspを含み、ペプチド類似体は、Glu、ValまたはHisへの299Aspの置換を持たない。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、301Leu、309Argおよび312Gluを含む。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、301Leuおよび309Argを含み、ただしペプチド類似体は、310Asp〜310Lysの置換を有さない。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、301Leuおよび309Argを含み、ただしペプチド類似体は、299Asp〜Glu、ValまたはHisの置換を有さない。
さらなる態様において、ペプチド類似体は、置換D310K、D310N、D310Q、D310Q、D310RおよびD310A、またはさらに310Aspの任意の置換を有さない。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、以下のうち一つ、二つ、三つまたは四つ全ての野生型残基を含む:295Asn、296Glu、298Leuおよび302Gly。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、以下のうち一つ、二つ、三つ、四つまたはすべての五つの野生型残基を含む:295Asn、296Glu、298Leu、302Glyおよび310Asp。
一つの態様において、ペプチドは295Asnを有する。
一つの態様において、ペプチド類似体は296Gluを有する。一つの態様においてそのペプチド類似体は298Leuを有する。一つの態様において、ペプチド類似体は302Glyを有する。一つの態様において、ペプチド類似体は310Aspを有する。
一つの態様において、ペプチド類似体は、310Asp、295Asnおよび296Gluのうち二つ以上を有する。一つの態様において、ペプチド類似体は、310Asp、295Asnおよび296Gluのうちの三つすべてを有する。
EGF(A)ペプチド類似体は、本明細書に記載したとおりのさらなるアミノ酸置換を含みうる。一つの態様において、本発明の類似体は、位置293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330および332の群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含みうる。
一つの態様において、本発明の類似体は、位置293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、331および332の群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含みうる。
一つの態様において、本発明の類似体は、294、299、300、303、309、312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330および332から選択される位置に一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含みうる。
一つの態様において、本発明の類似体は、299、300、309、313、316、318、321、322、323、324、326、328、329、330および332から選択される位置に一つまたは複数のアミノ酸置換をさらに含みうる。
一つの態様において、本発明の類似体は、位置309、312、313、321、324、328および332の群から選択される位置に一つまたはさらなるアミノ酸置換をさらに含みうる。
さらなる態様において、ペプチド類似体は、本明細書で上述したアミノ酸残基に加えて特定の特異的な位置に、wtアミノ酸残基または異なる残基、すなわちアミノ酸置換のいずれかを含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置293にアミノ酸残基Gly(G)またはAsn(N)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置294にアミノ酸残基Trp(W)、Thr(T)またはGly(G)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置299にアミノ酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、 Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)またはTrp(W)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、アミノ酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Ala(A)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)またはTrp(W)を位置299で含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置299にアミノ酸残基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)またはTyr(Y)を299に含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置299にアミノ酸残基Asp(D)またはAla(A)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置300にアミノ酸残基His(H)またはAsn(N)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置307にアミノ酸残基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)またはIle(I)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置307にアミノ酸残基Val(V)またはIle(I)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置307にSer(S)、Thr(T)またはIle(I)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置307にIle(I)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置309にアミノ酸残基Asn(N)、Glu(E)、His(H)、Arg(R)、Ser(S)またはLys(K)に含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置309にアミノ酸残基Asn(N) 、Arg(R)、Ser(S)またはLys(K)に含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置309にアミノ酸残基Asn(N)、Arg(R)またはSer(S)に含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置309にアミノ酸残基Asn(N)またはArg(R)を含む。
一つのこうした態様において、本発明の類似体は、位置309にアミノ酸残基Lys(K)またはArg(R)を含む。
EGF(A)ペプチド類似体は、299Ala、307Ileおよび321Gluの群から選択される一つまたは複数のアミノ酸置換など、本明細書に記載したとおりのいくつかのアミノ酸置換を含みうる。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、位置321にアミノ酸残基Asp(D)、Lys(K)またはGlu(E)を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、位置321にアミノ酸残基Asp(D)またはGlu(E)を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、位置321にアミノ酸残基Glu(E)を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、位置324にアミノ酸残基Gln(Q)またはGly(G)を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、位置329にアミノ酸残基Arg(R)またはHis(H)を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、300Asn(N)とPro(P)の置換を有しない。
LDL-RのEGF(A)ドメインは、位置312にリジンを含み、これは本明細書に記載したとおりの置換に有用である可能性がある。312に対する置換基の付着が望ましくない態様において、312Lysは、本明細書に記載したとおりの別のアミノ酸によって置換されてもよい。
一つの態様において、位置312のLysは、Gly、Pro、Asp、Glu、Arg、His、Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、PheおよびTyrから選択されるアミノ酸残基によって置換される。一つの態様において、位置312のLysは、Gly、Asp、Glu、Ser、Thr、Asn、Ala、Val、Ile、Leu、PheおよびTyrから選択されるアミノ酸残基によって置換される。一つの態様において、位置312のLysは、Asp、Glu、Thr、Asn、Ile、Leu、PheおよびTyrから選択されるアミノ酸残基によって置換される。一つの態様において、312Lysは、312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ileまたは312Pheによって置換される。一つの態様において、312Lysは、312Glu、312Asp、312Glnまたは312Argによって置換される。
一つの態様において、312Lysは、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Pheまたは312Tyrによって置換される。一つの態様において、312Lysは、312Glu、312Asnまたは312Ileによって置換される。
一つの態様において、312Lysは、312Gluまたは312Argによって置換される。一つの態様において、312Lysは、312Argによって置換される。一つの態様において、312Lysは、312Gluによって置換される。
一つの態様において、その他のLysは、EGF(A)ペプチド類似体に含まれない。
さまざまな位置（さらに以下を参照）に置換基を付着する選択肢を含めるために、配列番号：1の野生型残基のアミノ酸置換によって、または292Lysまたは333Lysなどの配列番号：1のペプチド伸長によって、Lysが導入されてもよい。
二つ以上の置換基が望ましい場合、一つは312Lysを経由することができ、第二の置換基は、配列番号：1におけるペプチド伸長または置換によって導入されるLysを経由する。
一つの態様において、配列番号：1のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される位置に少なくとも一つのLys残基を含む。
一つの態様において、配列番号：1のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される位置に少なくとも一つのLys残基を含む。
一つの態様において、配列番号：1のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される位置に少なくとも一つのLys残基を含む。
一つの態様において、配列番号：1のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される位置に少なくとも一つのLys残基を含む。
一つの態様において、配列番号：1のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される位置に少なくとも一つのLys残基を含む。
加えて、またはあるいは、本発明のペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys、307Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、295Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。
さらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、292Lys、293Lys、294Lys、303Lys、305Lys、306Lys、310Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、296K、298K、301K、302Kおよび307Kの任意の置換を含まない。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、296K、298K、301K、302K、307Kおよび310Kの任意の置換を含まない。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、296K、298K、301K、302K、307Kおよび295Kの任意の置換を含まない。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、296K、298K、301K、302K、307Kおよび295Dの任意の置換を含まない。
特定の態様において、本発明のペプチド類似体は、Lys置換を一つも含まない。特定の態様において、本発明のペプチド類似体は、Lys残基を一つも含まない。
特定の態様において、本発明のペプチド類似体は、こうしたLys置換のうち一つまたは二つを含む。
加えて、またはあるいは、本発明のペプチドは、312Lysを含みうる。
一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、二つのLys残基を含む。一つの態様において、本発明のペプチド類似体は、以下からなる対から選択される二つのLys残基を含む。
本明細書で上述したとおり、様々なペプチド類似体が本発明によって提供される。さらなる態様において、本発明によるEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して以下のi〜xxivの群のいずれかによって特定される少なくとも二つのアミノ酸置換を含む。
なおさらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、以下に示されるi〜xxivの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる。
さらなる態様において、本発明によるEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して以下に示されるi〜xviの群のいずれかによって特定される少なくとも二つのアミノ酸置換を含む。
なおさらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、以下に示されるようにi〜xvi群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる。
i. 301Leuおよび309Arg
ii. 301Leu、309Arg、312Glu
iii. 301Leu、307Ileおよび309Arg
iv. 301Leu、307Ile、309Argおよび312Glu
v. 301Leu、309Argおよび321Glu
vi. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Glu
vii. 301Leu、307Ile、309Argおよび299Ala
viii.301Leu、307Ile、309Arg、299Alaおよび312Glu
ix. 301Leuおよび309Arg並びに少なくとも一つのLys置換
x. 301Leu、309Arg、312Gluおよび少なくとも一つのLys置換
xi. 301Leu、307Ileおよび309Arg並びに少なくとも一つのLys置換
xii. 301Leu、307Ile、309Argおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xiii.301Leu、309Argおよび321Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xiv. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xv. 301Leu、307Ile、309Argおよび299Ala並びに少なくとも一つのLys置換または
xvi. 301Leu、307Ile、309Arg、299Alaおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換。
一つの態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、以下のいずれかにより特定されるアミノ酸置換を含むか、またはからなる。
v. 301Leu、309Argおよび321Glu
vi. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Gluまたは
xiii.301Leu、309Arg、312Gluおよび少なくとも一つのLys置換
xiv. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Glu、並びに少なくとも一つのLys置換。
さらなる態様において、本発明によるEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して以下のxvii-xxの群のいずれかによって特定される少なくとも二つのアミノ酸置換を含む。1
なおさらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、以下に示すxvii〜xxの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換で構成される。
xvii. 301Leuおよび309Lys
xviii. 301Leu、309Lysおよび312Glu
xix. 301Leuおよび309Lys並びに少なくとも一つのLys置換
xx. 301Leu、309Lysおよび312Glu並びに少なくとも一つのさらなるLys置換。
さらなる態様において、本発明によるEGF(A)ペプチド類似体は、配列番号：1と比較して以下のxxi〜xxivの群のいずれかによって特定される少なくとも二つのアミノ酸置換を含む。
なおさらなる態様において、本発明のEGF(A)ペプチド類似体は、以下に示されるxxi〜xxivの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる。
xxi. 301Leuおよび307Ile
xxii. 301Leu、307Ileおよび312Glu
xxiii.301Leuおよび307Ile並びに少なくとも一つのさらなるLys置換および
xxiv. 301Leu、3307Ileおよび312Gluおよび少なくとも一つのさらなるLys置換。
さらなる特定の態様において、ペプチド類似体、または本発明による化合物のペプチド類似体は、配列番号：1〜114により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜114により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜47および49〜114により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜44、46、47および49〜114のいずれか一つによって同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜44、46、47、49〜53、55、58〜114
により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。2〜44、46、47、49〜53、55、58〜114。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜4、6〜44、46、47、49〜53、55、58〜114
により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。2〜4、6〜44、46、47、49〜53、55、58〜114。
一つの態様において、ペプチド類似体は配列番号：2〜4、6〜19、21〜44、46、47、49〜53、55、58〜114により同定されるアミノ酸配列のいずれか一つを含むか、またはからなる。2-4、6-19、21-44、46、47、49-53、55、58-114。
一つの態様において、ペプチド類似体は、配列番号：2〜4、6〜19、21〜44、46、47、49〜53、55、58〜109および111〜114で同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は、配列番号：19、21、73、107、108、109、110、111、112、113および114によって同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は、配列番号：2、5、6、23、26、49、50、62、81、107、108、109、110および111によって同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は、配列番号：107、108、109、110、111、112、113および114によって同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはからなる。
一つの態様において、ペプチド類似体は、配列番号：107、108、109、110および111によって同定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはからなる。一つの態様においてそのペプチド類似体は配列番号：107により同定されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
一つの態様においてそのペプチド類似体は配列番号：108により同定されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる。
具体的なEGF(A)ペプチド類似体は、アミノ酸置換および配列番号：に関する情報を含めて、下記の表示含まれている。
中間化合物
本発明はまた、本発明の誘導体に組み込まれうるペプチド類似体に関する。かかるペプチド類似体は、「中間生成物」または「中間化合物」と呼ばれうる。これらは、新規LDL-R(293-332)類似体の形態であり、上述に説明したとおり、以にさらに説明するように本発明のEGF(A)誘導体に組み込むことができる。こうしたペプチド類似体は、上記の節で定義したとおりである。
特に、本発明によるペプチド類似体または中間ペプチドは、配列番号：1のペプチド類似体と呼ばれうる。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)誘導体などのEGF(A)化合物の製造において使用するためのEGF(A)ペプチド類似体に関する。
本明細書に記載されているとおりのEGF(A)ペプチド類似体は、あるいは、本発明のEGF(A)ペプチド類似体の有益な効果を有するさらなる代替的EGF(A)化合物を作製するその他のタンパク質要素の融合パートナーとして使用されてもよい。こうした態様において、EGF(A)ペプチドは、ゼロ、一つまたは二つのLys残基を有してもよい。
本発明のペプチド類似体に関連して本明細書に開示されるその他の特徴、定義、態様および態様は、本発明の中間生成物にも適用されうる。
EGF(A)誘導体
本発明のペプチド類似体は、置換基をさらに含んでもよく、それによって誘導体化合物になる。
「誘導体」という用語は一般に、化学修飾によって、特に一つまたは二つの置換基の共有結合によって、天然ペプチドまたはその類似体から製造されうる化合物を意味する。
本明細書で使用される「本発明の誘導体」、「EGF(A)誘導体」、「EGF(A)誘導体または「LDL-R(293-332)誘導体または「LDL-R(293-332)類似体の誘導体」という用語は、一つまたは二つの置換基が付着しているペプチドを意味する。これらのそれぞれはまた、またはあるいは、側鎖と呼ばれうる。言い換えれば、本発明の誘導体は、ペプチドすなわちペプチド配列を含み、これは本明細書ではEGF(A)ペプチド類似体および一つまたは二つなどを含む少なくとも一つの置換基を含む。
「置換基」という用語は、EGF(A)ペプチドと共有結合した部分を記述するために使用され、たとえば置換基は、EGF(A)ペプチド自体の一部ではない部分である。
一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体の窒素原子に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基はEGF(A)ペプチド類似体のアミノ基に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸またはEGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸残基のアルファ窒素に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体中のLys残基に付着される。一つの態様において、一つまたは複数の置換基は、EGF(A)ペプチド類似体中のLys残基のイプシロン窒素に付着される。
置換基の例は、多種があり、以下に記述される。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)ペプチド類似体および少なくとも一つの置換基を含むEGF(A)誘導体に関する。一つの態様において、誘導体の置換基は少なくとも一つの脂肪酸基を含む。すべての態様において、EGF(A)誘導体という用語は、薬学的に許容されるその塩、アミドまたはエステルも包含する。
置換基
置換基は、EGF(A)ペプチド類似体に付着された部分である。本発明によると、部分、たとえば置換基は、EGF(A)ペプチドの機能性に対して影響がないか、または影響が最小限である一方で、より長い半減期および／または経口投与後の曝露の改善など、その他の有益な特性を付加することが好ましい。
その結果、上述の本発明の類似体、並びに類似体は、PCSK9に結合する能力も有する。こうしたPCSK9に対する結合は、LDL-Rに対するPCSK9結合を阻害し、それによってLDL-R分解を防止し、よってLDL-Cおよびアテローム性リポタンパク質のクリアランスを増加する。
特定の態様において、本発明の誘導体および類似体は、たとえば天然LDL-R(293-332)と、または他のPCSK9結合化合物と比較してPCSK9に結合する改善された能力を有する。本発明の類似体および誘導体は、たとえば本明細書の実施例D.1.1に記載されるアッセイを使用してLDL-Rに対するPCSK9結合を阻害する能力について試験することができる。
一つの態様において、置換基は、ペプチドの機能性を改善することを目的とする。
一つの態様において、置換基は、実施例1および48（節 Ｄ2、表7）で示すように、バックボーンペプチドおよび置換基を含む誘導体の血漿半減期がバックボーンペプチドの半減期と比較して長い半減期を持つように、ペプチド類似体の半減期を増大させる。異なる種での半減期を決定する方法は、当技術分野において周知であり、マウスおよびイヌについて本明細書で例示してある（節D2およびD5）。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、4時間よりも長い半減期を有する。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、たとえば皮下投与または静脈内投与のいずれかの後で測定されるマウスにおいて8時間よりも長いなど、または10時間よりも長いなど、6時間よりも長い半減期を有する。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、イヌにおいて25時間よりも長い半減期を有する。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、イヌにおいて100時間よりも長い半減期など、または150時間よりも長い半減期など、50時間よりも長い半減期を有する。
一つの態様において、半減期延長置換基は、タンパク質部分である。こうしたさらなる態様において、タンパク質部分は、ヒトアルブミン、Fcドメインまたは非構造化タンパク質延長部分を含みうる。さらなる態様において、タンパク質部分は、ペプチド類似体に融合されることによってもよい。さらなる態様において、タンパク質部分は、Fcドメインであり、Fcドメインは、ペプチド類似体に融合される。Fc融合が製造されるとき、結果として得られる化合物は、通常二つのFc-ポリペプチドとして二価であり、一つのFcドメインを形成する。
一つの態様において、置換基は、タンパク質部分ではない。一つの態様において、置換基は、EGF(A)ペプチド類似体に融合されたタンパク質部分ではない。一つの態様において、タンパク質部分は、Fcドメインではない。
別の態様において、置換基は、非タンパク質部分である。
特定の態様において、置換基は、アルブミンと非共有錯体を形成することができ、それによって血流内の誘導体の循環を促進し、また誘導体の作用時間を延長する効果を有する。特定の態様において、置換基は、PCSK9に対するその結合能力を実質的に低減することなく、EGF(A)化合物の作用時間を延長することができる。
一つの態様において、EGF(A)誘導体は、半減期延長置換基を含む。様々な半減期延長置換基は、当技術分野で周知であり、また下記にさらに説明したような脂肪酸基を含む特定のアルブミン結合剤を含み、このようなアルブミン結合剤は、非タンパク質置換基である。
置換基は、少なくとも一つの脂肪酸基を含む。
特定の態様において、脂肪酸基は、少なくとも8つの連続した-CH2-基を含む炭素鎖を含む。一つの態様において、その脂肪酸基は、少なくとも12個の連続した-CH2-基、少なくとも14個の連続した-CH2-基、少なくとも16個の連続した-CH2-基、少なくとも18個の連続した-CH2-基など、少なくとも10個の連続した-CH2-基を含む。
一つの態様において、脂肪酸基は、8〜20個の連続した-CH2-基を含む。一つの態様において、脂肪酸基は、10〜18個の連続した-CH2-基を含む。一つの態様において、脂肪酸基は、12〜18個の連続した-CH2-基を含む。一つの態様において、脂肪酸基は、14〜18個の連続した-CH2-基を含む。
誘導体が二つの置換基を含む状況において、半減期の増大は、短めの脂肪酸基を用いて獲得されうるもので、したがって誘導体が二つの置換基を含む一つの態様において、脂肪酸基は、少なくとも10個の連続した-CH2-基など、少なくとも12個の連続した-CH2-基など、少なくとも14個の連続した-CH2-基など、少なくとも16個の連続した-CH2-基など、少なくとも8つの連続した-CH2-基を含みうる。
誘導体が二つの置換基を含むさらなる態様において、置換基は、それぞれ8〜18個の連続した-CH2-基を含む脂肪酸基を含む。こうしたさらなる態様において、12〜18個の連続した-CH2-基など、14〜18個の連続した-CH2-基など、脂肪酸基は10〜18の連続した-CH2-基を含む。本明細書で使用される「脂肪酸基」という用語は、pKaが<7であるブレンステッド-ローリー酸である少なくとも一つの官能基を含む化学基と呼ばれる場合がある。ブレンステッド-ローリー酸であるそのような官能基の非限定的な例は、カルボン酸（カルボキシフェノキシを含む）、スルホン酸、テトラゾール部分を含む。
一つの態様において、前記脂肪酸基は、カルボン酸、スルホン酸、テトラゾール部分、メチルスルホニルカルバモイルアミノ（MSU）部分および3−ヒドロキシ-イソオキサゾレイソオキサゾール部分から選択される官能基を含む。したがって、本発明の半減期延長置換基は、一つの態様においてカルボン酸、スルホン酸、テトラゾール部分、メチルスルホニルカルバモイルアミノ部分またはヒドロキシ-イソオキサゾレイソオキサゾール部分を含み、さらに下記によって定義される8〜20個の連続する-CH2-基をさらに含む：
化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*、式中、nは8〜20の範囲の整数であり、これはC(n+2)二酸とも呼ばれ、または次式として表されてもよい
化学物質1b：
（式中、nは8〜20の範囲の整数である）。
化学物質2: 5-テトラゾリル-(CH2)n-CO-*、（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、次式として表されてもよい。）
化学物質2b：
（式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*、（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、次式として表されてもよい。）
化学物質3b：
（式中、カルボキシ基は、化学物質3の(C6H4)基の位置2、3、4であり、式中mは8〜11の範囲の整数である。）
化学物質4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO-*であり、（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、次式として表されてもよい。）
化学物質4b:
（式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
化学物質5：MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)n-CO-*であり、（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、次式として表されてもよい。）
化学物質5b:
（式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
化学物質6：3-HO-Isoxazole-(CH2)n-CO-*であり、（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、次式として表されてもよい。）
化学物質6b:
（式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
酸性形態の官能基という用語は、FG-Hと呼ばれ、またその共役塩基としての形態は、FG-と呼ばれる。本明細書で使用される「pKa < 7を有する官能基」という用語は、水溶液中でそのメチル誘導体（CH3-FG-H）の形態であるブレンステッド-ローリー酸が7より小さい平衡pKaを有することを意味することがあり、（式中、pKaは、下記に示す平衡の平衡定数（Ka）に対する-logである。）
pKaの決定方法は、当技術分野で周知である。このような方法は、たとえばReijenga et al. in Anal Chem Insights 2013 (2013; 8: 53-71)に記載されている。
一つの態様において本発明による置換基は、一つまたは複数のリンカー要素を含む。リンカー要素は、アミド結合により脂肪酸基に連結されてもよく、またZ2-Z10と呼ばれうる。本明細書にさらに定義されるように、リンカー要素の数は、多くても10でありうる。
特定の態様において、置換基は、式I:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I]であり、（式中、
Z1は、以下から選択される:）
化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*または
化学物質1b:
化学物質2: 5-テトラゾリル-(CH2)n-CO-*または
化学物質2b:
化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*または
化学物質3b:
式中、カルボキシ基は、-(C6H4)-の位置2、3または4である。
化学物質4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*または
化学物質4b:
化学物質5：MeS(O)2NH2N(CO)NHN-(CH2)n-CO-*または
化学物質5b:
および
化学物質6：3-HO-イソオキサゾール-(CH2)n-CO-*および
化学物質6b:
（式中、nは8〜20の範囲の整数であり、mは8〜11の範囲の整数である。）
特定の態様において、nは、化学物質1または1bにおいて8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。特定の態様において、nは、化学物質2または2bにおいて8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。特定の態様において、nは、化学物質4または4bにおいて8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。特定の態様において、mは、化学物質3または3bにおいて8、9、10または11である。
特定の態様において、nは、化学物質5または5bにおいて8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。
特定の態様において、nは、化学物質6または6bにおいて8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20である。
特定の態様において、記号*は、Z2における窒素への付着点を示す。別の態様において、Ｚ2は結合であり、シンボル*は、隣接するZ要素の窒素への付着点を示す。
式Iの文脈で使用される「結合」という用語は、共有結合を意味する。式I（Z1-Z10）の構成要素が結合として定義されるとき、それ前記構成要素が存在しない式Iと等価である。
本明細書で下記のZ2-Z10のうちいずれかが結合であるという表示は、Z2-Z10のいずれかが存在しないとしても読まれうる。論理的に「結合」には「結合」が続かない。本明細書の「結合」という表示は、したがって前のZ要素が「結合」（または非存在）ではない次のZ要素に共有結合されていることを意味する。
リンカー要素Z2-Z10は、 Glu、γGlu（ガンマGluまたはgGluとも呼ばれ、*-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*によって定義される）、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、AeeepおよびTtdSuc並びに下記に定義するさらなる部分などのアミノ酸様の部分を含む、アミド結合を形成することができる化学部分から選択される。
Z2は、以下から選択される:
化学物質7：*-NH-SO2-(CH2)3-CO-*または
化学物質7b:
化学物質8：*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*または
化学物質8b:
および
結合。
Z3は、γGlu、Gluまたは結合から選択される。
Z3は、Z2が化学物質7または化学物質7bであるとき、γGlu、Gluまたは結合から選択される。
Z3は、γGlu、Glu、または結合から選択され、ただしZ2が化学物質8であるときZ3はγGlu、Gluから選択されることを条件とする。
Z3は、Z2が化学物質8であるとき、γGluおよびGluから選択される。
Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9は、互いに独立して、Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep、TtdSucおよび結合から選択される。
Glu、Gly、Ser、Ala、Thrは、当技術分野において周知のアミノ酸残基である。
γGluは、式化学物質9:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*であり、これは化学物質9bと同じである:
および、gGluとも呼ばれうる。
TtdSucは、式化学物質10:
*-NH-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2O-(CH2)3-NHCO*または
*-NH-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCO*であり、これは、
化学物質10b:
と同じである。
Adoは、式化学物質11: *-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*であり、これは8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸と呼ばれてもよく、これは、
化学物質b 11b:
と同じである。
Aeepは式化学物質12: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*であり、これは、 化学物質12b:
としても示されうる。
Aeeepは、式化学物質13: *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*であり、これは、
化学物質13b:
としても示されうる。
Z10は、結合および化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*から選択され、これは、
化学物質14b:
としても示されうる。
特定の態様において、Z10は、化学物質14であり、置換基は前記ペプチドのN末端アミノ基に付着される。
別の態様において、Z10は、結合であり、前記置換基は、前記ペプチド中に存在するLys残基のイプシロン位置または前記ペプチドのN末端アミノ酸残基に付着される。
一つの態様において、誘導体は、二つの置換基を含む。一つのこうした態様において、二つの置換基は同一である。一つのこうした態様において、二つの置換基は異なる。一つの態様において、二つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体の窒素原子に付着される。一つの態様において、二つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体のアミノ基に付着される。一つの態様において、二つの置換基が、N末端アミノ酸EGF(A)およびEGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着される。一つの態様において、一つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸残基のアルファ窒素を付着し、一つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着する。一つの態様において、二つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸に付着される。一つの態様において、二つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体の異なるLys残基に付着される。一つの態様において、二つの置換基はEGF(A)ペプチド類似体にある異なるLys残基のイプシロン窒素に付着される。
二つの置換基が存在する一つの態様において、Z10は、ペプチド類似体およびN末端アミノ基に付着された一つの置換基にある化学物質14であり、Z10は、前記ペプチド類似体に存在するLys残基のイプシロン位置に付着された他の置換基にある結合である。
二つの置換基が存在する別の態様において、Z10は、ペプチド類似体およびN末端アミノ基に付着された一つの置換基にある結合であり、Z10は、前記ペプチド類似体に存在するLys残基のイプシロン位置に付着された他の置換基にある結合である。
二つの置換基が存在する別の態様において、Z10は、両方の置換基にある結合であり、二つの置換基のそれぞれは、ペプチド類似体中に存在する異なるLys残基のイプシロン位置に付着される。
特定の態様において、本発明の誘導体は、1個または2個の置換基の共有結合によってEGF(A)ペプチド類似体から製造されてもよい。
特定の態様において、二つの置換基は、式I: Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I]である。Z1〜Z10は、上記に定義されているとおりである。特定の態様において、二つの置換基は、式Iの置換基であり、かつ同一であり、選択されたZ1〜Z10が両方の置換基で同じであることを意味する。別の態様において、二つの置換基は、式Iの置換基であり、かつ異なる置換基であり、選択されたＺ1〜Z10の一つまたは複数が一つの置換基と他方の置換基との間で異なることを意味する。
特定の置換基
上記のとおり、さまざまな置換基が当業者によって製造されうる。したがって、本出願に含まれる置換基は、本発明に限定されるものとはみなされない。
一つの態様において、一つまたは二つの置換基は、以下から構成される置換基の群から選択される。
一つの態様において、置換基は、式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*である。）
一つの態様において、置換基は、式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、置換基は、式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは14または16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、およびZ4、Z5、Z6、Z7、Z8およびZ9のすべては結合であり；Z10は結合である。
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16または18であり；Z2は化学物質8（Trx）であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質2：テトラゾリル-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは15であり；Z2は化学物質7（スルホンイミド）であり；Z3は結合であり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質2：テトラゾリル-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは15であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質2：テトラゾリル-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは12であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3は結合であり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のすべては結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のすべては結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち一つはγGluで、残りの五つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち一つはγGluで、二つはAdoで、残りの三つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち三つはGlyで、残りの三つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち三つはAdoで、残りの三つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち四つはAdoで、残りの二つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち一つはTtdSucで、残りの五つは結合であり；Z10は結合である。
