JP2014525922A - Ｎ−グリコシル化インスリン類似体 - Google Patents

Ｎ−グリコシル化インスリン類似体 Download PDF

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Abstract

Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を含む組成物および製剤を記載する。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体をインビボで製造し、それは、高マンノースまたはフコシル化もしくは非フコシル化ハイブリッド、少マンノースまたは複合Ｎ−グリカンから選択される１以上のＮ−結合Ｎ−グリカンを含む。他の実施形態においては、高マンノースまたはフコシル化もしくは非フコシル化ハイブリッド、少マンノースまたは複合Ｎ−グリカンを含むＮ−グリカンを該インスリン類似体にインビトロで結合させる。Ｎ−グリカンの例には、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１１年８月８日付け出願の米国仮出願第６１／５２１，１４２号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
発明の分野
本発明は、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を含む組成物および製剤に関する。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体はインビボで製造され、高マンノースまたはフコシル化もしくは非フコシル化ハイブリッド、少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）または複合Ｎ−グリカンから選択される１以上の該Ｎ−結合グリカンを含む。他の実施形態においては、高マンノースまたはフコシル化もしくは非フコシル化ハイブリッド、少マンノースまたは複合グリカンを含むオリゴ糖またはグリカンを該インスリン類似体にインビトロで結合させる。
インスリンは、ヒトを含むほとんどの高等真核生物において適切なグルコースレベルを維持するのに不可欠なペプチドホルモンである。糖尿病は、個体がインスリンを産生できない又はインスリン抵抗性を生じさせる疾患である。Ｉ型糖尿病は、膵臓のインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊から生じる糖尿病の一形態である。ＩＩ型糖尿病は、インスリン抵抗性および相対的インスリン欠乏の状態における高血糖により特徴づけられる代謝障害である。Ｉ型またはＩＩ型糖尿病を有する個体は、治療されないで放置されると死亡する。インスリンは、根治薬ではないものの、実質的に全ての形態の糖尿病におけるグルコースを低下させるのに有効である。残念ながら、その薬理学的特性はグルコース感受性ではなく、したがって、それは、生命を脅かす低血糖を招きうる過剰作用を引き起こす可能性がある。調和性を欠く薬理学特性がインスリン療法の特徴であり、したがって、低血糖の発生を伴うことなく血液グルコースを正常化することは極めて困難である。更に、天然インスリンは短い作用持続時間を有し、それを基礎グルコースの制御における使用に適したものにするための修飾を要する。インスリン療法における１つの中核的目標は、１日１回の時間的作用をもたらしうるインスリン製剤の設計である。インスリン投薬の作用時間を延長させる方法は、注射部位におけるインスリンの溶解度を減少させること、または糖、ポリエチレングリコール、疎水性リガンド、ペプチドもしくはタンパク質を該インスリンに結合させることを含む。
インスリンの溶解度を減少させるための分子的アプローチは、（１）亜鉛および／またはプロタミンを含有する不溶性懸濁液としてインスリンを製剤化すること、（２）アミノ酸の置換および／または付加（例えば、生理的ｐＨにおいて該分子を不溶性にするカチオン性アミノ酸）により、その等電点を増加させること、あるいは（３）インスリンの溶解度を減少させ血清アルブミンに結合する疎水性リガンドを含むようにインスリンを共有結合により修飾することを含む。これらのアプローチの全ては、注射部位における該分子の沈殿と共に生じる、ならびに後続の該分子の再可溶化および活性ホルモンの形態での血液への輸送と共に生じる固有の可変性により制限されている。たとえ、インスリンの再可溶化がより長い作用持続時間をもたらすとしても、インスリンは血清グルコースレベルに対して尚も応答性ではなく、低血糖のリスクが依然として存在する。
インスリンは、低い効力の一本鎖プロインスリン前駆体から酵素的プロセシングにより生合成的に誘導される二本鎖ヘテロ二量体である。ヒトインスリン類似体は、ジスルフィド結合により互いに結合しており合計５１アミノ酸を有する２本のペプチド鎖、すなわち、「Ａ鎖ペプチド」（配列番号３３）および「Ｂ鎖ペプチド」（配列番号２５）からなる。Ｂ鎖のＣ末端領域およびＡ鎖の２つの末端は、インスリン受容体への高アフィニティ結合のための部位を構成する三次元構造で会合する。該インスリン分子はＮ−グリコシル化を含有しない。
インスリン分子は、該分子の薬物動態学的または薬力学的特性を修飾するための試みにおいて、種々の部分を該分子に連結することにより修飾されている。例えば、アシル化インスリン類似体が、例えば米国特許第５，６９３，６０９号および第６，０１１，００７号を含む幾つかの刊行物に開示されている。例えば米国特許第５，６８１，８１１号、第６，３０９，６３３号、第６，３２３，３１１号、第６，８９０，５１８号、第６，８９０，５１８号および第７，５８５，８３７号を含む幾つかの刊行物には、ＰＥＧ化インスリン類似体が開示されている。例えば国際公開番号ＷＯ０６０８２１８４、ＷＯ０９０８９３９６、ＷＯ９０１０６４５、米国特許第３，８４７，８９０号、第４，３４８，３８７号、第７，５３１，１９１号および第７，６８７，６０８号を含む幾つかの刊行物には、糖結合インスリン類似体が開示されている。ＰＥＧ化などのためのグリカン構造を含有させるための、インスリンを含むペプチドのリモデリングが、例えば米国特許第７，１３８，３７１号および米国公開出願第２００９００５３１６７号を含む刊行物に開示されている。
本明細書に開示されているとおり、本出願人は、Ｎ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体、該Ｎ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体を含む組成物および製剤、ならびにそれらの製造方法を提供する。これらのＮ−グリコシル化インスリン類似体はインスリン受容体において活性であり、Ｎ−グリカン基の種々の組合せが該インスリンまたはインスリン類似体に種々の修飾された薬物動態学的および／または薬力学的特性を付与する。
発明の簡潔な概要
本発明は、Ｎ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体、該Ｎ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体を含む組成物および製剤、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の製造方法、ならびに該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の使用方法を提供する。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は１以上のＮ−グリカンを含み、各Ｎ−グリカンは、コンセンサスＮ−結合グリコシル化部位のアスパラギン残基に結合しており、該インスリンまたはインスリン類似体のインビボ発現およびプロセシング中に該タンパク質に結合する。他の実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、インビトロで該分子のアミノ酸残基に連結された１以上のＮ−グリカンを含む。他の実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は少なくとも２つのＮ−グリカンを含み、それらのうちの１つは、Ｎ−結合グリコシル化部位を含むアスパラギン残基にインビボで連結され、それらのうちの１つは該分子のアミノ酸残基にインビトロで連結される。該Ｎ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体（ならびにそれらを含む組成物および製剤）は、インスリン療法を要するＩ型およびＩＩ型糖尿病個体を治療するのに有用である。
したがって、特定の実施形態においては、インスリンのＡ鎖ペプチドまたはその機能的類似体およびＢ鎖ペプチドまたはその機能的類似体を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、Ａ鎖もしくはその機能的類似体またはＢ鎖アミノ酸もしくはその機能的類似体のアミノ酸残基の少なくとも１つはＮ−グリカンに共有結合しており、該インスリンまたはインスリン類似体は３つのジスルフィド結合を有する。第１ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の６位および１１位のシステイン残基の間に存在し、第２ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の７位およびＢ鎖またはその機能的類似体の７位のシステイン残基の間に存在し、第３ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の２０位およびＢ鎖またはその機能的類似体の１９位のシステイン残基の間に存在する。
したがって、特定の実施形態においては、アミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３３）を含むＡ鎖ペプチドおよびアミノ酸配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１６１）を含むＢ鎖ペプチドを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、該Ａ鎖またはＢ鎖アミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つはＮ−グリカンに共有結合しており、該インスリンまたはインスリン類似体は、１７個までのアミノ酸置換を更に含んでいてもよく、ならびに／または該Ａおよび／もしくはＢ鎖ペプチドのＮ末端に、該Ａ鎖および／もしくはＢ鎖のＣ末端に、あるいはＮ末端において該Ｂ鎖のＣ末端に、およびＣ末端において該Ａ鎖のＮ末端に、あるいはそれらの組合せで共有結合している３〜３５アミノ酸のポリペプチドを更に含んでいてもよい。該インスリンまたはインスリン類似体は３つのジスルフィド結合を有し、第１ジスルフィド結合は配列番号３３の６位および１１位のシステイン残基の間に存在し、第２ジスルフィド結合は配列番号１６１の３位および配列番号３３の７位のシステイン残基の間に存在し、第３ジスルフィド結合は配列番号１６１の１５位および配列番号３３の２０位のシステイン残基の間に存在する。
他の実施形態においては、前記組成物は、前記のとおりの複数のグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含み、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、ここで、該組成物中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）Ｎ−グリカンからなる。もう１つの実施形態においては、前記組成物は、前記のとおりの複数のグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含み、ここで、特定の高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカン種が、主要な又は唯一のＮ−グリカンである。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
更に、（ａ）複数のＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、（ｂ）医薬上許容される担体とを含む医薬製剤を提供し、ここで、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、該製剤中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカンからなる。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、該インスリンのアミノ酸残基に該Ｎ−グリカンを化学的に結合させることによりインビトロで製造されることが可能であり、あるいは該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、インビボで製造されうる。他の態様においては、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。適当な宿主細胞には、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作された昆虫、植物、酵母または糸状菌宿主細胞、例えば、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
更に、インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、溶液中のインスリンまたはインスリン類似体を安定化させ、あるいは溶液中のインスリンまたはインスリン類似体の原線維化を低減するための方法を提供し、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体より、溶液中で安定であり、または低減した原線維化を有する。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、主に又は専ら、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
特定の実施形態においては、該インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に該Ｎ−グリカンを化学結合させることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させて、グリコシル化されていないインスリンまたはインスリン類似体と比較して溶液中の安定性の増強または原線維化の低減を示すグリコシル化インスリンを得、あるいは、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、グリコシル化されていないインスリンまたはインスリン類似体と比較して溶液中の安定性の増強または原線維化の低減を示すグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。他の態様においては、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。
もう１つの実施形態においては、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子（該インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、それにおいてコードされているインスリンまたはインスリン類似体内にＮ−結合グリコシル化部位を導入するために修飾されている）を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）培地内に分泌される該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、（ｅ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、グリコシル化されていないインスリンまたはインスリン類似体と比較して溶液中の安定性の増強または原線維化の低減を示すグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。
適当な宿主細胞には、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作された昆虫、植物、酵母または糸状菌宿主細胞、例えば、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
更に、１以上のＮ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、そのような１以上のＮ−グリカンを有するインスリン類似体は、グリコシル化されていないインスリンまたはインスリン類似体と比較して溶液中の安定性の増強または原線維化の低減を示す。もう１つの実施形態においては、該組成物は、複数のＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、（ｂ）医薬上許容される担体とを含み、ここで、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、該組成物中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカンからなる。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。一般に、該組成物は、本明細書に示されているインビボまたはインビトロ方法により製造される。
更に、インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性を変化させるための方法を提供し、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性は、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化している。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を主に又は専ら有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
特定の実施形態においては、該インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に該Ｎ−グリカンを化学結合させることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させて、グリコシル化インスリンを得、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性は、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化しており、あるいは、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性は、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化している。
もう１つの実施形態においては、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子（該インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、それにおいてコードされているインスリンまたはインスリン類似体内にＮ−結合グリコシル化部位を導入するために修飾されている）を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）培地内に分泌される該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、（ｅ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性は、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化している。
適当な宿主細胞には、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作された昆虫、植物、酵母または糸状菌宿主細胞、例えば、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
更に、１以上のＮ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、そのような１以上のＮ−グリカンを有するインスリン類似体は、そのような１以上のＮ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化した薬物動態学的または薬力学的特性を有する。もう１つの実施形態においては、該組成物は、複数のＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、（ｂ）医薬上許容される担体とを含み、ここで、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、該組成物中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカンからなる。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。一般に、該組成物は、本明細書に示されているインビボまたはインビトロ方法により製造される。
更に、インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に、末端ガラクトース残基を含むＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、肝臓内の受容体を主に標的化するインスリンまたはインスリン類似体の製造方法を提供し、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は肝臓内の受容体を主に標的化する。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を主に又は専ら有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
特定の実施形態においては、該インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に該Ｎ−グリカンを化学結合させることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させて、肝受容体を主に標的化するグリコシル化インスリンを得、あるいは、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、肝受容体を主に標的化するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。他の態様においては、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。
もう１つの実施形態においては、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子（該インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、それにおいてコードされているインスリンまたはインスリン類似体内にＮ−結合グリコシル化部位を導入するために修飾されている）を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）培地内に分泌される該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、（ｅ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、肝受容体を主に標的化するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。もう１つの実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造を有する、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される構造を有するフコシル化または非フコシル化グリカンからなる。