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は化学物質8（Trx）であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは9であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち一つはTtdSucで、残りの五つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは15であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質4: HO-S(O)2-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは15であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Z10は化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質5：MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは12であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質6：3-OH-イソオキサゾール-(CH2)12-CO-*であり、式中、nは12であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
特定の置換基の組み合わせ:
一つの態様において、本発明の化合物は、式Iの二つの置換基を含むか、または有し、式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、（式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、式Iの二つの置換基を含むか、または有し、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは14であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、式Iの二つの置換基を含むか、または有し、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは14であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち四つすべては結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、式Iの二つの置換基を含むか、または有し、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を含むか、または有し、一方は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4）-CH2-*であり）、他方の置換基は式Iの他の置換基であり、（式中、Z1は、化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を含むか、または有し、一方は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4）-CH2-*であり）、他方の置換基は式Iの他の置換基であり、（式中、Z1は、化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を含むか、または有し、一方は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合であり）、他方の置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、mは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり、Z4、Z5、Ｚ6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoで、残りの四つは結合であり；Z10は結合である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を含むか、または有し、一方は式Iの置換基であって、（式中、Z1は化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*であり、式中、nは16であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合であり）、他方の置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*であり、式中、mは15であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Z10は化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*である。）
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を含むか、または有し、一方は式Iの置換基であって、（式中、Z1は化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*であり、式中、ｍは10であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8およびZ9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Ｚ10は結合であり）、他方の置換基は式Iの置換基であり、（式中、Z1は化学物質4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*であり、式中、mは15であり；Z2は結合であり；Z3はγGluであり；Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9のうち二つはAdoであり、残りの四つは結合であり；Z10は化学物質14：*-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*である。）
ペプチドおよび付着部位
本発明によるEGF(A)誘導体または化合物は、配列番号：1により定義されるLDL-RのEGF(A)ドメインのEGF(A)ペプチド類似体を含む。こうしたペプチド配列については、本明細書で上記に詳細に記載されてきたが、本発明の誘導体または化合物のペプチドが、同一の用語によって記述され定義されうる。EGF(A)誘導体または化合物はさらに、本明細書で上記に記載されているペプチド配列に関連づけられた少なくとも一つの置換基を有する。
本発明の化合物において、置換基はペプチドに共有結合され、ペプチド配列の一つのアミノ酸残基に対する共有結合を意味する。
一つの態様において、本発明のEGF(A)誘導体は、位置295、296、298、301、302および307のいずれか一つには付着されない置換基を含む。さらなる態様において、置換基は、位置295、296、298、301、302、307および310のいずれか一つには付着されない。こうしたさらなる態様において、これは位置299および320のいずれか一つにも付着されない。
特定の態様において、置換基は、任意の位置297、304、308、317、319および331のいずれかを除いて、292〜333の任意の位置に付着される。
特定の態様において、置換基は、位置297、298、301、302、304、307、308、317、319および331のいずれかを除いて、292〜333の任意の位置に付着される。
特定の態様において、置換基は、位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、317、319および331のいずれかを除いて、292〜333の任意の位置に付着される。特定の態様において、置換基は、位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、310、317、319、320および331のいずれかを除いて、292〜333の任意の位置に付着される。特定の態様において、置換基は、位置295、296、297、298、301、302、304、307、308、309、310、317、319、320および331のいずれかを除いて、292〜333の任意の位置に付着される。
一つの態様において、置換基は、EGF(A)ペプチド類似体の位置292、293、294、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332および333のうち任意の一つまたは二つに付着される。
一つの態様において、置換基は、EGF(A)ペプチド類似体の位置292、293、294、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332および333のうち任意の一つまたは二つに付着される。
一つの態様において、置換基は、EGF(A)ペプチド類似体の位置292、293、294、300、303、305、306、311、312、313、314、315、316、318、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、332および333のうち任意の一つまたは二つに付着される。
一つの態様において、置換基は、ペプチド配列のN末端アミノ酸に付着される。特定の態様において、N末端アミノ酸は、Glyである。特定の態様において、N末端アミノ酸は、293Glyである。特定の態様において、N末端アミノ酸は293Lysである。特定の態様において、N末端アミノ酸は292Lysである。これは、N末端位置におけるLysもしくはGlyまたは別のアミノ酸残基であってもよく、これは293であるか、または294Thr、294Glyもしくは294Lysまたは295AsnなどN末端からさらに下方あるものでもよい。特定の態様において、置換基は、ペプチド類似体のN末端アミノ酸残基のアルファ窒素に付着される。別の態様において、N末端アミノ酸残基がLysである場合、置換基は、アルファ窒素またはリジン残基のイプシロンアミノ基に共有結合されてもよい。
特定の態様において、置換基は、ペプチド中に存在するLys残基のε-アミノ基に付着される。
別の態様において、置換基は、C末端位置のLysに付着され、これは位置332、333またはさらにC末端に向かう任意の位置でもよい。
本発明のペプチドがN末端またはC末端のいずれかに伸長を含む態様において、置換基は、前記伸長のアミノ酸残基に付着されうる。N末端伸長の存在下において、置換基は、伸長配列内に存在する前記伸長のN末端アミノ酸に、または伸長配列内に存在するLysに付着されうる。C末端伸長の存在下において、置換基は、C末端アミノ酸にあるLys残基に、または伸長配列内に存在するLysに付着されうる。
なお別の態様において、置換基は、ペプチド配列内に存在するアミノ酸に付着される。特定の態様において、置換基は、ペプチド中に存在するリジン残基に連結される。特定の態様において、置換基は、ペプチド中に存在するリジン残基のイプシロンアミノ基に連結される。置換基が連結されるリジン残基は、ペプチドのN末端位置またはC末端位置を含むLDL-R(293-332)EGF(A)ペプチド類似体の任意の位置、存在する場合ペプチドのN末端位置またはC末端部分を含むLDL-R(293-332) EGF(A)ペプチド類似体の任意の位置、N末端伸長が存在する場合N末端の最終残基内の任意の位置、C末端伸長が存在する場合C末端の最終残基内の任意の位置に連結されうる。
本明細書で上記に記載したとおり、EGF(A)ペプチド類似体は、一つまたは複数のLys残基があり、それらの残基は、置換基の付着にとって有用である。
特定の態様において、置換基が連結されるリジンは、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される。
特定の態様において、置換基が連結されるリジンは、293Lys, 294Lys, 295Lys、296Lys、298Lys、299Lys、301Lys、302Lys、303Lys、305Lys、306Lys, 307Lys、309Lys、310Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys, 318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys, 328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される。
特定の態様において、置換基が連結されるリジンは、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される。
特定の態様において、置換基が連結されるリジンは、293Lys、294Lys、298Lys、299Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される。
別の態様において、置換基が連結されるリジンは、292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される。
別の態様において、置換基が連結されるリジンは、292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysの群から選択される。
別の態様において、置換基が連結されるリジンは、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される。
別の態様において、置換基が連結されるリジンは、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysから選択される。
置換基がC末端伸長に付着される態様において、置換基が連結されるリジンは、333Lys〜242Lysのいずれか一つの位置および／または333Lys〜383Lysのいずれか一つの位置から選択されうる。
本発明の化合物が二つの置換基を持つ態様において、置換基は、上述のように互いに独立して連結されてもよく、いずれか一方がペプチドのN末端アミノ酸に、ペプチドのC末端アミノ酸に、またはペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸に付着されうることを意味する。
LysがN末端位置に存在する態様において、二つの置換基は、どちらもペプチドのN末端Lysに連結されうる。一方は、前記LysのN末端アルファアミンに連結されてもよく、他方は前記Lysのイプシロン窒素に連結されてもよい。二つの置換基が存在する場合、一方はペプチドのN末端アミノ酸に連結され、他方の置換基は、ペプチド内のLysなどのアミノ酸に連結されてもよい。あるいは、一方の置換基は、ペプチドのC末端位置にあるLysに連結され、他方の置換基は、ペプチド内のLysなどのアミノ酸に連結されてもよい。あるいは、一方の置換基は伸長を含むペプチド内のLysなどのアミノ酸残基に連結され、他方の置換基は伸長を含むペプチド内のLys内の別のアミノ酸残基に連結されてもよい。
一つの態様において、本発明の化合物は、一つの置換基を有し、前記置換基は、N末端でペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置293Lysにあるペプチドに連結されるか、または前記置換基は位置299Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置300Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置309Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置311Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置312Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置313Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置314Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置315Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置316Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置318Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置320Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置321Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置322Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置323Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置324Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置325Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置326Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置328Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置329Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置330Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置332Lysにあるペプチドに連結されるか；または前記置換基は位置333Lysにあるペプチドに連結される。
本発明の誘導体が二つの置換基を有する態様において、前記置換基は、N末端また293Lys、309Lys、313Lys、324Lys、328Lys、330Lys、332Lysおよび333Lysなど上述の任意のLys位置を介してペプチドに連結されてもよい。
誘導体が二つの置換基を有するさらなる態様において、それらは、以下のLys残基の対のいずれかなど、二つの異なるLys残基に連結されてもよい。
一つの態様において、二つの置換基は、333Lysを経由して付着され、Lysは、293Lys、309Lys、312Lys、313Lys、314Lys、321Lys、324Lys、328Lys、330Lysおよび332Lysから選択される。
一つの態様において、二つの置換基は、333Lysを経由して付着され、Lysは、312Lys、313Lys、314Lys、321Lys、324Lys、328Lysおよび330Lysから選択される。
一つの態様において、二つの置換基は、333Lysを経由して付着され、Lysは、313Lys、324Lysおよび328Lysから選択される。
上述のように、ペプチドは、本明細書に記載したとおりの特定の位置における特定のアミノ酸残基と組み合わせられうる一つまたは複数のアミノ酸置換を有してもよい。こうした特定のアミノ酸残基は、維持されるべきwtアミノ酸残基でもよく、一連の態様において、たとえば本明細書で説明したその他の特徴との組み合わせで、ペプチド類似体中に存在しうるシステインなどである。こうした態様において、ペプチド類似体は、297Cys〜308Cys、304Cys〜317Cys、および319Cys〜331Cysの位置に三つのジスルフィド架橋を含む。こうした態様のさらなる実施例において、ペプチド誘導体のペプチド類似体は、297Cys〜308Cys、304Cys〜317Cys、および319Cys〜331Cysの位置の三つのジスルフィド架橋並びに少なくとも一つの置換基を含み、ここで置換基は、前記ペプチド類似体の295、296、298、301、302および307から選択される位置には付着されない。当業者であれば、ペプチド配列情報の組み合わせを、置換基の位置および同定の情報と組み合わせて、本発明の様々な特定の態様が定義されうることが理解できる。
一つの態様において、ペプチド類似体は、置換基が連結されている位置以外の位置にはLysを含まない。
一つの態様において、本発明の化合物は、一つの置換基を有し、前記置換基は、N末端の位置、または任意の位置のLysのいずれかに連結されており、ペプチド類似体は、それ以外のどの位置にもLysを含まない。一つの態様において、本発明の化合物は、一つの置換基を有し、前記置換基は、位置312以外の任意の位置にあるLysに連結されており、ペプチド類似体は、位置312ArgにArgを含む。
一つの態様において、本発明の化合物は、二つの置換基を有し、ペプチド類似体は、置換基が連結されている位置以外の位置にはLysを含まない。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、実施例1〜47、51〜102および106〜159からなるEGF(A)誘導体の群から選択される。
さらなる態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、個別的に、実施例1〜47、51〜102および106〜159からなるEGF(A)誘導体の群から選択される。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、実施例1〜44、46〜47、51〜55、57、60〜64、66〜69、71〜102および106〜159からなるEGF(A)誘導体の群から選択される。
一つの態様において、本発明によるEGF(A)誘導体は、実施例31、95、128、133、143、144、150、151、152および153からなるEGF(A)誘導体の群から選択される。
EGF(A)化合物を製造する方法
本発明はさらなる態様において、EGF(A)化合物を製造する方法に関する。
意外にも発明者らは、二価陽イオンの存在が本発明によるEGF(A)化合物の製造に関与する様々なプロセス工程、特に水溶液中で実施される工程を含むすべての工程、並びに有機溶媒の溶液中で実施される工程の収率を改善することを見出した。様々な実験室操作を実施するとき、安定性を損なうことなく貯蔵および異なる溶液中での可溶性を許容する利用可能な複数の選択肢を有することは非常に魅力的である。
本明細書に記載したとおり、EGF(A)誘導体を含むEGF(A)化合物は、異なる経路によって製造されてもよい。EGF(A)ペプチド類似体は、合成されてもよく、こうした合成中に一つまたは複数の置換基を付着しうる。あるいは、EGF(A)誘導体は、EGF(A)ペプチド類似体を製造する第一の工程および置換基をEGF(A)ペプチド類似体に付着する第二の工程を含む二工程プロセスで製造されてもよい。発明者らは、後者のプロセスが実施されるとき、二価陽イオンが含まれる場合にプロセスの収率が増加することを見出した。特定の態様において、カルシウムイオンなどの二価陽イオンは、EGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体を含む、水溶液などのEGF(A)化合物を含む任意の溶液中に含めることができる。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)ペプチド類似体を製造するための方法であって、EGF(A)ペプチド類似体は、カルシウムイオンなどの陽イオンイオンの存在下で処理される方法に関する。
さらなる態様において、本方法は、カルシウムイオンなどの二価陽イオンの存在下におけるEGF(A)ペプチド類似体の精製を含む。EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の製造方法とは独立して、分子は、カルシウムイオンなどの二価陽イオンの存在下で精製されうる。一つのこうした態様において、精製は、pH5〜10など、pH5〜9など、pH5〜8など、またはpH6〜8など、pH4〜10で実施される。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)誘導体を製造するための方法であって、少なくとも一つの置換基は、二価陽イオンの存在下でEGF(A)ペプチド類似体に付着される方法に関する。本明細書に上述したとおり、置換基は、半減期延長部分であってもよく、上記で説明した脂肪酸基を含む置換基を含むがこれに限定されず、本明細書で具体的に開示される置換基によって例示される。
一つの態様において、本発明は、EGF(A)化合物を製造するための方法であって、
i.EGF(A)ペプチド類似体を提供する工程、
ii.置換基を提供する工程、
iii.前記半減期延長部分を二価陽イオンの存在下でEGF(A)ペプチド類似体に付着する工程、
を含み、
これにより、EGF(A)化合物が得られる方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、EGF(A)誘導体を製造するための方法であって、
i. EGF(A)ペプチド類似体を提供する工程、
ii. 置換基を提供する工程、
iii. 前記EGF(A)ペプチド類似体および前記半減期延長部分を前記二価陽イオンの存在下で混合する工程、
を含み、
これにより、EGF(A)誘導体が得られる方法に関すr4得。
本明細書における開示から明らかとなるように、たとえば陽イオンが上記の工程iで使用されるEGF(A)ペプチド類似体製造品に含まれる場合、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を製造する方法の全体を通して二価陽イオンが存在してもよい。標品が工程iiiで希釈される場合、さらなる二価陽イオンを含むことが有利でありうる。EGF(A)ペプチド類似体の任意の処理は、カルシウムイオンなどの二価陽イオンの存在下で実施されるのが望ましいことにさらに留意されたい。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体は、カルシウムイオンの存在下で精製される。
一つの態様において、方法は、二価陽イオンの塩を含む。一つの態様において、方法は、Mg2+、Ba2+、Ca2+およびSr2+などの二価陽イオンの塩を含む。一つの態様において、塩は、酢酸塩または塩化物である。一つの態様において、塩は、カルシウム塩である。一つの態様において、方法は、カルシウム塩を含み、塩、はCaCl2またはCa(OAc)2である。さらなる態様において、塩は、CaCl2である。一つの態様において、カルシウムなどの二価陽イオンの濃度は、少なくとも2mMなど、または少なくとも5mMなど、少なくとも1mMである。一つの態様において、カルシウムイオンの濃度は、10mMなど、20mMなど、30mMなど、40mMなど、50mMなど、60mMなど、たとえば80mMなど、少なくとも100mMなど、少なくとも5mMである。
一つの態様において、カルシウムイオンの濃度は、多くても75mMなど、多くても50mMなど、多くても100mMである。一つの態様において、二価陽イオンイオンの濃度は、5〜75mMなど、または10〜50mMなど、2〜100mMである。
一つの態様において、二価陽イオンイオンの濃度は、10〜75mMなど、または10〜50mMなど、10〜100mMである。
本明細書の他の場所に記載したとおり、カルシウムとEGF(A)化合物の濃度の比は、当量でも記述することができ、これはEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の製造時に含められる陽イオンの量、および特異的にカルシウムイオンの量を定義するためにも有用である。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度に対するカルシウムイオンの濃度は、少なくとも1当量など、少なくとも2当量など、少なくとも3当量など、少なくとも4当量など、または少なくとも5当量など、少なくとも0.5当量である。
一つの態様において、カルシウムイオンの濃度は、EGF(A)ペプチド類似体の濃度の少なくとも1当量など、少なくとも2当量など、少なくとも3当量など、少なくとも4当量など、少なくとも0.5当量である。
一つの態様において、カルシウムイオンの濃度は、EGF(A)ペプチド類似体の濃度の75当量など、50当量など、多くても40当量など、多くても30当量など、多くても20当量など、多くても10当量など、多くても100当量である。
一つの態様において、カルシウムイオンの濃度は、EGF(A)ペプチド類似体の1〜40当量など、2〜40当量など、2〜30当量など、5〜25当量など、0.5〜50当量である。
本明細書に記載したとおり、製造される化合物に応じて様々なストラテジーが適用されてもよい。
実施例で示すように、N末端に置換基が付着されている誘導体は、直接合成および還元的アルキル化によって得られる一方、リジン残基、すなわちリジン残基のイプシロンアミノ基を介して置換基が付着されている誘導体の製造は、直接合成によるか、または上記で言及した溶液中でのアシル化によるかのいずれかでなされる。当業者であれば、EGF(A)化合物を製造するのに適した代替プロセスを他にも見出すことができる。
二工程の方法を実施するとき、活性化された置換基は、N末端アミノ基とも反応しうるため、リジンに対する選択性が問題となることがある。本発明はさらに、二工程プロセスでのリジン残基への置換基の選択的付着のための方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、pHが増大する上述のようなEGF(A)誘導体を製造する方法に関する。一つの態様において、pHは、NaOHを添加することによって増大する。一つの態様において、pHは、NaOHによって、11を超えるなど、10以上に増大する。反応収率を改善するために、置換基（アシル化試薬）がEGF(A)ペプチド類似体と混合される反応工程の間もpHを調節して、プロセス工程が高いpHで実施されるようにすることがさらに可能である。
水混和性有機溶媒などの様々な溶媒およびその混合物を試薬の溶解性を確保するために含めることができる。こうした溶媒は、一つまたは複数の工程に含めうる。溶媒の例は、 N-メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、およびジメチルアセトアミドである。
さらなる態様において、N-メチルピロリジノンは、EGF(A)ペプチド類似体に置換基を付着する工程に含まれる。メチルピロリジノンは、EGF(A)ペプチド類似体製造品および／または置換基と共に含めてもよい。
EGF(A)誘導体の形成後、反応混合物は酸を添加することによって中和されうる。特定の態様において、中和はトリフルオロ酢酸を添加することにより得られる。
医薬組成物
本発明はまた、本発明の化合物、たとえば本発明のペプチド類似体または薬学的に許容されるその塩、アミドもしくはエステルおよび薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。こうした組成物は、当技術分野で周知のとおりに製造されてもよい。
「賦形剤」の語は、広く、活性治療成分以外の任意の成分をいう。賦形剤は、非活性物質、不活性物質および／または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、たとえば担体、媒体、希釈剤、錠剤補助剤として様々な目的を果たし、および／あるいは活性物質の投与および／または吸収を改善するように機能しうる。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤および安定剤である。様々な賦形剤を伴った薬学的活性成分の製剤化は、当該技術分野において公知であり、たとえばRemington: The Science and Practice of Pharmacy(たとえば、第19版(1995)および任意のその後の版)を参照されたい。
本発明の組成物は、液体製剤、すなわち水を含む水性製剤の形態であってもよい。液体製剤は、溶液または懸濁液であってもよい。「水性製剤」という用語は、少なくとも50%w/wの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも50%ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50%ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
あるいは、これは、固形製剤、たとえば凍結乾燥または噴霧乾燥した組成物であってもよい。
医薬品製剤は、0.1〜200mg/mLの濃度、たとえば1mg/mL〜100mg/mLの濃度で化合物を含みうる。製剤は、緩衝システム、防腐剤、等張化剤、キレート剤、安定剤および／または界面活性剤をさらに含んでもよい。
本発明の医薬組成物は、併用療法の場合に投与を簡略化しうる治療剤など、第二の有効成分をさらに含みうる。
本発明の組成物は、経口組成物であってもよく、投与経路は、経口による。本発明の化合物および特に遅延性化合物、すなわち誘導体化合物は、経口投与に適している。本発明のペプチドおよび化合物は、本発明に従い、経口製剤によって、すなわち経口投与に適し、かつ適切なレベルの生物学的利用能を提供する組成物によって構成されうる。当該技術分野で周知の経口製剤技術が使用されうる。これには、およびGIPET製剤に記載されるN-(8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ)カプリル酸の塩、特にWO96/30036およびWO2008/028859号に記載のあるN-(8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ)カプリル酸(SNAC)、並びにEP1154761およびUS 8053429に記載のあるものなど、カプリン酸ナトリウムを含むGIPET製剤の使用が含まれる。
経口組成物のための化合物を提供するために、発明者らは、本発明によるEGF(A)ペプチド誘導体がラットにおいて胃腸吸収を示すことを確認した（表10）。
あるいは、本発明の組成物は、たとえば皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によって実施される非経口投与用であってもよい。当然、皮下投与を目的とした化合物は、胃腸吸収を示す必要はないであろうものの、液体製剤中での高い安定性などの他の特徴が望ましいであろう。
一つの態様において、本発明は、皮下投与のための医薬組成物であって、本明細書に記載したとおりのEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む組成物に関する。
一つのこうした態様において、医薬組成物は、液体製剤、すなわち水を含む水性製剤の形態である。一つの態様において、医薬組成物は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む液体製剤である。一つの態様において、液体製剤はさらに、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤および／または安定剤のうちの一つまたは複数などの一つまたは複数の賦形剤を含む。一つの態様において、液体製剤は、緩衝液なしである。一つの態様において、液体製剤はさらに、溶媒、希釈剤、防腐剤、張性調節剤、キレート剤および／または安定剤などの一つまたは複数の賦形剤を含む。
さらなる態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む医薬組成物は、Mg2+、Ba2+、Ca2+またはSr2+から選択される二価陽イオンなどの二価陽イオンを含む。一つの態様において、医薬組成物は塩を含む。一つの態様において、医薬組成物は、Mg2+、Ba2+、Ca2+またはSr2+の塩を含む。一つの態様において、医薬組成物は、イオン（Ca2+）を含む。
一つの態様において、医薬組成物は、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩または塩化物を含む。一つの態様において、医薬組成物は、H2PO4-、HPO4 2-またはPO4 3-などのリン酸塩を含む。
一つの態様において、医薬組成物は、酢酸塩（OAc）または塩化物（Cl）の塩を含む。一つの態様において、塩は、カルシウム塩である。一つの態様において、医薬組成物は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体および塩を含み、塩は、CaCl2 またはCaOAcである。さらなる態様において、医薬組成物は、CaCl2を含む。
一つの態様において、医薬組成物は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体および塩を含む。一つの態様において、医薬組成物は、塩を含み、塩は、Mg2+、Ba2+、Ca2+、およびSr2+などの二価陽イオンの塩である。一つの態様において、塩は、CaCl2である。一つの態様において、二価陽イオンの濃度は、少なくとも2mMなど、少なくとも5mMなど、少なくとも1mMなど、少なくとも25mMなど、少なくとも50mMなど、少なくとも75mMなど、または少なくとも100mMなど、少なくとも1mMである。
一つの態様において、二価陽イオンの濃度は、多くても150mMなど、多くても100mMなど、たとえば多くても75mMなど、または多くても50mMなど、多くても200mMである。一つの態様において、二価陽イオンの濃度は、5〜150mMなど、10〜100mMなど、5〜75mMなど、または10〜50mMなど、2〜200mMである。
一つの態様において、組成物は、上述のように0.1〜200mg/mlのEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体および陽イオンを含む。一つの態様において、組成物は、1〜50mg/mlなど、2〜25mg/mlなど、0.5〜100mg/mlのEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度は、0.01〜50mMなどのモル濃度で提供される。
本発明の発明者らは、カルシウムを用いて例証される陽イオンの安定化効果は、EGF(A)ペプチド類似体と陽イオンの濃度比に依存すること、したがってモル濃度比を使用してEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の量に対して陽イオンの量を調節することが好ましい。
一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体のモル濃度は、陽イオン濃度の多くても10倍であるべきである。一つの態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体のモル濃度は、陽イオンの濃度と少なくとも等しい。
濃度比は、陽イオンとEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体との濃度が同じであるときに、化合物がEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に対して一（1）当量の陽イオンが含まれるように、等量といわれうる。上述したとおり、陽イオン濃度がEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の少なくとも1/10である場合、陽イオンの少なくとも0.1当量が含まれる。一つの態様において、組成物は、EGF(A)ペプチド、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に対して、少なくとも0.2当量など、少なくとも0.5当量など、少なくとも0.1当量の陽イオンまたは塩を含む。
さらなる態様において、医薬組成物は、少なくとも0.5当量の陽イオンを含む。こうした態様において、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の少なくとも0.5当量の塩が存在してもよい。疑義を避けるために、これは、塩のモル濃度がEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度の少なくとも半分であることを意味する。
一つの態様において、医薬組成物は少なくとも1.0当量のカチオンを含む。さらなる態様において、医薬組成物は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に対して、2当量または3当量など、少なくとも1当量の陽イオンを含む。
さらなる態様において、陽イオンまたは塩の濃度は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の少なくとも6当量など、少なくとも8当量など、または少なくとも10当量など、少なくとも4当量である。一つの態様において、陽イオンまたは塩の濃度は、EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の2〜18当量など、5〜15当量など、1〜20当量である。
当業者であれば、溶媒、希釈剤、緩衝液、防腐剤、張性調節剤、キレート剤、界面活性剤、界面活性剤および／または安定剤などの付加的賦形剤が医薬組成物で使用されうることが分かるであろう。
一つの態様において、本発明は、緩衝液、防腐剤、等張化剤およびキレート剤のうちの一つまたは複数をさらに含む、本明細書に記載したとおりの医薬組成物に関する。
一つの態様において、本発明は、防腐剤、等張化剤およびキレート剤のうちの一つまたは複数をさらに含む、本明細書に記載したとおりの医薬組成物に関する。
一つの態様において、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝液は、酢酸塩、炭素塩、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リン酸塩、リン酸水素、リン酸二水素、HEPESおよびTris(ヒドロキシメチル)-アミノメタン（TRIS）、ビシン、トリシン、コハク酸塩、アスパラギン酸、アスパラギンおよびTris(ヒドロキシメチル)-アスパラギン酸、アスパラギン酸またはそれらの混合物からなる群から選択されうる。
一つの態様において組成物は以下からなる群から選択される緩衝剤を含む:TrisおよびHEPES。一つの態様において、緩衝液は、Tris緩衝液である。一つの態様において、組成物は、5〜50mM Trisである。
一つの態様において、組成物は、pH6〜9など、pH7〜8など、pH7.2〜7.8など、pH7.3〜7.6など、pH7.4など、5〜10のpHを持つ。
本発明のさらなる態様において、製剤は、薬学的に許容される防腐剤をさらに含む。本発明のさらなる態様において、防腐剤は、フェノール、m-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、ベンジルアルコール、クロロブタノール、安息香酸、イミド尿素、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウムまたはそれらの混合物からなる群から選択される。医薬組成物に防腐剤を使用することは、当業者には周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition、1995を参照されたい。
一つの態様において、組成物は、フェノールまたはメタ−クレゾールからなる群から選択される防腐剤を含む。
一つの態様において、防腐剤は、フェノールである。一つの態様において、組成物は、20〜80mMなど、25〜75mMなど、40〜60mMなど、50-70mMなど、10〜100mMのフェノールを含む。
本発明のさらなる態様において、製剤は、等張剤をさらに含む。等張剤は、塩（たとえば、塩化ナトリウム）、単糖類、二糖類もしくは多糖類または水溶性グルカン（たとえば、果糖、ブドウ糖、マンノース、ラクトース、蔗糖、トレハロース、デキストランを含む）などの糖、またはアミノ酸（たとえば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン）、アルジトール（たとえば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール (プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)ポリエチレングリコール（たとえば、PEG400）などの糖アルコール、またはそれらの混合物からなる群から選択されうる。糖アルコールには、たとえばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。
こうしたさらなる態様において、組成物は、プロピレングリコールおよびグリセロールからなる群から選択される等張剤を含む。一つの態様において、安定剤は、プロピレングリコールである。
医薬組成物に等張剤を使用することは、当業者には周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition、1995を参照されたい。
本発明のさらなる態様において、製剤はキレート剤をさらに含む。本発明のさらなる態様において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸、およびアスパラギン酸、EGTAおよびそれらの混合物の塩から選択される。
上述のように、製剤は、安定剤として機能するCa2+などの二価陽イオンを含む塩を含みうる。本発明のさらなる態様において、製剤は、代替的またはさらなる安定剤を含みうる。医薬組成物に安定剤を使用することは、当業者には周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition、1995を参照されたい。
こうしたさらなる態様において、製剤は、高分子量ポリマーおよび低分子量化合物の群から選択される安定剤をさらに含む。
こうしたさらなる態様において、安定剤は、ポリエチレングリコール（たとえば、PEG 3350）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロースまたはその誘導体（たとえば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC）、シクロデキストリン、硫黄含有物質（モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノールなど）および様々な塩（たとえば、塩化ナトリウム）から選択される。
本発明のさらなる態様において、製剤は、界面活性剤をさらに含む。典型的な界面活性剤（商品名の例は、括弧[]内）は、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート［Tween 20］、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノパルミタート［Tween 40］またはポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレアート［Tween 80］などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルや、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン［Pluronic F68/poloxamer 188］、ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル［Triton X-100］またはポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル［Brij 35］などのポロキサマーである。医薬組成物に界面活性剤を使用することは、当業者には周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition、1995を参照されたい。
他の成分が、本発明のペプチド医薬製剤中に存在しうることが可能である。こうした付加的成分には、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性賦形剤、タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（たとえば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンまたはヒスチジンなどのアミノ酸）が含まれうる。
本発明の組成物はさらに、たとえば共有結合的、疎水的または静電気的な相互作用を介して、さらに化合物の安定性を高める、生物学的利用能を増大させる、溶解性を高める、有害影響を減らす、当業者に周知の時間療法を達成する、および患者の服薬遵守を高める、またはそれらの任意の組み合わせのために、薬物担体、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムに配合されうるか、または付着されうる。担体、薬物送達システムおよび高度な薬物送達システムの例には、ポリマー（たとえば、セルロースおよび誘導体）、多糖類（たとえば、デキストランおよび誘導体、デンプンおよび誘導体）、ポリ（ビニルアルコール)、アクリル酸およびメタクリル酸ポリマー、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそのブロック共重合体、ポリエチレングリコール、担体タンパク質（たとえば、アルブミン）、ゲル（たとえば、熱ゲル化システムで、当業者に周知のブロック共重合体システムなど）、ミセル、リポソーム、微小粒子、ナノ粒子、液晶およびその分散、脂質水システムにおける相挙動の技術の当業者に周知のL2相およびその分散、高分子ミセル、多層乳剤（自己乳化、自己マイクロ乳化)、シクロデキストリンおよびその誘導体、並びにデンドリマーが含まれるが、これに限定されない。
一つの態様において、医薬組成物は、非経口投与のためである。非経口投与は、シリンジによって、随意にペン様のシリンジによって皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射により実施されうる。別の方法として、非経口投与は、輸液ポンプによって行うことができる。さらなる選択肢は、鼻スプレーまたは肺スプレーの形態の化合物の投与のための溶液または懸濁液としうる組成物である。
併用療法
本発明によるEGF(A)ペプチド類似体またはその誘導体を用いた治療は、抗糖尿病薬、肥満抑制薬、食欲調整薬、高血圧治療薬、糖尿病に起因または関連する合併症の治療および/または予防のための薬剤、並びに肥満に起因または関連する合併症および障害の治療および/または予防のための薬剤の一つまたは複数の薬理活性物質と組み合わされてもよい。
これらの薬理活性物質の例は、GLP-1受容体作動薬、インスリン、DPP-IV（ジペプチジルペプチダーゼ-IV）阻害剤、アミリン作動薬およびレプチン受容体作動薬である。このような活性物質の特定の例は、GLP-1受容体作動薬リラグルチド、セマグルチドおよびインスリンデグルデクである。
医薬品の適応症
一つの態様において、本発明は、医薬の製造に使用するための、本明細書に記載したとおりのEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体の使用に関する。
本発明はまた、たとえば本発明によるペプチド類似体もしくは誘導体、または医薬として、もしくは医薬の製造で使用するための医薬組成物など、本発明の化合物に関する。
一つの態様において、本発明の化合物またはその組成物は、(i)脂質パラメータの改善（異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下など）；LDL-Cの低下、HDLの増加；小型高密度LDLの低下；VLDLの低下；トリグリセリドの低減；コレステロールの低減；リポタンパク質aの血漿濃度(Lp(a))の低減；アポリポタンパク質A(apo(A))生成の阻害；(ii)心血管疾患（心臓X症候群、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再潅流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患または早期心血管疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および/または慢性心不全、不整脈、心律動異常、失神、狭心症、心臓バイパスおよび/またはステント再閉塞、間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害、および/または収縮不全など）の予防および/または治療；および/または血圧の低下（f収縮期血圧の低下など）；心血管疾患の治療に使用されうる。
本発明はまた、(i)脂質パラメータの改善（異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下など）；LDL-Cの低下、HDLの増加；小型高密度LDL-Cの低下；VLDLの低下；トリグリセリドの低減；コレステロールの低減；リポタンパク質aの血漿濃度(Lp(a))の低減；アポリポタンパク質A(apo(A)) 生成の阻害；(ii)心血管疾患（心臓X症候群、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再潅流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患または早期心血管疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および/または慢性心不全、不整脈、心律動異常、失神、狭心症、心臓バイパスおよび/またはステント再閉塞、間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症)、拡張機能障害、および/または収縮不全など）の予防および/または治療；および/または血圧の低下（f収縮期血圧の低下など）；心血管疾患の治療をするための方法に関し、ここで、本発明による医薬品として有効な量の化合物（ペプチド類似体または本発明による誘導体）が投与される。
本発明のある特定の特徴を本明細書において例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の態様が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
態様
1. 配列番号：1によって定義されるLDL-RのEGF(A)ドメインのEGF(A)ペプチド類似体であって、301Leuを含むペプチド類似体。
2. ペプチド類似体が野生型cys残基297Cys、304Cys、308Cys、317Cys、319Cys、331Cysを含む、態様1に記載のEGF(A)ペプチド類似体。
3. 前記ペプチド類似体が、（野生型）アミノ酸残基295Asn、296Glu、298Leu、302Gly、および310Aspの一つまたは複数を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
4. 前記ペプチド類似体が、位置295にある残基Asn(N)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
5. 前記ペプチド類似体が、位置296にある残基Glu(E)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
6. 前記ペプチド類似体が、位置298にある残基Leu(L)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
7. 前記ペプチド類似体が、位置302にある残基Gly(G)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
8. 前記ペプチド類似体が、位置310にある残基Asp(D)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
9. 前記ペプチド類似体が、位置295（Asn/N）および310（Asp/D）にある野生型残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
10. 前記ペプチドが、配列番号：1と比較して1〜15のアミノ酸置換を有する、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
11. 前記ペプチド類似体が、以下の位置の群から選択される位置にある一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：293、294、296、299、300、303、305、306、309、311、312、313、314、315、316、318、320、321、322、323、324、325、326、328、329、330、332。
12. 前記ペプチド類似体が、以下の位置の群から選択される位置にある一つまたは複数のアミノ酸置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：294、299、300、303、309、 312、313、314、316、318、321、322、323、324、325、326、328、329、330、332。
13. 前記ペプチド類似体が、以下の位置の群から選択される位置にある一つまたは複数のさらなるアミノ酸置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：309、312、313、321、324、328、332。
14. 前記ペプチド類似体が、位置293にあるアミノ酸残基Gly(G)またはAsn(N)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
15. 前記ペプチド類似体が、位置294にあるアミノ酸残基Thr(T)またはGly(G)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
16. ペプチド類似体が、位置299にアミノ酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、 Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)またはTrp(W)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
17. ペプチド類似体が、位置299にアミノ酸残基Asp(D)、Gly(G)、Pro(P)、Arg(R)、Lys(K)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、 Ala(A)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)またはTrp(W)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
18. ペプチド類似体が、位置299にあるアミノ酸残基Asp(D)、Ser(S)、Arg(R)、Leu(L)、Ala(A)、Lys(K)またはTyr(Y)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
19. ペプチド類似体が、位置299にあるアミノ酸残基Asp(D)またはAla(A)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
20. ペプチド類似体が、位置300にあるアミノ酸残基His(H)またはAsn(N)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
21. ペプチド類似体が、位置307にあるアミノ酸残基Val(V)、Ser(S)、Thr(T)またはIle(I)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
22. ペプチド類似体が、位置307にあるアミノ酸残基Val(V)またはIle(I)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
23. ペプチド類似体が、位置307にあるアミノ酸残基Ser(S)、Thr(T)またはIle(I)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
24. ペプチド類似体が、位置307にあるIle(I)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
25. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Asn(N)、Glu(E)、His(H)、Arg(R)、Ser(S)またはLys(K)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
26. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Asn(N)、Arg(R)、Ser(S)またはLys(K)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
27. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Asn(N)、Arg(R)またはSer(S)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
28. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Asn(N)またはArg(R)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
29. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Lys(K)またはArg(R)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
30. ペプチド類似体が、位置309にあるアミノ酸残基Arg(R)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
31. ペプチド類似体が、位置312にあるアミノ酸残基Lys(K)、Glu(E)、Asp(D)、Gln(Q)またはArg(R)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
32. ペプチド類似体が、位置312にあるLys(K)のアミノ酸置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
33. 態様32に記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、312Lysが、以下からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されるもの: 312Gly、312Pro、312Asp、312Glu、312Arg、312His、312Ser、312Thr、312Asn、312Gln、312Ala、312Val、312Ile、312Leu、312Met、312Pheおよび312Tyr。
34. 態様32に記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、312Lysが、以下からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されるもの: 312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ile、312Pheおよび312Tyr。
35. 態様32に記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、312Lysが、以下からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されるもの: 312Asp、312Glu、312Thr、312Asn、312Ileおよび312Phe。
36. 態様32に記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、312Lysが、以下からなる群から選択されるアミノ酸によって置換されるもの: 312Glu、312Asp、312Glnおよび312Arg。
37. ペプチド類似体が、位置321にあるアミノ酸残基Asp(D)、Lys(K)またはGlu(E)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
38. ペプチド類似体が、位置321にあるアミノ酸残基Asp(D)またはGlu(E)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
39. ペプチド類似体が、位置321にあるアミノ酸残基Glu(E)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
40. 前記ペプチド類似体が、位置324にあるアミノ酸残基Gln(Q)またはGly(G)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
41. ペプチド類似体が、位置329にあるアミノ酸残基Arg(R)またはHis(H)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
42. 前記ペプチドが、Glu(E)、Val(V)、またはHis(H)への299Asp(D)の置換を有しない、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
43. ペプチドが、Pro(P)への300Asn(N)の置換を有しない、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
44. ペプチド類似体が、Lysアミノ酸残基を含まない、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
45. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLysアミノ酸残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
46. ペプチド類似体が、Lys置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
47. ペプチド類似体が、位置312にLys置換およびwt Lysを含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
48. ペプチド類似体が、位置312にLys置換および非Lysアミノ酸残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
49. ペプチド類似体が、位置312にLys置換およびアミノ酸残基Lys(K)、Glu(E)、Asp(D)、Gln(Q)またはArg(R)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
50. ペプチド類似体が、位置312にLys置換およびGlu(E)を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
51. ペプチド類似体が、一つまたは複数のLys置換を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
52. 前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、前記ペプチドが、以下を含む、および／または以下のいずれかから構成される少なくとも二つのアミノ酸置換を有するもの：
i. 301Leuおよび309Arg
ii. 301Leu、309Arg、312Glu
iii. 301Leu、307Ileおよび309Arg
iv. 301Leu、307Ile、309Argおよび312Glu
v. 301Leu、309Argおよび321Glu
vi. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Glu
vii. 301Leu、307Ile、309Argおよび299Ala
viii. 301Leu、307Ile、309Arg、299Alaおよび312Glu
ix. 301Leuおよび309Arg並びに少なくとも一つのLys置換
x. 301Leu、309Arg、312Gluおよび少なくとも一つのLys置換
xi. 301Leu、307Ileおよび309Arg並びに少なくとも一つのLys置換
xii. 301Leu、307Ile、309Argおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xiii. 301Leu、309Argおよび321Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xiv. 301Leu、309Arg、321Gluおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換
xv. 301Leu、307Ile、309Argおよび299Ala並びに少なくとも一つのLys置換または
xvi. 301Leu、307Ile、309Arg、299Alaおよび312Glu並びに少なくとも一つのLys置換。
53. 前述の態様1〜51のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、前記ペプチドが、以下を含む、および／または以下のいずれかから構成される少なくとも二つのアミノ酸置換を有するもの：
xvii. 301Leuおよび309Lys
xviii. 301Leu、309Lysおよび312Glu
xix. 301Leuおよび309Lys並びに少なくとも一つのさらなるLys置換または
xx. 301Leu、309Lysおよび312Glu並びに少なくとも一つのさらなるLys置換。
54. 前述の態様1〜51のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体であって、前記ペプチドが、以下を含む、および／または以下のいずれかから構成される少なくとも二つのアミノ酸置換を有するもの：
xxi. 301Leuおよび307Ile
xxii. 301Leu、307Ileおよび312Glu
xxiii. 301Leuおよび307Ile並びに少なくとも一つのさらなるLys置換または
xxiv. 301Leu、3307Ileおよび312Gluおよび少なくとも一つのさらなるLys置換。
55. ペプチド類似体が、N末端および/またはC末端の伸長を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
56. ペプチド類似体が、1〜10のアミノ酸残基のN末端伸長を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
57. ペプチド類似体が、292 Ala(A)または292(K)など位置292のアミノ酸残基のN末端伸長を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
58. ペプチド類似体が、1〜10のアミノ酸残基のC末端伸長を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
59. ペプチド類似体が、333 Ala(A)または333(K)など位置333のアミノ酸残基のC末端伸長を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
60. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
61. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
62. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
63. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
64. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
65. ペプチド類似体が、少なくとも一つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：313Lys、324Lys、328Lysおよび333Lys。
66. ペプチド類似体が、態様60〜66で定義されているいずれかの基のうち二つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
67. ペプチド類似体が、以下から構成される対から選択される二つのLys残基を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
68. 前記ペプチド類似体がN末端またはC末端の切断を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
69. ペプチド類似体が、1〜10のアミノ酸残基のN末端切断を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
70. ペプチド類似体が、少なくとも、または特異的にアミノ酸293Glyを欠損するN末端切断を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
71. ペプチド類似体が、1〜2のアミノ酸残基のC末端切断を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
72. ペプチド類似体が、少なくとも、または特異的にアミノ酸332Gluを欠損するC末端切断を含む、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
73. 前記ペプチド配列が配列番号：2〜114のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
74. 前記ペプチド配列が配列番号：2〜47および49〜114のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
75. 前記ペプチド配列が配列番号：2〜44、46、47および49〜114のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体。
76. 前記ペプチド配列が以下の配列番号：のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：2〜44、46、47、49〜53、55、58〜114。
77. 前記ペプチド配列が以下の配列番号：のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：2〜4、6〜44、46、47、49〜53、55、58〜114。
78. 前記ペプチド配列が以下の配列番号：のいずれか一つにより同定される、前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体：2〜4、6〜19、21〜44、46、47、49〜53、55、58〜114。
79. 前述の態様1〜78のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体を含むEGF(A)化合物。
80. EGF(A)ペプチド類似体および置換基を含むEGF(A)誘導体。
81. EGF(A)誘導体が少なくとも一つの置換基を含む、態様79に記載のEGF(A)誘導体。
82. 置換基が半減期延長置換基である、態様79または81に記載のEGF(A)誘導体。
83. EGF(A)ペプチド類似体が、上記態様1〜78のいずれかと同様に定義される、態様79または82に記載のEGF(A)誘導体。
84. 一つまたは二つの置換基が、前記EGF(A)ペプチド類似体の窒素原子に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
85. 一つまたは二つの置換基が、前記EGF(A)ペプチドのアミノ基に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
86. 一つまたは複数の置換基が、EGF(A)ペプチドのN末端アミノ酸またはLys残基に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
87. 一つまたは二つの置換基が、前記EGF(A)ペプチドのN末端アミノ酸に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
88. 一つまたは二つの置換基が、前記EGF(A)ペプチドのN末端アミノ酸残基のアルファ-窒素に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
89. 一つまたは二つの置換基が、EGF(A)ペプチドのLys残基に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
90. 一つまたは二つの置換基が、EGF(A)ペプチドのLys残基のイプシロン-窒素に付着される、態様79〜83のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
91. EGF(A)誘導体が二つの置換基を含む、態様79〜83に記載のEGF(A)誘導体。
92. 二つの置換基が同一である、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
93. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体の窒素原子に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
94. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体のアミノ基に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
95. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチドのN末端アミノ酸に、およびEGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着される、態様91のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
96. 一つの置換基がEGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸残基のアルファ窒素に付着され、一つの置換基がEGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
97. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体のN末端アミノ酸に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
98. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体のLys残基に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
99. 二つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基のイプシロン窒素に付着される、態様91に記載のEGF(A)誘導体。
100. 一つまたは複数の置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様79〜99のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
101. 一つまたは複数の置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様79〜99のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
102. 一つまたは複数の置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様79〜99のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
103. 置換基が、EGF(A)ペプチド類似体にある312Kに付着される、態様79〜102に記載のEGF(A)誘導体。
10.4 置換基が、EGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様79〜102に記載のEGF(A)誘導体。
105. 誘導体が二つの置換基を含み、一つが置換されたLys残基に付着され、もう一つがEGF(A)ペプチド類似体にある312Kに付着される、態様104に記載のEGF(A)誘導体。
106. 誘導体が二つの置換基を含み、一つが置換されたLys残基に付着され、もう一つがEGF(A)ペプチド類似体にある置換されたLys残基に付着される、態様104および105に記載のEGF(A)誘導体。
107. 一つまたは二つの置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様104〜106のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
108. 一つまたは二つの置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様104〜106のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
109. 一つまたは二つの置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様104〜106のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：292Lys、293Lys、294Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、313Lys、314Lys、316Lys、318Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
110. 一つまたは二つの置換基が、以下から構成される群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体にあるLys残基に付着される、態様104〜106のいずれかに記載のEGF(A)誘導体：313Lys、324Lys、328Lysおよび333Lys。
111. 置換基が、位置295、298、301、302、307および310のいずれかにあるアミノ酸残基を介してEGF(A)ペプチド類似体に付着される、態様79〜109に記載のEGF(A)誘導体。
112. 置換基が、位置295、296、298、301、302、307、310のいずれかにあるアミノ酸残基を介してEGF(A)ペプチド類似体に付着される、態様79〜109に記載のEGF(A)誘導体。
113. 置換基が、Fcドメインではない、態様79〜112に記載のEGF(A)誘導体。
114. 置換基が、EGF(A)ペプチドと融合されていない、態様79〜112に記載のEGF(A)誘導体。
115. EGF(A)誘導体が、少なくとも一つの脂肪酸基を含む、態様79〜114に記載のEGF(A)誘導体。
116. 前記脂肪酸基が、pKaが<7である少なくとも一つの官能基(FG)と、少なくとも8個の連続した-CH2-基を含む炭素鎖とを含む化学基である、態様115に記載のEGF(A)誘導体。
117. 前記脂肪酸基が、カルボン酸、スルホン酸、テトラゾール部分、メチルスルホニルカルバモイルアミノ部分、または3-ヒドロキシ-イソオキサゾール部分から選択される官能基を含む、態様115に記載のEGF(A)誘導体。
118. 前記置換基が、カルボン酸、スルホン酸、テトラゾール部分、メチルスルホニルカルバモイルアミノ部分、または連続的な8〜20個の連続した-CH2-基を含むヒドロキシイソキサゾール3-ヒドロキシイソオキサゾール部分を含む、態様115に記載のEGF(A)誘導体。
119. 前記置換基が式I:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I]を有する、態様115に記載のEGF(A)誘導体
（式中、
Z1は、以下から選択される:
化学物質1：HOOC-(CH2)n-CO-*、
化学物質2:テトラゾリル-(CH2)n-CO-*、
化学物質3：HOOC-(C6H4)-O-(CH2)m-CO-*、
化学物質4: HOS(O)2-(CH2)n-CO-*、
化学物質5：MeS(O)2NH(CO)NH-(CH2)n-CO-*および
化学物質6：3-HO-イソオキサゾール-(CH2)n-CO-*
式中、
nは、8〜20の範囲の整数であり、
mは、8、〜11の範囲の整数であり、
化学物質3の-COOH基は、フェニル環上の位置2、3または4に付着されてもよく、
記号*は、Z2にある窒素への付着点を示すか、またはZ2が結合である場合には隣接するZ要素上の窒素への付着点を示す。
Z2は、以下から選択される:
化学物質7: *-NH-SO2-(CH2)3-CO-*、
化学物質8：*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*および
結合；
Z3は、以下から選択される:
γGlu、Glu、および結合；
Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9 以下から互いに独立して選択される。
Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep、TtdSucおよび結合；
Z10は、以下から選択される:
化学物質7: *-NH-CH2-(C6H4)-CH2-*および結合。）
120. 態様119に記載のEGF(A)誘導体、（式中、
γGluは、式化学物質9: *NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*、
TtdSucは、式化学物質10: *NH-CH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CH2NHCO*、
Adoは、式化学物質11: *NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*、
Aeepは、式化学物質12 *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*、および
Aeeepは、式化学物質13 *NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*である。）
121. 前記置換基が式I:
Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10- [I]を有する、態様119に記載のEGF(A)誘導体、
（式中、
Z1は、以下から選択される:
化学物質1b:
化学物質2b:
化学物質3b：
化学物質4b:
化学物質5b
および
化学物質6b
式中、
化学物質1b、2b、4b、5b、または6bのnは、8〜20の範囲の整数であり、
化学物質3のmは、8〜11の範囲の整数であり、化学物質3bの-COOH基は、フェニル環上の位置2、3または4に付着されてもよく、
記号*は、Z2にある窒素への付着点を示すか、または、Z2が結合である場合には隣接するZ要素上の窒素への付着点を示す。
Z2は、以下から選択される:
化学物質7b:
化学物質8b:
および
結合；
Z3は、以下から選択される:
γGlu、Glu、および結合；
Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9は、以下から互いに独立して選択される。
Glu、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、TtdSuc、および結合；
Z10は、以下から選択される:
化学物質14b
および結合；
ただし、
Z10が化学物質14bのとき、前記置換基は前記ペプチドのN末端アミノ基のアルファ窒素に付着される。
Z10は結合であるとき、前記置換基は、前記ペプチド中に存在するLys残基のイプシロン位置に、または前記ペプチドのN末端アミノ酸残基のアルファ窒素に付着される、
ことを条件とする。）
122. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質1b:
であり、式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
123. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質2b:
であり、式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
124. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質4b:
であり、式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
125. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質5b:
であり、式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
126. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質6b:
であり、式中、nは8〜20の範囲の整数である。）
127. 態様119に記載のEGF(A)誘導体（式中、Z1は、式
化学物質3b:
であり、式中、nは8〜11の範囲の整数である。）
128. mが8、9、10または11である、態様127に記載のEGF(A)誘導体。
129. mが10または11である、態様127に記載のEGF(A)誘導体。
130. nが10〜18、10〜14、15〜18、8〜15または16〜20の範囲内である、態様122〜126のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
131. nが8、9、10、11または12である、態様122〜126のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
132. nが13、14、15または16である、態様122〜126のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
133. nが14、15、16、17または18である、態様122〜126のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
134. nが17、18、19または20である、態様122〜126のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
135. 態様119および134のいずれかに記載のEGF(A)誘導体であって、Z2が化学物質7または化学物質7bおよびZであり、Z3はγGlu、Glu、および結合から選択される。
136. 態様119および134のいずれかに記載のEGF(A)誘導体であって、Z2が化学物質8または化学物質8bであり、Z3はγGlu、Glu、および結合から選択される。
137. 前記誘導体が、以下から構成される群から選択される一つまたは二つの置換基を有する、態様119および136のうちいずれかに記載のEGF(A)誘導体
138. EGF(A)誘導体が、以下から構成されるEGF(A)誘導体の群から選択される、態様79に記載のEGF(A)誘導体：実施例化合物1〜47、51〜102および106〜159。
139. EGF(A)誘導体が、以下から構成されるEGF(A)誘導体の群から選択される、態様79に記載のEGF(A)誘導体：実施例化合物1〜44、46〜47、51〜55、57、60〜64、66〜69、71〜102および106〜159。
140. EGF(A)誘導体が、実施例化合物31、95、128、133、143、144、150、151、152および153から構成されるEGF(A)誘導体の群から選択される、態様79に記載のEGF(A)誘導体。
141. EGF(A)誘導体が、実施例1〜47、51〜102および106〜159から構成されるEGF(A)誘導体の群から個別に選択される、態様79に記載のEGF(A)誘導体。
142. ペプチドまたは誘導体がPCSK9阻害剤である、前述の態様のいずれかによるEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体。
143. PCSK9阻害剤が、ヒト低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）へのPCSK9の結合を阻害する能力を有する、態様137に記載のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体。
144. PCSK9阻害剤が、ヒト低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）へのPCSK9の結合を減少させる、態様137に記載のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体。