適当な宿主細胞には、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作された昆虫、植物、酵母または糸状菌宿主細胞、例えば、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
更に、１以上のＮ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、そのような１以上のＮ−グリカンを有するインスリン類似体は肝臓内の受容体を主に標的化する。もう１つの実施形態においては、該組成物は、複数のＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、（ｂ）医薬上許容される担体とを含み、ここで、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、該組成物中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカンからなる。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。一般に、該組成物は、本明細書に示されているインビボまたはインビトロ方法により製造される。
更に、インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合（コンジュゲート化）させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、糖尿病の治療に使用された場合にグルコースの血清濃度に感受性である該コンジュゲートの薬物動態学的または薬力学的特性の少なくとも１つを有するインスリンまたはインスリン類似体の製造方法を提供し、ここで、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、グルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有する。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を主に又は専ら有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。
特定の実施形態においては、該インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に該Ｎ−グリカンを化学結合させることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させて、グルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有するグリコシル化インスリンを得、あるいは、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、グルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。他の態様においては、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。
もう１つの実施形態においては、（ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、（ｂ）インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子（該インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、それにおいてコードされているインスリンまたはインスリン類似体内にＮ−結合グリコシル化部位を導入するために修飾されている）を該宿主細胞内に導入し、（ｃ）培地内に分泌される該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、（ｄ）該Ｎ−グリカンを含むグリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、（ｅ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工（プロセシング）して、グルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させて、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得る。
適当な宿主細胞には、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作された昆虫、植物、酵母または糸状菌宿主細胞、例えば、ヒト様Ｎ−グリカンまたは主に特定のＮ−グリカン種を産生するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が含まれる。
更に、１以上のＮ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物を提供し、ここで、そのような１以上のＮ−グリカンは、そのような１以上のＮ−グリカンを有するインスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性の少なくとも１つを、糖尿病の治療に使用された場合にグルコースの血清濃度に対して感受性にする。もう１つの実施形態においては、該組成物は、複数のＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、（ｂ）医薬上許容される担体とを含み、ここで、各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合した少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、該組成物中の主要な又は唯一のＮ−グリカンは高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノースＮ−グリカンからなる。例えば、該Ｎ−グリカン種は、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子である。他の実施形態においては、主要な又は唯一のＮ−グリカンはＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択される。一般に、該組成物は、本明細書に示されているインビボまたはインビトロ方法により製造される。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該Ｎ−グリカンはβ１結合でＡｓｎ残基のアミド基に共有結合している。更に詳細な実施形態においては、該Ａｓｎ残基は天然Ａ鎖ペプチドのアミノ酸１０もしくは２１位または天然Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸３、２５または２８位に存在する。ただし、該ＡｓｎがＢ鎖の３位に存在する場合には、該Ｂ鎖ペプチドの５位のアミノ酸はＳｅｒまたはＴｈｒであり、該ＡｓｎがＡ鎖の２１位に存在する場合には、Ａ鎖は該ＡｓｎのＣ末端にアミノ酸配列Ｘａａ−ＳｅｒまたはＸａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）のジペプチドを更に含む。更に詳細な実施形態においては、該ＡｓｎはＡ鎖ペプチドの２１位に存在し、Ａ鎖ペプチドは該ＡｓｎのＣ末端にアミノ酸配列Ｘａａ−ＳｅｒまたはＸａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）のジペプチドを更に含む。特定の実施形態においては、ＸａａはＬｙｓ、ＡｒｇまたはＧｌｙである。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を有するトリペプチドがＡ鎖のＮ末端にペプチド結合で共有結合している。特定の実施形態においては、ＸａａはＴｈｒである。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を有するトリペプチドがＢ鎖のＮ末端にペプチド結合で共有結合している。特定の実施形態においては、ＸａａはＴｈｒである。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を有するトリペプチドがＢ鎖のＣ末端にペプチド結合で共有結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、Ａ鎖ペプチドのＮ末端、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端、Ｂ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロン−アミノ基またはいずれかの他の利用可能なアミノ基がＣ１−２０アルキル基に共有結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンはＡ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドのＮまたはＣ末端のアミノ酸残基において該インスリンまたはインスリン類似体に結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンはヒスチジン、システインまたはリシン残基において該インスリンまたはインスリン類似体に結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、該インスリンまたはインスリン類似体は、Ａ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドを含むヘテロ二量体分子であり、この場合、Ａ鎖ペプチドは２つのジスルフィド結合により該Ｂ鎖に共有結合しており、あるいは、Ａ鎖ペプチドを含む一本鎖分子が接続ペプチドによりＢ鎖に連結されており、この場合、Ａ鎖とＢ鎖とは２つのジスルフィド結合により共有結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、Ｂ鎖ペプチドの１〜４位および／または２６〜３０位の１以上のアミノ酸が欠失している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、該アミノ酸置換は、Ａ鎖ペプチドの５、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、１８および２１位ならびにＢ鎖ペプチドの１、２、３、４、５，９、１０、１３、１４、１７、２０、２１、２２、２３、２６、２７、２８、２９および３０位から選択される。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、Ａ鎖ペプチドの２１位のアミノ酸はＧｌｙであり、Ｂ鎖はジペプチドＡｒｇ−Ａｒｇを含み、これは、Ｂ鎖ペプチドの３０位のＴｈｒに共有結合している。
前記実施形態のいずれかの更に詳細な態様においては、Ｂ鎖ペプチドは３０位のトレオニン残基を欠く。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の組成物を提供し、ここで、該組成物中のＮ−グリカンは高マンノースＮ−グリカン、フコシル化または非フコシル化ハイブリッドＮ−グリカン、少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）Ｎ−グリカン、複合Ｎ−グリカン（二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）または多アンテナ（ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）Ｎ−グリカンを含む）またはそれらの組合せからなる。典型的なＮ−グリカンには、限定的なものではないが、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ここで、整数は糖残基の数を示す）からなる群から選択される構造を有するフコシル化または非フコシル化Ｎ−グリカンが含まれる。一般に、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体はインスリン受容体における天然インスリンの活性の少なくとも２０％を有しうる。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体はインスリン受容体における天然インスリンの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有しうる。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、本発明で提供するグリコシル化インスリンまたは類似体組成物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ここで、整数は糖残基の数を示す）からなる群から選択される少なくとも１つのハイブリッドＮ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。
特定の実施形態においは、該ハイブリッドＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該ハイブリッドＮ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。該ハイブリッドＮ−グリカンがＮＡＮＡ残基を含む特定の実施形態においては、該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２，６結合で結合しており、あるいは該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２、３結合で結合している。
更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、本発明で提供するグリコシル化インスリンまたは類似体組成物は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧｌｃ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ここで、整数は糖残基の数を示す）からなる群から選択される少なくとも１つの複合Ｎ−グリカンを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。
特定の実施形態においは、該複合Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。該複合Ｎ−グリカンがＮＡＮＡ残基を含む特定の実施形態においては、該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２，６結合で結合しており、あるいは該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２，３結合で結合している。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該Ｎ−グリカンはフコシル化されている。一般に、該フコースは該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃに対するα１，３結合、該Ｎ−グリカンの還元末端におけるＧｌｃＮＡｃに対するα１，６結合、該Ｎ−グリカンの非還元末端における糖に隣接した又は該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧａｌ（ガラクトース）に対するα１，２結合、該Ｎ−グリカンのの非還元末端付近の又は該Ｎ−グリカンの非還元末端におけるＧｌｃＮＡｃに対するα１，３結合またはα１，４結合で存在する。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該グリコフォーム（糖形態）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ）からなる群から選択されるグリコフォームを生成するようにα１，３結合またはα１，６結合フコースで存在し、あるいはＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２（Ｆｕｃ１−２）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択されるグリコフォームを生成するようにα１，３結合またはα１，４結合フコースで存在し、あるいはＧａｌ（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２（Ｆｕｃ１−２）ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（ここで、整数は糖残基の数を示す）からなる群から選択されるグリコフォームを生成するようにα１，２結合で存在する。
特定の態様においは、該フコシル化Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該主要フコシル化Ｎ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。
更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。該フコシル化Ｎ−グリカンがＮＡＮＡ残基を含む特定の実施形態においては、該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２，６結合で結合しており、あるいは該ＮＡＮＡはガラクトース残基にα２，３結合で結合している。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンはフコシル化および非フコシル化多アンテナＮ−グリカン種を更に含む。特定の態様においては、該フコシル化または非フコシル化多アンテナＮ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。
更に詳細な態様においは、該主要フコシル化または非フコシル化多アンテナＮ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該複合Ｎ−グリカンは二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）Ｎ−グリカン種を更に含む。特定の態様においては、該二分岐Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該主要二分岐Ｎ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該グリコシル化インスリンまたは類似体は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される高マンノースＮ−グリカン、またはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造（ここで、整数は糖残基の数を示す）からなるＮ−グリカンからなる。
特定の態様においては、該Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該主要Ｎ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。
前記実施形態のいずれかの特定の態様においては、該Ｎ−グリカンはＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２、またはＭａｎＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧｌｃＮＡｃＭａｎＧｌｃＮＡｃ２構造からなるＮ−グリカンでありうる。特定の態様においては、該Ｎ−グリカンは該組成物中の主要Ｎ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該主要Ｎ−グリカンは、該組成物中のＮ−グリカンの約３０モル％、４０モル％、５０モル％、６０モル％、７０モル％、８０モル％、９０モル％、９５モル％、９７モル％、９８モル％、９９モル％または１００モル％を構成する特定のＮ−グリカン種である。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％はグリコシル化されている。更に詳細な態様においては、該組成物中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は該Ｎ−グリカンを含む。
本発明を構成するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、それに結合したＮ−グリカンが高マンノシル化Ｎ−グリカン、または別のマンノース残基にβ結合で結合した１以上のマンノース残基を含むＮ−グリカンである実施形態を除く。
更に、糖尿病治療用の組成物または製剤の製造のための、Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の使用を提供する。更に、糖尿病治療用の、本明細書に開示されている組成物を提供する。例えば、それは、アミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３３）を含むＡ鎖ペプチドおよびアミノ酸配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１６１）を含むＢ鎖ペプチドを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と、糖尿病治療用の医薬上許容される担体とを含み、ここで、Ａ鎖またはＢ鎖アミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つは該Ｎ−グリカンに結合しており、該インスリンまたはインスリン類似体は、所望により、１７個までのアミノ酸置換、および／またはＮ末端、Ｃ末端に共有結合している３〜３５アミノ酸のポリペプチドを更に含むことが可能であり、あるいはそれは、Ｎ末端においてＢ鎖のＣ末端に共有結合しており、Ｃ末端においてＡ鎖のＮ末端に結合している。
定義
本明細書中で用いる「インスリン」なる語は、動物体内の炭水化物の代謝に影響を及ぼす、そして糖尿病の治療に重要である、膵臓の活性因子を意味する。この語は、天然に存在するインスリンと構造、使用および意図される効果において同じである又は類似している、糖尿病の治療において重要な、合成により及びバイオテクノロジーにより誘導された産物を含む。
「インスリン」または「インスリン分子」なる語は、配列番号３３に示されているアミノ酸配列を有するＡ鎖ペプチドと、配列番号２５に示されているアミノ酸配列を有するＢ鎖ペプチドとを含む５１アミノ酸のヘテロ二量体であって、Ａ鎖の６位のシステイン残基と１１位のシステイン残基とがジスルフィド結合で連結されており、Ａ鎖の７位のシステイン残基とＢ鎖の７位のシステイン残基とがジスルフィド結合で連結されており、Ａ鎖の２０位のシステイン残基とＢ鎖の１９位のシステイン残基とがジスルフィド結合で連結されているヘテロ二量体を示す総称である。