145. PCSK9阻害剤が、競合ELISA法で測定して8nM、6nM、5nM、4nM、3nM未満など、または2nM未満など、10nM未満のみかけの結合親和性（Ki）を有する、態様137に記載のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体。
146. PCSK9阻害剤が、D1.1で説明した競合ELISA法で測定して8nM、6nM、5nM、4nM、3nM未満など、または2nM未満など、10nM未満のみかけの結合親和性（Ki）を有する、態様137に記載のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体。
147. 誘導体が、マウスにおいて8時間超など、または10時間超など、6時間超の半減期を有する、上記態様のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。誘導体が、イヌにおいて100時間など、または150時間など、50時間超の半減期を有する、上記態様のいずれかに記載のEGF(A)誘導体。
148. 医薬として使用するための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体。
149. 治療方法において使用するための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体。
150. 心血管疾患の治療の方法または予防において使用するための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体。
151. 脂質パラメータを改善するための方法において使用するための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体。
152. 以下に挙げる治療の方法において使用するための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体、
i.異脂肪血症の予防および／または治療、総血清脂質の低減、HDL-Cの増加、LDL-Cの低減、小型高密度LDL-Cの低減、VLDL-Cの低減、トリグリセリドの低減、コレステロールの低減、リポタンパク質aの血漿濃度 (Lp(a))の低減またはアポリポタンパク質A(apo(A))の生成の阻害など、脂質パラメータの改善；
ii.心臓X症候群、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再潅流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患または早期心血管疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および/または慢性心不全、不整脈、心律動異常、失神、狭心症、心臓バイパス手術および／またはステント再閉塞、間欠性跛行（閉塞性動脈硬化症）、拡張機能障害、および／または収縮不全など、心血管疾患の防止および／または治療；並びに／または収縮期血圧の低下などの血圧の低下；心血管性疾患の治療。
153. 以下のための、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の使用、
i.異脂肪血症の予防および／または治療、総血清脂質の低減、HDLの増加、LDL-Cの低減、小型高密度LDL-Cの低減、VLDL-C、非HDL-Cの低減、トリグリセリドの低減、コレステロールの低減、リポタンパク質aの血漿濃度(Lp(a))の低減、アポリポタンパク質A(apo(A))の生成の阻害など、脂質パラメータの改善；
ii.心臓X症候群、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再潅流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患または早期心血管疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および/または慢性心不全、不整脈、心律動異常、失神、狭心症、心臓バイパス手術および／またはステント再閉塞、間欠性跛行（閉塞性動脈硬化症）、拡張機能障害、および／または収縮不全など、心血管疾患の防止および／または治療；並びに／または収縮期血圧の低下などの血圧の低下；心血管性疾患の治療。
154. 前述の態様のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む医薬組成物、および医薬品として容認できる賦形剤。
155. 前記組成物が液体製剤である、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む、態様154に記載の医薬組成物。
156. 組成物が二価陽イオンである、前述の態様1〜147のいずれかに記載のEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を含む、態様154または155に記載の医薬組成物。
157. 組成物が、以下の群から選択される二価陽イオンである、態様156に記載の医薬組成物：Mg2+、Ba2+、Ca2+、およびSr2+。
158. 組成物が、二価陽イオンの塩を含む、態様156に記載の医薬組成物。
159. 組成物が、以下の群から選択される二価陽イオンの塩を含む、態様156に記載の医薬組成物：Mg2+、Ba2+、Ca2+、およびSr2+。
160. 組成物が、カルシウムイオン（Ca2+）を含む、態様156に記載の医薬組成物。
161. 組成物が、カルシウム塩（Ca2+）を含む、態様156に記載の医薬組成物。
162. 組成物が、リン酸塩、酢酸塩または塩化物をさらに含む、態様156に記載の医薬組成物。
163. 組成物が、以下の群から選択されるカルシウム塩を含む、態様156に記載の医薬組成物：CaCl2およびCa(OAc)2。
164. 組成物が、CaCl2を含む、態様156に記載の医薬組成物。
165. 前記組成物が、少なくとも3mMなど、少なくとも4mMなど、少なくとも5mMなど、少なくとも10mMなど、少なくとも25mMなど、少なくとも50mMなど、少なくとも75mMなど、または少なくとも100mMなど、少なくとも2mMの前記二価陽イオンを含む、態様156〜164のいずれかに記載の医薬組成物。
166. 前記組成物が、多くても100mMなど、または多くても50mMなど、多くても200mMの前記二価陽イオンを含む、態様156〜164に記載の医薬組成物。
167. 前記組成物が、2〜100mMなど、5〜75mMなど、または10〜50mMなど、1〜200mMの前記二価陽イオンを含む、態様156〜164に記載の医薬組成物。
168. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度が0.1〜200 mg/mlである、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
169. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度が0.01〜50 mMである、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
170. EGF(A)ペプチド類似体のモル比が、多くても2である、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
171. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の陽イオンまたは塩のモル比が、少なくとも0.2など、少なくとも0.5など、少なくとも0.1である、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
172. 組成物が、 EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に関連する陽イオンまたは塩の、少なくとも0.2など、少なくとも0.5など、少なくとも0.1当量を含む、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
173. 組成物が、 EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に関連する陽イオンまたは塩の、少なくとも4など、少なくとも6など、少なくとも2当量を含む、態様156〜167のいずれかに記載の医薬組成物。
174. 緩衝液、防腐剤、等張化剤およびキレート剤のうちの一つまたは複数をさらに含む、態様156〜173のいずれかに記載の医薬組成物。
175. 組成物が、緩衝剤を含む、態様174に記載の医薬組成物。
176. 組成物が、以下からなる群から選択される緩衝剤を含む、態様174に記載の医薬組成物：TrisおよびHEPES。
177. 組成物が、Tris緩衝液を含む、態様174に記載の医薬組成物。
178. 組成物が、5〜50mMのTrisを含む、態様174に記載の医薬組成物。
179. 組成物が、防腐剤を含む、態様174-0に記載の医薬組成物。
180. 組成物が、フェノールまたはメタクレゾールからなる群から選択される防腐剤を含む、態様179に記載の医薬組成物。
181. 組成物が、フェノールを含む、態様179に記載の医薬組成物。
182. 組成物が、58mMのフェノールを含む、態様179に記載の医薬組成物。
183. 組成物が、等張剤を含む、態様174〜182に記載の医薬組成物。
184. 組成物が、安定化剤を含む、態様174〜183に記載の医薬組成物。
185. 組成物が、プロピレングリコールおよびグリセロールグリセロールからなる群から選択される安定化剤を含む、態様184に記載の医薬組成物。
186. 組成物が、プロピレングリコールを含む、態様184に記載の医薬組成物。
187. 前記組成物が、6〜9など、7〜8など、7.2〜7.8など、7.3〜7.6など、およそ7.4など、5〜10のpHを有する、態様174〜0のいずれかに記載の医薬組成物。
188. 皮下投与のための態様154〜187のいずれかに記載の医薬組成物。
189. 経口投与のための態様154のいずれかに記載の医薬組成物。
190. 態様1〜147のいずれかに記載されている医薬品として有効な量のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体、または態様154〜189のいずれかに記載されている医薬品として有効な量の医薬組成物を投与する工程を含む、脂質パラメータを改善する方法。
191. 態様1〜147のいずれかに記載されている医薬品として有効な量のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体、または 態様154〜189のいずれかに記載されている医薬品として有効な量の医薬組成物を投与する工程を含む、脂質パラメータを改善する方法であって、ここで、脂質パラメータの改善が、異脂肪血症の予防および／または治療、総血清脂質の低減、HDLの増加、LDL-Cの低減、小型高密度LDL-C（Lp(a)）の低減、VLDL-Cの低減、非HDL-C、トリグリセリドの低減、コレステロールの低減、リポタンパク質aの血漿濃度の低下、アポリポタンパク質A（apo(A)）の生成の阻害などである、方法。
192. 態様1〜147のいずれかに記載されている医薬品として有効な量のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体、または 態様154〜189のいずれかに記載されている医薬品として有効な量の医薬組成物を投与する工程を含む、心血管疾患を予防および／または治療する方法。
193. 態様1〜147のいずれかに記載されている医薬品として有効な量のEGF(A)ペプチド類似体またはEGF(A)誘導体、または 態様154〜189のいずれかに記載されている医薬品として有効な量の医薬組成物を投与する工程を含む、心血管疾患を予防および／または治療する方法であって、ここで、心血管疾患が、心臓X症候群、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再潅流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心疾患または早期心血管疾患、左室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧、急性高血圧性緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および/または慢性心不全、不整脈、心律動異常、失神、狭心症、心臓バイパス手術および／またはステント再閉塞、間欠性跛行（閉塞性動脈硬化症）、拡張機能障害、および／または収縮不全など、心血管疾患の防止および／または治療；並びに／または収縮期血圧の低下などの血圧の低下；心血管性疾患の治療である、方法。
194. EGF(A)ペプチド類似体が生成され、かつ随意に少なくとも一つの置換基と連結される、前述の態様1〜147のいずれかによるEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を製造する方法。
195. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体が、少なくとも一つの工程で、カルシウムイオンなどの二価陽イオンの存在下で処理される、態様194に記載の方法。
196. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体が精製される、態様194または195に記載の方法。
197. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の精製がカルシウムイオンの存在下で実施される、態様196に記載の方法。
198. 前記精製が、5〜8のpHなど、4を超えるpHで実施される、前述の態様196〜197のいずれかに記載の方法。
199. 精製中のカルシウム濃度が、少なくとも7mM、少なくとも10mMなど、5mMを超える、前述の態様196〜198のいずれかに記載の方法。
200. EGF(A)ペプチド類似体が精製される、前述の態様196〜199のいずれかに記載の方法。
201. 方法が、EGF(A)ペプチド類似体への少なくとも一つの置換基の付着によってEGF(A)誘導体を製造するためのものである、態様194に記載の方法。
202. EGF(A)ペプチド類似体への少なくとも一つの置換基の取付けがカルシウムイオンの存在下で実施される、態様201に記載の方法。
203. 前記方法が、pHが9を超えるなど、10を超えるなど、または11を超えるなど、8を超える方法工程を含む、態様194〜202のいずれかに記載の方法。
204. 前記方法が、pHが9を超えるなど、10を超えるなど、または11を超えるなど、8を超える方法工程が、カルシウムイオンの存在下で実施される、態様194〜202のいずれかに記載の方法。
205. 少なくとも一つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体のリジン残基のアシル化によって付着される、態様201〜204のいずれかに記載の方法。
206. 少なくとも一つの置換基が、EGF(A)ペプチド類似体のリジン残基のアシル化によって付着され、かつ前記アシル化がカルシウムイオンの存在下で実施される、態様201〜204のいずれかに記載の方法。
207. 少なくとも一つの置換基が、9を超えるなど、10を超えるなど、または11を超えるなど、8を超えるpHでのEGF(A)ペプチド類似体のリジン残基のアシル化によって付着され、かつ前記アシル化がカルシウムイオンの存在下で実施される、態様201〜204のいずれかに記載の方法。
208. EGF(A)ペプチド類似体が組換えにより産生される、態様194〜207のいずれかに記載の方法。
209. EGF(A)ペプチド類似体が合成的な方法により産生される、態様194〜207のいずれかに記載の方法。
210. EGF(A)誘導体を製造する方法であって、
i. EGF(A)ペプチド類似体を提供する工程
ii. 少なくとも一つの置換基を提供する工程
iii. 前記少なくとも一つの置換基を、カルシウムイオンの存在下で、EGF(A)ペプチド類似体に付着させる工程、および
iv. EGF(A)誘導体を取得する工程を含む、方法。
211. EGF(A)誘導体を製造する方法であって、
i. EGF(A)ペプチド類似体を提供する工程と、
ii. 少なくとも一つの置換基を提供する工程
iii. 前記EGF(A)ペプチド類似体および前記置換基をカルシウムイオンの存在下で反応させる工程、および
iv. EGF(A)誘導体を取得する工程を含む、方法。
212. 方法が、水溶液などの溶液で実施される、態様201〜211のいずれかに記載の方法。
213. EGF(A)ペプチド類似体への少なくとも一つの置換基の付着が、水溶液中など、溶液中で実施される、態様201〜211に記載の方法。
214. EGF(A)ペプチド類似体の製造がカルシウムイオンを含む、態様201〜211のいずれかに記載の方法。
215. カルシウムがカルシウム塩（CaCl2など）として供給される、態様201〜214のいずれかに記載の方法。
216. カルシウムイオンの濃度が、少なくとも7mMなど、少なくとも10mMなど、少なくとも20mMなど、少なくとも25mMなど、5mMを超える、前述の態様201〜215のいずれかに記載の方法。
217. EGF(A)ペプチド類似体の濃度に対するカルシウムイオンの濃度比が、少なくとも1など、たとえば少なくとも2など、たとえば少なくとも3など、少なくとも4など、少なくとも0.5である、態様201〜215のいずれかに記載の方法。
218. カルシウムイオンの濃度が、EGF(A)ペプチド類似体の濃度の少なくとも1など、少なくとも2など、少なくとも3など、少なくとも4など、少なくとも0.5当量である、態様201〜215のいずれかに記載の方法。
219 カルシウムイオンの濃度が、EGF(A)ペプチド類似体の濃度の当量が1.0〜40など、2.0〜30など、5.0〜25など、0.5〜50当量である、態様201〜215のいずれかに記載の方法。
220. 少なくとも一つの置換基が、リジン残基を介してEGF(A)ペプチド類似体に付着される、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
221. 少なくとも一つの置換基が、リジン残基を介して、そのイプシロンアミノ基によってEGF(A)ペプチド類似体に付着される、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
222. EGF(A)ペプチド類似体のpHがNaOHと共に増加する、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
223. EGF(A)ペプチド類似体の製造のpHがNaOHと共に11を超えるなど、10を超えて増加する、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
224. EGF(A)ペプチド類似体を含む溶液のpHがNaOHと共に増加する、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
225. EGF(A)ペプチド類似体を含む溶液のpHがNaOHと共に11を超えるなど、10を超えて増加する、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
226. N-メチルピロリジノンが、置換基をEGF(A)ペプチド類似体に付着させる工程に含まれる、態様201〜225のいずれかに記載の方法。
227. N-メチルピロリジノンが、EGF(A)ペプチド類似体の製造に含まれる、および／または置換基と共に含まれる、態様226のいずれかに記載の方法。
228. N-メチルピロリジノンが、EGF(A)ペプチド類似体の製造に含まれる、態様226に記載の方法。
229. N-メチルピロリジノンが、置換基と共に含まれる、態様226に記載の方法。
230. 方法が、取得したEGF(A)誘導体を中和する工程を含む、態様201〜229のいずれかに記載の方法。
231. 酸が取得したEGF(A)誘導体に加えられる、態様230に記載の方法。
232. トリフルオロ酢酸が取得したEGF(A)誘導体に加えられる、態様230に記載の方法。
この実験部分は、略語のリストで始まり、その後に本発明の類似体および誘導体を合成および特徴付けるための一般的な方法を含む節が続く。次に、類似体および誘導体を含む、本発明の具体的EGF(A)化合物の製造に関連する多数の実施例が続き、最後にこれらの化合物の活性および特性に関連して多数の実施例が含まれている（薬理学的方法という見出しの節）。
実施例は、本発明を例証する役割を果たす。
略語リスト
AcOH: 酢酸
Ado: 8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
Aeep: 9-アミノ-4,7-ジオキサノナン酸
Aeeep: 12-アミノ-4,7,10-トリオキサ-ドデカン酸
Alloc: アリルオキシカルボニル
API: 医薬品有効成分
AUC: 曲線下面積
BG: 血糖
Boc: t-ブチルオキシカルボニル
bs: 太い一重線
BSA: ウシ血清アルブミン
CLND: 化学発光窒素検出
Clt: 2-クロロトリチル
コリジン: 2,4,6-トリメチルピリジン
d: 二重線
DCC N,N-ジシクリオヘキシルカルボジイミド
DCM: ジクロロメタン
Dde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC: ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: 4-ジメチルアミノピリジン
DMF ジメチルホルムアミド
DMSO: ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイトール
EDC・HCl N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩
EDT 1,2-エタンチオール
EGF: 上皮細胞増殖因子様
EGF(A): 上皮細胞増殖因子様ドメインA
F（表5）: 生物学的利用能
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HDL: 高密度リポタンパク質
HEPES: 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
hPCSK9: ヒトPCSK9
HPLC： 高速液体クロマトグラフィー
h: 時間
HSA: ヒト血清アルブミン
IC50: 半数阻害濃度
Inp: イソニペコチン酸
IPA イソプロピルアルコール
i.v. 静脈内
ivDde: 1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
LCMS: 液体クロマトグラフィー質量分析
LDL-RまたはLDLr: LDL受容体
LDL: 低密度リポタンパク質
LDL-C: LDLコレステロール
m: 多重線
MeOH: メタノール
min: 分
Mmt: 4-メトキシトリチル
Mtt: 4-メチルトリチル
MRT: 平均滞留時間
MSU: メチルスルホニルカルバモイルアミノ
MQ milliQ 水
NMP: N-メチルピロリドン
OBz: ベンゾイルエステル
OSu: O-スクシンイミジルエステル（ヒドロキシスクシンイミドエステル）
OtBu: tertブチルエステル
Oxyma Pure（登録商標）: シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS: リン酸緩衝食塩水
PD: 薬力学的
PK: 薬物動態学的
quint: 五重線
QC: 品質管理
RP: 逆相
RP-HPLC: 逆相高速液体クロマトグラフィー
RT: 室温
Rt: 保持時間
s: 一重線
s.c.: 皮下
SD: 標準偏差
SEM: 標準誤差
SPPS: 固相ペプチド合成
t: 三重線
tBu: tert.ブチル
TCTU O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-yl)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム
TFA: トリフルオロ酢酸
THA-SBA-OH 4-(N-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイル)スルファモイル)ブタン酸
TISまたはTIPS: トリイソプロピルシラン
Tmax: Cmaxに到達するまでの時間
Tris: Tris(ヒドロキシメチル)-アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt: トリフェニルメチル（トリチル）
Trx: トラネキサム酸
UPLC: 超高性能液体クロマトグラフィー
TBS-T: Tris緩衝化生理食塩水
化学的方法
この節は、本発明の化合物の一般的製造方法に関連する節Aと、本発明の多数の具体的な化合物の製造に関連する節Bと、本発明の化合物の検出および特徴付けの方法および多数の具体的な実施例化合物の結果に関連する節Cの三つに分割される。
A.製造方法
本発明の化合物は、当該技術において周知の方法によって、並びに下記に説明され、および節Bで特定したとおりに製造されてもよい。
ペプチド、すなわち配列番号：1またはその類似体のEGF(A)ペプチドの製造:SPPS一般的方法:
使用したFmoc保護アミノ酸は、次の標準的に推奨されるものである:たとえばAnaspec、Bachem、Iris BiotechまたはNovabiochem から供給される、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OHおよびFmoc-Lys(Mtt)-OHまたはFmoc-Lys(Alloc)-OH。SPPSは、Protein Technologies（米国アリゾナ州ツーソン85714）製のPrelude Solid Phase Peptide Synthesizer（Prelude固相ペプチドシンセサイザー）上でのFmocベースの化学を使用して実施されうる。C末端カルボン酸を製造するための適切な樹脂は、Fmoc-Glu(tBu)-Wang resin (Low Load、0.35mmol/g)などのアミノ酸を用いたWang樹脂である。置換基がC末端リジンに付着されている場合、適切な樹脂は予め充填されたFmoc-Lys(Mtt)-Wangである。C末端ペプチドアミドの製造に適した樹脂は、H-Rink Amide-ChemMatrix樹脂（たとえば、0.52nmol/g）またはRink Amide AMポリスチレン樹脂（Novabiochem、たとえば0.62mmol/gなど）等である。Fmoc-脱保護は、20%ピペリジンのNMP溶液で達成される。ペプチドカップリングは、DIG/HOAt/コリジンまたはDIC/Oxyma Pureのいずれかをコリジンの有無、事前活性化の有無において使用して、またはたとえばカップリング中のHisのエピマー化（epimization of eg.His)の抑制のためのDEPBt(3-(ジエトキシホスホリルオキシ)-1,2,3-ベンゾトリアジン-4(3H)-オン) /DIPEAを使用して実施される。アミノ酸／HOAtまたはアミノ酸/Oxyma Pure溶液（3〜10倍モル過剰の0.3M/0.3M NMP）を樹脂に加え、その後、同じモル当量のDIC（NMP）を加え、その後、コリジンを（3MのNMP溶液）を加える。たとえば、以下の量の0.3Mアミノ酸／HOAt溶液を、以下のスケール反応の結合にしたがって使用することができる：スケール/mL、0.05mmol/1.5mL、0.10mmol/3.0mL、0.25mmol/7.5mL。
Fmoc-Lys(Mtt)-OHを使用する場合、HFIP/DCM（75:25）（2×2分）を用いて樹脂を洗浄し、DCMで洗浄し、HFIP／DCM（75:25）（2×20分）中に樹脂を懸濁させ、その後で洗浄を行うと、置換基をリジン部分のイプシロン位置に導入されうる。
Fmoc-Lys(Alloc)-OHを使用する場合、一つまたは複数の補足剤（たとえば、モルホリン（6.0当量）および／またはジメチルボラン錯体（18.0当量）（30分）の組み合わせの存在下で、樹脂をPd(PPh3)4（0.02当量）で処理することによってAlloc基を取り除くことができる。次に、樹脂をMeOH、NMPまたはDMFおよびIPA（イソプロピルアルコール）でそれぞれ洗浄すると、置換基がリジン部分のイプシロン位置に導入されうる。
置換基の付着（アシル化―合成中）
置換基は、上述の標準アミノ酸などの適切に保護された構成ブロック、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸またはFmoc-Glu-OtBuを使用して、上述のPreludeペプチド合成装置によって段階的手順で導入することができる。置換基の導入は、オクタデカン二酸モノ−tert−ブチル−エステルなどの構成ブロックを使用して達成することができる。毎回のカップリング工程後、未反応のペプチド中間体は、過剰な無水酢酸およびコリジン（>10当量）を用いてキャップされうる。
リジンのイプシロン窒素に対する置換基の導入は、Mtt (Fmoc-Lys(Mtt)-OH)、Alloc (Fmoc-Lys(Alloc)-OH)、またはivDde基 (Fmoc-Lys(ivDde)-OH)で保護されたリジンを使用して達成される。置換基へのγGlu部分の導入は、アミノ酸Fmoc-Glu-OtBuと結合することによって達成されうる。
置換基内の各部分の導入は、長時間のカップリング時間（1×6時間）を使用した後、無水酢酸またはあるいは酢酸／DIC／HOAt／コリジンを用いてキャップすることで、達成されうる。
樹脂からの切断
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、ペプチドをTFA/TIPS/水（95/2.5/2.5）またはTFA/EDT（1,2-エタンジチオール）/水（90/5/5）を用いて2〜3時間処理して切断し、その後で、Et2O（ジエチルエーテル）で沈殿させた。沈殿物をEt2Oで洗浄する。
酸化的フォールディング
上記の工程から沈殿物をDMSOに溶解させ、以下からなる溶液に添加する:
50mM TRIS
5mM CaCl2
3mM システイン
0.3mM シスチン
MQ水では、pH8〜8.8
反応混合物は、室温で、またはLCMSが完全な反応を示すまで一晩保持される。
精製および定量
粗製ペプチド（誘導体）をTFAでpH2〜3に酸性化させ、C8-またはC18-シリカゲルを含むカラムでの逆相分取HPLC（Waters Delptrep 4000またはGilson）によって精製する。溶出は、0.1%TFAを含むMeCN水溶液の勾配を増加させることで実施される。関連する画分は、分析HPLCまたはUPLCによってチェックする。純粋な標的ペプチド誘導体を含む画分を混合する。たとえば0.05M NH4HCO3を含む別の勾配を使用して、さらなる精製工程を導入してもよい。得られた溶液を分析（HPLC、LCMS）し、生成物（すなわち、誘導体）を化学発光窒素特異的HPLC検出器（Antek 8060 HPLC-CLND）を用いて、または280 nmでのUV吸収を測定することにより定量化する。生成物をガラスバイアルに分注する。バイアルをミリ細孔グラスファイバー前置フィルターでキャップする。凍結乾燥法により、ペプチドトリフルオロ酢酸が白色の固形物として得られる。
ペプチド、すなわち配列番号：1またはその類似体のEGF(A)ペプチドの製造: 組換えの一般的方法:
EGF(A)ペプチド類似体は、あるいは、当該技術分野で周知の組み換え方法によって生成され、一つまたは複数のカラムクロマトグラフィー工程、すなわち陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製されうる。このような方法で生成された材料は、いくつかのアイソフォームと発現に関連した不純物を含みうる。アシル化のためのバックボーンとしてEGF(A)ペプチド類似体の使用を可能にするために、さらなる精製工程を使用して、高い純度の、典型的には>90%の主要アイソフォームを含有する材料を提供することができる。
置換基の付着（還元的アルキル化―N末端）
精製されたペプチド類似体は、アルデヒド官能性を用いて誘導体化された適切なアルブミン結合置換基を用いて、還元的アルキル化に供することができる。
ペプチド類似体をクエン酸pH=5.5に溶解して、適切なアルデヒドを、溶解性を増加させるためのシクロデキストリンを含みうる水に溶解される。MeOHに溶解したボランピリジン錯体などの還元剤を加え、混合物を一晩穏やかに振とうさせる。収率を最適にするために、過剰なアルデヒドおよび還元剤のその後の添加が要求されることがある。混合物は、上述の手順を使用して精製される。
置換基の付着（Lysによるアシル化―溶液中）
精製されたペプチド類似体は、ペプチドバックボーンを置換基と高いpHで反応させる方法に供することができ、それによってLys残基の選択的置換が得られる。反応は、N-メチルピロリジノンを含み、pHが10.5〜12に達するまで水酸化ナトリウムを添加する。アシル化試薬を水またはN-メチルピロリジノンに溶解してもよい。反応混合物は、トリフルオロ酢酸を滴下することによって中和される。
B. 本発明の化合物の製造
本発明の化合物は、以下に記述する一般的な方法と本質的に違いのない方法によって製造した。
方法A
LDL-R(293-332)ペプチド類似体の合成（置換基なし）
使用したFmoc保護アミノ酸は、次の標準的に推奨されるものである:たとえばAnaspec、Bachem、Iris Biotech、またはNovabiochem Biotechから供給される、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(BOC)-OH、BOC-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(BOC)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OHおよびFmoc-Lys(Mtt)-OH。SPPSは、Protein Technologies（米国アリゾナ州ツーソン85714）製のPrelude Solid Phase Peptide Synthesizer（Prelude固相ペプチドシンセサイザー）上でのFmocベースの化学を使用して実施した。Fmoc-Glu(tBu)-Wang 樹脂（低荷重、0.35mmol/g）など、アミノ酸を予め含んだWang樹脂を使用した。Fmoc-脱保護は、20%ピペリジンのNMP溶液で達成した。ペプチドカップリングは、DIC/Oxyma Pureをコリジンと共に使用して実施した。アミノ酸／Oxyma Pure溶液（3〜10倍モル過剰の0.3M/0.3M DMF溶液）を樹脂に加え、その後、同じモル当量のDIC（NMP）を加え、その後、コリジン（3MのNMP溶液）を加えた。
樹脂からの切断
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIPS/DTT/水（92.5/2.5/2.5/2.5）を用いて2〜3時間処理してペプチドを切断し、その後ジエチルエーテルで沈殿させた。その後、沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した。
酸化的折り畳み
上記の工程からの沈殿物をDMSOに溶解し、以下からなる溶液に加えた:
50mM TRIS
5mM CaCl2
3mM システイン
0.3mM シスチン
MQ水溶液、pH8.0〜8.8
反応混合物を室温で、またはLCMSが完全な反応を示すまで一晩保持した。
精製および定量
粗製ペプチドをTFAでpH2〜3に酸性化して、C8-またはC18-シリカゲルを含むカラムでの逆相分取HPLC（Waters Delptrep 4000またはGilson）によって精製した。溶出は、0.1%TFAを含むMeCN水溶液の勾配を増加させることで実施した。関連する画分をUPLCを使用して分析した。純粋な標的ペプチドを含む画分をプールした。得られた溶液を分析（UPLC、LCMS）し、ペプチド誘導体を、化学発光窒素特異的HPLC検出器（Antek 8060 HPLC-CLND）を用いて、または280nmでのUV吸収を測定することにより定量化した。生成物をガラスバイアルに分注した。バイアルをミリ細孔グラスファイバー前置フィルターでキャップした。凍結乾燥法により、ペプチドのトリフルオロ酢酸塩が白色の固形物として得られた。
方法B
LDL-R(293-332)EGF(A)類似体の誘導体の（置換基との）合成（樹脂上）
樹脂結合型EGF(A)ペプチドの合成は、上述したとおりである。
配列のN末端におけるリジンのイプシロン窒素での置換基の導入は、BOC-Lys(Fmoc)-OHを使用して達成した。N末端アミノ酸のアルファ位置での置換基の導入は、標準Fmoc保護アミノ酸（すなわちFmoc-Gly-OH）を使用して達成した。
他の位置におけるリジンのイプシロン窒素での置換基の導入のために、Fmoc-Lys(Mtt)-OHを使用した。Mtt基をHFIP／DCM（75:25）（2×2分）で処理して除去し、その後DCMで洗浄した。次に、樹脂をHFIP／DCM（75:25）（2×20分、または2×30分）中に再懸濁し、その後で置換基で洗浄すると、リジン部分のイプシロン位置に置換基が導入された。
置換基の部分は、方法Aで説明したFmoc保護アミノ酸、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸またはFmoc-Glu-OtBuなど、適切に保護された構成ブロックを使用して、方法Aで説明したとおり、Preludeペプチド合成装置によって段階的手順で導入することができる。脂肪酸基の導入は、オクタデカン二酸モノ−tert−ブチル−エステルなどであるが、これに限定されない適切な構成ブロックを使用して達成された。一部の事例において、結合時間が長くなるか、または各構成ブロックの結合工程を繰り返した。
切断、酸化的フォールド、精製および定量化は、方法Aに記載したとおりに実施した。
方法C
溶液中の置換基の付着（還元的アルキル化による）
方法Aから得られた精製されたペプチドを、アルデヒド官能性で誘導体化した適切な置換基を使用する還元的アルキル化に供した。
冷凍乾燥したペプチド粉末を、クエン酸緩衝液（40mM、pH5.55；ペプチド濃度:4 mg/mL）に溶解した。選択した置換基（10当量、10mg/mL）の40%（w/v）シクロデキストリン水溶液を含む溶液をペプチド溶液に加え、反応バイアルの反転によって穏やかに混合させた。この溶液に、ボランピリジン錯体（100当量、80mg/mL溶液、MeOH溶液）を少量の一定分量に分けて加え、反応バイアルの反転を穏やかに行った。反応溶液を室温で一晩穏やかに振とうさせた。反応の進行をLC-MSによってモニタリングした。翌朝、反応溶液をTFAを使用してpH2〜3まで酸性化し、方法Aで上述した手順を使用して精製した。
方法D
置換基の付着（溶液中の折り畳まれたペプチドのN末端アシル化）
凍結乾燥ペプチド粉末をK2HPO4緩衝液（20mM、pH8.15）に溶解して、5mg/mLの標的濃度にした。18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸のDMSO溶液（4当量; 4 mg/mL）を4回の一定分量に分けて加えた。毎回の一定分量を加えた後、反応バイアルを反転させてペプチド溶液を穏やかに混合させた。その後、反応溶液のpH値を測定し、N,N-ジイソプロピルエチルアミンを少しずつ加えてpH8.0-8.3に調節し、その後で溶液を室温で放置した。反応の進行をLC-MSで追跡した。3時間後に溶液をTFAでpH5.9に酸性化し、上述の手順を使用して精製した。
方法E
置換基の付着（Lysによる―溶液中）
精製されたペプチド類似体は、以下に本明細書に記載したとおりにペプチドバックボーンを置換基と反応する方法に供することができる。
折り畳まれたEGF(A)ペプチド類似体の溶液（10〜40mg/mL、20mM Tris、pH7.5、5〜10mM、塩化カルシウム）に、N-メチルピロリジノン（0.25×ペプチド溶液の体積）を撹拌しながら加える。選択的反応条件を得るために、pHが10.5〜12に達するまで水酸化ナトリウム水溶液を徐々に加えてpHを増大する。
アシル化試薬（EGF(A)ペプチド類似体と比較して2〜4モル当量)をN-メチルピロリジノンまたは水に溶解する。水が使用される場合には、pHは水酸化ナトリウム水溶液を加えることによってpH4〜7に調節する。アシル化試薬溶液を2〜60分間にわたり攪拌したペプチド溶液に加え、その間に水酸化ナトリウム水溶液を加えることによってpHを10.5〜12に連続的に調節する。最終反応混合物を一定のpHで室温でアシル化試薬が消費されるまで攪拌する（0〜4時間）。反応混合物は、トリフルオロ酢酸を滴下することによって中和される。
B.1. プロトラクターおよびリンカー要素の合成
オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルの合成については、特許出願WO 2010102886を参照されたい。テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸およびエイコサン二酸の対応するモノ-tert-ブチルエステルをこうして製造する。14-スルホ-テトラデカン酸および16-スルホ-ヘキサデカン酸の合成については、WO2015071355を参照されたい。16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカン酸および13-(1H-テトラゾール-5-イル)トリデカン酸の合成については、WO2006005667を参照されたい。4-(N-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイル)スルファモイル)ブタン酸の合成については、US 2012/0088716を参照されたい。
13-(メチルスルホニルカルバモイルアミノ)トリデカン酸。
化学物質6-OH、式中、n=12:
この分子は、次の文献からの修飾手順を使用して作製した：Luckhurst et al. Tetrahedron Letters Volume 48, Issue 50, 2007, Pages 8878-8882 http://dx.doi.org/10.1016/j.tetlet.2007.10.046。
トリエチルアミン（4.46mL、32.0mmol）およびクロロギ酸エチル（3.05mL、32.0mmol）を続いて14-(tert-ブトキシ)-14-オキソテトラデカン酸（6.29g、20.0mmol）のアセトン溶液（176mL）に0℃で加えた。30分後、0℃でアジ化ナトリウム（2.60g、40.0mmol）の水溶液（12mL）を加え、混合物を0℃で2時間撹拌した。混合物を真空内で（30℃で）濃縮して、氷水（300mL）に注いだ。得られた混合物を酢酸エチル（3×250mL）で抽出し、有機抽出物を混合して、水（200mL）、炭酸水素ナトリウムの10%水溶液（200mL）および水（200mL）で洗浄し、無水硫酸マグネシウム（200mL）上で乾燥させて、乾燥するまで蒸発させると、14-アジド-14-オキソテトラデカン酸tert-ブチルおよび14-イソシアナト-14-オキソテトラデカン酸tert-ブチルの混合物が淡黄色の油として得られた。
メタンスルホンアミド（1.52g、16.0mmol）、炭酸カリウム（6.63g、48.0mmol）を、14-アジド-14-オキソテトラデカン酸tert-ブチルと14-イソシアナト-14-オキソテトラデカン酸tert-ブチルの混合物（5.43g、16.0mmol）の無水トルエン溶液（50mL）に加えた。反応混合物を85℃で一晩加熱した。水（100mL）を加え、その後、水溶性塩酸1Mを加えた（pHは、pH=4に調節した）。その混合物をジエチルエーテル（4×150mL）で抽出し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空中で蒸発させて、13-(3-(メチルスルホニル)ウレイド)トリデカン酸tert-ブチルを得た。
1H NMRスペクトル (300 MHz, DMSO, dH): 10.01 (s, 1 H); 6.42 (t, J=4.7 Hz, 1 H); 3.20 (s, 3 H); 3.02 (q, J=6.7 Hz, 2 H); 2.16 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 1.52-1.33 (m, 13 H); 1.30-1.11 (m, 16 H)。
トリフルオロ酢酸（21.0mL）および水（2.50mL）を13-(3-(メチルスルホニル)ウレイド)トリデカン酸tert-ブチル（3、6.30g、15.5mmol）のジクロロメタン溶液（30mL）に滴下して加えた。反応混合物を室温で3時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させると、13-(3-(メチルスルホニル)ウレイド)トリデカン酸が得られた。
1H NMRスペクトル(300 MHz, DMSO, dH): 10.02 (s, 1 H); 6.43 (t, J=4.5 Hz, 1 H); 3.20 (s, 3 H); 3.02 (q, J=6.6 Hz, 2 H); 2.18 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 1.56-1.33 (m, 4 H); 1.24 (s, 16 H)。
13-(3-ヒドロキシイソオキサゾール-5-イル)トリデカン酸
化学物質5-OH、式中、n=12:
この分子は、次の文献からの修飾手順を使用して作製した：Sorensen et al. J. Org. Chem., 2000, 65 (4), pp 1003-1007. DOI: 10.1021/jo991409d。
14-(tert-ブトキシ)-14-オキソテトラデカン酸（1、30.0g、95.4mmol）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（43.3g、209mmol）および4-ジメチルアミノピリジン（25.6 g、20.9mmol）を、無水ジクロロメタン（700mL）および2,2-ジメチル-1,3-ジオキサン-4,6-ジオン（2、20.6 g、143mmol）に溶解して、溶液に加えた。反応混合物を室温で16時間攪拌した。次に、揮発分を蒸発させ、混合物をジエチルエーテル（500mL）で希釈し、白色沈殿物をろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル（300mL）で希釈し、1M水溶性塩酸（3×100mL）およびブライン（1×100mL）で抽出した。有機部分を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて、14-(2,2-ジメチル-4,6-ジオキソ-1,3-ジオキサン-5-イル)-14-オキソテトラデカン酸tert-ブチルを黄色の油として得た。粗製生成物をさらに精製することなく、次の工程に使用した。
1H NMRスペクトル(300 MHz, CDCl3, dH): 3.07 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.20 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 1.74 (s, 6 H); 1.71-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.36-1.23 (m, 16 H).
上記の粗製生成物をエタノール（300mL）に溶解し、得られた溶液を80℃で3時間攪拌し、次いで室温で一晩攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Silicagel 60、0.040〜0.063 mm、溶出液:シクロヘキサン／酢酸エチル9:1）で精製し、無色の油として3-オキソヘキサデカン二酸16-メチル1-エチルを得た。
1H NMRスペクトル(300 MHz, CDCl3, dH): 4.21 (q, J=7.2 Hz, 2 H); 3.44 (s, 2 H); 2.54 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.21 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 1.67-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.38-1.21 (m, 19 H)。
水酸化ナトリウム（1.09g、27.3mmol）を、アルゴン雰囲気下で−30℃で、メタノール（40.0mL）と水（10.0mL）に溶解した。上記エステル（4、10.0 g、26.0mmol）をメタノール（40mL）とジメトキシエタン（50mL）に溶解し、−30℃で反応混合物に滴下して加えた。20分後、ヒドロキシルアミン塩酸塩（3.61g、52.0mmol）および水酸化ナトリウム（2.18g、54.6mmol）のジメトキシエタン（10mL）および水（10.0mL）中の溶液を滴下し、反応混合物を−30℃で3時間撹拌した。次に、混合物をアセトン（5mL）でクエンチし、5分後に濃塩酸（70mL）に一度に注いで、80℃で70分加熱した。次に、すべての揮発分を減圧下で除去し、固形物をジクロロメタン（400mL）で溶解し、蒸留水（100mL）とブライン（70mL）で抽出した。有機部分を硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Silicagel 60、0.040〜0.063 mm、溶出液:シクロヘキサン／酢酸エチル3:1）で精製し、13-(3-ヒドロキシイソオキサゾール-5-イル)トリデカン酸メチルを白色の固体として得た。
1H NMRスペクトル(300 MHz, CDCl3, dH): 5.66 (s, 1 H); 3.67 (s, 3 H); 2.63 (t, J=7.6 Hz, 2 H); 2.31 (t, J=7.6 Hz, 1 H); 1.72-1.55 (m, 4 H); 1.40-1.19 (m, 16 H)。
メチル13-(3-ヒドロキシイソオキサゾール-5-イル)トリデカン酸メチル（5、6.20 g、19.9mmol）を、メタノール（60.0mL）と水（20.0mL）に溶解し、水酸化リチウム一水和物（4.04 g、96.3mmol）を加え、反応混合物を室温で16時間攪拌した。次に、揮発分を減圧下で除去し、水（50.0mL）を加えた後、1M水溶性塩酸（50.0mL）を加えた。沈殿物を濾過して水（2×100mL）で洗浄し、次いで減圧下で乾燥させ、13-(3-ヒドロキシイソオキサゾール-5-イル)トリデカン酸をベージュ色の固体として得た。
1H NMRスペクトル(300 MHz, DMSO-d6, dH): 5.74 (s, 1 H); 2.57 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.18 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 1.63-1.41 (m, 4 H); 1.34-1.14 (m, 16 H)。
B.2 還元的アルキル化のための中間置換前駆物質の合成
18-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-ホルミルフェニル)メチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソ-ブチル]アミノ]-18-オキソ-オクタデカン酸
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ（42.6g、42.6mmol）を無水ジクロロメタン（205mL）中に放置し20分間膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(13.7g、35.5mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（23.5mL、135mmol）の無水ジクロロメタン（30mL）中の溶液を樹脂に加え、混合物を3時間振とうした。樹脂を濾過し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（12.4mL、70.9mmol）のメタノール／ジクロロメタン混合物（4:1、250mL、2×5分）溶液で処理した。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（2×150mL）、ジクロロメタン（3×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン（1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（2×150mL）およびジクロロメタン（200mL、2×150mL）で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（20.5g、53.2mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCTU、18.9g、53.2mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（16.7mL、95.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（100mL）およびジクロロメタン（50mL）中の溶液を、樹脂に加え、混合物を1時間振とうした。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×150mL）、ジクロロメタン（2×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（3×155mL）で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン（1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することによりFmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（2×150mL）およびジクロロメタン（200mL、2×150mL）で洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu（22.6g、53.2mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCT、18.9g、53.2mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（16.7mL、95.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（155mL）中の溶液を樹脂に加え、混合物を1時間振とうした。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×150mL）、ジクロロメタン（2×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（150mL）で洗浄した。ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン（1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（2×150mL）およびジクロロメタン（200mL、2×150mL）で洗浄した。オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル（19.7g、53.2mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCTU、18.9g、53.2mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（16.7mL、95.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン混合物（1:4、200mL）中の溶液を樹脂に添加した。樹脂を2時間振盪し、濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、ジクロロメタン（2×150mL）、メタノール（2×150mL）およびジクロロメタン（300、6×150mL）で洗浄した。生成物を2,2,2-トリフルオロエタノール（200mL）で19時間処理することによって樹脂から切断した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン（2×150mL）、2-プロパノール／ジクロロメタン混合物（1:1、2×150mL）、2-プロパノール（150mL）およびジクロロメタン（2×150mL）で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発し、粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲルl60、0.040〜0.060mm、溶出液:ジクロロメタン／メタノール1:0〜9:1）により精製した。純粋な生成物を真空内で乾燥させ、黄色の油として得た。
17-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ヘプタデカン酸tert-ブチルエステルの収量：25.85g（86%）。
RF（SiO2、クロロホルム／メタノール85:15）: 0.25。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, dH): 7.38 (bs, 1 H); 7.08 (bs, 1 H); 6.61 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.43 (m, 1 H); 4.15 (s, 2 H); 4.01 (s, 2 H); 3.78-3.39 (m, 16 H); 2.31 (t, J=6.9 Hz, 2 H); 2.27-2.09 (m, 5 H); 2.01-1.84 (m, 1 H); 1.69-1.50 (m, 4 H); 1.46 (s, 9 H); 1.43 (s, 9 H); 1.24 (bs, 24 H)。
LC-MS m/z: 846.6 (M+H)+。
(4-ホルミル-ベンジル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル（Boc-アミノメチルベンズアルデヒド、1.54g、6.60mmol）をジクロロメタン（50mL）に溶解し、塩酸のジオキサン溶液（3.8 M、20mL、76mmol）を加えた。混合物を16時間攪拌すると、固体材料が溶液から沈殿した。すべての溶媒を蒸発により除去した。17-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(5.08g、6.00mmol）、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl、1.73g、9.00mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、0.037g、0.30mmol）およびジクロロメタン（50mL）を加えた。混合物を攪拌し、ジイソプロピルエチルアミン（2mL、11.6mmol）を3回に分けて加えた。反応混合物を2時間攪拌し、溶媒を蒸発させた。残留物をジクロロメタン（10mL）に溶解し、塩酸の溶液をpHが5より低くなるまで滴下した。溶液をカラムクロマトグラフィー（Silicagel 60、0.040〜0.060mm、溶出液:ジクロロメタン／メタノール95:5）にかけると、置換基が黄色の油として得られた。
収量: 3.15g (54%)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, dH): 9.99 (s, 1 H); 7.85 (d, J=7.9 Hz, 2 H); 7.54-7.43 (m, 3 H); 7.06 (t, J=5.5 Hz, 1 H); 6.86 (t, J=5.6 Hz, 1 H); 6.48 (d, J=7.7 Hz, 1 H); 4.58 (d, J=6.2 Hz, 2 H); 4.45-4.36 (m, 1 H); 4.09 (s, 2 H); 3.94 (s, 2 H); 3.73-3.37 (m, 16 H); 2.32-2.05 (m, 7 H); 1.99-1.80 (m, 1 H); 1.69-1.51 (m, 4 H); 1.45 (s, 9 H); 1.44 (s, 9 H); 1.33-1.20 (m, 24 H).
LC-MS m/z: 963.5 (M+H)+。
(2S)-5-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[(4-ホルミルフェニル)メチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-5-オキソ-2-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)ペンタン酸
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ、1.8mmol/g（1、8.40ｇ、14.3mmol）を無水ジクロロメタン（150mL）中に30分間放置して膨潤させた。乾燥ジクロロメタン(50mL）中の{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH（2.82g、9.50mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（6.30mL、36.1mmol）の無水ジクロロメタン溶液（約150mL）を樹脂に加え、混合物を24時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（3.30mL、19.0mmol）のメタノール／ジクロロメタン混合物（4:1、2×150mL、2×5分）溶液で処理した。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、ジクロロメタン（3×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（3×150mL）およびジクロロメタン（3×150mL）で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、4.80g、16.2mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCTU、5.74ｇ、16.2mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（4.47mL、25.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（150mL）中の溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、ジクロロメタン（3×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（3×150mL）およびジクロロメタン（3×150mL）で洗浄した。(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル（Fmoc-Glu-OtBu、6.87g、16.2mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCTU、5.74g、16.2mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（4.47mL、25.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（150mL）中の溶液を、樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、ジクロロメタン（3×150mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×150mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、2-プロパノール（3×150mL）およびジクロロメタン（3×150mL）で洗浄した。16-((4-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-2,2-ジメチルブトキシ)スルホニル)ヘキサデカン酸（6.62g、12.4mmol）、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラフルオロホウ酸テトラメチルウロニウム（TCTU、4.39g、12.4mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（4.47mL、25.7mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン混合物（1/1, 150mL）中の溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（3×150mL）、メタノール（5×150mL）およびジクロロメタン（10×150mL）で洗浄した。生成物を、2,2,2-トリフルオロエタノール（150mL）で24時間処理することによって樹脂から切断した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン（3×150mL）で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発させ、粗製生成物（7.80g）をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル60、0.040〜0.060mm、溶出液:ジクロロメタン／メタノール100:2からジクロロメタン/メタノール100:10まで）により精製し、中間化合物を白色の固体として得た。
収量: 4.00 g (42%)。
RF（SiO2、ジクロロメタン／メタノール8:1）: 0.50。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, dH): 7.79-7.65 (m, 1 H); 7.36-7.20 (m, 1 H); 6.86 (d, J=7.5 Hz, 1 H); 4.49-4.63 (m, 1 H); 4.44-4.29 (m, 1 H); 4.07-3.93 (m, 4 H); 3.90 (s, 2 H); 3.77-3.35 (m, 16 H); 3.25-3.02 (m, 4 H); 2.44-1.75 (m, 8 H); 1.72-1.38 (m, 22 H); 1.38-1.18 (m, 22 H); 1.00 (m, 6 H).
LC-MS m/z: 1012.3 (M+H)+。
上記の中間化合物（3.77g、3.73mmol）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（1.75mL、10.1mmol）、［1,2,3］トリアゾロ［4,5-b］ピリジン-1-オール（HOAt、0.51g]ピリジン-1-オール）-N'（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl、1.43g、7.46mmol）をジクロロメタン（120mL）に溶解した。4-ホルミル-ベンジル-塩化アンモニウム(5、0.77g、4.48mmol）を加えた。混合物を室温で24時間攪拌した。この時点の後、反応混合物を蒸発させ、酢酸エチル（300mL）に溶解し、0.5M塩酸水溶液（200mL）で洗浄した。有機相を分離し、水（200mL）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた。酢酸エチルを蒸発させ、粗製混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（Silicagel 60、0.040〜0.060 mm、溶出液:ジクロロメタンからジクロロメタン／メタノール100:5まで）で精製して、保護アルデヒドを白色の固体として得た。
収量: 3.00 g (71%)。
RF（SiO2、ジクロロメタン／メタノール10:1）: 0.70。
1H NMRスペクトル (300 MHz, CDCl3, dH): 9.99 (s, 1 H); 7.85 (d, J=8.1 Hz, 2 H); 7.64-7.38 (m, 3 H); 7.14-6.97 (m, 1 H); 6.91-6.76 (m, 1 H); 6.54-6.43 (m, 1 H); 4.58 (d, J=6.2 Hz, 2 H); 4.47-4.32 (m, 1 H); 4.09 (s, 2 H); 3.88 (s, 2 H); 3.81-3.30 (m, 16 H); 3.22-3.02 (m, 4 H); 2.38-2.08 (m, 4 H); 1.96-1.71 (m, 5 H); 1.71-1.16 (m, 41 H); 0.99 (m, 6 H).
LC-MS m/z: 1129.5 (M+H)+。
上記の保護アルデヒド（3.00g、2.66mmol）をトリフルオロ酢酸（15mL）と水（1mL）混合物で3時間攪拌した。この時点の後、混合物をジクロロメタンおよびトルエンで減圧下で数回蒸発させた。残留物を水／アセトニトリル混合物（1／1、15mL）に注いだ。pHをトリリン酸ナトリウムの飽和水溶液で8.0に調節し、得られた溶液を50℃で20分間攪拌した。硫酸水素カリウムの飽和水溶液でpHを6.0に調節した。残留物を逆相クロマトグラフィー（DelTapak、C18、15mm 50mm×500mm、アセトニトリル／水5〜15%／15分、5〜55%／180分、0.05% TFA）により脱塩した。溶媒を凍結乾燥して除去し、置換基を白色の粉末として得た。
収量: 0.66 g (28%)。
H NMRスペクトル (300 MHz, D2O, dH): 9.81 (s, 1 H); 7.79 (d, J=7.7 Hz, 2 H); 7.41 (d, J=7.9 Hz, 2 H); 4.44 (s, 2 H); 4.32-4.19 (m, 1 H); 4.05 (s, 2 H); 3.90 (s, 2 H); 3.74-3.43 (m, 12 H); 3.38-3.18 (m, 4 H); 2.83-2.60 (m, 2 H); 2.37-1.76 (m, 6 H); 1.76-1.37 (m, 4 H); 1.34-0.91 (m, 22 H).
LC-MS m/z: 873.8 (M+H)+。
N-((1-(4-ホルミルフェニル)-3,12,21-トリオキソ-5,8,14,17-テトラオキサ-2,11,20-トリアザテトラコサン-24-イル)スルホニル)-16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカンアミド
反応スキーム:
Wang樹脂 0.68mmol/g(20.5g、13.9mmol）をテトラヒドロフラン(200mL）で20分間放置して膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（Fmoc-Ado-OH、16.1g、41.8mmol）および4-ジメチルアミノピリジン（DMAP, 0.17g、1.39mmol）およびN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、6.47mL、41.8mmol）のテトラヒドロフラン（200mL）中の溶液を樹脂に添加し、混合物を18時間振盪した。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）で洗浄した。樹脂を無水酢酸（13.2mL、139mmol）およびピリジン（11.3mL、139mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（180mL）溶液で処理した。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×180mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）で洗浄した。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-Ado-OH、10.8g、27.9mmol）、5-クロロ-1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-ベンゾ[d][1,2,3]トリアゾール3-酸化物テトラフルオロホウ酸塩（TCTU、9.91g、27.9mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（7.28mL、41.8mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド(180mL）中の溶液を樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン(1×5分、1×30分、2×180mL）で処理することにより、Fmoc基を除去した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）およびN,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）で洗浄した。4-(N-(16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイル)スルファモイル)ブタン酸(THA-SBA-OH、8.91g、18.8mmol）、1-((ジメチルアミノ)(ジメチルイミニオ)メチル)-1H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン3-酸化物ヘキサフルオロリン酸塩（HATU、7.16g、18.8mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（5.71mL、32.8mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（90mL）およびジクロロメタン（90mL）の混合物中の溶液を樹脂に加え、混合物を18時間振盪した。
樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×180mL）、ジクロロメタン（2×180mL）、2-プロパノール（2×180mL）およびジクロロメタン（10×180mL）で洗浄した。トリフルオ酢酸（150mL）と水（7.5mL）の混合物で1時間処理することにより、生成物を樹脂から切断した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン（2×150mL）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をジエチルエーテル（100mL）で処理した。中間体（7.90g、10.3mmol）のテトラヒドロフラン（100mL）中の溶液に、水酸化リチウム一水和物（1.74g、41.4mmol）の水溶液（100mL）に加えた。溶液を18時間攪拌した。溶液を10%硫酸水素カリウム水溶液でpH=3になるまで酸性化し、塩化ナトリウムで飽和させた。有機相を除去し、水相を酢酸エチル（1×300mL）で抽出した。混合した有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、中間体を白色の粉末として得た。
収量: 5.50 g (52%)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, dH): 4.22 (s, 2 H); 4.12 (s, 2 H); 3.83-3.61 (m, 12 H); 3.59-3.43 (m, 6 H); 3.02 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 2.49 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.41 (t, J=7.5 Hz, 2 H); 2.22-2.09 (m, 2 H); 1.89-1.75 (m, 2 H); 1.74-1.60 (m, 2 H); 1.47-1.26 (m, 22 H)。
上記化合物（2.90g、3.80mmol）、4-アミノメチルベンズアルデヒド塩酸塩（0.78g、4.56mmol）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、0.78g、3.80mmol）および4-ジメチルアミノピリジン（DMAP、1.02g、8.35mmol）の無水ジクロロメタン（100mL）中の溶液を18時間攪拌した。沈殿物を濾過し、溶液を10%硫酸水素カリウム水溶液（2×100mL）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をテトラヒドロフラン（30mL）から結晶化させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（Silicagel 60、0.040〜0.063mm、溶出液:ジクロロメタン／メタノール、20:1〜5:1）で精製して、最終生成物を淡黄色の粉末として得た。
収量: 1.51 g (45%)。
1H NMRスペクトル (300 MHz, AcOD-d4, dH): 9.96 (s, 1H); 7.91 (d, J=7.9 Hz, 2 H); 7.92 (d, J=7.9 Hz, 2 H); 4.63 (s, 2 H); 4.21 (s, 2 H); 4.08 (s, 2 H); 3.81-3.57 (m, 12 H); 3.54-3.41 (m, 6 H); 3.02 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 2.47 (t, J=7.3 Hz, 2 H); 2.38 (t, J=7.4 Hz, 2 H); 2.19-2.07 (m, 2 H); 1.86-1.72 (m, 2 H); 1.70-1.57 (m, 2 H); 1.43-1.23 (m, 22 H).
LC-MS純度: 100%。
LC-MS Rt（Kinetex 4.6mm×50mm、アセトニトリル/水20:50〜100:0＋0.1%FA):3.58分。
LC-MS m/z: 882.0 (M+H)+。
B.3 液体アシル化のための中間置換前駆物質の合成
アシル化試薬A: 16-{[(1S)-1-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2,4-ジクロロ-6-スルホ-フェノキシ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-4-オキソ-ブチル]アミノ}-16-オキソ-ヘキサデカン酸
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ（3.4g、5mmol）をジクロロメタン（50mL）中で45分間放置して膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（9.63g、25mmol）および2,4,6-コリジン（6.6mL、50mmol）のジクロロメタン（50mL）中の溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（2×50mL）で洗浄した。樹脂にメタノール（2×3.75mL）、ジクロロメタン（2×20mL）および2,4,6-コリジン（2×1.25mL）の混合物を2回加え、混合物を2×10分間振盪させた。次に、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（3×25mL）で洗浄した。20v/v%ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド溶液（2×60mL）で2×15分間処理して脱保護した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×60mL）で洗浄した。{2-[2-(9)H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（3.08g、8mmol）、Oxyma Pure（1,14g、8mmol）およびN,N-ジイソプロピルカルボジイミド（1.24mL、8mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（53mL）中の溶液を10分間攪拌し、樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（4×60mL）で洗浄した。20v/v%ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド（2×60mL）中の溶液を用いて2×15分処理して脱保護をした。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×60mL）で洗浄した。(4S)-5-tert-ブチルオキシ-4-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-5-オキソ-ペンタン酸（3.40g、8mmol）、Oxyma Pure（1,14g、8mmol）およびN,N-ジイソプロピル-カルボジイミド（1.24mL、8mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（53mL）中の溶液を10分間攪拌し、樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（6×60mL）で洗浄した。20v/v%ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド溶液（2×60mL）で2×15分間処理して脱保護した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×60mL）で洗浄した。ヘキサデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル（2.74g、8mmol）、Oxyma Pure（1.14g、8mmol）、N,N-ジイソプロピル-カルボジイミド（1.24mL、8mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（53mL）中の溶液を10分間攪拌し、樹脂に添加し、混合物を2時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（2×60mL）およびジクロロメタン（2×60mL）で洗浄した。
樹脂から生成物を切断するために、2,2,2-トリフルオロエタノール（50mL）で18時間処理した。混合物をジクロロメタン（50mL）で希釈し、樹脂を濾過した。樹脂を、2,2,2-トリフルオロエタノール（50mL）で0.5時間再び処理した。樹脂を濾過し、混合したろ過液を真空内で減少させ、 1.14 gの淡黄色の油を得た。
上記の油（1.14g、推定1.4mmol）をジクロロメタン（10mL）に溶解し、これにトリエチルアミン（0.77mL、5.6mmol）を加えた。これに3,5-ジクロロ-2-塩化ヒドロキシベンゼンスルホニル（0.44g、1.7mmol）の2-プロパノール（2mL）およびジクロロメタン（1mL）の混合物中の溶液に、15分間にわたり滴下して加えた。次に、反応混合物を室温で18時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタン（40mL）で希釈し、5w/v%炭酸水素ナトリウム水溶液（50mL）および10w/v%硫酸水素カリウム（50mL）の混合物で洗浄した後、10w/v%硫酸水素カリウム（50mL）で洗浄し、最後にブライン（50mL）で洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を真空内で除去して油を得た。粗製生成物を少量のジクロロメタンに再溶解し、RediSep Rf順相シリカカラムでの順相分取クロマトグラフィー（Combiflash Rf）により精製した。溶出は、ジクロロメタン中のメタノールの勾配を増加されることにより溶出し、溶出は214nmで検出した。関連する画分をプールし、真空内で濃縮し、透明で無色の油を得た。
上記の油をトリフルオロ酢酸（4mL）に溶解し、これにトリイソプロピルシラン（0.1mL）を加えた。混合物を1時間攪拌した後、溶媒を窒素流下で除去した。ジエチルエーテル（40mL）を加え、混合物を-18℃に冷却した。混合物を濾過して、白色の粘着性の固体を得た。粗製生成物をC18-シリカゲルを含むカラムで逆相分取HPLC（Gilson）により精製した。溶出は、0.1%TFAを含む水中のアセトニトリルの勾配を増加させることで実施した。関連する画分をUPLCを使用して分析し、純粋な標的生成物を含む画分をプールし、水で500mLに希釈した。溶媒を凍結乾燥により除去し、標的生成物を白色の固体として得た。
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 8.03 (d, J=7.4 Hz, 1H), 7.90 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.77 (d, J=2.5 Hz, 1H), 7.69 (t, J=5.8 Hz, 1H), 7.65 (d, J=2.5 Hz, 1H), 4.39 (bs, 2H), 4.13 (td, J=8.0, 5.2 Hz, 1H), 3.88 (s, 2H), 3.70-3.67 (m. 2H), 3.62-3.51 (m, 6H), 3.46 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.41 (t, J=6.0 Hz, 2H), 3.28 (q, J=5.8 Hz, 2H), 3.20 ((q, J=5.8 Hz, 2H), 2.20-2.09 (m. 6H), 1.97-1.89 (m. 1H), 1.80-1.70 (m, 1H), 1.52-1.44 (m. 4H), 1.27-1.21 (m, 20H).
LC-MS m/z: [M]+ 計算 930.9, 実測 930.6。
11-(4-ベンジルオキシカルボニルフェノキシ)ウンデカン酸の合成
11-ブロモウンデカン酸（80.0g、300mmol）をtert-ブタノール（450mL）に溶解し、木炭（5.00g）と混合して、濾過した。ジ-tert-ブチルジカルボネート（130g、600mmol）をtert-ブタノール（450mL）および4-ジメチルアミノピリジン（3.60g、30.0mmol）中の溶液を加え、得られた溶液を室温で15時間攪拌した。混合物を水（300mL）で希釈し、シクロヘキサン（1.5Ｌ）を加えた。混合物を10%塩酸溶液（500mL）、水（500mL）およびブラインを加えた水溶液（500mL）で洗浄し、エマルジョンを破壊した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空内で除去し、11-ブロモウンデカン酸tert-ブチルを油として得た。粗製生成物には、微量の二炭酸ジ-tert-ブチルが含まれる（1H-NMRによる）。
収率:119 g（100%、二炭酸ジ-tert-ブチル、96.3 gを含む、純粋な生成物について再計算）。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 3.36 (t, J=6.8 Hz, 2H); 2.16 (t, J=7.5 Hz, 2H); 1.86-1.76 (m, 2H); 1.60-1.48 (m, 2H); 1.43 (s, 2H); 1.40 (s, 9H); 1.25 (bs, 10H)。
4-ヒドロキシ安息香酸ベンジル（62.0g、272mmol）および上記11-ブロマンデカン酸メチル（96.3g、300mmo）をN-メチルピロリドン（1L）に溶解し、炭酸カリウム（87.0g、1.58 mol）を加えた。混合物を80℃に20時間加熱し、シクロヘキサン（2Ｌ）および酢酸エチル（675mL）を加えた。固形物を濾過し、濾液を水（6×500mL）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を真空内で除去し、粗製4-(11-tert-ブトキシ-11-オキソ-ウンデシルオキシ)安息香酸ベンジルを、赤色の油として得た。
収量: 147.3 g
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.01 (d, J=8.4 Hz, 2H); 7.49-7.30 (m, 5H); 6.90 (d, J=8.6 Hz, 2H); 5.34 (s, 2H); 4.00 (t, J=6.6 Hz, 2H); 2.21 (t, J=7.4 Hz, 2H); 1.80 (m, 2H); 1.89-1.69 (m, 2H); 1.60-1.55 (m, 2H); 1.45 (s, 9H); 1.30 (bs, 10H)。
上記エステル（すべての材料；300mmol）をトルエン（800mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（200mL）を加えた。溶液を20時間攪拌してから、酢酸エチル（1L）を加え、混合物を水（6×500mL）で洗浄した。有機層を蒸発させて乾燥させた。残留物をシクロヘキサン／酢酸エチル混合物（1L）に溶解し、シリカパッドを通して濾過した。有機溶媒を蒸発させ、その材料をアセトニトリルから結晶化させ、次にジクロロメタン／シクロヘキサン混合物から結晶化させて、表題生成物を白色の固体として得た。
収量: 56.5 g。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.08-7.96 (m, 2H); 7.48-7.32 (m, 5H); 6.94-6.83 (m, 2H); 5.35 (s, 2H); 4.01 (t, J=6.6 Hz, 2H); 2.36 (t, J=7.4 Hz, 2H); 1.85-1.58 (m, 2H); 1.67-1.60 (m, 2H); 1.50-1.30 (m, 12H).