本明細書中で用いる「インスリン類似体」なる語は、天然Ａ鎖ペプチドおよび／またはＢ鎖ペプチドの修飾の１以上を含む任意のヘテロ二量体類似体または一本鎖類似体を含む。修飾には、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置における天然アミノ酸を或るアミノ酸で置換すること、Ｂ１〜４およびＢ２６〜３０位のいずれか又は全てを欠失させること、あるいは１以上のアシル、ポリエチレングリシン（ＰＥＧ）または糖部分（単数または複数）を直接的に又は重合体もしくは非重合体リンカーにより結合させること、あるいはそれらのいずれかの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に開示されているＮ−結合グリコシル化インスリン類似体により例示されているとおり、この語は更に、少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を有するように修飾された任意のインスリンヘテロ二量体および一本鎖類似体を含み、特に、該Ｎ−結合グリコシル化部位がＮ−グリカンに連結されている又はＮ−グリカンにより占有されている実施形態を含む。インスリン類似体の例には、公開国際出願ＷＯ２０１０００８０６０６、ＷＯ２００９／０９９７６３およびＷＯ２０１００８０６０９（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているヘテロ二量体および一本鎖類似体が含まれるが、これらに限定されるものではない。一本鎖インスリン類似体の例には、公開国際出願ＷＯ９６３４８８２、ＷＯ９５５１６７０８、ＷＯ２００５０５４２９１、ＷＯ２００６０９７５２１、ＷＯ２００７１０４７３４、ＷＯ２００７１０４７３６、ＷＯ２００７１０４７３７、ＷＯ２００７１０４７３８、ＷＯ２００７０９６３３２、ＷＯ２００９１３２１２９；米国特許第５，３０４，４７３号および第６，６３０，３４８号；ならびにＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１−９８６（１９９５）（それらの開示のそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているものも含まれるが、これらに限定されるものではない。
「インスリン類似体」なる語は更に、インスリン受容体における検出可能な活性をほとんど又は全く有さないが、天然インスリンと比較してインスリン受容体における活性の少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％を示す、インスリン受容体における活性を有するように１以上のアミノ酸修飾または置換を含むように修飾されており、少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を更に含む一本鎖およびヘテロ二量体ポリペプチド分子を含む。特定の態様においては、該インスリン類似体は、天然インスリンと比較してインスリン受容体における２倍〜１００倍低い活性を有する部分アゴニストである。他の態様においては、該インスリン類似体、例えば、公開国際出願ＷＯ２０１００８０６０７（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているＩＧＦＢ１６Ｂ１７誘導体ペプチドは、インスリン受容体における増強した活性を有する。インスリン成長ホルモン受容体における低減した活性およびインスリン受容体における増強した活性を有するこれらのインスリン類似体はヘテロ二量体および一本鎖類似体の両方を含む。
本明細書中で用いる「一本鎖インスリン」または「一本鎖インスリン類似体」なる語は、天然インスリンと比較してインスリン受容体におけるインスリンの活性の少なくとも１％、１０％、５０％、７５％または９０％を有する、Ａ鎖ペプチドまたは機能的類似体とＢ鎖ペプチドまたは機能的類似体とが２〜３５アミノ酸のペプチドもしくはポリペプチドまたは非ペプチド重合体もしくは非重合体リンカーにより共有結合している構造的に関連したタンパク質の一群を含む。該一本鎖インスリンまたはインスリン類似体は更に、３つのジスルフィド結合を含み、第１ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の６位および１１位のシステイン残基の間に存在し、第２ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の７位およびＢ鎖またはその機能的類似体の７位のシステイン残基の間に存在し、第３ジスルフィド結合はＡ鎖またはその機能的類似体の２０位およびＢ鎖またはその機能的類似体の１９位のシステイン残基の間に存在する。
本明細書中で用いる「接続ペプチド」または「Ｃ−ペプチド」なる語は一本鎖プレ−プロインスリン様分子のＢ−Ｃ−Ａポリペプチド配列の接続部分「Ｃ」を意味する。特に、天然インスリン鎖においては、Ｃ−ペプチドはＢ鎖の３０位のアミノ酸とＡ鎖の１位のアミノ酸とを接続する。この語は、天然インスリンＣペプチド（配列番号３０）、サルＣ−ペプチド、およびＢ鎖をＡ鎖に接続する３〜３５アミノ酸のいずれかの他のペプチドの両方を意味しうる。したがって、それは、一本鎖インスリン類似体（例えば、米国公開出願第２００９０１７０７５０号および第２００８００５７００４号ならびにＷＯ９６３４８８２を参照されたい）において並びにＷＯ９５１６７０８および米国特許第７，１０５，３１４号に開示されているようなインスリン前駆体分子においてＢ鎖ペプチドをＡ鎖ペプチドに連結する任意のペプチドを含むと意図される。
本明細書中で用いる「プレ−プロインスリン類似体前駆体」なる語は、プレ−プロインスリン類似体前駆体を宿主細胞の分泌経路へと標的化するリーダーペプチドを含む融合タンパク質を意味し、ここで、該リーダーペプチドはＢ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチド類似体のＮ末端に融合しており、該Ｂ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチド類似体はＣペプチドのＮ末端に融合しており、そして該Ｃペプチドは、そのＣ末端において、Ａ鎖ペプチドまたはＡ鎖ペプチド類似体のＮ末端に融合している。該融合タンパク質は、所望により、該リーダーペプチドのＣ末端と該Ｂ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチド類似体のＮ末端との間に１以上の伸長またはスペーサーペプチドを含みうる。該伸長またはスペーサーペプチドは、存在する場合には、Ｂ鎖またはＢ鎖類似体のＮ末端を発酵中のプロテアーゼ消化から保護しうる。天然ヒトプレ−プロインスリンは、配列番号３５に示されているアミノ酸配列を有する。
本明細書中で用いる「プロインスリン類似体前駆体」なる語は、該プレ−プロインスリン類似体前駆体のシグナルまたはプレペプチドが除去されている分子を意味する。
本明細書中で用いる「インスリン類似体前駆体」なる語は、プロインスリン類似体前駆体のプロペプチドが除去されている分子を意味する。該インスリン類似体前駆体は、所望により、Ｂ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチド類似体のＮ末端に、伸長またはスペーサーペプチドを含みうる。該インスリン類似体前駆体は、Ｃペプチドを含むため、一本鎖分子であるが、該インスリン類似体前駆体は、ヒトインスリンの場合と同様に、適切に配置された（３つの）ジスルフィド架橋を含有し、１以上の後続の化学的および／または酵素的プロセシングにより、ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体に変換されうる。
本明細書中で用いる「リーダーペプチド」なる語は、プレペプチド（シグナルペプチド）とプロペプチドとを含むポリペプチドを意味する。
本明細書中で用いる「シグナルペプチド」なる語は、タンパク質の前駆体形態上にＮ末端ペプチドとして存在するプレペプチドを意味する。シグナルペプチドの機能は、それが結合している発現ポリペプチドの、小胞体内へのトランスロケーションを促進することである。シグナルペプチドは通常、この過程の経過中に切断除去される。シグナルペプチドは、該ポリペプチドを製造するために使用される生物に対して異種または同種でありうる。使用されうる幾つかのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチドまたはいずれかの機能的類似体（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉら，ＹＥＡＳＴ ６：１２７ １３７（１９９０）および米国特許第５，７２６，０３８号）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）接合因子α１遺伝子（ＳｃＭＦα１）遺伝子のシグナルペプチド（Ｔｈｏｒｎｅｒ（１９８１）Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編，ｐｐ １４３ １８０，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹおよび米国特許第４，８７０，００８号）が含まれる。
本明細書中で用いる「プロペプチド」なる語は、それが結合している発現ポリペプチドが小胞体からゴルジ装置へと、そして更には培地内への分泌のために分泌小胞へと導かれること（すなわち、細胞壁を越えて、または少なくとも細胞膜を越えて酵母細胞の周辺腔内に運ばれる、該ポリペプチドの輸出）を可能にする機能を有するペプチドを意味する。該プロペプチドはＳｃＭＦα１でありうる（米国特許第４，５４６，０８２号および第４，８７０，００８号を参照されたい）。あるいは、プロペプチドは、合成プロペプチド、すなわち、天然で見出されないプロペプチド、例えば米国特許第５，３９５，９２２号、第５，７９５，７４６号および第５，１６２，４９８号ならびにＷＯ９８３２８６７に開示されているもの（これらに限定されるものではない）でありうる。プロペプチドは、好ましくは、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位、例えばＬｙｓ−Ａｒｇ配列またはそのいずれかの機能的類似体を含有する。
本明細書中で「インスリン」なる語と共に用いる「ｄｅｓＢ３０」または「Ｂ（１−２９）」なる語は、Ｂ３０アミノ酸残基を欠くインスリンＢ鎖ペプチドを意味すると意図され、「Ａ（１−２１）」はインスリンＡ鎖を意味する。
本明細書中で用いる「直接的にＮ末端に」なる語は、あるアミノ酸残基またはペプチド配列が、そのＣ末端において、別のアミノ酸残基またはアミノ酸配列のＮ末端にペプチド結合により直接的に結合している状況を示すと意図される。
本明細書中で用いるアミノ酸「修飾」は、該アミノ酸への又はアミノ酸からの化学基の付加および／または除去によるアミノ酸の誘導体化またはアミノ酸の置換を意味し、ヒトタンパク質において一般に見出される２０種のアミノ酸および非定型または非天然アミノ酸のいずれかでの置換を含む。非定型アミノ酸の商業的入手源には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）が含まれる。非定型アミノ酸は商業的供給業者から購入され、新たに合成され、または天然アミノ酸から化学修飾もしくは誘導体化されうる。
本明細書中で用いるアミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と交換することを意味する。本出願の全体において、文字および数字による特定のアミノ酸位置に対する全ての言及（例えば、Ａ５位）は、それぞれの天然ヒトインスリンＡ鎖（配列番号３３）またはＢ鎖（配列番号２５）におけるＡ鎖（例えば、Ａ５位）またはＢ鎖（例えば、Ｂ鎖）のその位置のアミノ酸、あるいはそのいずれかの類似体における対応アミノ酸位置を意味する。
「糖タンパク質」なる語は、１以上のオリゴ糖が共有結合している１以上の結合基を含む一本鎖インスリン類似体などのいずれかのグリコシル化インスリン類似体を含むと意図される。
本明細書中で用いる「Ｎ−結合グリコシル化部位」はトリペプチドアミノ酸配列ＮＸ（Ｓ／Ｔ）またはＡｓｎＸａａ（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を意味し、ここで、「Ｎ」はアスパラギン（Ａｓｎ）残基を表し、「Ｘ」はプロリン（Ｐｒｏ）以外の任意のアミノ酸（Ｘａａ）を表し、「Ｓ」はセリン（Ｓｅｒ）残基を表し、「Ｔ」はトレオニン（Ｔｈｒ）残基を表す。
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（糖形態）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合グリコシル化部位を含む結合基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖基自体を意味する。該Ｎ−グリカンオリゴ糖基は、アスパラギン以外のいずれかのアミノ酸残基にインビトロで、あるいはＮ−結合グリコシル化部位を含むアスパラギン残基にインビボで結合されうる。
「Ｎ−結合グリカン」なる語は、還元末端におけるＮ−アセチルグルコサミン残基が該タンパク質中の結合基のアスパラギン残基のアミド窒素にβ１結合で結合したＮ−グリカンを意味する。
本明細書中で用いる「Ｎ−結合グリコシル化」および「Ｎ−グリコシル化」なる語は互換的に用いられ、アスパラギン残基またはＮ−結合グリコシル化部位もしくはモチーフを含む結合基に結合したＮ−グリカンに関するものである。
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカンコンジュゲート」なる語は、結合基にインビトロでコンジュゲート化（結合）されたＮ−グリカンを意味する。該結合基はアスパラギン残基を含んでいても含んでいなくてもよい。
本明細書中で用いる「グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体」なる語は、Ｎ−グリカンがインビボまたはインビトロで結合しているインスリンまたはインスリン類似体を意味する。
本明細書中で用いる「インビボグリコシル化」または「インビボＮ−グリコシル化」または「インビトロＮ−結合グリコシル化」は、インビボ（すなわち、Ｎ−結合グリコシル化によりポリペプチドを発現するグリコシル化細胞における翻訳後プロセシング中）で生じるＮ−結合グリコシル化部位へのアスパラギン残基へのオリゴ糖またはグリカン部分の結合を意味する。厳密なオリゴ糖構造は、該グリコシル化タンパク質またはポリペプチドを製造するために使用される宿主細胞に大きく左右される。
本明細書中で用いる「インビトログリコシル化」なる語は、Ｎ−グリカンコンジュゲートを得るために、場合によっては架橋剤を使用して、ポリペプチドの結合基にコンジュゲート化または連結されうる官能基を有するＮ−グリカンを共有結合させることを通常は含む、インビトロで行われる合成グリコシル化を意味する。インビトログリコシル化は更に、該タンパク質またはポリペプチドを化学合成することを含み、この場合、Ｎ−グリカンに共有結合したアミノ酸が該タンパク質またはポリペプチド内に合成中に取り込まれる。インビボおよびインビトログリコシル化は後記に更に詳細に記載されている。
「結合基」なる語は、巨大分子物質、例えばオリゴ糖もしくはグリカン、重合体分子、親油性分子または有機誘導体化剤に共有結合しうる、該ポリペプチドの、特に、そのアミノ酸残基の官能基を示すと意図される。
インビボＮ−グリコシル化の場合、「結合基」なる語は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）を含む「Ｎ−結合グリコシル化部位」または「Ｎ−グリコシル化部位」を構成するアミノ酸残基を示すために、通常でない様態で用いられる。Ｎ−グリコシル化部位のアスパラギン（Ｎ）残基は、グリコシル化中にオリゴ糖またはグリカン部分が結合する部位であるが、そのような結合は、該Ｎ−グリコシル化部位のその他のアミノ酸残基が存在しない限り達成され得ない。該Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体前駆体は、インビボＮ−グリコシル化を可能にする「結合基」を構成する全３個のアミノ酸を含むが、該Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体は後に、Ｘおよび／またはＳ／Ｔを欠失するようにプロセシングされうる。したがって、コンジュゲート化がＮ−グリコシル化により達成されることになる場合、ポリペプチドのアミノ酸配列の改変に関して用いられる「オリゴ糖またはグリカンのための結合基を構成するアミノ酸残基」なる語は、機能的Ｎ−グリコシル化部位が該アミノ酸配列内に導入されるように、Ｎ−グリコシル化部位を構成する１以上のアミノ酸残基が改変されることになることを意味すると理解されるべきである。該結合基は該インスリン類似体前駆体内に存在しうるが、該ヘテロ二量体インスリン類似体においては、該オリゴ糖またはグリカンに連結されるアスパラギン（Ｎ）ではない該結合部位を構成するアミノ酸残基の１つ又は２つが除去されうる。例えば、インスリン類似体前駆体は、それぞれＢ２８、２９および３０位においてＮＫＴからなる結合基を含みうるが、該類似体の成熟ヘテロ二量体は、３０位のＴが除去されたｄｅｓＢ３０インスリン類似体でありうる。
一般に、巨大分子物質のための結合基を伴う導入アミノ酸残基を含む本明細書に開示されているコンジュゲートの場合、該巨大分子物質は該導入アミノ酸残基に結合することが好ましい。より詳しくは、該巨大分子物質のための結合部位として本明細書に特に示されている位置に関しては、本発明のコンジュゲートは、少なくとも、該位置の１つに結合した巨大分子物質を含むと一般に理解される。
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）の共通の五糖コアを有する。通常、Ｎ−グリカン構造は、非還元末端を左側に、そして還元末端を右側にして表される。Ｎ−グリカンの還元末端は、該タンパク質上のグリコシル化部位を含むＡｓｎ残基が結合している末端である。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「少（ｐａｕｃｉ）マンノースコア」とも称されるＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される周辺糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分岐（アンテナ）の数において異なる。Ｎ−グリカンは、その分岐（分枝）構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５個以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、１，３マンノースアームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃとを有する。複合Ｎ−グリカンは、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」が挙げられ、ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基をも有しうる。複合Ｎ−グリカンは、コアフコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換をも有しうる。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、トリマンノースコアの１，３マンノースアームの末端における少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃと、トリマンノースコアの１，６マンノースアーム上の０個以上のマンノースとを有する。Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造からなるＮ−グリカンは少（ｐａｕｃｉ）マンノースと称される。前記の種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム（糖形態）」とも称される。
複合Ｎ−グリカンに関しては、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は以下を意味する。「Ｇ−２」は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ−１」なる語は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられうるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ０」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ１」なる語は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ｇ２」なる語は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ１」なる語は、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味し、「Ａ２」なる語は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられるＮ−グリカン構造を意味する。特に示されていない限り、「Ｇ−２」、「Ｇ−１」、「Ｇ０」、「Ｇ１」、「Ｇ２」、「Ａ１」および「Ａ２」なる語は、Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコースを欠くＮ−グリカン種を意味する。該用語が「Ｆ」を含む場合、「Ｆ」は、該Ｎ−グリカン種が該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基上にフコース残基を含有することを示す。例えば、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ａ１ＦおよびＡ２Ｆは全て、Ｎ−グリカンが、該Ｎ−グリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合したフコース残基を更に含むことを示す。酵母および糸状菌のような下等真核生物は、通常、フコースを示すＮ−グリカンを産生しない。
多アンテナＮ−グリカンに関しては、「多アンテナＮ−グリカン」なる語は、該Ｎ−グリカンの１，６アームもしくは１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基上のＧｌｃＮＡｃ残基、または該Ｎ−グリカンの１，６アームおよび１，３アームの非還元末端を含むマンノース残基のそれぞれにおいてＧｌｃＮＡｃ残基を更に含むＮ−グリカンを意味する。したがって、多アンテナＮ−グリカンは、式ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（２−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられうる。「１−４」なる語は１、２、３または４個の残基を意味する。
二分岐Ｎ−グリカンに関しては、「二分岐Ｎ−グリカン」なる語は、ＧｌｃＮＡｃ残基が該Ｎ−グリカンの非還元末端においてマンノース残基に結合している、Ｎ−グリカンを意味する。二分岐Ｎ−グリカンは式ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により特徴づけられることが可能であり、ここで、各マンノース残基はその非還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。これに対して、多アンテナＮ−グリカンがＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２として特徴づけられる場合、該式は、２つのＧｌｃＮＡｃ残基が、Ｎ−グリカンの、２つのアームの一方の非還元末端において、マンノース残基に結合しており、１つのＧｌｃＮＡｃ残基が、該Ｎ−グリカンの他方のアームの非還元末端において、マンノース残基に結合していることを示す。
本明細書中で用いる略語は、当技術分野において一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」が含まれ、これらは全て、糖ペプチドＮ−グリコシダーゼ、グリコペプチダーゼ、Ｎ−オリゴ糖グリコペプチダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ、グリコペプチダーゼ、タチナタマメ グリコペプチダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グリコペプチドＮ−グリコシダーゼ（ＥＣ３．５．１．５２；旧称ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。
本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、後の世代において、ある修飾が生じうるため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞でありうる。宿主細胞は、糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母、真菌、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞および原核生物および古細菌でありうる。
糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル百分率」または「モル％」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、グリコフォーム組成により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ−結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２は、遊離したグリカンの５０％がＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｇａｌ２ＮＡＮＡ２であり、残りの５０％が他のＮ−結合オリゴ糖から構成されることを意味する。いくつかの実施形態においては、糖タンパク質の調製物中の特定のグリカンのモル％は２０％〜１００％、好ましくは２５％超（すなわち、２５％を超える）、３０％超、３５％超、４０％超または４５％超、より好ましくは５０％超、５５％超、６０％超、６５％超または７０％超、最も好ましくは７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超である。
「機能的に連結」された発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するように、関心のある遺伝子に隣接して連結された発現制御配列、ならびに関心のある遺伝子を制御するように、トランスで又は或る距離を隔てて作用する発現制御配列を意味する。
「発現制御配列」または「調節配列」なる語は互換的に用いられ、本明細書中で用いられる場合には、それが機能的に連結されているコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増加させる配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに望ましい場合には、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物によって異なり、原核生物においては、そのような制御配列には、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「制御配列」なる語は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての成分を含むと意図され、存在すると有利である追加的な成分、例えばリーダー配列および融合相手の配列をも含みうる。
「トランスフェクト」、「トランスフェクション」、「トランスフェクトする」などの語は、高等真核細胞および下等真核細胞の両方を含む真核細胞内への異種核酸の導入を意味する。歴史的には、原核生物、酵母または真菌細胞内への核酸の導入を示すために「形質転換」が用いられてきたが、任意の原核または真核細胞（酵母および真菌細胞を含む）内への核酸の導入を示すために「トランスフェクション」なる語も用いられる。更に、原核または真核細胞内への異種核酸の導入はウイルスもしくは細菌感染または射撃ＤＮＡ導入によっても行われることが可能であり、「トランスフェクション」なる語は、適当な宿主細胞におけるこれらの方法を表すためにも用いられる。
「真核生物」なる語は有核細胞または生物を意味し、昆虫細胞、植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞および下等真核細胞を意味する。
「下等真核細胞」なる語は酵母および糸状菌を含む。酵母および糸状菌には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。
本明細書中で用いる「から実質的になる」なる語は、示されている整数または整数群の包含を示唆する一方で、示されている整数に対して著しい影響または改変をもたらす修飾または他の整数の除外を示唆するものと理解される。例えば、インスリンまたはインスリン類似体に結合しているＮ−グリカンの種に関しては、示されているＮ−グリカン「から実質的になる」なる語は、特定のＮ−グリカン種に関して、該Ｎ−グリカンがフコースを欠くグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と比較して該フコースが該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体に実質的に影響を及ぼさない限り、該Ｎ−グリカンが、糖タンパク質のアスパラギン残基に直接結合するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）においてフコシル化されているか否かにかかわらず、該Ｎ−グリカンを含むと理解される。
本明細書中で用いる「主に」なる語、またはその派生語、例えば「主要（主な）」または「優勢である」は、インスリン類似体をＰＮＧアーゼで処理し、遊離グリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳまたはＨＰＬＣにより分析した後、全中性Ｎ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「主に」なる語は、ある個々の実体（例えば、特定のグリコフォーム）が他のいずれの個々の実体よりも大きなモル％で存在する場合として定義される。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを「主として（主に）」含み、種Ｂは２番目に優勢（主要）な種ということになろう。幾つかの宿主細胞は、中性Ｎ−グリカン、および荷電Ｎ−グリカン、例えばマンノシルホスファートを含む組成物を産生しうる。したがって、糖タンパク質の組成物は複数の荷電および非荷電または中性Ｎ−グリカンを含みうる。本発明においては、主要Ｎ−グリカンが決定されるのは、該組成物中の全体的な複数の中性Ｎ−グリカンの状況においてである。したがって、本明細書中で用いる「主要Ｎ−グリカン」は、該組成物中の全体的な複数の中性Ｎ−グリカンのうち、該主要Ｎ−グリカンが、特定の構造のものであることを意味する。
本明細書中で用いる、フコースまたはガラクトースなどのような特定の糖残基を「実質的に含有しない」なる語は、糖タンパク質組成物が、そのような残基を含有するＮ−グリカンを実質的に欠くことを示すために用いられる。純度に関して表されている場合、実質的に含有しないは、そのような糖残基を含有するＮ−グリカン構造の量が１０％以下、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満であり、ここで、該比率は重量％またはモル％である。したがって、本明細書に開示されているインスリン類似体組成物におけるＮ−グリカン構造体の実質的に全ては、例えば、フコースまたはガラクトースまたはそれらの両方を含有しない。
本明細書において、インスリン類似体組成物がフコースまたはガラクトースのような特定の糖残基を「欠く」または「欠いている」と示されるのは、検出可能な量のそのような糖残基がいずれの時点においても該Ｎ−グリカン構造体上に存在しない場合である。例えば、本発明の好ましい実施形態においては、該インスリン類似体組成物は、酵母（例えば、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、アスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．））を含む前記の下等真核生物により産生されるが、これらの生物の細胞は、フコシル化Ｎ−グリカン構造体を産生するのに必要な酵素を有さないため、該糖タンパク質組成物は「フコースを欠く」であろう。したがって、「フコースを実質的に含有しない」なる語は「フコースを欠く」なる語を含む。しかし、組成物が一時的にフコシル化Ｎ−グリカン構造体を含有していた、または限られた量であるが検出可能な量の前記フコシル化Ｎ−グリカン構造体を含有する場合であっても、該組成物は「フコースを実質的に含有しない」ものとされうる。
本明細書中で用いる「医薬上許容される担体」なる語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エマルション、例えば油／水または水／油エマルション、および種々のタイプの湿潤剤のいずれかを含む。該用語はまた、ヒトを含む動物における使用に関して米国連邦政府の規制機関により承認された又は米国薬局方に収載されている物質のいずれかを含む。
本明細書中で用いる「医薬上許容される塩」なる語は、親化合物の生物活性を保有し生物学的に又はその他の点で不都合でない、化合物の塩を意味する。本明細書に開示されている化合物の多くは、アミノおよび／もしくはカルボキシル基またはそれらに類似した基を有するため、酸および／または塩基塩を形成しうる。
医薬上許容される塩基付加塩は無機および有機塩基から製造されうる。無機塩基由来の塩には、単なる例示としてであるが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基由来の塩には、第一級、第二級および第三級アミンの塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
医薬上許容される酸付加塩は無機および有機酸から製造されうる。無機酸由来の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸由来の塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエン−スルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書中で用いる「治療」なる語は特定の障害もしくは状態の予防、特定の障害もしくは状態に関連した症状の緩和および／または該症状の予防もしくは除去を含む。例えば、本明細書中で用いる「糖尿病を治療する」なる語は、一般に、血液グルコースレベル（血糖値）を正常レベル付近に維持することを意味し、与えられた状況に応じて血液グルコースレベルを増加または減少させることを含む。
本明細書中で用いる、インスリン類似体の「有効」量または「治療的有効量」は、所望の効果を与える、インスリン類似体の無毒性であるが十分な量を意味する。例えば、１つの所望の効果は高血糖の予防または治療であろう。「有効」である量は、個体の年齢および全身状態、投与方法などに応じて、対象によって変動するであろう。したがって、厳密な「有効量」を特定することが常に可能なわけではない。しかし、いずれかの個々の場合における適当な「有効」量は、通常の実験を用いて当業者により決定されうる。
「非経口」なる語は、消化管経由ではなく、何らかの他の経路、例えば鼻腔内、吸入、皮下、筋肉内、髄腔内または静脈内によるものであることを意味する。
本明細書中で用いる「薬物動態」なる語は、インスリンまたはインスリン類似体の、該タンパク質の遊離、吸収、分布、代謝および消失に関連した分野で一般に用いられるインビボ特性を意味する。そのような薬物動態学的特性には、用量、投与間隔、濃度、消失速度、消失速度定数、曲線下面積、分布体積、任意の組織または細胞におけるクリアランンス、血液中のタンパク質分解、バイオアベイラビリティ、血漿への結合、半減期、初回通過消失、抽出比、Ｃｍａｘ、ｔｍａｘ、Ｃｍｉｎ、吸収速度および変動が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書中で用いる「薬力学」なる語は、インスリンまたはインスリン類似体の、該タンパク質の生理的効果に関連した分野において一般に用いられるインビボ特性を意味する。そのような薬物動態学的特性には、最大グルコース注入速度、最大グルコース注入速度までの時間、およびグルコース注入速度曲線下面積が含まれるが、これらに限定されるものではない。
発明の詳細な説明
本発明は、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体分子、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体分子を含む組成物および医薬製剤、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の製造方法、ならびに該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の使用方法を提供する。該組成物および製剤は糖尿病の治療および療法に有用である。
１つの実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、結合部位を含むアスパラギン残基にβ１結合で結合したＮ−グリカンをそれぞれが含む１以上の結合基を含むＮ−結合グリコシル化インスリン類似体である。Ｎ−結合グリコシル化のための少なくとも１つの結合基を有するインスリン類似体をコードする核酸分子が、糖タンパク質を産生しうる宿主細胞において発現される場合、前駆体形態および成熟形態の両方のインスリン類似体は、該結合基を含むアスパラギン残基に連結された、該インスリン類似体上の少なくとも１つのＮ−結合グリカンを含むであろう。特定の実施形態においては、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体ヘテロ二量体へのＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体のプロセシングは、機能的結合基を含むアミノ酸残基の１つ又は２つの除去をもたらしうる。
もう１つの実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体はＮ−グリカンコンジュゲートであり、ここで、インスリンまたはインスリン類似体分子上の結合基はＮ−グリカンにインビトロでコンジュゲート化（結合）されることが可能であり、あるいは該インスリンまたはインスリン類似体分子は、Ｎ−グリカンに共有結合したアミノ酸残基を含むようにインビトロで合成される。
インビボＮ−グリコシル化
Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体分子を含む組成物においては、該組成物中の主要Ｎ−グリカン種は、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の発現に使用される宿主細胞に左右であろう。例えば、１以上の結合部位（例えば、Ｎ−結合グリコシル化部位）を含むインスリン類似体をコードする核酸分子の、哺乳類宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはマウス骨髄腫宿主細胞）における発現は、該哺乳類宿主細胞において産生される糖タンパク質にとってグリコシル化パターンが異種であり典型的なものである、Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体を産生するであろう。現在、未修飾宿主細胞に典型的なＮ−結合グリコシル化パターンとは異なるＮ−結合グリコシル化パターンを有するように遺伝的に修飾された哺乳類宿主細胞は少数しか存在しない（例えば、米国特許公開第２００４０１１０７０４号；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４−２２；ＥＰ １１７６１９５；ＷＯ ０３／０３５８３５；Ｓｈｉｅｌｄｓら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０を参照されたい）。哺乳類宿主細胞において産生されたＮ−結合グリコシル化インスリン類似体の組成物はＮ−グリコシル化の異種パターンを含むが、一般に、特定のグリコフォームが優勢であろう。
植物、糸状菌、酵母、藻類、原核生物および昆虫宿主細胞は、非哺乳類Ｎ−グリカンパターンを有する糖タンパク質を産生する。しかし、これらの宿主細胞（特に酵母宿主細胞）は全て、哺乳類またはヒト細胞において観察されるパターンに類似しているＮ−結合グリコシル化パターンのタイプを制御するためだけでなく、宿主細胞において産生される糖タンパク質の組成物中のどの特定のＮ−グリカン種が優勢になるかを制御するためにも、遺伝的に操作されうる。望ましくないグリコシルトランスフェラーゼを宿主細胞から除去し、グリコシダーゼおよび／またはグリコシルトランスフェラーゼの特定の組合せを導入することにより、これは達成されている。例えば、高マンノシル化Ｎ−グリカンの酵母グリコシル化パターンを産生する能力を喪失させるために遺伝的に操作された酵母宿主細胞（例えば、該酵母宿主細胞は、Ｎ−グリカンに関するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さないように遺伝的に操作される）は、哺乳類グリコシルトランスフェラーゼの種々の組合せを含むように更に操作されている。本明細書に示されているとおり、特定のＮ−グリカン構造が優勢である糖タンパク質を産生するこれらの酵母宿主細胞は、Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体を製造するために使用されている。これらの遺伝的に操作された宿主細胞は、該宿主細胞において産生される糖タンパク質のＮ−グリコシル化パターンを制御する可能性をもたらす。したがって、特定のＮ−グリカン構造が優勢であるＮ−結合グリコシル化インスリン類似体の組成物が提供されうる。しかし、Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体を製造するために使用される宿主細胞には無関係に、一般に、いずれかのＮ−グリカン種の最小多糖単位はＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２であり、ここで、還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基は、Ｎ−結合グリコシル化部位を含むアスパラギン残基に連結されている。しかし、特定の態様においては、該宿主細胞は、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃからなるグリコフォームへとＮ−グリカンを切断する組換え発現酵素を更に含むことが可能であり、あるいは該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ２ＧｌｃＮＡｃ２、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ２またはＧｌｃＮＡｃからなるグリコフォームを産生するようにインビトロで処理されうる。
インスリンはＮ−結合グリコシル化部位を天然では含有せず、したがって、本発明においては、該インスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子は、インスリン類似体をコードする核酸分子を得るために該ヌクレオチド配列内に少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位（結合部位）を導入するために修飾されている。Ｎ−結合グリコシル化部位はトリ−アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含み、ここで、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である。それにおけるアミノ酸突然変異および特定のＮ−結合グリカンは、薬物動態学的（ＰＫ）特性の向上、薬力学的（ＰＤ）特性の向上、低血糖のような副作用の軽減増強（これらに限定されるものではない）を含む、非グリコシル化Ｎ−グリコシル化インスリン類似体と比較した場合の１以上の有益な特性を、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体に付与することが可能であり、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体が、グルコース感受性活性を示すこと、インスリン受容体（ＩＲ）に対するアフィニティと比較して低下した、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）に対するアフィニティを示すこと、ＩＲ−ＡまたはＩＲ−Ｂのいずれかへの優先的な結合を示すこと、インスリン受容体に対するオン・レイト（ｏｎ−ｒａｔｅ）の増加、オン・レイトの減少および／もしくはオフ・レイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）の減少、ならびに／または運搬経路の改変（例えば、皮下、静脈内または筋肉内投与と、経口、鼻腔内または肺投与との違い）を示すことを可能にしうる。例えば、実施例および図４４に示されているとおり、Ｎ−グリカンを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体は、天然インスリンと比較した場合の安定性の増強、ならびに低ｐＨおよび高温で誘発される繊維形成（繊維化）の傾向の低下を示し、特定のＮ−グリカン構造は、該グリコシル化インスリン類似体が、血清中のグルコースの濃度に感受性または応答性であるインスリン受容体における活性を有することを可能にするらしい。
インスリン類似体上のＮ−結合Ｎ−グリカンは前記特性の１以上をもたらすことが可能であり、現在の糖尿病治療に対する有意な改善をもたらしうる。例えば、特定のＮ−結合Ｎ−グリカンは治療用タンパク質のＰＫ／ＰＤ特性を改変することが知られている。現在市販されているインスリン治療剤は、組換えヒトインスリン、およびヒトインスリンの突然変異体（インスリン類似体と称される）からなる。これらの類似体は、アミノ酸突然変異および製剤化バッファーの組合せにより、インビトロおよびインビボ特性の改変を示す。インスリンへのＮ−グリカンの付加は、全ての現在のインスリン療法に欠けている、体内のインスリン作用をモジュレーションするためのもう１つの特質を付加する。糖またはオリゴ糖部分に直接的に又は重合体もしくは非重合体リンカーにより結合したインスリンは、例えば米国特許第３，８４７，８９０号、米国特許第７，３１７，０００号、国際公開番号ＷＯ８１００３５４、ＷＯ８４０１８９６、ＷＯ９０１０６４５、ＷＯ２００４０５６３１１、ＷＯ２００７０４７９７７、ＷＯ２０１００８８２９４およびＥＰ０１１９６５０号に既に記載されている。本明細書に開示されている該グリコシル化インスリン類似体の特徴は、それに結合したＮ−グリカンが天然構造であることである。該Ｎ−グリカンがアスパラギン残基にインビボで連結されている実施形態においては、該連結は、Ｎ−結合グリコシル化能を有するいずれかの生物によりインビボで生成されうる天然化学結合である。
３０年以上にわたって、インスリンの研究者は、既存のインスリン療法を改善するために、化学的リンカーまたはエクスビボ酵素反応を用いて、糖をインスリンに結合させることを記載している。インスリンへの糖部分の化学結合の概念は、生理的血液グルコースレベルに応じてインスリンのバイオアベイラビリティをモジュレーションするための手段として、１９７９年にＭｉｃｈａｅｌ Ｂｒｏｗｎｌｅｅにより最初に導入された（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＆ Ｃｅｒａｍｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０６：１１９０（１９７９））。この最初の提示の大きな欠点は、グリコシル化インスリン誘導体が相互作用するコンカナバリンＡの毒性であった。酵母において産生されたインスリン上のＯ−結合マンノースグリカンの存在を記載している文献報告があるが、このグリカンは混入物とみなされた（Ｋａｎｎａｎら，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２３：１０３５（２００９）；国際公開番号Ｗ０９９５２９３４およびＷＯ２００９１０４１９９）。したがって、１つの実施形態においては、本発明は、少なくとも１つのＮ−グリカンがインビボで結合したＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体（前駆体形態または成熟形態、ヘテロ二量体形態、または一本鎖形態）を提供し、ここで、該Ｎ−グリカンは該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の少なくとも１つの治療特性を改変して、例えば、該インスリンまたはインスリン類似体を、少なくとも１つの修飾された薬物動態学的（ＰＫ）および／または薬力学的（ＰＤ）特性、例えば、血清半減期の延長、溶液中の安定性の改善、グルコース調節性インスリンとなる可能性、または肝臓のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）（Ａｓｈｗｅｌｌ−Ｍｏｒｅｌｌ受容体）のような特定の受容体を標的化する可能性を示す分子にする。