LC-MS m/z: [M+Na]+ 計算 435.2, 実測 435.5。
アシル化試薬B: 4-(11-{[(1S)-1-カルボキシ-4-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2,4-ジクロロ-6-スルホ-フェノキシ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-2-オキソ-エトキシ]エトキシ}エチルアミノ)-4-オキソ-ブチル]アミノ}-11-オキソ-ウンデコキシ)安息香酸
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ（20.0g、32mmol）をジクロロメタン（3×50mL）中で3×20分間放置して膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（37.0g、96mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（33mL、192mmol）をジクロロメタン（200mL）中の溶液を樹脂に加え、混合物を16.5時間振盪した。樹脂にメタノール（43mL、1063mmol）を加え、混合物を4.5時間振盪した。次に、樹脂をジクロロメタン（6×200mL）、N,N-ジメチルホルムアミド（3×200mL）、ジクロロメタン（8×200mL）で洗浄し、真空内で室温で乾燥させた。20v/v%ピペリジンをN,N-ジメチルホルムアミド（2×250mL）中の溶液を用いて2×15分処理して脱保護をした。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×200mL）で洗浄した。{2-[2-(9)H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸（37g、96mmol）、Oxyma Pure（13.64g、96mmol）およびN,N-ジイソプロピルカルボジイミド（14.9mL、96mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（120mL）中の溶液を15分間攪拌し、樹脂に加え、混合物を3.6時間振盪した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（7×200mL）で洗浄した。20v/v%ピペリジンをN,N-ジメチルホルムアミド（2×250mL）中の溶液を用いて2×15分処理して脱保護をした。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×200mL）で洗浄した。(4S)-5-tert-ベンジルオキシ-4-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-5-オキソ-ペンタン酸（44.11g、96mmol）、Oxyma Pure（13.64g、96mmol）およびN,N-ジイソプロピルカルボジイミド（14.9mL、96mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（140mL）中の溶液を15分間攪拌し、樹脂に添加し、混合物を4.6時間振盪した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（7×200mL）で洗浄した。
樹脂の一部分（24mmolに相当）の20v/v%ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド溶液（2×200mL）を用いて2×15分処理して脱保護をした。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（7×200mL）で洗浄した。11-(4-ベンジルオキシカルボニルフェノキシ)-ウンデカン酸（19.8g、48mmol）、Oxyma Pure（6.82g、48mmol）およびN,N-ジイソプロピルカルボジイミド（7.5mL、48mmol）を、N,N-ジメチルホルムアミド（105mL）中の溶液を15分間撹拌して、樹脂に加え、混合物を3時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（6×200mL）およびジクロロメタン（8×200mL）で洗浄した。樹脂を真空内で3日間乾燥させた。
樹脂から生成物を切断するために、樹脂の一部分（30.4g、23.4mmol）を2,2,2-トリフルオロエタノール（120mL）とジクロロメタン（30mL）の混合物で2時間処理した。樹脂を濾過し、再び2,2,2-トリフルオロエタノール（60mL）とジクロロメタン（15mL）の混合物で1.5時間処理した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン（150mL）、2,2,2-トリフルオロエタノール（75mL）で洗浄した。ろ過液と洗浄液を混合したものを真空内で減少させて、黄色の油を得た。油をアセトニトリル（120mL）に溶解し、真空内で濃縮して、黄色のろうを得た。ろうをジクロロメタンに溶解し、真空内で濃縮して、16.5gの粘性の高い黄色の油を得た。
上記の油（5.0g、5.1mmol）を2-メチルテトラヒドロフラン（40mL）に溶解し、トリエチルアミン（2.1mL、15.3mmol）を加えた。これに、3,5-ジクロロ-2-塩化ヒドロキシベンゼンスルホニル（1.4g、5.4mmol）を2-メチルテトラヒドロフラン（10mL）に溶解した溶液を15分間にわたり滴下して加えた。次に、反応混合物を室温で2.5時間攪拌した。反応混合物を、5w/v%硫酸水素カリウム水溶液（3×32mL）とブライン（3×8mL）の混合物で3回洗浄し、次にブライン（2×20mL）と水（2×20mL）の混合物で2回洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を真空内で除去して、6.0 gの半固体を得た。
残留物（1.8g）をテトラヒドロフラン（40mL）に溶解し、フラスコを3回排出し、不活性の窒素雰囲気で満たした。次に、活性炭（0.2ｇ）上のパラジウム10%を反応混合物に加え、フラスコを2回排出し、水素雰囲気で満たした。反応物を室温で攪拌した。16時間後、水素雰囲気を補充し、反応をさらに2時間攪拌した。反応混合物をセライトパッドを通して濾過した後、ガラス繊維フィルターを通して濾過した。濾液を真空内で濃縮した。残留物を0.2Mのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.8（50mL）に再溶解し、2-メチルテトラヒドロフラン（40mL+25mL）で2回洗浄する。水相に、滴下して1M HCl（10mL）をpHが2と3の間になるまで滴下して加えた後、ブライン（50mL）を加える。水相を2-メチルテトラヒドロフラン（50mL）で抽出する。有機相を2-メチルテトラヒドロフラン（50mL）で希釈し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空内で濃縮して、1.4gの白色の固体を得た。
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 8.04 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.87 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.77 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.69 (t, J=5.6 Hz, 1H), 7.65 (d, J=1.8 Hz, 1H), 7.00 (d, J=8.5 Hz, 2H), 4.40 (br s, 2H), 4.16-4.11 (m, 1H), 4.03 (t, J=6.2 Hz, 2H), 3.88 (s, 2H), 3.71-3.67 (m, 2H), 3.49-3.38 (m, 10 H), 3.32-3.25 (m, 2H), 3.23-3.17 (m, 2H), 2.17-2.07 (m, 4H), 1.98-1.89 (m, 1H), 1.73-1.67 (m, 3H), 1.52-1.44 (m, 2H), 1.29-1.22 (m, 12H)。
LC-MS m/z: [M+H]+ 計算 966.3, 実測 966.3。
アシル化試薬C: 4-(11-{[(1)S)-1-カルボキシ-4-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-4-オキソ-ブチル]アミノ}-11-オキソ-ウンデコキシ)安息香酸
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ（20.0g、32mmol）をジクロロメタン（3×50mL）中で3×20分間放置して膨潤させた。(4S)-5-ベンジルオキシ-4-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-5-オキソ-ペンタン酸（44.11g、96mmol）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（33mL、192mmol）のジクロロメタン（200mL）中の溶液を樹脂に加え、混合物を18時間振盪した。樹脂にメタノール（43mL、1063mmol）を加え、混合物を4.5時間振盪した。次に、樹脂をジクロロメタン（6×200mL）、N,N-ジメチルホルムアミド（3×200mL）、ジクロロメタン（8×200mL）で洗浄し、真空内で室温で乾燥させた。20v/v%ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド（2×250mL）中の溶液を用いて2×15分処理して脱保護をした。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド（6×200mL）で洗浄した。11-(4-ベンジルオキシカルボニルフェノキシ)ウンデカン酸（26.4g、64mmol）、Oxyma Pure（9.1g、64mmol）およびN,N-ジイソプロピルカルボジイミド（9.9mL、64mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（140mL）中の溶液を15分間撹拌して、樹脂に加え、混合物を4時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド（6×200mL）およびジクロロメタン（8×200mL）で洗浄し、真空内で室温で乾燥させた。
樹脂から生成物を切断するために、樹脂の一部分（27.3g、20.6mmol）を2,2,2-トリフルオロエタノール（96mL）とジクロロメタン（24mL）の混合物で18時間処理した。樹脂を濾過し、再び2,2,2-トリフルオロエタノール（48mL）とジクロロメタン（12mL）の混合物で0.5時間処理した。樹脂を濾過し、ジクロロメタン（120+60mL）で2回洗浄した。ろ液と洗浄液を混合したものを、真空内で減少させて油を得た。油をアセトニトリル（2×20mL）で2回再溶解し、真空内で濃縮して、8.78 gの生成物を含む9.59gの黄色の油を得た。
上記の油（4.4g、6.95mmol）のトルエン（32mL）溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド（0.88g、7.64mmol）およびテトラヒドロフラン（9mL）を加え、混合物をほぼ溶解するまで45℃に加熱した。この混合物にN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド（1.58g、7.64mmol）のトルエン溶液（3.4mL）を徐々に加えた。反応物を40℃で1時間攪拌した。反応混合物を濾過し、ろ過ケークをトルエン（10mL）で洗浄した。ろ液と洗浄液を混合したものを、真空内で体積の50%まで減少させた。溶液をトルエン（25mL）で希釈し、5w/v%生理食塩水（2×50mL）で2回洗浄した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空内で濃縮して、黄色の粘性物質を得た。残留物を45℃の温い酢酸エチル（10mL）に再溶解し、これにn-ヘプタン（15mL）を加え、得られる沈殿物を濾過によって単離した。ろ過ケークをn-ヘプタン（15mL）で洗浄した。生成物は4.6gの淡黄色の固体として得られた。
上記の固体（2.19g、3mmol）を2-メチルテトラヒドロフランに溶解し、溶液を窒素ガスでパージした。溶液に、活性炭（0.22g）上の5%パラジウムを加え、混合物を窒素ガスでパージした。次に、フラスコ中の雰囲気を水素ガスに交換し、反応を室温で3時間攪拌した。反応混合物をガラス繊維フィルターを通して濾過し、ろ過ケークを2-メチルテトラヒドロフラン（15mL）で洗浄した。ろ液と洗浄液を混合したものを、真空内で濃縮して、1.2gの白色の粉末を得た。
1H NMR (1:1.6:3.3回転異性体比、アスタリスクはマイナー回転ピークを示す、400 MHz, d6-DMSO): δ 8.46* (d, J=7.5 Hz, 1H); 8.41* (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.11 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.87 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7.00 (d, J=8.7 Hz, 2H), 4.78-4.66* (m, 1H), 4.26 (td, J=8.3, 5.0 Hz, 1H), 4.03 (t, J=6.4 Hz, 2H), 3.03-2.93* (m, 2H), 2.81 (s, 4H), 2.78-2.64 (m, 2H), 2.20-2.02 (m, 3H), 1.98-1.85 (m, 1H), 1.72 (quint, J=6.7 Hz, 2H), 1.54-1.47 (m, 2H), 1.43-1.36 (m, 2H), 1.35-1.23 (m, 10H)。
LC-MS m/z: [M+H]+ 計算 549.2, 実測 549.2。
合計29個の置換基を製造し、本明細書において以下に記載して個々の置換基のZ1〜Z10要素を特定している。最終的なEGF(A)誘導体に含まれていない化学基は、個別の置換基の説明に含まれないことに留意されたい。
B.4 検出および特徴付けの方法
LCMS法
LCMS01（表1を参照）
LCMS027（表2を参照）
UPLC方法（純度決定用）
UPLC01:
UPLC C11:
UPLC C12:
RP-UPLC-01
化学安定性（すなわち、純度損失）は、CSH C18カラムおよび60mM Na2SO4、40mM Na2SO4 pH2.3およびアセトニトリル9:1v/v（A 緩衝液）／80%アセトニトリル（B緩衝液）溶媒システムに基づく純度方法を示す安定性によって評価した。以下の条件を使用した:カラム温度:45℃、流量:0.250mL／分、および波長:215nm。勾配は、50.5分で38% B〜46% Bであった。純度方法は、類似体溶液中に5mm Ca2+が存在するときに互換性があることが示され、5mMのCa2+の有無にかかわらず、37℃で4週間の培養後、1mg/mLおよび20mg/mLの出発試料における含有物の損失は観察されなかった（データは示さず）。
純度損失（%）は、出発試料および37℃で2週間または4週間培養した試料の主要ピーク面積の積分から決定した。
RP-UPLC-02
化学安定性（すなわち、純度損失）は、（カルシウムの存在下で）CSH C18カラム（2.1×150mm）および0.1%ギ酸（A緩衝液）/100%アセトニトリル（B緩衝液）溶媒系に基づいて純度方法を示す安定性によって評価された。以下の条件を使用した:カラム温度: 55℃、流量:0.250mL／分および波長:215nm。勾配は、52分で25% B〜42% Bであった。純度方法は、類似体溶液中にCa2+が存在するときに互換性があることが示され、含有物/類似体の損失は観察されなかった（データは示さず）。類似物の純度は、出発試料および37℃で2、4、6週間培養された試料の主要ピーク領域の積分から決定した。
プロセス開発方法
RP01
B.5 化合物の例
実施例1
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：2である。
一般的方法AおよびCによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1743.9;実測m/4=1308.1;実測m/5=1046.7;計算質量=5229.1;実測質量=5229.6。
実施例2
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：3である。
一般的方法AおよびCによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1749.5;実測m/4=1312.4;実測m/5=1050.1;計算質量=5246.0;実測質量=5246.4。
実施例3
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：4である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1314.6;実測m/5=1052.1;計算質量=5255.9。
実施例4
N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：3である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1282.3;実測m/5=1026.3;計算質量=5126.8。
実施例5
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：6である。
一般的方法AおよびCによって製造される化合物
LCMS029: 計算質量=5246.92;実測質量=5247.37。
実施例6
N{イプシロン-299}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys299,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：7である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1714.2;実測m/4=1286.1;計算質量=5140.85。
実施例7
N{イプシロン-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：8である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1700.8;実測m/4=1275.8;実測m/5=1020.9, 計算質量 5099,7;実測質量=5099.75。
実施例8
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(16-スルホヘキサデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
23:ペプチドは、配列番号：6である。
一般的方法AおよびCによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1757.1;実測m/4=1318.04;計算質量=5268.95;実測質量=5269.39。
実施例9
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
24:ペプチドは、配列番号：8である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1939.2;実測m/4=1454.2;計算質量=5815.6;実測質量=5816.1。
実施例10
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：11である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1282.6;実測m/5=1026.3;計算質量=5126.8。
実施例11
N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：12である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1300.6;実測m/5=1040.5;計算質量=5198.9。
実施例12
N{アルファ}(N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：13である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=3022.4;実測m/3=2015.3;実測m/4=1511.8;実測m/5=1209.6;実測質量=6043.6;計算質量=6042.9。
実施例13
N{アルファ}(N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：13である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=3030.4;実測m/3=2020.7;実測m/4=1515.7;実測m/5=1212.8;実測質量=6059.7;計算質量=6058.8 。
実施例14
N{アルファ}(N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：15である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1497.4;実測m/5=1198.3;計算質量=5986.7 。
実施例15
N{アルファ}(N{イプシロン-330}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys330]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：16である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1987.7;実測m/4=1491.0;実測m/5=1193.0;計算質量=5959.7。
実施例16
N{アルファ}(N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：17である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1500.9;実測m/5=1201.2;計算質量=6000.8
実施例17
N{アルファ}(N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：18である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1498.2;実測m/5=1198.7;計算質量=5986.7 。
実施例18
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：19である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/2=2635.7;実測m/3=1757.5;実測m/4=1318.4;実測m/5=1054.9;計算質量=5270.0 ;実測質量=5270.5 。
実施例19
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：6である。
一般的方法AおよびDによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5127.8;実測m/3=1710.0;実測m/4=1282.3;実測m/5=1026.5;計算質量=5127.8。
実施例20
N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：21である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1286.1;実測m/5=1029.1;計算質量=5140.9 。
実施例21
N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：22である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1282.9;実測m/5=1026.5;計算質量=5127.8。
実施例22
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Gln312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：23である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1709.8;実測m/4=1282.6;計算質量=5126.8;実測質量=5127.3。
実施例23
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：24である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=2571.2;実測m/3=1714.5;実測m/4=1286.1;実測m/z=5141.4;計算質量=5140.9。
実施例24
N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：25である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=2607.2;実測m/3=1738.5;実測m/4=1304.1;実測質量=5213.5;計算質量=5212.9。
実施例25
N{アルファ-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：26である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1479.7;計算質量=5914.8 Da ;実測質量=5914.3。
実施例26
N{イプシロン-300}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：27である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1286.9;実測m/5=1029.7;計算質量=5141.8。
実施例27
N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：28である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5957.6;実測m/4=1490.4;実測m/5=1192.3; Calc m/1=5957.7。
実施例28
N{イプシロン-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys293,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：29である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5929.4;実測m/4=1483.3;実測m/5=1186.8; 計算m/1=5929. 。
実施例29
N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：30である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1700.8;実測m/4=1275.8;実測m/5=1020.9;計算質量=5099.8 (1A)。
実施例30
N{イプシロン-318}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys318]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：31である。
LCMS01:実測m/4=1286.5;実測m/5=1029.5;計算質量=5142.8。
実施例31
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=6002.8;実測m/4=1501.6;実測m/5=1201.5; 計算m/1=6002.7
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mMの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：32（4mL、37.4mg/mL、150mg、0.033mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（1.43mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.5に達するまで1M水酸化ナトリウム（0.165mL）をゆっくりと加え、その後5mMの塩化カルシウム（1.58mL）を加えた。
アシル化試薬B（350mg、31.5w/w%、0.115mmol）を水（0.3mL）および1M水酸化ナトリウム（0.5mL）に加えた。このアシル化試薬溶液を攪拌しながらペプチド溶液に15分間にわたって加えた。 同時に、0.5M水酸化ナトリウムを、pHが11.5に保たれるような速度で加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.5で維持されるように0.5M水酸化ナトリウム添加を続けた。すべての有効な側鎖が消費されるまで、反応をUPLCにしたがって行った。総反応時間は3.5時間である。反応混合物を、トリフルオロ酢酸（0.03mL）を滴下することでpH7.5に中和した。
UPLC01により、標的生成物の79.6%が得られた。
LC-MS m/z: [M+5H]5+ 計算1200.7, 実測1201.7。
実施例32
N{イプシロン-326}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys326]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：33である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1719.8;実測m/4=1290.1;実測m/5=1032.3;計算質量=5156.8。
実施例33
N{イプシロン-325}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys325]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：34である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1715.1;実測m/4=1286.6;実測m/5=1029.5;計算質量=5142.8。
実施例34
N{イプシロン-323}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys323]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：35である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5108.8;実測m/3=1703.8;実測m/4=1278.1;実測m/5=1022.5。
実施例35
N{イプシロン-322}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys322]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：36である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5198.9;実測m/3=1733.8;実測m/4=1300.6;実測m/5=1040.7。
実施例36
N{イプシロン-320}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys320]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：37である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1720.4;実測m/4=1290.3;実測m/5=1032.5;計算質量=5158.8。
実施例37
N{イプシロン-329}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys329]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：38である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=2550.7;実測m/3=1700.8;実測m/4=1275.9;計算質量=5099.8;実測質量=5100.5。
実施例38
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：39である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5143.0;実測m/4=1286.0;実測m/5=1029.0; 計算m/1=5142.8。
実施例39
N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：40である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/2=2564.7;実測m/3=1710.2;実測m/4=1282.9;実測 5127.8;計算質量=5128.5。
実施例40
N{イプシロン-316}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys316]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：41である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1709.7;実測m/4=1282.3;実測m/5=1026.1;計算質量=5126.8。
実施例41
N{イプシロン-315}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys315]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：42である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01: 実測m/3=1698.3;実測m/4=1273.8;実測m/5=1019.3;計算m/1=5092.8。
実施例42
N{アルファ}([His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：43である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5306.3;実測m/3=1768.7;実測m/4=1327.1;実測m/5=1061.7 。
実施例43
N{イプシロン-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：44である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1300.2;実測m/5=1040.2;計算質量=5198.9 。
実施例44
N{イプシロン-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：45である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1714.9;実測m/4=1286.2;実測m/5=1029.2;計算質量=5142.8。
実施例45
N{イプシロン-307}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：46である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1919.8;実測m/4=1290.1;実測m/5=1032.3;計算質量=5156.8。
実施例46
N{アルファ}([Leu301,Ser309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：47である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1738.8;実測m/4=1304.1;実測m/5=1043.5;実測質量=5214.3。
実施例47
N{アルファ}([Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：48である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/1=5187.2;実測m/3=1729.7;実測m/4=1297.2;実測m/5=1038.4;計算m/1=5186.8。
実施例48
Ala299,Leu301,Ile307,Arg309,Lys310]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：2である。
一般的方法Aによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1465.3;実測m/4=1099.3;実測m/5=879.6;計算=4391.0。
実施例49
[Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：3である。
一般的方法Aによって製造される化合物。
LCMS01:実測m/3=1470.3;実測m/4=1103.0;実測m/5=882.6;計算=4407.9。
実施例50
[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：6である。
一般的方法Aによって製造される化合物。
LCMS01:実測m/3=1471.3;実測m/4=1103.7;実測m/5=883.2;計算=4411.9。
実施例51
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Tyr306,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：49である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1695.8;計算質量=5085.1。
実施例52
N{アルファ-293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Asn293,Leu301,Ser309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：50である。
LCMS29:実測m/3=1706.1, 計算質量=5115.7
一般的方法Bによって製造される化合物
実施例53
N{イプシロン-306}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：51である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1707.0;実測m/4=1280.3;実測m/5=1024.4;計算質量=5118.8 。
実施例54
N{イプシロン-305}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys305,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：52である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1723.8 ;実測m/4=1292.8;実測m/5=1034.4;計算質量=5168.8。
実施例55
N{イプシロン-303}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys303,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：53である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1733.7;実測m/4=1300.3;実測m/5=1040.5;計算質量=5198.9。
実施例56
N{イプシロン-302}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys302,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：54である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1733.7;実測m/4=1300.3;実測m/5=1040.5;計算質量=5198.9。
実施例57
N{アルファ}([Asn293,His300,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys;
ペプチドは配列番号：55である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1341.5;実測m/5=1073.3;計算質量=5363。
実施例58
N{イプシロン-301}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：56である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1715.2;実測m/4=1286.6;実測m/5=1029.5;計算質量=5142.8 。
実施例59
N{イプシロン-298}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys298,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：57である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1715.1;実測m/4=1286.3;実測m/5=1029.3;計算 m/z=5142.8 。
実施例60
N{アルファ}([Asn293,Leu301,Arg309,Arg312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：58である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1780.7;実測m/4=1335.5;実測m/5=1068.4;計算質量=5340.1。
実施例61
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Ile307,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：59である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1700.0;実測m/4=1275.1;実測m/5=1020.3;計算質量=5097.8。
実施例62
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド;
ペプチドは配列番号：60である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1704.3;実測m/4=1278.5;実測m/5=1030.4;計算m/z=5110.8。
実施例63
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Ile307,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：61である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1700.3;実測m/4=1275.2;実測m/5=計算質量=5098.8。
実施例64
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：62である。
一般的方法AおよびCによって製造される化合物。
LCMS01:実測m/3=1757.1;実測m/4=1318.1;実測m/5=1054.2;計算質量=5269.0。
実施例65
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Pro300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：5である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1709.1;計算質量=5124.8。
実施例66
N{アルファ}([Asn293,Leu301,Ile307,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：9である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1329.1;計算質量=5313.0。
実施例67
N{アルファ}([Asn293,Leu301,Arg309,Asp312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：10である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1325.6;計算質量=5299.0。
実施例68
N{293}-[4-[[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルスルファモイル]ブタノイルアミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]メチル]フェニル]メチル-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：6である。
一般的方法Cによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1320.1;計算質量=5276.98。
実施例69
N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328,His329]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：6である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1278.09;計算質量=5108.8 Da。
実施例70
N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Asp295,Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：20である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1282.84;計算質量=5127.8 Da。
実施例71