現在、商業的に入手可能な組換えインスリンおよびインスリン類似体を製造するために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が使用されている。これらの３つの生物のうち、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のみが、Ｎ−グリカンをタンパク質に付加する固有能力を有する。一般に、酵母におけるＮ−グリコシル化は、真菌型高マンノースまたは高マンノシル化構造を有するＮ−グリカンを有する糖タンパク質の産生をもたらす。例えば、インスリン受容体（ＩＲ）アイソフォーム選択的インスリン類似体に関する報告において、Ｇｌｅｎｄｏｒｆら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（５）ｅ２０２８８（２０１１）は、真菌型Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株において発現された、Ｂ鎖の２５位のフェニルアラニンがアスパラギン残基で置換された類似体の構築を開示している。該著者は、該グリコシル化類似体がＩＲに結合しないと推定した。真菌高マンノースまたは高マンノシル化構造を含む糖タンパク質が哺乳動物またはヒトに投与された場合、該糖タンパク質は循環から迅速に消失し、幾つかの場合には、望ましくない免疫応答を惹起しうる。しかし、過去１０年の間に、グリコシル化パターンが真菌型から哺乳類またはヒト型へと変化した酵母株が構築された。例えば、本明細書に開示されている糖操作（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を使用して、該糖タンパク質のＮ−グリカン組成が予め決定され、制御されうる。したがって、特定のＮ−グリカンが主要種である糖タンパク質組成物が製造されうる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１（２００６）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＆ Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３８７（２００７）；Ｌｉ ＆ ｄ’Ａｎｊｏｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６７８（２００９）；Ｗｉｌｄｔ ＆ Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３：１１９（２００５）を参照されたい）。したがって、該糖操作酵母形態はＮ−グリコシル化インスリンおよびインスリン類似体の製造に好適である。Ｎ−グリコシル化インスリンは哺乳類細胞において発現されうるが、それは、現在、組換え製造するための実施不可能な手段のようである。なぜなら、哺乳類細胞培養は、最適な細胞生存性および適合性のためには、インスリンの添加を常套的に要するからである。インスリンは正常な哺乳類細胞発酵過程において代謝されるため、分泌されたＮ−グリコシル化インスリン類似体が該細胞により利用されて、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の収率が低下する可能性がある。哺乳類細胞培養の使用のもう１つの欠点は、特定のＮ−グリカンが優勢である組成を得るためにグリカンプロファイルを修飾または特別設計することが現在不可能であることである（Ｓｅｔｈｕｒａｍａｎ ＆ Ｓｔａｄｈｅｉｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３４１（２００６））。
最近の報告は、タンパク質グリコシル化を促進するための原核生物の遺伝的操作を記載している（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉｓｅｔｔ，＆ Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１１ Ａｐｒ ７；Ｐａｎｄｈａｌ，Ｏｗ，Ｎｏｉｒｅｌ，＆ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１１ Ａｐｒ；１０８（４）：９０２−１２；Ｆｉｓｈｅｒら，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｆｅｂ；７７（３）：８７１−８１）。また、古細菌および他の原核生物の種がタンパク質をＮ−グリコシル化することが報告されている（Ｃａｌｏ，Ｇｕａｎ，＆ Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ Ｆｅｂ ２１）。したがって、本明細書に開示されているＮ−結合グリコシル化インスリン類似体は、特定のＮ−グリカンが優勢である糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された原核生物から製造されうる。
本明細書に記載されているＮ−グリコシル化インスリン類似体の製造には多数の利点が存在する。遺伝的に操作された（または糖操作された）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、発酵可能性および収率を含む、インスリンのための他の酵母系インスリン産生系の魅力的な特性をもたらす。遺伝的操作は、酵素反応および精製の処理工程を排除する、インスリン前駆体のインビボ成熟を可能にする。インビボＮ−グリコシル化に関しては、酵母細胞はグリカンの供給源であるため、糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）はＮ−グリカン部分の化学合成または供給を必要とせず、このことは収率の改善をもたらし、原料コストを低下させうる。本明細書に記載されているとおり、インビトロ反応を用いた場合には合成および精製に高くつく可能性のある、ヒト糖タンパク質上に存在するハイブリッドおよび複合Ｎ−グリカン構造を含む特定の主要Ｎ−グリカン構造を有するＮ−グリコシル化インスリンを発現する糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株が選択されうる。更に、リンカードメインおよび非天然グリカンは、幾つかの場合には、Ｎ−結合Ｎ−グリカンより免疫原性であり、それにより、インスリン療法の有効性を低下させうる。最後に、選別されうるＮ−グリカン類似体の量を著しく増加させるために、インスリン上のＮ−結合グリカン構造は酵素反応または化学反応により更に修飾されうる。したがって、純粋に合成的な方法を用いた場合より迅速かつ低コストで、最適なＮ−グリカンが特定されうる。
一般に、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体をコードする核酸分子は、少なくとも１つのコンセンサスＮ−結合グリコシル化部位モチーフ（Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＴｈｒ；ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）をコードするように突然変異されることが可能であり、これは、Ｎ−結合グリコシル化のためにコンピテント宿主細胞において発現された場合、Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体の産生をもたらす。該宿主は、特定のＮ−グリカン構造またはグリコフォームが優勢であるＮ−グリコシル化インスリン類似体を産生する能力を有することが望ましい。特定の主要Ｎ−グリカン種は、臨床プロファイルが改変または改善されるように、特異な機能特性を該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体に付与する。例えば、特定のＮ−グリカン構造は受容体レベルにおける生物活性の相違をもたらす（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲ−Ａ、ＩＲ−Ｂにおける結合を増強および／または低減する）ことが可能であり、あるいはＮ−結合グリコシル化は、グルコース応答特性をもたらす、クリアランスの代替経路、またはより大きな治療指数をもたらす、組織分布（例えば、肝臓への標的化）における相違に影響を及ぼしうる。
現在市販されているインスリン類似体のアミノ酸置換は、しばしば、Ｂ鎖のカルボキシ末端に集中している。インスリン受容体（ＩＲ）への結合を保持するが、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）への結合に劇的な影響を及ぼしうる、この領域内の突然変異が、数十年間の研究により確立された。ＩＧＦ−１Ｒ結合はインスリンに望ましくないと一般に考えられている（Ｚｉｂ ＆ Ｒａｓｋｉｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ ８：６１１（２００６））。インスリン類似体のＰＫおよびＰＤ特性を改変する溶解度およびオリゴマー形成のような、この領域内の突然変異の追加的な影響が存在する。例えば、インスリン類似体であるインスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ）（ＮＯＶＯＬＯＧ）は、プロリン残基がアスパラギン酸で置換された１つのアミノ酸置換をＢ鎖内の２８位に含有する。この置換は、Ｂ２８におけるアスパラギン酸残基の電荷反発による六量体形成の抑制ゆえに、インスリン・アスパルトの迅速な作用発現および短い作用プロファイルをもたらす。インスリン・アスパルトはＩＧＦ−１Ｒ結合の低減をも示す。文献からのデータは、Ｂ鎖の末端に、より負の電荷を有するインスリン類似体が、ＩＧＦ−１Ｒ結合の低減を招くことを示唆している（Ｚｉｂ ＆ Ｒａｓｋｉｎ，前掲；Ｕｃｈｉｏら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３５：２８９（１９９９））。
したがって、本明細書に開示されているＮ−グリコシル化インスリン類似体の１つの実施形態においては、Ｂ鎖の２８位のプロリン残基がアスパラギン残基で置換されており（Ｐ２８Ｎ置換）、これは「ＮＫＴ」のトリ−アミノ酸配列を生成する。Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質の産生のためのコンピテントな宿主細胞、特に、特定のＮ−グリカン種またはグリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された宿主細胞において、Ｎ−結合グリコシル化のための部位を含むＮ−グリコシル化インスリン類似体が発現される場合、該ＮＫＴ配列は該Ｎ−結合グリコシル化部位を与える。
Ｂ鎖の２８位のアスパラギンにおける該インスリン類似体へのＮ−結合Ｎ−グリカンの付加は、インスリン受容体（ＩＲ）における活性を保有するＮ−グリコシル化インスリン類似体を与える。また、Ｂ鎖の２８位のＮ−結合Ｎ−グリカンは、例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の場合には約９１０ダルトン、またはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の場合には約２，２２２ダルトンの推定質量を増加させる（種々のＮ−グリカン構造の分子量に関しては、図２を参照されたい）。Ｂ２８位のＮ−グリカンの流体力学的体積は六量体形成を低減しうる。シアル酸（ＮＡＮＡ）およびその付随負電荷を含有するＮ−グリカンはＩＧＦ−１Ｒとの該類似体の相互作用を更に低減することが可能であり、これは臨床安全プロファイルから望ましいであろう。
Ｎ−グリカンは糖タンパク質の薬物動態学的特性に影響を及ぼすことが知られている。シアル酸組成を有するタンパク質は、シアル酸を含有しない同一タンパク質と比較して改善されたＰＫプロファイルを示す傾向にある。その改善されたＰＫプロファイルは、該タンパク質の流体力学的体積の増加および濾過部位の膜との電荷反発の増加による糸球体における腎クリアランスの低減によるものでありうる（Ｂｏｒｋら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９８：３４９９（２００９））。更に、シアル酸化糖タンパク質は、肝細胞膜におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と相互作用する中性グリカンのマスキングによる肝クリアランスの低減を示しうる。したがって、Ｂ鎖の２８位のＮ−グリカン上のシアル酸残基は迅速作用発現臨床プロファイルをも該類似体にもたらしうる。なぜなら、インスリン・アスパルトと同様に、該負電荷により、六量体形成が抑制されうるからである。しかし、シアル酸化Ｎ−グリコシル化インスリン類似体はインスリン・アスパルトと同様の迅速な作用発現（六量体形成の低減）を示しうるだけでなく、より長い活性持続時間（ＰＫプロファイルの改善）をも示すことにより、インスリン・アスパルトとは異なりうる。該Ｎ−グリカンへのポリシアル酸形態の追加的シアル酸の転移はＰＫプロファイルを更に改善する可能性があるであろう。糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）の追加的株の形質転換により、代替的グリカンの転移が明らかに可能である。
インビトログリコシル化
もう１つの実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体は、結合基がＮ−グリカンにインビトロでコンジュゲート化されているコンジュゲート、またはＮ−グリカンに共有結合したアミノ酸残基を含むように結合基がインビトロで合成されたコンジュゲートである。一般に、該結合基または部位および該Ｎ−グリカンは、該結合基への該Ｎ−グリカンの結合を可能にする、該Ｎ−グリカンの還元末端における機能的部分または基（官能基）を含むであろう。以下の表は、有用な結合基、およびＮ−グリカンを結合部位に結合させうる機能的部分または基を有する活性化Ｎ−グリカンの例を示す。
Figure 2014525922
 特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、直接的に、またはリンカーもしくはスペーサーにより間接的に、結合部位にインビトロでコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは、１〜約６０個の原子、または１〜３０個以上の原子、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子、または１０〜２０個以上の原子の鎖を含む。幾つかの実施形態においては、該鎖原子は全て、炭素原子である。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーのバックボーンにおける鎖原子は、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される。鎖原子およびリンカーまたはスペーサーは、より溶解性のコンジュゲートを得るために、それらの予想溶解度（親水性）に従い選択されうる。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは、標的組織または器官または細胞において見出される酵素もしくは他の触媒または加水分解条件による切断に付される官能基を与える。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーの長さは、立体障害の可能性を低下させるのに十分な程度に長い。該リンカーまたはスペーサーが共有結合またはペプチジル結合であり、インスリン類似体が異種ポリペプチド、例えば免疫グロブリン、免疫グロブリンのＦｃフラグメント、ヒト血清アルブミンにコンジュゲート化されている場合、該コンジュゲート全体は融合タンパク質でありうる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さでありうる。典型的リンカーは約１〜５０アミノ酸長、５〜５０、３〜５、５〜１０、５〜１５、または１０〜３０アミノ酸長である。
特定の実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは（ｉ）１〜７個のメチレン基を有する１、２、３個またはそれ以上の非分枝アルカンα、ω−ジカルボン酸基；（ｉｉ）１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸；あるいは（ｉｉｉ）１、２、３個またはそれ以上のγ−アミノブタニル残基でありうる。特定の実施形態においては、最適なリンカーまたはスペーサーは１、２、３個またはそれ以上のγ−グルタミル残基；１、２、３個またはそれ以上のβ−アラニル残基；１、２、３個またはそれ以上のβ−アスパラギル残基；あるいは１、２、３個またはそれ以上のグリシル残基でありうる。
特定の実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは共有結合；炭素原子；ヘテロ原子、以下のものからなる群から選択される所望により置換されていてもよい基：アシル、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール、ヘテロアリールおよび複素環基；所望により置換されていてもよい２価直鎖状または分枝状飽和または不飽和Ｃ１−３０炭化水素鎖［ここで、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−により置換されていてもよい（Ｒのそれぞれは、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アルアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である）］でありうる。
連結部分の例には、γ−Ｇｌｕ（γＥ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ（γＥγＥ）およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
結合基がアミン、例えば、Ａ鎖ペプチドのＮ末端のアミノ基（Ａ１）、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端のアミノ基（Ｂ１）、Ａ鎖またはＢ鎖ペプチドのリシン残基のイプシロンＮＨ２基あるいはそれらの組合せを含む実施形態においては、Ａ鎖ペプチドのＮ末端またはＢ鎖ペプチドのＮ末端またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、天然ヒトインスリンＡ鎖ペプチド（配列番号３３）またはその類似体と天然インスリンＢ鎖ペプチド（配列番号２５）またはその類似体とを含むグリコシル化インスリン類似体を提供する。
更に、Ｂ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ａ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、天然ヒトインスリンＡ鎖ペプチドまたはその類似体と天然インスリンＢ鎖ペプチドまたはその類似体とを含むグリコシル化インスリン類似体を提供する。
更に、Ａ鎖ペプチドのＮ末端またはＢ鎖ペプチドのＮ末端またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、配列番号３４に示されているアミノ酸配列を有するＡ鎖ペプチドと配列番号２７に示されているアミノ酸配列を有するＢ鎖ペプチドとを含むグリコシル化インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）類似体を提供する。
更に、Ｂ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ａ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２がＮ−グリカンに直接的または間接的に結合している、配列番号３４に示されているアミノ酸配列を有するＡ鎖ペプチドと配列番号２７に示されているアミノ酸配列を有するＢ鎖ペプチドとを含むグリコシル化インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）類似体を提供する。
更に詳細な実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、２８−２９位のＰｒｏ−ＬｙｓがＬｙｓ−Ｐｒｏにより置換されている天然ヒトインスリンＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド（インスリン・リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）、配列番号２９８）、２８位のＰｒｏがＡｓｐ残基により置換されている天然ヒトインスリンＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド（インスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ）、配列番号２９９）、３位のＡｓｎがＬｙｓ残基により置換されており２９位のＬｙｓがＧｌｕ残基により置換されているＢ鎖ペプチド（インスリン・グルリシン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）、配列番号３００）、２９位のＬｙｓがパルミチン酸に結合しており３０位のＴｈｒを欠くＢ鎖（インスリン・デグルデック（ｄｅｇｌｕｄｅｃ）、配列番号３０１）、または２９位のＬｙｓがミリスチン酸に結合しており３０位のＴｈｒを欠くＢ鎖（インスリン・デテミル（ｄｅｔｅｍｉｒ）、配列番号３０２）を含み、ここで、Ａ鎖ペプチドのＮ末端、またはＢ鎖ペプチドのＮ末端、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している。
更に、Ｂ鎖ペプチドの２８位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ａ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２８位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２８位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方およびＢ鎖ペプチドの２８位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、天然インスリンＡ鎖とインスリン・リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）Ｂ鎖ペプチドとを含むグリコシル化インスリン類似体を提供する。
更に、Ｂ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ａ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２８位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方およびＢ鎖ペプチドの２９位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、天然インスリンＡ鎖とインスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ）Ｂ鎖ペプチドとを含むグリコシル化インスリン類似体を提供する。
更に、Ｂ鎖ペプチドの３位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ａ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの３位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、Ｂ鎖ペプチドのＮ末端およびＢ鎖ペプチドの３位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２、またはＡ鎖ペプチドのＮ末端とＢ鎖ペプチドのＮ末端との両方およびＢ鎖ペプチドの３位のＬｙｓのイプシロンＮＨ２が直接的または間接的にＮ−グリカンに結合している、天然インスリンＡ鎖とインスリン・グルリシン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）Ｂ鎖ペプチドとを含むグリコシル化インスリン類似体を提供する。
結合基がＣｙｓ残基を含む実施形態においては、該Ｃｙｓ残基はＡ鎖の６、７および２０位ならびにＢ鎖の７および１９位のＣｙｓ残基のいずれでもない。特定の実施形態においては、該Ｃｙｓ残基はＡおよび／またはＢ鎖のＮおよび／またはＣ末端に存在する。
タンパク質およびペプチドのインビトログリコシル化は当技術分野で公知である。例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５：３２８７−３２９０（２００４）（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は糖ペプチドのインビトロ合成のための方法を開示しており、この場合、ブロモアセチアミジルジシアリル−１１糖（ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２−ＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ）をペプチド内のシステイン残基のスルフヒドリル基に結合させた。Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：２５３７−２５４０（２００３）（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）はシアリル糖ペプチドの固相合成を開示しており、この場合、アスパラギン結合ジシアリル−１１糖Ｆｍｏｃ誘導体（ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２−ＡｓｎＦｍｏｃ）が該ペプチドの合成中に該ペプチド内に取り込まれた。Ｉｔｏら，米国公開出願第２０１０００１６５４７号およびＡｎｄｅｒｓｅｎら，ＷＯ０２０５５５３２（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は種々のグリコシル化ＧＬＰ−１類似体の固相合成を開示しており、この場合、合成中に種々のアスパラギン結合オリゴ糖またはＮ−グリカン構造が該分子内に取り込まれる。Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ（Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３６：１９８９−１９９２（１９９７））、Ｗｅｉｓｓ ＆ Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ（Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４２６１−４２６３（２００３））、Ｅｌｌｅｒら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．５１：２６４８−２６５１（２０１０）およびＤａｖｉｓ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：５７９−６０１（２００２）は全て、複合Ｎ−グリカンをインビトロで化学合成するための開示している。
これらの方法は、分子内のアミノ酸残基に共有結合した特定のＮ−グリカン構造を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を製造するために使用されうる。したがって、特定の実施形態においては、Ｎ−結合グリコシル化のための結合基を含むアミノ酸または結合基（アスパラギン残基以外）に共有結合している本明細書に開示されているＮ−グリカン構造を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を提供する。例えば、１つの実施形態においては、本明細書に開示されているＮ−グリカン構造は、該グリカン分子の還元末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、アセトアルデヒドまたはプロピオンアルデヒド基を有するように化学合成されうる。ついで該Ｎ−グリカンは、インスリンまたはインスリン類似体に、Ｂ２９位のリシン残基において又は該分子内の他の位置の別のアミノ酸から置換されたリシンにおいてコンジュゲート化（結合）されうる。もう１つの実施形態においては、前記インスリン類似体またはインスリンは、Ｎ−グリカン分子の還元末端にスクシンイミジルまたはベンゾトリオール基を有するように合成された本明細書に開示されているＮ−グリカン構造に、Ｂ５のヒスチジン残基において又は該分子内の他の位置のアミノ酸から置換されたヒスチジンにおいてコンジュゲート化されうる。もう１つの実施形態においては、システイン残基を含むように修飾されたインスリン類似体は、Ｎ−グリカン分子の還元末端にマレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミドまたはオルトピリジルジスルフィド基を有するように合成された本明細書に開示されているＮ−グリカン構造にコンジュゲート化されうる。
Ｗａｎｇ，米国特許第７，８０７，４０５号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、均一なＮ−グリコシル化を伴う糖タンパク質を製造するためのインビトロ法を開示している。該方法は、糖タンパク質をエンド−Ａ、エンド−Ｆ、エンド−Ｈまたはエンド−Ｍでインビトロで処理して、該糖タンパク質からＮ−グリカンを除去するが、該糖タンパク質内のアスパラギン残基に結合した還元末端のＧｌｃＮＡｃ残基は残し、ついで該糖タンパク質を、特定のグリカン構造を有する糖オキサゾリンと反応させて、Ｎ−結合グリカンを再構築することを含む。該方法は、糖タンパク質組成物における糖タンパク質の実質的に全てが同一Ｎ−グリカン構造をそれにおいて有する、該糖タンパク質組成物の産生を可能にする。それにおいて開示されている方法は、本明細書に開示されているＮ−グリコシル化インスリン類似体の種々の種を産生させて、それにおけるＮ−グリコシル化インスリン類似体が特定のグリコフォームに関して実質的に均一である組成物を得るために使用されうる。
Ｉ．インスリンのタンパク質工学
１９８０年代の組換えインスリン発現の初期報告の後、突然変異インスリンタンパク質の構造−活性関係に関する多数の研究が報告された。科学文献は、種を越えたインスリンの天然アミノ酸変異を記載している（例えば、Ｃｏｎｌｏｎ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２２：１１８３（２００１）を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発を用いる実験は、結合、物理化学的または機能的特性の改変を伴う置換を示した（Ｋｏｈｎら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２８：９３５（２００７）；Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１２９７８（１９９７）；Ｓｌｉｅｋｅｒら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４０ Ｓｕｐｐｌ ２，Ｓ５４（１９９７））。そのような情報は、インスリン受容体との相互作用に決定的に重要なアミノ酸がＧｌｙＡ１、ＧｌｎＡ５、ＴｙｒＡ１９、ＡｓｎＡ２１、ＶａｌＢ１２、ＴｙｒＢ１６、ＧｌｙＢ２３、ＰｈｅＢ２４およびＰｈｅＢ２５を明らかにした（Ｍａｙｅｒら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ８８：６８７（２００７））。したがって、これらの残基は、グリコシル化による修飾にそれほど魅力的ではない標的に相当しうる。限定的なものではないが、種を越えるアミノ酸変異は超可変領域（Ａ８−Ａ１０）およびＢ鎖の末端において優勢である傾向にあり（Ｃｏｎｌｏｎら，前掲）、グリコシル化修飾のための魅力的な標的に相当しうる。追加的残基が、種を越えて置換または付加されうる。これらのデータに基づいて、置換がインスリン受容体における該分子の活性の変化を全く又は僅かしかもたらさない位置におけるアミノ酸が、該グリカンまたはオリゴ糖の結合のための結合基を得るために修飾されうる（例えば、Ｎ−結合グリコシル化部位を得るために修飾されうる）。特定の実施形態においては、インスリン受容体における活性の僅かな喪失を伴うグリコシル化インスリン類似体が幾つかの用途に有利でありうる。該グリカンが半減期の延長をもたらすグリコシル化インスリン類似体の場合、インビボ活性の喪失は、より長い半減期により取り戻される。
ａ．グリコシル化のためのタンパク質工学
インビボでグリコシル化されるインスリンをコードする核酸分子は、Ｎ−結合グリコシル化のための結合基を含有するように修飾されうる。該グリコシル化インスリン類似体は、２〜３５アミノ酸残基のＣ−ペプチドまたはペプチドドメインがＢ鎖ペプチドとＡ鎖ペプチドとの間に存在する一本鎖インスリン類似体またはヘテロ二量体インスリン類似体でありうる。該ペプチドドメインはインビボＮ−結合グリコシル化のための１以上の結合部位を含みうる。特定の実施形態においては、インビボＮ−グリコシル化のための結合部位はＡ鎖またはＢ鎖またはそれらの両方のＮ末端および／またはＣ末端に配置されうる。
本明細書における具体例（実施例）は、２８位のプロリン残基をアスパラギン残基により置換（Ｐ２８Ｎ置換）することによりＮ−結合グリコシル化部位がＢ鎖内に導入されたＮ−グリコシル化インスリン類似体の製造を例示している。追加的なＮ−結合グリコシル化は、複数のＮ−グリカン占有のために、Ｂ鎖、Ａ鎖またはそれらの組合せの他の位置で生じうる。更に、Ｎ−結合コンセンサスモチーフ（結合基）を生成させるためのアミノ酸置換は、天然野生型ヒトインスリンのアミノ酸配列、当技術分野において現在入手可能な又は記載されているインスリン類似体のいずれかのアミノ酸配列、あるいはいずれかの一本鎖インスリンのアミノ酸配列に施されうる。例えば、Ａ２１位のグリシン残基ならびにＢ３１およびＢ３２位のアルギニン残基のインスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）アミノ酸修飾を含むインスリン類似体は、２８位のプロリンがアスパラギンにより置換されて、アミノ酸配列ＮＫＴを有するＮ−結合グリコシル化部位が生成しているＢ鎖Ｐ２８Ｎ突然変異を更に含みうる。インスリン・グラルジンの、中性ｐＨにおけるその不溶性によるＰＫ特性の改善は、Ｐ２８Ｎ置換、および該アスパラギンへの中性Ｎ−グリカンの転移の場合にも維持されうる。しかし、特定の実施形態においては、Ｐ２８Ｎ置換を有するグリコシル化インスリン・グラルジンは、酸性電荷を伴うＮ−グリカンを有する可能性があり、該分子のｐＩを減少させて、中性ｐＨにおいてそれを溶解性にしうる。そのような分子は、中性ｐＨ不溶性を再獲得するために、該分子の他の位置における追加的なアミノ酸置換を要しうる。図１は、Ｎ−グリカン結合部位を与える該インスリン分子上の幾つかのアミノ酸置換、単一および二重修飾の例を示す。Ｂ−２、Ｂ３、Ｂ２５、Ｂ２８、Ａ−２、Ａ８、Ａ１０およびＡ２１位は、インスリン受容体への該分子の結合能を維持しながらＮ−結合グリコシル化部位を付与するためにアスパラギン残基が導入されうる、該インスリン分子内の部位に相当する。
以下は、Ｎ−グリカンモチーフ（結合基）を含むように修飾されうるインスリンアミノ酸配列の例を示す。以下の配列の組合せは、２以上のＮ−グリコシル化部位またはモチーフを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体分子を作製するために適用されうる。ジスルフィド結合を除去するいずれかの置換も以下には含まれていない。
１．Ｎ−結合グリコシル化部位を与える単一Ｂ鎖置換
Ｂ鎖Ｈ５Ｓ：ＦＶＮＱＳＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号４２）
Ｂ鎖Ｈ５Ｔ：ＦＶＮＱＴＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号４３）
Ｂ鎖Ｆ２５Ｎ：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＮＹＴＰＫＴ（配列番号４４）
Ｂ鎖Ｐ２８Ｎ：ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴ（配列番号２６）
２．Ｎ−結合グリコシル化部位を与える単一Ａ鎖置換
Ａ鎖Ｉ１０Ｎ：ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＮＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号４５）
３．Ｎ−結合グリコシル化部位を与える二重Ｂ鎖修飾
ＮへのＢ鎖置換：Ｎ３，Ｈ５，Ｃ７，Ｌ１７，Ｃ１９，Ｔ２７以外の全ての位置
ＳへのＢ鎖置換：Ｃ７，Ｓ９，Ｃ１９，Ｅ２１，Ｋ２９以外の全ての位置
ＴへのＢ鎖置換：Ｃ７，Ｓ９，Ｃ１９，Ｅ２１，Ｔ２７，Ｋ２９，Ｔ３０以外の全ての位置
Ｂ鎖付加：Ｂ鎖のＮ末端のトリペプチドＮＸＳまたはＮＸＴ（それぞれ、−２、−１および０位）（ここで、Ｆは１位に存在する）；２９位のアミノ酸がＮであり、３０位のアミノ酸がＰでない場合、Ｓ３１またはＴ３１；３０位のアミノ酸がＮであり、３１位のアミノ酸がＰでない場合、Ｓ３２またはＴ３２；１位のアミノ酸がＳまたはＴであり、−１位のアミノ酸がＮである場合、Ｐ以外の０位の任意の残基。
４．Ｎ−結合グリコシル化部位を与える二重Ａ鎖修飾
ＮへのＡ鎖置換：Ｅ４，Ｑ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｓ９，Ｃ１１，Ｎ１８，Ｃ２０，Ｎ２１以外の全ての位置
ＳへのＡ鎖置換：Ｃ６，Ｃ７，Ｔ８，Ｓ９，Ｃ１１，Ｓ１２，Ｌ１３，Ｃ２０以外の全ての位置
ＴへのＡ鎖置換：Ｃ６，Ｃ７，Ｔ８，Ｓ９，Ｃ１１，Ｌ１３，Ｃ２０以外の全ての位置
Ａ鎖付加：Ａ鎖のＮ末端のトリペプチドＮＸＳまたはＮＸＴ（それぞれ、−２、−１および０位）（ここで、Ｇは１位に存在する）；２１位のアミノ酸がＮであり、２２位のアミノ酸がＰでない場合、Ｓ２３またはＴ２３；１位のアミノ酸がＳまたはＴであり、−１位のアミノ酸がＮである場合、Ｐ以外の０位の任意の残基。
該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、Ａ鎖ペプチド、Ｂ鎖ペプチド、またはＡ鎖ペプチドとＢ鎖ペプチドとの両方の置換および／または二重修飾の任意の組合せを含みうる。したがって、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、コンセンサスＮ−結合グリコシル化部位またはモチーフを有するインスリン類似体を与えるＮ置換、Ｓ置換、Ｔ置換および付加の任意の組合せを含みうる。したがって、更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含むインスリン類似体を与えるＡ鎖ペプチドおよび／またはＢ鎖ペプチド置換および／または修飾の任意の組合せを含みうる。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、インスリン受容体結合活性を改善する更なる置換を伴うことなくＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ６、Ｂ８、Ｂ１１、Ｂ１２ ２Ｂ３またはＢ２４位の置換を含まない。
５．Ｂ鎖またはＡ鎖へのＮ−グリコシル化ペプチドドメインの付加
インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）は、追加的アミノ酸を含有し活性を尚も保有するインスリン類似体の一例である。それはＢ鎖ペプチドのＣ末端に２つの追加的アルギニン残基を含有する。これは、ＢおよびＡ鎖ペプチドのＮおよび／またはＣ末端における他のペプチド配列の付加も、インスリン受容体における活性を有するインスリン分子を与えうることを示唆している。したがって、Ｂ鎖またはＡ鎖またはそれらの両方の末端に１、２個またはそれ以上のアミノ酸を有するＮ−グリコシル化インスリン類似体が更に含まれる。Ａｓｎ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）モチーフ（結合基）（ここで、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）からなるＢ鎖および／またはＡ鎖のＮまたはＣ末端への３個のアミノ酸の付加は該分子へのＮ−グリカンの転移のための認識シグナルを与える。追加的配列がインスリンに融合されることが可能であり、これは、人工的または天然ペプチドまたはタンパク質配列、ヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＦｃフラグメント）との融合体、あるいはＮ−グリコシル化モチーフを含有するタンパク質との融合体を使用して達成されうる。該タンパク質融合体は、結合基をも含有する完全または部分タンパク質でありうる。例えば、該グリコシル化インスリン類似体へのポリシアル酸の転移を可能にしうるヒトＮＣＡＭからの部分配列。インビトロのエンドプロテアーゼプロセシングにより除去可能であるインスリン類似体前駆体のＣペプチドにおいてＮＣＡＭの部分ＩＧ５−ＦＮ１サブドメインを含むインスリン類似体前駆体は、Ｂ鎖のＰ２８ＮまたはＡ鎖ペプチドのＮ２１におけるポリシアル酸化をもたらしうる。該ＮＣＡＭ配列はトリプシンまたはエンドペプチダーゼＬｙｓＣでのエンドプロテアーゼプロセシングの後でグリコシル化インスリン類似体から除去されるであろう。
ＩＩ．糖設計
治療用糖タンパク質の大多数は、現在、哺乳類細胞系において製造されている。典型的に、哺乳類細胞由来のＮ−グリカンは、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）、フコース（Ｆｕｃ）およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から構成されうる複合構造のものである。
Ｎ−グリカンの結合はインスリンのＰＫおよびＰＤ特性に影響を及ぼしうる。具体例（実施例）に示されているとおり、シアル酸末端Ｎ−グリカンを主に有するＮ−グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体をヒトｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン（ｄｅｓ（Ｂ３０）となるように修飾されたＮＯＶＯＬＩＮ）と比較した場合、シアル酸末端Ｎ−結合グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体のＰＫプロファイルは、該修飾ＮＯＶＯＬＩＮおよびガラクトース末端Ｎ−グリカンを主に有するＮ−グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体と比較して改善された。また、該シアル酸末端Ｎ−結合グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体はインスリン増殖因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）への結合の低減を示した。両方のＮ−結合グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体はインビボグルコース低減活性を保持している一方で、特定の特性は特定のＮ−グリカン構造によりモジュレーションされた。
ａ．Ｎ−グリカン構造
図２は、結合基を構成するアスパラギン残基に還元末端においてβ１結合で結合しうる、糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）により産生されうるＮ−グリカン構造の幾つかの非限定的な例を示す。これらのグリコフォームのいずれかは、結合基を含むインスリン類似体に付加されうる。示されているグリコフォームの多くは、特定のＮ−グリカン構造が優勢である糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された宿主細胞において産生されうる。しかし、他のグリコフォームの場合、所望の優勢グリコフォームを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体を得るために、追加的な遺伝的改変、プロセス変化、精製スキームおよび／またはインビトロ酵素反応が用いられうる。図２に挙げられているグリコフォーム群は包括的であるわけではない。ポリシアル酸、ポリラクトサミン、シアル酸化ルイスＸ、ＧａｌＮＡｃ、フコース、グルコースなどのような追加的なグリカンが糖操作ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）において合成されうる。また、図２に示されている構造は結合基にインビトロで結合されうる。
したがって、特定の実施形態においては、本明細書に開示されているグリコシル化インスリン類似体は、オリゴ糖またはグリカンの還元末端においてＧｌｃＮＡｃ残基に共有結合される、インビボまたはインビトログリコシル化のための１以上の結合基を含む。したがって、式
ＩＮＳＬ−［Ｘ−Ｒ］ｎ
を有するグリコシル化インスリン類似体を提供する。前記式中、ＩＮＳＬは、Ａ鎖ペプチド、Ｂ鎖ペプチド、３個のジスルフィド結合および１以上の結合基（例えば、１〜１０個、または１〜５個、または１〜２個の結合基）を含むインスリンまたはインスリン類似体分子である；ｎは、１〜１０、または１〜５、または１〜２から選択される整数であり、該整数値はＩＮＳＬにおける結合基の数に対応する；Ｘは、結合基に共有結合している、１以上のアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、非ペプチド部分またはそれらの両方を含む、所望により存在するリンカーまたはスペーサーであるか、あるいは存在せず、ここで、該リンカーまたはスペーサーの各存在は、リンカーまたはスペーサーのいずれかの他の存在から独立している；Ｒは、その還元末端において、該結合基または該リンカーもしくはスペーサーに結合しているＮ−グリカン構造であり、ここで、Ｒの各存在は同一であるか、または独立して特定のＮ−グリカンである。該結合基は、インビボＮ−グリコシル化のためのＡｓｎ残基、またはインビトログリコシル化のためのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨもしくはＨｉｓのイミジゾール環でありうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、以下に示されている構造１〜１０６から選択される。
Figure 2014525922
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特定の実施形態においては、式
ＩＮＳＬ−［Ｘ−Ｒ］ｎ
を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物または製剤を提供する。前記式中、ＩＮＳＬは、Ａ鎖ペプチド、Ｂ鎖ペプチド、３個のジスルフィド結合および１以上の結合基（例えば、１〜１０個、または１〜５個、または１〜２個の結合基）を含むインスリンまたはインスリン類似体分子である；ｎは、１〜１０、または１〜５、または１〜２から選択される整数であり、該整数値はＩＮＳＬにおける結合基の数に対応する；Ｘは、結合基に共有結合している、１以上のアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、非ペプチド部分またはそれらの両方を含む、所望により存在するリンカーまたはスペーサーであるか、あるいは存在せず、ここで、該リンカーまたはスペーサーの各存在は、リンカーまたはスペーサーのいずれかの他の存在から独立している；Ｒは、その還元末端において、該結合基または該リンカーもしくはスペーサーに結合しているＮ−グリカン構造であり、ここで、Ｒの各存在は同一であるか、または独立して特定のＮ−グリカンである。該結合基は、インビボＮ−グリコシル化のためのＡｓｎ残基、またはインビトログリコシル化のためのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨもしくはＨｉｓのイミジゾール環でありうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは構造１〜１０６から選択される。該組成物または製剤は、医薬上許容される担体、塩、またはそれらの組合せを含む。