N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：62である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1717.5 実測m/4=1288.2 実測m/5=1030.4 - 計算質量=5149.9。
実施例72
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Ile307,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：26である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/4=1292.1;計算質量=5164.8 Da。
実施例73
N{イプシロン-296}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys296,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：63である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1709.9;実測m/4=1282.6;計算質量 5126.8。
実施例74
N{イプシロン-294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：64である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1289.7;実測m/5=1031.7;計算質量=5154.8。
実施例75
N{イプシロン}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：65である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1752.9;実測m/4=1315.0;計算質量=5255.9。
実施例76
N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Gly294,Leu301,Arg309,Glu312,Lys328],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：66である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1676.6 実測m/4=1257.7 実測m/5=1006 )
-計算質量=5026,7。
実施例77
N{アルファ}([Leu301,Asp306,Arg309,Glu312,Gly324]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：67である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1721.8;計算質量=5162.8 Da。
実施例78
N{アルファ}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Asp306,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：68である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS029:実測m/3=1528.7;計算質量=6110.8 Da。
実施例79
N{アルファ}(N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：17である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1493.9;実測m/5=1195.5;計算質量=5972.7。
実施例80
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：4である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1743.6;実測m/4=1307.9;実測m/5=1046.4 計算質量=5227.9。
実施例81
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：4である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1762.3;実測m/4=1321.7;実測m/5=1057.8;計算質量= 5284.0。
実施例82
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]Lys
ペプチドは配列番号：4である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1656.2;実測m/4=1242.4;実測m/5=994.0;計算質量= 4965.6。
実施例83
N{アルファ}(N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：17である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1958.5;実測m/4=1468.9;実測m/5=1175.3;計算質量= 5872.7。
実施例84
N{アルファ}(N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：17である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1483.1;実測m/5=1186.6;計算質量= 5928.8。
実施例85
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：69である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1500.1 実測m/5=1200.3 実測m/z=1000. 計算質量=5026,7。
実施例86
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：70である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1469.3;実測m/5=1175.8;計算質量= 5874.6。
実施例87
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：71である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1469.1;実測m/5=1175.5;計算質量= 5874.6。
実施例88
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：39である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1469.3;実測m/5=1175.7;計算質量= 5874.5。
実施例89
N{アルファ}(N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：72である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1497.6;実測m/5=1198.3;計算質量=5987.7。
実施例90
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：73である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1472.6;実測m/5=1178.3;計算質量=5887.6。
実施例91
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：74である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LC-MS:実測m/3=1981, m/4=1486: 計算質量=5940.6。
実施例92
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：39である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1507.3 実測m/5=1205.9 計算質量=6025.7。
実施例93
N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは、配列番号：75である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1487.1;実測m/5=1190.0;計算質量=5945.6。
実施例94
N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：76である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1455.1;計算質量=5817.5。
実施例95
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：76である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1272.4 ;実測m/5=1017.9;計算質量=5085.7。
実施例96
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：77である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1469.1;実測m/5=1175.5;計算質量=5873.6。
実施例97
N{アルファ}(N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは、配列番号：78である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS28:実測m/3=1996.9;実測m/4=1497.9;計算質量=5987.7。
実施例98
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]Lys
ペプチドは、配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1808.1;実測m/4=1356.4;実測m/5=1085.3;計算質量=5422.1
実施例99
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys
ペプチドは、配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1894.2;実測m/4=1420.9;実測m/5=1136.9;計算質量=5680.3。
実施例100
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[[2-[[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]アセチル]アミノ]アセチル]アミノ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1922.2;実測m/4=1441.9;実測m/5=1153.7;計算質量=5764.4。
実施例101
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1566.2;実測m/5=1252.9;計算質量=6260.9。
実施例102
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(3-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドは配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1494.6; m/5= 1195.9 計算質量=5974.6。
実施例103
Ala299,Leu301,Ile307,Arg309-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：79である。
一般的方法Aによって製造される化合物。
LCMS01:実測m/2=2191.4;実測m/3=1461.0; Calc=4381.0。
実施例104
Leu301,Arg309,Lys310-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：80である。
一般的方法Aによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1475.3;実測m/4=1107.0;計算=4424.0。
実施例105
Leu301-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドは配列番号：81である。
一般的方法Aによって製造される化合物
LCMS01:実測m/3=1456.3;実測m/4=1217.0;計算=4368.9。
実施例106
N{アルファ}([His300,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：82である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/3=1760.5;実測m/4=1320.6;実測m/5=1056.7;計算質量=5279.0。
実施例107
N{アルファ}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：4である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1996.9;実測m/4=1497.9;実測m/5=1198.6;計算質量=5987.7。
実施例108
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(295-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：83である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1460.8;実測m/5=1168.7;計算質量=5839.5。
実施例109
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(3-ヒドロキシ-1,2-オキサゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(3-ヒドロキシ-1,2-オキサゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：69である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1495.0;実測m/5=1196.0;計算質量=5975.7。
実施例110
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(3-ヒドロキシ-1,2-オキサゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(3-ヒドロキシ-1,2-オキサゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1489.0;実測m/5=1191.0;計算質量=5952.7。
実施例111
N{アルファ}(N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：84である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1987.6;実測m/4=1490.9;実測m/5=1193.0;計算質量=5959.7。
実施例112
N{アルファ}(N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Tyr306,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：85である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1991.6;実測m/4=1493.9;実測m/5=1195.1;計算質量=5971.7。
実施例113
N{アルファ}(N{イプシロン-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys314]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：86である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2028.3;実測m/4=1521.5;計算質量=6081.8。
実施例114
N{アルファ}(N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Trp294,Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：87である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2025.3;実測m/4=1519.2;実測m/5=1215.6;計算質量=6072.8。
実施例115
N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：88である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/2=2916.7;実測m/3=1944.9;実測m/4=1458.9;計算質量=5831.5。
実施例116
N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：89
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2924.1;実測m/3=1949.6 実測m/4=1462.4;計算質量=5846.5。
実施例117
N{アルファ}(N{294}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：90である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1977.6;実測m/4=1483.5;実測m/5=1187.2;計算質量=5930.6。
実施例118
N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：91
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/2=2930.4;実測m/3=1953.9;実測m/4=1465.7;計算質量=5859.6。
実施例119
N{アルファ}(N{292}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-Ala[Leu301,Arg309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：92
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2020.6;実測m/4=1515.7;実測m/5=1212.8;計算質量=6058.8。
実施例120
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Tyr306,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：93である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2010.2;実測m/4=1508.2;実測m/5=1206.8;計算質量=6028.7。
実施例121
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：11
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/2=2930.3;実測m/3=1953.7;実測m/4=1465.8;計算質量=5858.6。
実施例122
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：40
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/2=2930.1;実測m/3=1953.9;実測m/4=1465.7;計算質量=5859.6。
実施例123
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：22
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2930.9;実測m/3=1954.3;実測m/4=1465.9;計算質量=5859.6。
実施例124
N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：94
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2916.1;実測m/3=1944.2;実測m/4=1458.4;計算質量=5830.6。
実施例125
N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：106である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2916.6;実測m/3=1944.5;実測m/4=1458.9;計算質量=5831.5。
実施例126
N{293}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-309}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Lys309,Glu312]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：30である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2916.7;実測m/3=1944.6;実測m/4=1458.7;計算質量=5831.5。
実施例127
N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：95
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1958.3;実測m/4=1469.0;計算質量=5871.6。
実施例128
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2966.28;実測m/3=1978.0;実測m/4=1483.5;計算質量=5930.7。
実施例129
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2676.0;実測m/3=1784.2;実測m/4=1338.4;計算質量=5330.1。
実施例130
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-332}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：96
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1966.7;実測m/4=1475.0;計算質量=5896.6。
実施例131
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]プロピルアミノ]-4-オキソブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]プロピルアミノ]-4-オキソブタノイル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2009.9;実測m/4=1507.7;計算質量=6026.8。
実施例132
N{イプシロン-313}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]プロピルアミノ]-4-オキソブタノイル],N{イプシロン-332}-[4-[3-[2-[2-[3-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]プロポキシ]エトキシ]エトキシ]プロピルアミノ]-4-オキソブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321,Lys332]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：97
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1971.3;実測m/4=1478.9;計算質量=5911.7。
実施例133
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：98である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1505.0;実測m/5=1204.3;計算質量=6016.7
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mmの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：98（1.69mL、29.6mg/mL、50mg、0.011mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（0.476mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.5に達するまで1M水酸化ナトリウム（0.054mL）をゆっくりと加え、その後5mMの塩化カルシウム（0.15mL）を加えた。
アシル化試薬B（32.7mg、78.5w/w%、0.026mmol）を、水（0.075mL）および1M水酸化ナトリウム（0.06mL）に加えた。このアシル化試薬溶液を攪拌しながらペプチド溶液に9分間にわたって加えた。 同時に、0.5M水酸化ナトリウムを、pHが11.5に保たれるようなレートで加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.5で維持されるように0.5M水酸化ナトリウム添加を続けた。すべての有効な側鎖が消費されるまで、反応をUPLCにしたがって行った。総反応時間は2時間である。反応混合物を、トリフルオロ酢酸（0.01mL）を滴下することでpH7.5に中和した。
UPLC01により、標的生成物の84.6%が得られた。
LC-MS m/z: [M+5H]5+ calcd 1203.6, 実測1204.4。
実施例134
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：19である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1766.7;実測m/5=1325.3;計算質量=5258.0。
実施例135
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys314]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：99である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1487.3;実測m/5=1190.0;計算質量 =5945.6。
実施例136
N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：100である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1469.3;実測m/5=1175.5;計算質量 =5873.6。
実施例137
N{イプシロン-312}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-314}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Lys314]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：101である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1483.3;実測m/5=1186.8;計算質量 =5929.7。
実施例138
N{イプシロン-311}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Lys311,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：102である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1473.0;実測m/5=1178.6;計算質量 =5889.5。
実施例139
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイル-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルLys
ペプチドバックボーンは配列番号：69である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1297.4;実測m/5=1038.2;計算質量=5186.9。
実施例140
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(1H-テトラゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(1H-テトラゾール-5-イル)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1481.6;実測m/5=1185.3;計算質量=5922.7。
実施例141
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(14-スルホテトラデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(14-スルホテトラデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/3=1992.6;実測m/4=1494.7;実測m/5=1196.0;計算質量=5974.8。
実施例142
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(メチルスルホニルカルバモイルアミノ)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[13-(メチルスルホニルカルバモイルアミノ)トリデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/3=2020.7;実測m/4=1515.8;実測m/5=1212.8;計算質量=6058.8。
実施例143
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：98である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=2719.0;実測m/3=1812.8;実測m/4=1359.8;計算質量=5436.1。
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mMの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：98（1.69mL、29.6mg/mL、50mg、0.011mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（0.476mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.3に達するまで1M水酸化ナトリウム（0.060mL）をゆっくりと加え、その後5mMの塩化カルシウム（0.15mL）を加えた。
アシル化試薬C（25.9mg、92.7w/w%、0.044mmol）をN-メチルピロリジノン（0.08mL）に溶解した。このアシル化試薬溶液を、攪拌しながらペプチド溶液に60分間にわたって加えた。 同時に、0.5M水酸化ナトリウムを、pHが11.3に保たれるようなレートで加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.3で維持されるように0.5M水酸化ナトリウム添加を続けた。さらなる生成物形成がなくなるまで、UPLCにしたがって反応を続けた。総反応時間は1.5時間である。
UPLC C11により、標的生成物の84.0%が得られた。
LC-MS m/z: [M+5H]5+ 計算 1087.5, 実測1088.2。
実施例144
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：98である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1982.2;実測m/4=1486.9;実測m/5=1189.7;計算質量=5944.7。
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mMの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：98（1.69mL、29.6mg/mL、50mg、0.011mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（0.476mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.5に達するまで1M水酸化ナトリウム（0.05mL）をゆっくりと加えた。
アシル化試薬A（25.5mg、96.6w/w%、0.026mmol）を、水（0.15mL）および1 M水酸化ナトリウム（0.05mL）に加えた。このアシル化試薬溶液を、攪拌下でペプチド溶液に9分間にわたって添加した。 同時に、0.5M水酸化ナトリウムを、pHが11.5に保たれるようなレートで加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.5で維持されるように0.5M水酸化ナトリウム添加を続けた。すべての有効な側鎖が消費されるまで、反応をUPLCにしたがって行った。総反応時間は2時間である。
UPLC01により、標的生成物の85.1%が得られた。
LC-MS m/z: [M+5H]5+ 計算 1189.2, 実測 1189.9。
実施例145
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[16-(1H-テトラゾール-5-イル)ヘキサデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=2003.3;実測m/4=1502.7;実測m/5=1202.2;計算質量=6006.8。
実施例146
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：98である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/3=1788.8;実測m/4=1341.9;実測m/5=1073.7;計算質量=5364.1。
実施例147
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：103である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS29:実測m/2=3020.8;実測m/3=2014.3;実測m/4=1510.9;計算質量=6039.8。
実施例148
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/3=2195.5;実測m/4=1646.9;実測m/5=1317.7;計算質量=6583.3。
実施例149
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His300,Leu301,Arg309,Glu312,Lys313],des-Gly293-LDL-R-(294-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：74
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS027:実測m/3=1990.6;実測m/4=1493.2;実測m/5=1191.1;計算質量=5968.7。
実施例150
N{アルファ}(N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：78である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/2=2958.7;実測m/3=1973.0;実測m/4=1480.0;計算質量=5915.7。
実施例151
N{アルファ}(N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：104
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1483.2;実測m/5=1186.8;計算質量=5930.0。
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mMの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：104（106mL、27.5mg/mL、2.91g、0.639mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（26.5mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.5に達するまで1M水酸化ナトリウム（6mL）をゆっくりと加えた。
アシル化試薬A（2023.3mg、96.3w/w%、2.09mmol）を水（5mL）に溶解して、濁り溶液を得た。攪拌下で1M水酸化ナトリウムを、pH6〜7になり、かつ溶液が透明になるまで徐々に加えた。溶液を水で希釈し15mLにした。アシル化試薬溶液（11mL、1.53mmol）を10分（1.1mL／分）にわたりペプチド溶液に加えた。 同時に、1M水酸化ナトリウム（3mL）を、pHが11.5に保たれるような速度で加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.5で維持されるように水酸化ナトリウム（1.1mL）添加を続けた。すべての有効な側鎖が消費されるまで、反応をUPLCにしたがって行った。総反応時間は2時間である。反応混合物を、トリフルオロ酢酸（0.3mL）を滴下させてpH7.5に中和し、不透明な溶液を得た。
UPLC01により、標的生成物の85.4%が得られた。
LC-MS m/z: [M+3H]3+ 計算 1976.3, 実測 1976.6, [M+4H]4+ 計算 1482.5, 実測 1483.0, [M+5H]5+ 計算 1186.2, 実測 1186.2。
実施例152
N{アルファ}(N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：72である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS34:実測m/4=1974.6;実測m/5=1183.9;計算質量=5915.7。
実施例153
N{アルファ}(N{イプシロン-324}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys324]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：105である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1483.3 実測m/5=1186.8 計算質量=5929.8。
一般的方法Eによって製造される化合物
20mmのTris、pH7.5および5mMの塩化カルシウムを含むペプチド配列番号：105（3.54mL、14.1mg/mL、50mg、0.011mmol）の溶液に、N-メチルピロリジノン（0.884mL）を撹拌しながら加えた。この混合物に、pHが11.5に達するまで1M水酸化ナトリウム（0.070mL）をゆっくりと加えた。
アシル化試薬A（31.6mg、96.6w/w%、0.033mmol）を水（0.10mL）および1M水酸化ナトリウム（0.035mL）に加えた後、水（0.05mL）を加えた。このアシル化試薬溶液を、攪拌下でペプチド溶液に9分間にわたって添加した。 同時に、0.5M水酸化ナトリウムを、pHが11.5に保たれるような速度で加えた。完全な側鎖添加の後、pHが11.5で維持されるように0.5M水酸化ナトリウム添加を続けた。すべての有効な側鎖が消費されるまで、反応をUPLCにしたがって行った。総反応時間は3時間である。
UPLC C11により、標的生成物の75.6%が得られた。
LC-MS m/z: [M+5H]5+ 計算 1186.2, 実測 1187.0
実施例154
N{アルファ}(N{イプシロン-328}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Glu321,Lys328]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：104である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1497.3;実測m/5=1198.2;計算質量=5985.9。
実施例155
N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],N{イプシロン-321}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Lys321]-LDL-R-(293-332)-ペプチド
ペプチドバックボーンは配列番号：72である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS01:実測m/4=1454.7;実測m/5=1164.0 計算質量=5815.6。
実施例156
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：32
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/3=2094.6;実測m/4=1571.2;計算質量=6281.1。
実施例157
N{アルファ}(N{イプシロン-313}-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Leu301,Arg309,Glu312,Lys313,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[[11-(4-カルボキシフェノキシ)ウンデカノイルアミノ]メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：98である。
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/3=2099.3;実測m/4=1574.7;計算質量=6295.1。
実施例158
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：19
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/3=1813.2;実測m/4=1360.2;実測m/5=1088.3;計算質量=5437.2。
実施例159
N{アルファ}([Leu301,Arg309,Glu312,Glu321]-LDL-R-(293-332)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys
ペプチドバックボーンは配列番号：19である
一般的方法Bによって製造される化合物
LCMS27:実測m/3=1803.9;実測m/4=1353.1;実測m/5=1082.7;計算質量=5409.2。
D. 特徴付けの一般的な方法
D.1.1 PCSK9-LDL-R結合競合（ELISA）
このアッセイの目的は、EGF(A)化合物のPCSK9に対する見かけの結合親和性を測定することである。
LDL-RとのPCSK9の相互作用を阻害する能力により、本発明の化合物はPCSK9阻害剤と呼ばれることもある。
実験前日、組換えヒト低密度リポタンパク質受容体（rhLDL-R；NSO由来；R & Dシステム#2148-LD）を50mm炭酸ナトリウム（pH 9.6）に1μg/mlで溶解した後、100μlの溶液をアッセイプレート（Maxisorp 96, NUNC #439454）の各ウェルに加え、4℃で一晩覆った。実験当日、 ビオチン化PCSK9（0.5ug/ml、BioSite/BPSBioscience cat#71304）を含有するEGF(A)化合物の8点濃度曲線を複製して作製した。EGF(A)化合物およびビオチン化PCSK9の混合物を製造し、25mm Hepes、pH 7.2（15630-056, 100mL、1M）、150mm NaCl（Emsure 1.06404.1000）1% HSA（Sigma A1887-25G）0.05% Tween 20（Calbiochem 655205）2mm CaCl2（Sigma 223506-500G）を含有するアッセイ緩衝液中で室温で1時間培養した。次に、覆われたアッセイプレートを200μlアッセイ緩衝液で4回洗浄した後、100μlのEGF(A)化合物とビオチン化PCSK9の混合物をプレートに加え、室温で2時間培養した。プレートを、200μlのアッセイ緩衝液で4回洗浄した後、ストレプトアビジン-HRP（25ng/ml；VWR #14〜30−00）と共に室温で1時間培養した。反応は、50μlのTMB-on（KEM-EN-TEC）を加えて、暗所で10分間培養することにより検出される。次に、混合物に50μl 4MのH3PO4を電子マルチピペッティングによって加えることによって反応を停止した。次に、プレートを1時間以内に450nmおよび620nmでSpectramaxで読み取った。620nmの読取値をバックグラウンド除去法用に使用した。IC50値は、Graphpad Prismを使用して、非線形回帰対数（阻害剤）と反応−変数勾配（4パラメータ）によって計算され、以下の式を使用してKi値に変換した:Ki=IC50/(1+(ビオチン-PCSK9)/(kd(ビオチン-PCSK9)))、式中、ビオチン-PCSK9のKdは、1.096727714μg/mlであり、[ビオチン-PCSK9]=0,5(μg/mL）である。
結果を以下の表5.1〜5.5に示す。Ki値が高くなると、PCSK9に対する見かけの結合親和性が低く反映され、その逆もそうである。化合物のいくつかは、測定された結合が特異的ではないことを示す500nMを超える値など、EGF66について測定された値よりも実質的に高いKiを示すことがわかる。ペプチドの両方のアミノ酸置換および／または一つまたは複数の側鎖誘導体は、LDL-Rに対する結合の欠失に寄与しうる。一般に、試験した多数のEGF(A)化合物は、hLDL-Rに対する結合においてPCSK9を阻害する能力を示した。