特定の態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも８０％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも９０％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも９５％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも９８％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中のインスリンまたはインスリン類似体の少なくとも９９％がグリコシル化されている。一般に、該組成物または製剤中の構造１〜１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカン種が優勢または主要体であろう。
特定の態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約３０モル％〜約１００モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの３０モル％〜１００モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの３０モル％〜８０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。更に詳細な態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの５０モル％〜１００モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。
更に、特定の組成物および製剤においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約３０モルが、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約４０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約５０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約５０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約６０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約７０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約８０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約８５モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約９０モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約９５モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約９８モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約９９モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。もう１つの態様においては、該組成物または製剤中の全Ｎ−グリカンの約１００モル％が、構造１〜１０６から選択されるＮ−グリカン種からなる。
特定の実施形態においては、ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−グリカンに共有結合した少なくとも１つのアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）残基を含む。したがって、更に詳細な実施形態においては、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基がＮ−グリカンに結合している限り、該ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、以下の配列番号（ＳＥＱ ＩＮＯ）１６２〜２５４および３１６〜３３７に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せ、あるいはそれらと天然ＡまたはＢ鎖との組合せを含む。更に詳細な実施形態においては、該ヘテロ二量体Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基がＮ−グリカンに結合している限り、該ヘテロ二量体Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、以下の配列番号１６２〜２５４および３１６〜３３７に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せ、あるいはそれらと天然ＡまたはＢ鎖との組合せを含む。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
Figure 2014525922
 前記のＡ鎖配列において、Ｘ１はセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐｒｏ）以外の任意のアミノ酸であり、Ｎ ＊ は、Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合したアスパラギン（Ａｓｎ）である。該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。
Figure 2014525922
Figure 2014525922
Figure 2014525922
Figure 2014525922
前記のＢ鎖配列において、Ｘ１はセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）であり、Ｘ２はプロリン（Ｐｒｏ）以外の任意のアミノ酸であり、Ｎ ＊ は、Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合したアスパラギン（Ａｓｎ）である。該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。
もう１つの態様においては、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、ヒトインスリンのＢ鎖ペプチドおよびＡ鎖ペプチドまたはそれらの類似体または誘導体を含むＮ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体であり、それらは、例えば、該一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基が、接続ペプチドにより連結されたＮ−グリカンに結合している限り、配列番号１６２〜２５４および３１６〜３３７に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せ、あるいはそれらと天然ＡまたはＢ鎖との組合せ体を含む前記誘導体のいずれかであり、ここで、Ｂ鎖ペプチド、Ａ鎖ペプチドまたは接続ペプチドの少なくとも１つが、それらに結合したＮ−グリカンを含む限り、該接続ペプチドは、３アミノ酸残基から、ヒトインスリンにおける天然Ｃペプチドの長さに対応する長さまでの様々な長さのものでありうる。しかし、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体における接続ペプチドは、通常、ヒトＣペプチドより短く、典型的には、該ペプチド鎖における３〜約３５、３〜約３０、４〜約３５、４〜約３０、５〜約３５、５〜約３０、６〜約３５、または６〜約３０、３〜約２５、３〜約２０、４〜約２５、４〜約２０、５〜約２５、５〜約２０、６〜約２５、または６〜約２０、３〜約１５、３〜約１０、４〜約１５、４〜約１０、５〜約１５、５〜約１０、６〜約１５、または６〜約１０、または６〜９、６〜８、６〜７、７〜８、７〜９または７〜１０アミノ酸残基の長さである。一本鎖ペプチドは、米国公開出願第２００８００５７００４号、米国特許第６，６３０，３４８号、国際出願番号ＷＯ２００５０５４２９１、ＷＯ２００７１０４７３４、ＷＯ２０１００８０６０９、ＷＯ２０１０００９９６０１およびＷＯ２０１１１５９８９５（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体接続ペプチドは、式Ｇｌｙ−Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｚ２（式中、Ｚ１はＡｓｎであるか、またはチロシン以外の別のアミノ酸であり、Ｚ２は２〜３５アミノ酸のペプチドである）を含む。特定の実施形態においては、該接続ペプチドは、配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）を含む少なくとも１つの結合部位を含む。例えば、Ｚ１がＡｓｎである場合、Ｚ２のＮ末端アミノ酸はＳｅｒまたはＴｈｒである。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体接続ペプチドはＧＮＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２５８）、ＧＡＧＮＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２５９）、ＧＡＧＳＮＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２６０）、ＧＮＧＳＮＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２６１）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＮＱＴ（配列番号２６２）、ＧＮＧＳＳＳＲＲＡＮＱＴ（配列番号２６３）、ＧＡＧＮＳＳＲＲＡＮＱＴ（配列番号２６４）、ＧＡＧＳＮＳＳＲＲＡＮＱＴ（配列番号２６５）、ＧＮＧＳＮＳＳＲＲＡＮＱＴ（配列番号２６６）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２６７）、ＧＧＧＰＲＲ（配列番号２６８）、ＧＧＧＰＧＡＧ（配列番号２６９）、ＧＧＧＧＧＫＲ（配列番号２７０）またはＧＧＧＰＧＫＲ（配列番号２７１）である。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体接続ペプチドはＶＧＬＳＳＧＱ（配列番号２７２）またはＴＧＬＧＳＧＲ（配列番号２７３）である。他の態様においては、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体接続ペプチドはＲＲＧＰＧＧＧ（配列番号２７４）、ＲＲＧＧＧＧＧ（配列番号２７５）、ＧＧＡＰＧＤＶＫＲ（配列番号２７６）、ＲＲＡＰＧＤＶＧＧ（配列番号２７７）、ＧＧＹＰＧＤＶＬＲ（配列番号２７８）、ＲＲＹＰＧＤＶＧＧ（配列番号２７９）、ＧＧＨＰＧＤＶＲ（配列番号２８０）またはＲＲＨＰＧＤＶＧＧ（配列番号２８１）である。
特定の実施形態においては、該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、該一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基がＮ−グリカンに結合している限り、（１）配列番号１６２〜２５４および３１６〜３３７に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せ、あるいはそれらと天然ＡまたはＢ鎖との組合せ、および（２）任意の前記接続ペプチドを含む。特定の実施形態においては、該Ｂ鎖はＣ末端において１、２、３、４または５個のアミノ酸を欠いていることが可能である。もう１つの実施形態においては、該Ｂ鎖はｄｅｓＢ３０またはｄｅｓＢ２６−３０である。該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、該一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基がＮ−グリカンに結合している限り、（１）配列番号１６２〜２５４および３１６〜３３７に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せ、あるいはそれらと天然ＡまたはＢ鎖との組合せ、および（２）配列番号２５８〜２８１に示されるアミノ酸配列を有する接続ペプチドを含む。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化一本鎖インスリン類似体接続ペプチドはＧＮ ＊ ＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２８３）、ＧＡＧＮ ＊ ＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２８４）、ＧＡＧＳＮ ＊ ＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２８５）、ＧＮ ＊ ＧＳＮ ＊ ＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２８６）、ＧＡＧＳＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴ（配列番号２８７）、ＧＮ ＊ ＧＳＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴ（配列番号２８８）、ＧＡＧＮ ＊ ＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴ（配列番号２８９）、ＧＡＧＳＮ ＊ ＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴ（配列番号２９０）またはＧＮ ＊ ＧＳＮ ＊ ＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴ（配列番号２９１）であり、ここで、Ｎ ＊ は、Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合したアスパラギン（Ａｓｎ）である。該Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。
特定の実施形態においては、該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、（１）天然Ａ鎖およびＢ鎖、ならびに（２）配列番号２５８〜２８１に示されるアミノ酸配列を有するＮ−グリコシル化接続ペプチドを含む。該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体のＮ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨもしくはＨｉｓのイミジゾール環がＮ−グリカンに直接的または間接的に結合している限り、（１）天然Ａ鎖およびＢ鎖、または１、２、３、４、５個もしくはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を有するそれらの類似体、ならびに（２）任意の前記接続ペプチドを含む。該一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体のＮ−グリカンは、Ｍａｎ（１−９）ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＧａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群におけるＮ−グリカンから選択される構造を有する分子でありうる。該Ｎ−グリカンは、本明細書に示されているＮ−グリカン構造１〜１０６の群から選択されうる。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）またはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンは、所望により存在しうる前記リンカーまたはスペーサーにより、結合部位に直接的または間接的にインビトロで結合される。更に詳細な実施形態においては、前記の所望により存在しうるリンカーまたはスペーサーは、１〜約６０個の原子、または１〜３０個以上の原子、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子、または１０〜２０個以上の原子の長さの鎖を含む。幾つかの実施形態においては、該鎖原子は全て、炭素原子である。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーのバックボーンにおける鎖原子は、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される。鎖原子およびリンカーまたはスペーサーは、より溶解性のコンジュゲートを得るために、それらの予想溶解度（親水性）に従い選択されうる。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは、標的組織または器官または細胞において見出される酵素もしくは他の触媒または加水分解条件による切断に付される官能基を与える。幾つかの実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーの長さは、立体障害の可能性を低下させるのに十分な程度に長い。該リンカーまたはスペーサーが共有結合またはペプチジル結合であり、インスリン類似体が異種ポリペプチド、例えば免疫グロブリン、免疫グロブリンのＦｃフラグメント、ヒト血清アルブミンにコンジュゲート化されている場合、該コンジュゲート全体は融合タンパク質でありうる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さでありうる。典型的リンカーは約１〜５０アミノ酸長、５〜５０、３〜５、５〜１０、５〜１５、または１０〜３０アミノ酸長である。更に、医薬上許容される担体、塩またはそれらの組合せを含む前記の組成物および製剤を提供する。
特定の実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは（ｉ）１〜７個のメチレン基を有する１、２、３個またはそれ以上の非分枝アルカンα、ω−ジカルボン酸基；（ｉｉ）１、２、３個またはそれ以上のアミノ酸；あるいは（ｉｉｉ）１、２、３個またはそれ以上のγ−アミノブタニル残基でありうる。特定の実施形態においては、最適なリンカーまたはスペーサーは１、２、３個またはそれ以上のγ−グルタミル残基；１、２、３個またはそれ以上のβ−アラニル残基；１、２、３個またはそれ以上のβ−アスパラギル残基；あるいは１、２、３個またはそれ以上のグリシル残基でありうる。
特定の実施形態においては、該リンカーまたはスペーサーは共有結合；炭素原子；ヘテロ原子、以下のものからなる群から選択される所望により置換されていてもよい基：アシル、脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール、ヘテロアリールおよび複素環基；所望により置換されていてもよい２価直鎖状または分枝状飽和または不飽和Ｃ１−３０炭化水素鎖［ここで、１以上のメチレン単位は、所望により且つ独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＯＣ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（Ｒ）ＳＯ２−、ＳＯ２Ｎ（Ｒ）−により置換されていてもよい（Ｒのそれぞれは、独立して、水素、適当な保護基またはアシル部分、アルアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分またはヘテロ脂肪族部分である）］でありうる。
ＩＩＩ．インスリン類似体
本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の種々の実施形態においては、該グリコシル化はＮ−結合であり、該結合基はＢ２８に存在する（ＰはＮにより置換されている）。しかし、Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体がアスパラギン以外のアミノ酸残基への突然変異をＢ２８位に含む実施形態においては、Ｎ−結合グリコシル化部位（結合基）は、該分子内の別の位置に存在するように選択され、例えば、Ｂ−２、Ｂ３、Ｂ２５、Ａ−２、Ａ８、Ａ１０またはＡ２１に存在するように選択される。例えば、インスリン・リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）（ＨＵＭＡＬＯＧ）は、ＢペプチドのＣ末端の最後から２番目のリシンおよびプロリン残基が逆転している迅速作用性インスリン類似体（ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン）であり、これはインスリン多量体の形成を低減する。インスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ）（ＮＯＶＯＬＯＧ）は、Ｂ２８位のプロリンがアスパラギン酸により置換されている、もう１つの迅速作用性インスリン突然変異体（ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン）である。この突然変異も多量体の形成を低減する。したがって、結合基が２８位に位置する（すなわち、Ｎ−結合グリコシル化部位を得るためにＢ２８位のプロリンがアスパラギンにより置換されている）、またはオリゴ糖もしくはグリカンがＢ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸に化学的にコンジュゲート化されている（例えば、２９位のリシンまたは２８位のリシンにコンジュゲート化されている）、本明細書に開示されているグリコシル化インスリンは、多量体を形成する能力の低減を示し、したがって即効性プロファイルを示しうる。幾つかの実施形態においては、Ｂ２８および／またはＢ２９位の突然変異は該インスリンポリペプチド内の他の位置の１以上の突然変異を伴う。例えば、インスリン・グルリシン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）（ＡＰＩＤＲＡ）は、Ｂ３位のアスパラギンがリシン残基により置換されており、Ｂ２９位のリシンがグルタミン酸残基により置換されている、更にもう１つの迅速に作用するインスリン突然変異体（ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン）である。この類似体はＢ３位のリシン残基においてオリゴ糖またはグリカンにコンジュゲート化（結合）されうる。