PCSK9阻害剤ペプチド
最初に、さまざまなアミノ酸置換を含むペプチドの群を節D1.1に記載したとおりに試験し、その結果を表5.1に示してある。
WO 2012177741において最も強力なペプチドバリアントとして特定されたEGF66は、五つの突然変異を有する。上記のとおり、本発明者らは、D1.1に記載したアッセイで決定されたEC50値について、これらの突然変異のうちいくつかはあまり重要ではないことを見出した。特に、発明者らは、310の野生型残基Asp(D)を含む化合物は、310Kの化合物よりも高い力価があることを見出した。また、鍵となるアミノ置換は、301Lであり、309Rとの組み合わせが好ましい。最後に307Iおよび299Aは、ペプチドの親和性に対してのみ寄与した。
置換基のN末端付着
その後の実験において、半減期プロトラクター（たとえば、ペプチドへの置換基）の付着が、D.1.1に記載したアッセイにより決定されるEC50に影響を与えるかどうかを試験した。本明細書に記載したとおり、置換基は、異なる技術によって付着されてもよく、発明者は、まずペプチドのN末端アミノ酸を使用して窒素原子を介した付着を適用することを決定した。これは、節Bに記述されているとおり、アシル化（溶液中または樹脂上）およびアルキル化によって達成された。
表5.2に示すように、試験したすべての化合物は、3.0未満のKi値を有し、これは様々なプロトラクターおよびリンカー要素が十分に許容されることを示唆している。これは、GLP-1などのペプチドでそれまでに観察されたように、力価は通常、側鎖の付着によりマイナスの影響を受けることからして、異常である。
置換基のLys付着
PCSK9阻害剤ペプチドへの置換基の付着のため代替的な位置を評価するために、一連の化合物を製造した。三つのアミノ酸置換（N301L、N309RおよびK312E）を含むバックボーンペプチドを、様々な位置でのLys置換と組み合わせて、実施例58、29および4以外で使用した。試験した全ての化合物には、位置297、304、308、317、319、331の六つのシステインアミノ酸が含まれ、これは通常システインジスルフィド架橋に関与する。312Eは、wt 312Kへの付着が得られる実施例4以外において、部位特異的置換を確保にするために含めた。一つのLysでのペプチドの延長も試験される（実施例75および3）。C18二酸プロトラクターおよびgGlu-2xAdoリンカーを含む上述と同じ置換基が、すべての化合物で使用され、アシル化を介して付着された。結果を表5.3に含めてあるる。
分析は、PCSK9阻害剤ペプチドの大部分が機能性を維持していることを示した。例外は、位置298、301、302および307のいずれかでのLys置換および誘導体化であって、非機能的ペプチドを生じさせた。また、位置296、299、315および320KでのLysの導入および置換が見かけの親和性を減少させることも観察された。
したがって、データは、Asn(N) 301〜Leu(L)のアミノ酸置換が結合にとって不可欠であることを示す表5.1に記載した結果を確認するものである。
位置295および310でのLysの導入および置換についてはデータは観察されなかった。上記で説明したように、310にAspを保持することは、310K置換よりも好ましいことが見出された。下記のように、結合は、位置295でのAsp(D)の導入（実施例70）によって解除されることも見出された。
まとめると、PCSK9ペプチドの位置295、298、302、307および310のいずれか、またはPCSK9ペプチドの位置295、296、298、299、302、307、310、315および320のいずれかに付着された置換基を含まない化合物は、一般的に機能的であることが結論付けられた。位置295、298、302および310のいずれかにおけるアミノ酸置換は、一般的に魅力的ではないことがさらに結論付けられた。表5.1および5.2から分かるように、それにもかかわらずV307I突然変異は、301Leuと組み合わせて許容されるか、または場合によっては魅力的であるようである。
さらに、位置295、296、298、302、310のうちの一つにアミノ酸置換を有するペプチドの機能性は、低い可能性が低い一方、299、315および320の置換は、わずかに低い機能性であると見られるだけであると考えられる。また、他方で、側鎖のLys置換および付着は、たいていの他のアミノ酸置換と同程度にペプチドに影響を与えるため、残りのアミノ酸残基について高いレベルの柔軟性が存在しうることも示唆されている。
二つの置換基を有するPCSK9阻害剤
二つの置換基を有する一連の化合物を製造した。二重置換は、N末端またはLys(K)残基におけるアシル化、アルキル化または組み合わせによって得られうる。ここでも、N末端は、アミノ酸293Gまたは変異体アミノ酸残基292A、293G、293Kおよび294T（たとえば293Gが欠失している場合）であってもよい。化合物は、異なる置換基で製造したが、個々の化合物上の二つの置換基は、同一である。この研究で使用したバックボーンには、ここでも特定のアシル化／アルキル化を得るために必要とされるN309Rおよび様々なN末端および／またはLys置換と組み合わせたN301Lアミノ酸置換が含めた。
ここでも、発明者らは、置換基は様々な位置および組み合わせで非常に良好に許容性があると結論付けた。
さらなるPCSK9阻害誘導体
PCSK9ペプチドの様々なアミノ酸置換のさらなる役割を調べるために、表5.5に示すようにさらなる化合物を製造し、試験した。すべての化合物は、333Kによるアミノ酸置換または延長によって導入されたLys残基を介して付着される一つの置換基を含む。バックボーンペプチドはすべて、N301Lアミノ酸置換および任意選択でN309RおよびI312Eの一つまたは複数を含む。置換基はすべて、16〜20個の炭素原子を含む脂肪二酸と、いずれかのgGlu単独であるか、またはAdo-Adoおよび／またはトラネキサム酸（Trx）部分であるかのいずれかであるリンカーを含む。
上記の表5.5における結果は、位置312の内部wtリジンがGlu(E)だけでなく、Gln(Q)、Arg(R)もしくはAsp(D)でも置換されうることを示している。このバリエーションに基づいて、ペプチドの阻害機能を妨害することなく、広範囲のアミノ酸残基が位置312において許容されることが予期される。
いくつかの他のアミノ酸置換は、G293N、T294G、D299A、N300H、H306Y、H306D、N309S、Q324GおよびR329Hを含めて十分に許容性あることが証明されているが、N295DおよびN300Pは、いずれも魅力的なアミノ酸置換ではない。
D.1.2 HepG2細胞におけるLDL取り込みアッセイ
PCSK9ペプチドおよびその誘導体の阻害強度を決定するための代替アッセイおよびHepG2細胞内におけるLDLの取り込みの測定を以下に記載する。
アッセイ原理 LDL取り込みは、主に内因的に発現されるhLDLRによって媒介され、したがってLDL取り込み能力は、LDLR発現の間接的尺度である。hLDLRは、用量依存的に外因性PCSK9と共に培養することにより下方制御することができる。したがって、PCSK9培養は、細胞がLDL分子を取り込む能力を減少させる。次に、LDL取り込みのこの下方制御は、PCSK9/LDLR結合を中和または阻害する化合物の添加によって拮抗されうる。したがって、PCSK9阻害剤は、それらがPCSK9の存在下でLDL取り込みを増加する、たとえばPCSK9媒介性hLDLR下方制御を妨げる能力に基づいて特徴付けることができる。
アッセイは、10%リポタンパク質欠損ウシ胎児血清（Sigma Aldrich #S5394）中で培養されたHepG2細胞（Sigma Aldrich ECACC: Acc no. 85011430）を使用して実施され、細胞がBODIPY蛍光標識されたLDL粒子（Life technologies Europe BV #L3483）を取り込む能力が測定される。
アッセイプロトコル:96ウェルプレート（Perkin Elmer、ViewPlate-96 Black #60005182）をインキュベーター内で1時間にわたってポリ-D-リシンで被覆した（10mg/L、Sigma Aldrich #P6407、PBS Gibco #14190-094に溶解）。次に、プレートを100μlのPBS（Gibco #14190-094）で2回洗浄した。EGF(A)化合物の8点濃度曲線のための試験組成物をアッセイ培地（DMEM（Gibco #31966-021）中で希釈したPCSK9（10μg/ml）、10%リポタンパク質欠損ウシ胎児血清（Sigma Aldrich #S5394）および1%ペンストレップ（Cambrex #DE17-602E）をすべて含めて製造し、50μl／ウェルの体積でプレート上に添加した。
30〜60分後、50.000個のHepG2細胞（Sigma-Aldrich: ECACC:ATCC no. 85011430 ロット:13B023）をアッセイ培地で希釈したものを50μl/ウェルの量で加え、プレートをCO2透過性プラスチックバッグ（Antalis Team、LDPEバッグ120/35x300x0.025mm #281604）内で20時間培養した（37℃、5%CO2）。この後、プレートを空にし、その直後に、アッセイ媒体中10μg/mlの濃度の50μl FL-LDL（Life technologies Europe BV #L3483）を各ウェルに加え、プレートをCO2透過性プラスチック袋内で、光から保護するためにリッドを黒いカバーで覆って、CO2透過性プラスチックバッグで2時間（37℃、5%CO2）で培養した。プレートを空にし、100μlのPBS（Gibco #14190-094）で2回洗浄した。次に、100μlのPBS（Gibco #14190-094）を加え、その後15分以内に、SpecktraMax M4（Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies）でフィルターEx（515nm）/Em（520nm）を使用してプレートを読み取った（bottom read）。
最後に、GraphPad Prism、非線形回帰曲線フィット、S字状用量応答（可変勾配）を使用してEC50値を計算した。
結果を下記の表6に示す。より低いEC50値は、LDL取り込みのPCSK9を媒介した下方制御を逆転する能力がより高いことを反映し、より高いEC50値は、LDL取り込みのPCSK9を媒介した下方制御を阻害する能力がより低い化合物であることを示す。
ほとんどの化合物は、見られるように、LDL取り込みアッセイで100〜500nMのEC50を示し、LDL取り込みのPCSK9を媒介した下方制御を逆転する能力が高い化合物であることを示している。
D.2. マウスにおけるPK
この研究の目的は、上述のPCSK9阻害剤のPKプロフィールを測定することであった。
方法：
メスのC57bl/Jマウス、Taconic（Ry, デンマーク）製を使用した。
化合物の投与:化合物を皮下（s.c.、500nmol/kg）または静脈内（i.v.、250nmol/kg）のいずれかで、体重1グラム当たり5μLの量で投与した。
採血:血液は、2分、15分、30分、60分、2時間、4時間、6時間、8時間、18時間、24時間、30時間および48時間で少量を採取した。血液（200μl）は、舌下静脈から採取し、EDTA被覆されたチューブ（Microvette（登録商標）VetMed 200 K3E、Sarstedt nr 09.1293.100）に移した。血漿を単離し、抗PCSK9ペプチドの定量化に使用した。
定量化:血漿試料は、LC-MSを使用したPCSK9阻害剤の定量化に使用した。
サンプリングおよび分析:
ドライアイス上のMicronicチューブに血漿をピペットで移して、-20℃で保持した後、LC-MSを使用してそれぞれのPCSK9阻害剤の血漿濃度を解析した。血漿試料（未知の試料の定量化に使用され、0.5〜1000nMの濃度範囲でPCSK9阻害剤を混合したブランク血漿から調製した標準曲線およびQC試料を含む）は、3回分の量の100%のメタノールまたはアセトニトリルを、1%ギ酸（抗PCSK9ペプチドに依存) と共に用いてタンパク質沈殿させ、遠心分離した（16000×g、4℃、20分）。上清を、初回Turboflow Cyclone精製カラム0.5×50mm（Thermo Fischer Scientific）および溶出用Aerisペプチド3.6μm XB-C18カラム2.1×50mm（Phenomenex）（60℃に保持）からなるクロマトグラフシステム（TurboFlow Transcend 1250 & 10バルブ VIM, Thermo Fisher Scientific）内に注入した。抗PCSK9ペプチドを、水およびアセトニトリルの0.1%または1%のギ酸（EGF(A)類似体または誘導体に応じて）との混合物からなる移動相でのクロマトグラフ勾配を使用して溶出した。抗PCSK9ペプチドを検出し、ポジティブモード、ESI+で作動する電気スプレーインターフェースを装備したLTQ OrbitrapまたはQ Exactive質量分析計（Thermo Fischer Scientific）にLC流をオンライン注入した後に定量化した。
PK特性の計算:
血漿濃度−時間プロファイルを、ソフトウェアPhoenix WinNonlin 6.4を使用して非区画薬物動態分析により分析した。I.V.およびS.C.の両方のデータの計算を、線形台形線形補間を使用して、重み付けを1/Y^Yで実施した。生物学的利用能は、S.C.プロファイルについてのAUC/用量をI.V.プロファイルのAUC/用量で割って計算した。
結果：
結果を表7に示す。表7では、Tmaxは、試験したEGF(A)類似体または誘導体の最大血漿濃度に達する時間を示す。T1/2は、EGF(A)類似体または誘導体の半減期である。MRTは、平均滞留時間である。F（s.c.）は、皮下注射後のEGF(A)類似体または誘導体の生物学的利用能である。より高いT1/2値は、試験した化合物の半減期がより長いことを反映する。
結果は、本発明のPCSK9阻害剤が脂肪酸置換基で置換された特定のLDL-R(293-332)類似体で半減期が延長されることを示す。
D.3. hPCSK9チャレンジモデル
この研究の目的は、抗PCSK9ペプチドによる静脈内注射hPCSK9の作用の阻害に応答して、マウス肝臓におけるLDL受容体発現レベルの変化を示すことであった。
方法
健常なオスのBalBCマウスまたはNMRIマウス（Charles River、ドイツ）に、s.c.もしくはi.v.のいずれかで抗PCSK9ペプチドを注射してから、15〜120分後に、hPCSK9（Sino Biologicals、中国）を0.4mg/kgの用量で尾静脈内に注射する。hPCSK9注射の60分後、動物はイソフルランで麻酔し、頚椎脱臼によって安楽死させる。次に、肝臓を速やかに切除し、液体窒素中で急速凍結させる。肝臓は、分析まで摂氏-80度に保たれる。
LDL-Rウェスタンブロッティング:
肝組織試料（100mg）を、ホスファターゼ阻害カクテル：PhosStop（Roche、04 906 837 001）およびプロテアーゼ阻害カクテル：compelate（Roche、04 693 159 001）を含む500μl溶解緩衝液（Life Technology、FNN0011）中でホモジナイズした。一つの鋼ビーズ組織を添加した後、30Hzで2.5分間均質化した。5000xgで5分間遠心分離した後、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce、23225）を使用して総タンパク質含有量を決定した。サンプル緩衝液（Life Technology、NP0007）中の等量のタンパク質（60μg）を10分間沸騰させ、14000rpmで2分間回転させてから、Criterion XT 3〜8%のTris-アセテートゲル（BioRad#345-0131）に装填し、SDS-PAGEを行った。タンパク質は、メーカーの指示（Life Technology）に従い、ニトロセルロース膜（iBlot 2 NC Regular stack、novex # IB23001）に転写した。同等のタンパク質移動であることが膜のPonceau S（Sigma、P7170）染色により確認され、膜をブロッキング緩衝液（TBS-T、2% Tween）中でさらにブロッキングした。LDL-rタンパク質は、一次ウサギ抗LDLr抗体（Cayman Chemical Company #10012422）で検出され、一方βアクチンタンパク質は、一次ウサギ抗βアクチン抗体（abcam # ab6276）を使用して検出された。両方のタンパク質を、WesternBright Quantum Chemiluminscent（Advansta # K-12042-D10）を使用して、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Biorad #170-6516）でさらに視覚化し、CCDカメラ（LAS3000、FujiFilm社）を使用して撮像した。ウエスタンブロットからの化学発光シグナルの定量分析は、MultiGaugeソフトウェア（Fujifilm）で行った。
結果
図1は、ウェスタンブロットによって測定された肝臓LDL-R発現レベルを示し、個々の動物が散布プロットとして提示されており、n=3〜6である。「媒体-媒体」は、健常な対照の群（ベースラインレベル）であり、「媒体-hPCSK9」は、hPCSK9単独が注入された群である。
結果は、hPCSK9がLDL-Rの発現レベルを低下させ、この効果が試験したPCSK9阻害剤によって阻害されることを示している。
表8において、データは、健常な対照動物（100%に設定）のベースラインレベルとhPCSK9単独による下方制御の後のレベル（0%に設定）との間の枠での変化率（％）として提示される。
試験された六つすべての実施例は、LDL-R発現レベルに対するhPCSK9の作用を阻害することができ、観察された阻害レベルは、対照分子Alirocumabを使用して観察された阻害レベルと類似している。
結論
いくつかの化合物の実施例は、hPCSK9によるLDL-R発現レベルの下方制御の阻害における有効性を示している。
D.4. ハムスターにおけるLDL-コレステロールの低減
この研究の目的は、標準的な固形飼料を与えたゴールデンシリアンハムスターにおけるLDL-Cに対するPCSK9阻害剤の効果を評価することであった。
方法
オスのゴールデンシリアンハムスター（Janvier Elevage, Saint Isle、フランス）、生後6週間（91〜100g）を研究で使用した。1週間の順化の後、4時間絶食させたハムスター（絶食は08:00am頃開始）を秤量し、正午頃にイソフルラン麻酔下での眼窩後出血によって採血し（100μL/EDTA）、総コレステロール、LDL-コレステロールおよびHDL-コレステロールを測定した。ハムスターは、1）LDL-コレステロール、2）HDL-コレステロールおよび3）総コレステロールに応じて、五つの均質な群（n=10/群）に無作為化した。無作為化後、ハムスターを5日間にわたって1日1回皮下注射により処置した。体重は、治療期間中毎日測定された。
処置3日目、4時間絶食させたハムスターを秤量し、正午頃にイソフルラン麻酔下での眼窩後出血によって採血し（100μL/EDTA）、総コレステロール、LDL-コレステロールおよびHDL-コレステロールを測定した。
治療の5日目に、4時間の絶食ハムスターを計量し、朝の投与（正午頃）の約1時間後にイソフルラン麻酔下での眼窩後出血によって採血（最大血液量／EDTA）した。
血漿を直ちに単離した。各個体について、総コレステロール値、LDL-コレステロールおよびHDL-コレステロールを測定するために、〜15μLの血漿量を維持した。各個体について別の血漿容量（〜50μL）を使用してそれぞれの治療群（すなわち、1群当たり1プール（約500μL）で、5プール）の血漿プールをFPLC総コレステロールプロファイル用に作製した。次に、ハムスターをイソフルラン麻酔下で頚椎脱臼により犠牲にし、失血させた。肝臓を採取し、秤量し、二つの肝臓サンプル（〜50mg〜約100mg、重量は未記録）を液体窒素中で急速凍結させてから-80℃で保存した。
約50mgの試料を使用して、ウエスタンブロットおよび濃度測定分析（Image Jソフトウェア）による肝臓LDL受容体およびパン-カドヘリン（ローディング管理）タンパク質発現を評価した。データは、平均±SEMとして提示してある。それぞれ統計解析に使用したDunnettまたはBonferroniポストテストを備えた1元または2元ANOVAをそれぞれ統計分析に使用した。p値＜0.05を有意とみなした。
結果
図2は、媒体または10nmol/kg、30nmol/kg、100nmol/kgまたは300nmol/kgの実施例2を、5日にわたり1日1回、皮下注射することにより治療したハムスターにおける治療期間中の血漿LDL-コレステロールを示す（**p<0.01および***p<0.001対試験媒体、2元ANOVA、Dunnetts事後分析）。
図3は、媒体で、または実施例2を10nmol/kg、実施例2を30nmol/kg、実施例2を100nmol/kgまたは実施例2を300nmol/kgで、5日にわたり1日1回、皮下注射することにより治療したハムスターの肝臓サンプルからのローディング管理パン-カドヘリンに対する肝臓LDL発現を示す（*p<0.05、**p<0.01および***p<0.001対試験媒体、1元ANOVA、Dunnetts事後分析）。
媒体と比較して、体重および体重増加は、どの処理でも影響を受けなかった（データ非表示）。すべての用量は、LDL-コレステロールを減少させた（図2を参照）。この効果は、実施例2の最も低い用量では有意ではなかったが、より高い用量100〜300nmol/kgでは、5日目に35%までのLDL-コレステロールレベルの減少があった。これらの傾向は、FPLC分析によってさらに確認された、これはハムスターが試験品目実施例2で処置されたときに、LDLおよびHDLに対応する分画の総コレステロールレベルの実質的な減少を示した（データ非表示）。肝臓中のLDL-R発現レベルの併用用量依存的な増加も示した（図2および図3を参照）。
結論
用量応答研究は、通常の固形試料を与えたゴールデンシリアンハムスターにおける3日後および5日後の少なくとも30nmol/kgの用量で、LDLコレステロールに対する有意な効果を得る可能性があることを実証している。LDLコレステロールに対する効果は、肝臓のLDL受容体発現レベルが有意に高いことと同時に起こる。
D.5 イヌi.v. PK試験
イヌi.v. PKプロファイル決定のために、3〜4匹のビーグル犬（オス、10〜16kg）を、70mM塩化ナトリウム、50mMのリン酸塩、70ppmのポリソルビン酸塩20、pH=7.4中の単一または複数のPCSK9類似体で静脈内投与（2nmol/kg、0.1mL/kg）した。投与前に、水道水は自由に飲めるようにしてイヌを一晩絶食させた。類似体は、針（20G）を通した単回注射によるか、または挿入されたベンフロンを通した連続投与によって、伏在静脈または橈側皮静脈を介して投与した。0.8mLの血液サンプルを投与後0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、24、48、72、120、144、168、192、216、240、288時間にそれぞれEDTA被覆されたチューブに収集する。最初の4時間のサンプリングについて、イヌがプラットフォーム上に固定された時に挿入されたベンフロンを通して血液を収集した。4時間経過後の残りのサンプリングポイントでは、単一ニードルパンチ（20G）によって頚静脈を通して収集した。血液採取の直後に、各サンプルを3〜4回穏やかに反転させ、血漿製造の前にアイスボックス上に迅速に移した（10分、4℃）、4000rpm)。血漿試料は、生物分析の前に-20℃に保った。採血の最大偏差は、投与後120分後に1分間、4〜10時間の時点で5分間、残りの日数では1時間以内である。
血漿分析:
共投与試験からの血漿をドライアイス上のMicronicチューブにピペットに移し、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を使用してそれぞれのPCSK9誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃に保持した。血漿試料（未知の試料の定量化に使用され、0.5〜500nMの公称濃度範囲でPCSK9誘導体を混合したブランク血漿から調製した標準曲線およびQCサンプルを含む）は、3回分の量のメタノール（内部標準として実施例4を含む）を用いてタンパク質沈殿させ、遠心分離した（16000×g、4℃、30分）。上清を初回Turboflow Cyclone精製カラム0.5×50mm（Thermo Fischer Scientific）および溶出用Aerisペプチド3.6μm XB-C18カラム2.1×50mm（Phenomenex）（60℃に保持）からなるクロマトグラフシステム（TurboFlow Transcend 1250 & 10バルブ VIM, Thermo Fisher Scientific）内に注入した。PCSK9誘導体を、水およびアセトニトリル/メタノール50/50 v/v%の1%のギ酸との混合物からなる移動相でのクロマトグラフ勾配を使用して溶出した。PCSK9誘導体を検出し、ポジティブモード、ESI+で作動するエレクトロスプレーインターフェースを装備したQ Exactive質量分析計（Thermo Fischer Scientific）にLC流をオンライン注入した後に定量化した。血漿試料のバイオアッセイの間、異なるPCSK9誘導体に対して異なる程度の異性化が観察された。異性体は、全て同一のモノアイソトピック質量を有し、また一緒に定量化される。
試験したそれぞれの類似体のPKパラメータ（たとえば、T1/2）は、Phoenix WinNonlinソフトウェアを使用してノンコンパートメント分析（NCA）によって解析され、半減期の計算は、同じ分子量を有する全異性体の曝露レベルに基づいて分析された。
D.6 ラットにおける経口取り込み研究
本研究では、健常なラットに経口投与された共製剤化ペプチドの胃腸吸収が研究された。
動物:
オスのスプラーグドーリーラット、タコニック、デンマーク、到着時250g。ラットは、試験前に動物単位、Novo Nordisk A/Sの実験動物部門で少なくとも1週間で順化させた。試験開始時の体重は、約280〜300gであった。投与前にラットをグリッド上で18時間絶食させた。
ペプチドの共製剤
生体内（ラット）でのPCSK9i類似体の経口共投与用液体製剤の製剤化は、以下に記載するように実施した。
標的EGF(A)ペプチド濃度は、各類似体について200μmであり、標的濃度55mg/mlのデカン酸ナトリウムおよび水で製剤化した。5〜6個の異なるペプチド類似体を、同一製剤で一緒に製剤かした。
短い場合、超純水を使用してデカン酸ナトリウムの原液（110mg/mL）を製造し、HClを使用して溶液のpHを8.0に調節した。
APIを20mLガラスバイアルに移し、5gの超純水を加え（1mg/mL密度と仮定）、APIをローラーミキサー上で室温で放置して溶解させた。続いて、pHが安定するまで溶液のpHをNaOHで8.0に調節し、その後、6.5gのデカン酸ナトリウムのストック（最終濃度55mg/mL）を加え、pHをpH8.0に調節した。次に、溶液をローラーミキサー上で室温で一晩保持した（光から保護）。翌日、必要に応じて、pH8.0への最終的なpH調節をNaOHを使用して実施した。
最終製剤重量は、超純水を使用して13gに設定し、続いて0.22μmフィルターを通して濾過した。正確な用量を確保するために、最終製剤に対してAPIおよびデカン酸ナトリウム含有量を決定した。製剤は、さらなる使用まで4℃で保存した。
液体製剤中の各APIの濃度は、215nmでのUV吸収によって決定した。LC法を、各共投与APIが相互に別個に溶出されるように開発した。各APIについて既知の濃度（CLNDにより決定）の標準をひとまとめにして、合計して五つの標準濃度を使用して較正曲線を作成した。最終決定された濃度は、三つの試料からの平均であり、それぞれに二回の実験を繰り返す。液体製剤中のカプリン酸濃度は、三つの濃度の基準で構成される較正曲線を使用して同様の方法で決定した。
投与:
動物は、各ペプチドについて1000nmol/kgの標的用量、および時間=0で5mL/kg体積で、胃管栄養法により経口投与された。
採血および血漿分離
血液試料を、投与後15、30、60、および120分の各時点で採取した。意識のあるラットの舌静脈を穿刺することにより、血液試料（200μl）をEDTA被覆チューブに採取した。サンプルを8000Gで5分間4℃で遠心分離した。血漿（60〜75μl）を分離し、ピペットでマイクロニックチューブ（75μl）に移し、直ちに-20℃で凍結させた。
血漿分析:
共投与試験からの血漿をドライアイス上のMicronicチューブにピペットで移し、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）を使用してそれぞれのPCSK9誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃に保持した。血漿試料（未知の試料の定量化に使用され、0.5〜500nMの公称濃度範囲でPCSK9誘導体を混合したブランク血漿から製造された、標準曲線およびQCサンプルを含む）は、3回分の量のメタノールまたはアセトニトリルを1v/v%のギ酸（内部標準として実施例4を含む）と共に用いてタンパク質沈殿させ、遠心分離した（16000×g、4℃、30分）。上清を、初回Turboflow Cyclone精製カラム0.5×50mm（Thermo Fischer Scientific）および溶出用Aerisペプチド3.6μm XB-C18カラム2.1×50mm（Phenomenex）（60℃に保持）からなるクロマトグラフシステム（TurboFlow Transcend 1250 & 10バルブ VIM, Thermo Fisher Scientific）内に注入した。PCSK9誘導体を、水およびアセトニトリル/メタノール50/50v/v%の1%のギ酸との混合物からなる移動相でのクロマトグラフ勾配を使用して溶出した。PCSK9誘導体を検出し、ポジティブモード、ESI+で作動するエレクトロスプレーインターフェースを装備したQ ExactiveまたはLTQ OrbiTrap Discovery質量分析計（Thermo Fischer Scientific）にLC流をオンライン注入した後に定量化した。血漿試料のバイオアッセイの間、異なるPCSK9誘導体に対して異なる程度の異性化が観察された。異性体は、全て同一のモノアイソトピック質量を有し、また一緒に定量化される。
データ計算:
LC-MSによって決定された血漿濃度から、それぞれのラットの各ペプチドについて最大血漿濃度（Cmax）を抽出し、Cmax／用量をn=6〜8ラットについて平均値±SDとして計算した。用量は、注入量として計算され、体重に合わせて調節され、実際のペプチド濃度を掛けたものであり、単位は、pmol/kgである。
それぞれの共製剤群において、参照ペプチドを含めた（実施例3）。以下の表では、Cmax/用量（kg/l）を参照ペプチド（実施例3）に対するCmax/用量（kg/l）と共に8つの異なるペプチドに対して一覧表示する。Cmax計算は、同じ分子量を有する全異性体の合計の曝露レベルに基づく。結果は、EGF(A)誘導体が概して十分に吸収されていることを示す。
D.7 安定性試験-EGF(A)類似体の精製
EGF(A)類似体の逆相精製中のピーク形状および解像度のカルシウムの効果
N末端延長EGF(A)類似体の逆相クロマトグラフィー中のピーク形状および分離品質に対するカルシウムの効果[Leu301、Arg309、Glu312]EGF(A)（配列番号：6）を評価した。EGF(A)類似体を組み換え方法によって製造し、合計5g EGF(A)の類似体をC18カラムに充填し、10カラムの量を超える直線邸エタノール勾配で溶出した。この勾配のための緩衝液は、中性ランのための0.6%w/w（50mm） pH7.5、または酸性ランのための0.5%v/vギ酸のいずれかを含む。50%w/wエタノールを含む緩衝液と含まない緩衝液を直線的エタノール勾配を得るために使用した。精製は、すべての緩衝液中で25ｍMの塩化カルシウムの非存在または存在下で実施した。使用された方法の詳細は、節B4 RP01に記載されている。
精製のクロマトグラム（図4）は、カルシウムの存在がより鋭いピークをもたらし、これば生成物の精製を容易にすることを示す。
D.8.1 安定性試験-pHおよびエタノールの効果
異なるpH濃度およびエタノール濃度でのEGF(A)類似体の安定性を評価するために、異なる二つの緩衝液系を独立した実験で使用して、pH3.0〜pH11.0の範囲をカバーした。緩衝液系1は、pH3.0〜7.5をカバーし、緩衝液系2はpH7.5〜11.0をカバーする。各緩衝液系について、異なる96の溶媒組成物を以下の方法で予じめ混合する:
1.低pHの緩衝液（pH3.0またはpH7.5のいずれかに調節）および高pHの緩衝液（pH7.5またはpH11.0のいずれかに調節）を8とおりの異なる比で混合して、それぞれpH3.0〜pH7.5およびpH7.5〜pH11.0の間の値を得る。混合後の合計容積は300μlである。
2.次に、これらの緩衝液に12の異なる量の有機修飾剤を加え、0〜70%w/wのエタノール濃度を得る。
3.カルシウムを含有する実験では、ある一定量の1M CaCl2原液を加えて、最終カルシウム濃度を得る。
4.水を加えて、各ウェルに1.0 gの溶媒となるための合計重量を得る。
96個の異なる溶媒系を調製した後、各系の90μlを96ウェルプレートに移し、10mg/mlのEGF(A)類似体原液を10μl加え、溶液を混合する。プレートは、500rpmに設定された回転振盪器上で、所定時間の間、所定の温度で保存される。50μlの試料を各ウェルから取り出し、50μlの水で希釈する。その後、試料を純度決定のためにUPLCによって分析する（節B4:UPLC12）。
スクリーニングに使用した緩衝液は、以下のとおりであった:
カルシウムの非存在下において、および25ｍMカルシウムの存在下において、配列番号：6によって特定されるEGF(A)類似体のLeu301、Arg309およびGlu312の置換を含むN末端拡張EGF(A)類似体の主要アイソフォームの濃度（パーセント）を図5に示してある。UPLC分析は、室温で3日後に実施し、不純物のレベルは、プロットの濃さを増大させることによって示してある。結果は、[Leu301、Arg309、Glu312]EGF(A)の安定性が25ｍMのカルシウムの存在下で劇的に増大し、これが主なアイソフォームが安定しているpH範囲、並びにエタノール濃度を拡大する。
D.9.1 安定性試験-アシル化条件下
301L、309R、312E、313K、333Kを有するEGF(A)類似体（配列番号：32）および実施例化合物128（インビトロ合成によって製造）の安定性は、様々な濃度のCaCl2の存在下におけるアシル化条件下で試験された。
EGF(A)類似体およびその誘導体、25mg/mL（5.5mM）の濃度でMQ水中に溶解し、pH11.5に調節した。
0ｍM、1ｍM、2.5ｍM、5ｍM、10ｍMまたは25ｍM CaCl2を含む並列試料っをEGF(A)類似体で調製し、同様に0mMまたは10mM CaCl2を含む並列試料を実施例化合物128で調製した。
時点では、5μLの反応混合物を95μLの9:9:2水／アセトニトリル／酢酸に加えることにより停止させ、続いてUPLC01上で分析した。純粋な化合物の％を、UPLC01勾配の4.0〜16.0分の間の積分面積の因数として決定し、t＝0分での出発材料の純度に関して修正した。
配列番号：32のEGF(A)類似体について得られた結果を図6Aに示し、実施例化合物128についての結果を図6Bに示す。どちらも、カルシウム濃度依存的な安定性を示すものの、配列番号：32のペプチドバックボーン[301L、309R、312E、313K、333K]EGF(A)は、その置換バージョンよりもずっと脆弱である。
D.9.2 安定性試験-製造時
アシル化プロセスに対するカルシウムの効果を例示的化合物128の調製中に評価した。
配列番号：32のEGF(A)ペプチド類似体を0ｍMまたは10ｍM CaCl2を含有するMQ水中に濃度25mg/mL（5.5mM）で溶解し、pH 11.5に調節した。
置換基HOOC-(CH2)14-CO-gGlu-2xADO-を提供するアシル化試薬Ａ（2.4当量）を、10分間にわたり室温で加え、0.1M NaOHの自動添加によって反応全体を通してpHが一定に維持した。時点では、5μLの反応混合物を95μLの9:9:2水／アセトニトリル／酢酸に加えることにより停止させ、続いてUPLC01で分析した。純粋な生成物の％を、UPLC01勾配の4.0〜16.0分の間の積分面積の因数として決定し、t＝0分での出発材料（配列番号：32）の純度に関して修正した（t=-10分）。
図7に含まれる結果は、CaCl2の存在下でより速く、より完全なアシル化反応が得られることを示す。
D.9.3 安定性試験-製造時
アシル化反応が、一連の化合物の製造について評価され、これらの化合物はすべて、置換基の付着のために、5〜10mM CaCl2の存在下で、pH11.5で、上記（方法E）で説明したように製造された。
ペプチドバックボーンの開始濃度は、開始濃度が約10mg/mLであった実施例化合物153を除き、約20mg/mLであった。データは、UPLC分析用サンプルを引き出すことにより、アシル化試薬の添加開始から時間経過に伴い得られた（方法UPLC01またはUPLC C11）。
実施例化合物133、143、144、151および153の製造は、以下のバックボーンペプチドのアシル化により得られた：配列番号：98（294W、301L、309R、312E、333K、化合物133、143および144）、配列番号：104（301L、309R、312E、321E、328K、333K、化合物151）および配列番号：105（301L、309R、312E、321E、324K、333K、化合物153）。他の箇所で説明したように、アシル化試薬Ａは実施例化合物144、151および153の生成に使用され、アシル化試薬Bは、実施例化合物133に使用され、アシル化試薬Cは、実施例化合物143に使用された。
図8に示す結果は、実施例化合物133、143、144、151および153がカルシウムイオン含有反応混合物で効率的に生成されることを示す。化合物143に見られるように、ペプチドバックボーン濃度が低下すると、わずかに遅い反応が観察される。
結論として、データは、Ca2+が試験したすべてのEGF(A)類似体および誘導体を安定化することを実証する。
D.10.1 安定性試験-保存製剤
製剤にカルシウムイオンを加えることの安定化効果、純度損失に対する効果。
20mM Tris、pH7.4、13mg/mlプロピレングリコール、58ｍMフェノールからなる製剤に、カルシウムイオンを加えることにより、一連の製剤を製剤化して、潜在的な安定化効果（純度損失の減少）を調べた。
二つの異なる濃度1.0mg/ml（0.19mM）および6.7mg/ml（1.27mM）の二つのEGF(A)化合物を試験した。
実施例化合物3（301L、309R、312E、333K ｗ．置換基333K）を以下のように試験した。1.0mg/mlの濃度について8とおりのカルシウム濃度を使用した。カルシウムイオンの比率に応じて、カルシウムイオンをCaCl2として、0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0および10の比で化合物に加えた。6.7mg/mlの濃度については、1.0の比のみを使用した。
実施例化合物18（301L、309R、312E、321E、333K ｗ．置換基333K）を以下のように試験した。1.0mg/mlの濃度について9とおりのカルシウム濃度を使用した。カルシウムイオンの比率に応じて、カルシウムイオンをCaCl2として、0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、5.0および10の比で化合物に加えた。6.7mg/mlの濃度については、1.0の比のみを使用した。
製剤は、各構成要素の原液を次の順序で混合することによって製剤化した:Tris、フェノール、プロピレングリコール、CaCl2、MQ水（ほとんどがこれである）、化合物、pHを0.1N HClおよび0.1N NaOHを使用して調整し、残りのMQ水。
各製剤を滅菌濾過し、1200μlを2.0mLガラスバイアルに満たし、37℃で温度制御キャビネットに静かに保存した。
カルシウムの存在下における熱ストレスを与えた類似体の化学的安定性（すなわち、純度損失）は、不純物を示す安定性の分離に最適化されたRP-UPLC-02（節B4-純度方法）によって評価した。安定性を示す純度方法は、CSH C18カラムに基づいており、方法の節でさらに説明されている。純度方法は、類似体溶液中にCa2+が存在するときに適合することが示され、含有物/類似体の損失は、観察されなかった（データは示さず）。類似物の純度は、出発試料および37℃で2、4、6週間培養された試料の主要ピーク領域の積分から決定した。
両方の化合物について、カルシウム:化合物比が増加すると、製剤が37℃で静的に保存されたときの純度の損失が低減された。6.7mg/mlの化合物濃度を持つ製剤についての結果も、安定化の程度を決定するのがカルシウム対APIの比であることを示す。
毎月の劣化は、データの線形補間によって計算され、図9に示されている。
上述のように製造された実施例化合物133、142、144、151および153について類似の研究を実施した。
上述のとおり製造された熱ストレスを与えた類似体の化学的安定性（すなわち、純度損失）は、不純物を示す安定性の分離に最適化されたRP-UPLC-02（節B4）によって評価した。
純度損失（%）は、出発試料および37℃で2週間または4週間培養した試料の主要ピーク面積の積分から決定した。図10を参照されたい。
試験した類似物の優れた化学安定性が、5mM Ca2+の存在下において、高低いずれの類似体濃度でも観察された。
D.10.2 安定性試験-保存製剤-HMWP形成
製剤にカルシウムイオンを加える効果の安定化、HMWP形成に対する効果。
20mM Tris、pH7.4、13mg/mlプロピレングリコール、58mMフェノールからなる製剤に、カルシウムイオンを加えることにより、一連の製剤を製剤化して、潜在的な安定化効果（HMWP形成の低下）を調べた。
五つの化合物（実施例化合物133、143、144、151および153）の安定性を1.0mg/mlおよび20mg/mlの濃度で試験した。
各製剤は、カルシウムイオンを添加せずに試験し、また5.0mM CaCl2を添加して試験した。製剤を複製して、上記の例に記載したとおりに製剤化したが、平底ガラスHPLCバイアルに充填し、温度管理キャビネットで37℃で静的に保存した。製剤を、HMWPについて、共有結合二量体およびオリゴマーを検出するSEC-UPLC法により解析した。ここではHMWP（試料中の二量体／オリゴマーパーセント）で定義される。共有HMWP法は、BEH125Åカラムおよび0.15%のTFA v/vおよび60%アセトニトリルv/vの溶媒に基づいた。以下の条件を使用した:カラム温度:40℃、流量:0.3mL/分、波長:215nmおよび溶出:イソクラティック。試料は、製造の直後（0日）、およびそれぞれ14日、28日、56日後にも分析した。
結果は、37℃で保存されたときの純度損失は、5mM CaCl2が製剤に含められたとき、すべての試験化合物について実質的に小さいことを示す（図11）。
要約すると、ここでもCa2+は、試験された全ての化合物の安定性を増加させることが示されており、その効果は、一部の化合物について他の化合物よりも顕著である。
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (15)

  1. EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体、および二価陽イオンを含む医薬組成物であって、前記EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体が、配列番号：1により定義されるLDL-RのEGF(A)ドメインのEGF(A)ペプチド類似体を含み、301Leuを含む、医薬組成物。
  2. 前記組成物が液体製剤である、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 前記組成物がカルシウムイオンを含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  4. 前記組成物がCaCl2を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記組成物が、前記EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体に対して、0.1〜50当量の二価陽イオン（Ca2+など）を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記組成物が、緩衝液、防腐剤、等張化剤およびキレート剤のうちの一つまたは複数などの医薬品として容認できる賦形剤をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記EGF(A)ペプチド類似体が321Gluをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 請求項1〜7のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記EGF(A)ペプチド類似体がさらに、
    i. 312Lysのアミノ酸置換および310Aspを含み、または
    ii. 310Aspを含み、ペプチドが299AspのGlu、ValまたはHisへの置換を有さない、
    医薬組成物。
  9. 前記EGF(A)化合物が、少なくとも一つの脂肪酸基を含む少なくとも一つの置換基を含むEGF(A)誘導体である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 少なくとも一つの置換基が、以下からなる群から選択されるEGF(A)ペプチド類似体中のLys残基に付着される、請求項9に記載の医薬組成物：292Lys、293Lys、294Lys、296Lys、299Lys、300Lys、303Lys、305Lys、306Lys、309Lys、311Lys、312Lys、313Lys、314Lys、315Lys、316Lys、318Lys、320Lys、321Lys、322Lys、323Lys、324Lys、325Lys、326Lys、327Lys、328Lys、329Lys、330Lys、332Lysおよび333Lys。
  11. 請求項1〜10のいずれか一項で定義されたEGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体を製造する方法であって、前記EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体が、少なくとも一工程において二価陽イオン（カルシウムイオンなど）の存在下で処理される、方法。
  12. 精製工程がカルシウムイオンの存在下で実施される、請求項11に記載の方法。
  13. 置換基の付着がカルシウムイオンの存在下で実施される、請求項11に記載の方法。
  14. 前記カルシウムイオンの濃度が、前記EGF(A)ペプチド類似体、EGF(A)化合物またはEGF(A)誘導体の濃度の0.5〜50当量、例えば1.0〜40当量、例えば2.0〜30当量、例えば2.0〜40当量、例えば5.0〜25当量である、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 置換基を付着するとき、pHが10を越えてまで増大する、請求項12または13に記載の方法。
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