種々の実施形態においては、インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、ヒトインスリンから変化した等電点を有する。幾つかの実施形態においては、等電点の変化は、インスリンＡ鎖ペプチドのＮ末端および／またはインスリンＢ鎖ペプチドのＣ末端に１以上のアルギニン、リシンまたはヒスチジン残基を付加することにより達成される。そのようなインスリンポリペプチドの例には、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンおよびＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリンが含まれる。更なる例としては、インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）（ＬＡＮＴＵＳ）は、ＡｓｎＡ２１がグリシンにより置換されており、２つのアルギニン残基がＢペプチドのＣ末端に共有結合している、典型的な長時間作用性インスリン類似体である。これらのアミノ酸変化の効果は、該分子の等電点を変化させて、それにより、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４〜６．５）で可溶性であり生理的ｐＨで不溶性である分子を生成することであった。インスリン・グラルジンの溶液を筋肉内に注射すると、該溶液のｐＨは中和され、インスリン・グラルジンは微小沈殿物を形成し、該微小沈殿物は、注射の２４時間にわたってインスリン・グラルジンをゆっくり放出し、この場合、顕著なインスリンピークは生じず、したがって、低血糖を誘導するリスクの低減が示される。このプロファイルは、患者の基礎インスリンを供与する１日１回の投与を可能にする。したがって、幾つかの実施形態においては、該インスリン類似体は、Ａ２１位のアミノ酸がグリシンであるＡ鎖ペプチド、ならびにＢ３１およびＢ３２位のアミノ酸がアルギニンであるＢ鎖ペプチドを含む。本開示はこれらの突然変異の単一および複数の組合せの全て、ならびに本明細書に記載されている任意の他の突然変異（例えば、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン）を含む。
種々の実施形態においては、インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体はトランケート化（末端切断）されている。例えば、ある実施形態においては、Ｂ鎖ペプチドは少なくともＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９またはＢ３０を欠く。特定の実施形態においては、Ｂ鎖ペプチドは残基の組合せを欠く。例えば、Ｂ鎖は、アミノ酸残基Ｂ１−Ｂ２、Ｂ１−Ｂ３、Ｂ１−Ｂ４、Ｂ２９−Ｂ３０、Ｂ２８−Ｂ３０、Ｂ２７−Ｂ３０および／またはＢ２６−Ｂ３０を欠くようにトランケート化されうる。幾つかの実施形態においては、これらの欠失および／またはトランケート化は、前記インスリン類似体のいずれかにも（例えば、限定的なものではないが、ｄｅｓ（Ｂ２９）−インスリン・リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）、ｄｅｓ（Ｂ３０）−インスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ）などを得るために）適用される。
幾つかの実施形態においては、インビトログリコシル化またはインビボグリコシル化インスリン類似体はＡ鎖ペプチドまたはＢペプチドのＮまたはＣ末端に追加的なアミノ酸残基を含有する。幾つかの実施形態においては、１以上のアミノ酸残基はＡ０、Ａ２２、Ｂ０および／Ｂ３１位に位置する。幾つかの実施形態においては、１以上のアミノ酸残基は０位に位置する。幾つかの実施形態においては、１以上のアミノ酸残基はＡ２２位に位置する。幾つかの実施形態においては、１以上のアミノ酸残基はＢ０位に位置する。幾つかの実施形態においては、１以上のアミノ酸残基はＢ３１位に位置する。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体はＡ０、Ａ２２、Ｂ０またはＢ３１位にいずれの追加的なアミノ酸残基をも含まない。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体のアミド化アミノ酸の１以上が酸性アミノ酸または別のアミノ酸で置換されている。例えば、グリコシル化位置以外の位置のアスパラギンはアスパラギン酸またはグルタミン酸または別の残基で置換されうる。同様に、グルタミンはアスパラギン酸またはグルタミン酸で置換されうる。特に、ＡｓｎＡ１８、ＡｓｎＡ２１もしくはＡｓｎＢ３またはそれらの残基の任意の組合せはアスパラギン酸またはグルタミン酸により置換されうる。ＧｌｎＡ１５もしくはＧｌｎＢ４またはそれらの両方はアスパラギン酸またはグルタミン酸または別の残基により置換されうる。特定の実施形態においては、該インスリン類似体はＡ２１位のアスパラギン酸または別の残基、あるいはＢ３位のアスパラギン酸または別の残基、あるいはそれらの両方を有する。
分子の生物活性を維持させたまま、インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体における更に他のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することが可能である、と当業者は認識するであろう。例えば、限定的なものではないが、以下の修飾も当技術分野で広く受け入れられている：アスパラギン酸でのＢ１０位のヒスチジン残基の置換（ＨｉｓＢ１０からＡｓｐＢ１０へ）；アスパラギン酸でのＢ１位のフェニルアラニン残基の置換（ＰｈｅＢ１からＡｓｐＢ１へ）；アラニンでのＢ３０位のトレオニン残基の置換（ＴｈｒＢ３０からＡｌａＢ３０へ）；アラニンでのＢ２６位のチロシン残基の置換（ＴｙｒＢ２６からＡｌａＢ２６へ）；およびアスパラギン酸でのＢ９位のセリン残基の置換（ＳｅｒＢ９からＡｓｐＢ９へ）。
種々の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、延長した作用プロファイルを有する。例えば、ある実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は脂肪酸でアシル化されうる。すなわち、該インスリン類似体上のアミノ基と該脂肪酸のカルボン酸基との間でアミド結合が形成される。該アミノ基は該インスリン類似体のＮ末端アミノ酸のアルファ−アミノ基であることが可能であり、あるいは該インスリン類似体のリシン残基のイプシロン−アミノ基であることが可能である。該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、野生型ヒトインスリンに存在する３つのアミノ基の１以上においてアシル化されることが可能であり、あるいは野生型ヒトインスリン配列内に導入されたリシン残基上でアシル化されることが可能である。特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体はＢ１位においてアシル化されうる。ある実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体はＢ２９位においてアシル化されうる。ある実施形態においては、該脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデシル酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデシル酸（Ｃ１７）およびステアリン酸（Ｃ１８）から選択される。例えば、インスリン・デテミル（ｄｅｔｅｍｉｒ）（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、ＴｈｒＢ３０が欠失しておりＣ１４脂肪酸鎖（ミリスチン酸）がγＥリンカーを介してＬｙｓＢ２９に結合している長時間作用性インスリン突然変異体であり、インスリン・デグルデック（ｄｅｇｌｕｄｅｃ）は、ＴｈｒＢ３０が欠失しておりＣ１６脂肪酸鎖（パルミチン酸）がγＥリンカーを介してＬｙｓＢ２９に結合している長時間作用性インスリン突然変異体である。
１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含むインビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体分子は、４−アミノフェニルアラニンへのＡ１９、Ｂ１６またはＢ２５位のアミノ酸の修飾、あるいは５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置における１以上のアミノ酸置換、あるいはＢ１〜４およびＢ２６〜３０の位置のいずれか又は全ての欠失を含む天然Ａ鎖および／またはＢ鎖の修飾誘導体を含むヘテロ二量体類似体および一本鎖類似体を含む。インスリン類似体の例は、例えば、公開国際出願ＷＯ９６３４８８２、ＷＯ９５５１６７０８；ＷＯ２０１０００８０６０６、ＷＯ２００９／０９９７６３およびＷＯ２０１００８０６０９、米国特許第６，６３０，３４８号、およびＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：９８１−９８６（１９９５）（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されうる。更に詳細な実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体はアシル化および／またはペジル化（ＰＥＧ化）されうる。
幾つかの実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体のＡペプチドのＮ末端、ＢペプチドのＮ末端、Ｂ２９位のＬｙｓのイプシロン−アミノ基または任意の他の利用可能なアミノ基は、一般式：
Figure 2014525922
 （式中、Ｘは該インスリンポリペプチドのアミノ基であり、Ｒは水素またはＣ１−３０アルキル基であり、該インスリン類似体は１以上のＮ−結合グリコシル化部位を含む）の脂肪酸部分に共有結合している。いくつかの実施形態においては、ＲはＣ１−２０アルキル基、Ｃ３−１９アルキル基、Ｃ５−１８アルキル基、Ｃ６−１７アルキル基、Ｃ８−１６アルキル基、Ｃ１０−１５アルキル基またはＣ１２−１４アルキル基である。ある実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＡ１位の部分にコンジュゲート化（結合）される。特定の実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＢ１位の部分にコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、該インスリンポリペプチドはＢ２９位のイプシロン−アミノ基の部分にコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体のＢ２８位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ２８のイプシロン−アミノ基が該脂肪酸部分にコンジュゲート化される。特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体のＢ３位はＬｙｓであり、ＬｙｓＢ３のイプシロン−アミノ基が該脂肪酸部分にコンジュゲート化される。幾つかの実施形態においては、該脂肪酸鎖は８〜２０炭素長である。特定の実施形態においては、該脂肪酸はオクタン酸（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）、ウンデカン酸（Ｃ１１）、ドデカン酸（Ｃ１２）またはトリデカン酸（Ｃ１３）である。ある実施形態においては、該脂肪酸はミリスチン酸（Ｃ１４）、ペンタデカン酸（Ｃ１５）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ヘプタデカン酸（Ｃ１７）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ノナデカン酸（Ｃ１９）またはアラキジン酸（Ｃ２０）である。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、あるいは該アスパラギン残基がＢ２８位に存在しグリコシル化インスリン類似体がｄｅｓＢ３０である場合にＮ−結合グリコシル化部位を構成していたアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン（インスリン・リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ））、ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン（インスリン・アスパルト（ａｓｐａｒｔ））、ＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９−ヒトインスリン（インスリン・グルリシン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ））、ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン（インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ））、ＮεＢ２９−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン（インスリン・デテミル（ｄｅｔｅｍｉｒ））、ＡｌａＢ２６−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０−ヒトインスリン、ＡｓｐＢ１ＧｌｕＢ１３−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２７）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ２８−Ｂ３０）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１）−ヒトインスリン、ｄｅｓ（Ｂ１−Ｂ３）−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、あるいは該アスパラギン残基がＢ２８位に存在しグリコシル化インスリン類似体がｄｅｓＢ３０である場合にＮ−結合グリコシル化部位を構成していたアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−パルミトイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−ミリストイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ３０−パルミトイル−ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（Ｎ−リトコリル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、あるいは該アスパラギン残基がＢ２８位に存在しグリコシル化インスリン類似体がｄｅｓＢ３０である場合にＮ−結合グリコシル化部位を構成していたアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリンポリペプチドの１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ３０ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ミリストイル−ａｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＧｌｙＡ２１ＡｓｐＢ３ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＡｒｇＡ０ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、あるいは該アスパラギン残基がＢ２８位に存在しグリコシル化インスリン類似体がｄｅｓＢ３０である場合にＮ−結合グリコシル化部位を構成していたアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｙＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＡｌａＡ２１ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−トリデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−テトラデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ドデカノイル−ＧｌｎＢ３ＧｌｕＢ３０−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、本開示のインスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−アセチル−ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ペンタノイル−ＮαＡ１−ペンタノイル−ＮαＢ１−ペンタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘキサノイル−ＮαＡ１−ヘキサノイル−ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ヘプタノイル−ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＮαＢ１−ヘプタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−オクタノイル−ＮαＡ１−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−ノナノイル−ＮαＡ１−ノナノイル−ＮαＢ１−ノナノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２８−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン、ＮεＢ２８−デカノイル−ＮαＡ１−デカノイル−ＮαＢ１−デカノイル−ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む。
特定の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、以下のインスリン類似体の１つの、突然変異および／または化学修飾を含む：ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ｄｅｓ（Ｂ２６）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−アセチル−ＡｓｐＢ２８−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＮαＢ１−プロピオニル−ＡｓｐＢ１ＡｓｐＢ３ＡｓｐＢ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ペンタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ヘキサノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ヘプタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−オクタノイル−ＮαＢ１−オクタノイル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−プロピオニル−ＮαＡ１−プロピオニル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮαＡ１−アセチル−ＮαＢ１−アセチル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ホルミル−ＮαＡ１−ホルミル−ＮαＢ１−ホルミル−ＧｌｙＡ２１−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、ＮεＢ２９−ブチリル−ＮαＡ１−ブチリル−ＮαＢ１−ブチリル−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、Ｎ−結合グリコシル化部位を構成するアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含み、あるいは該アスパラギン残基がＢ２８位に存在しグリコシル化インスリン類似体がｄｅｓＢ３０である場合にＮ−結合グリコシル化部位を構成していたアスパラギン残基に結合している本明細書に開示されている少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
したがって、特定の実施形態においては、該インスリン分子が、少なくとも１つのアシル基、および例えばＡｓｎ残基において又はＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨもしくはＨｉｓのイミジゾールに結合している少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む限り、該ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むＡ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドまたはそれらの類似体を含む。更に詳細な実施形態においては、該インスリン分子が、例えばＡｓｎ残基において又はＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨもしくはＨｉｓのイミジゾールに結合している少なくとも１つのＮ−グリカンを更に含む限り、該ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体は、前記アシル化類似体のいずれか、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含む。
該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、前記突然変異および／または化学修飾のいずれかを含む、非ヒトインスリン（例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど）の修飾形態を更に含む。これらの及び他の修飾インスリン分子は米国特許第６，９０６，０２８号、第６，５５１，９９２号、第６，４６５，４２６号、第６，４４４，６４１号、第６，３３５，３１６号、第６，２６８，３３５号、第６，０５１，５５１号、第６，０３４，０５４号、第５，９５２，２９７号、第５，９２２，６７５号、第５，７４７，６４２号、第５，６９３，６０９号、第５，６５０，４８６号、第５，５４７，９２９号、第５，５０４，１８８号、第５，４７４，９７８号、第５，４６１，０３１号および第４，４２１，６８５号、ならびに米国特許第７，３８７，９９６号、第６，８６９，９３０号、第６，１７４，８５６号、第６，０１１，００７号、第５，８６６，５３８号および第５，７５０，４９７号（それらの全開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に詳細に記載されている。
種々の実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は３つの野生型ジスルフィド架橋（すなわち、１つ目はＡ鎖の７位とＢ鎖の７位との間、２つ目はＡ鎖の２０位とＢ鎖の１９位との間、および３つ目はＡ鎖の６位と１１位との間）を含む。
幾つかの実施形態においては、該インビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、インスリン受容体に対するそのアフィニティを低減するように修飾され、および／または突然変異している。特定の理論に拘泥するものではないが、修飾（例えば、アシル化）または突然変異によるインスリン分子の受容体アフィニティの低減は、インスリン分子が血液から消失する速度を減少させうると考えられている。幾つかの実施形態においては、低減したインビトロインスリン受容体アフィニティはインビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体に関する優れたインビボ活性と解釈される。
ＩＶ．インスリンタンパク質工学および糖設計の統合
ａ．薬物動態学的（ＰＫ）／薬力学的（ＰＤ）改善
患者におけるインスリンの基礎レベルを供与する１日１回投与のインスリン類似体であるインスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）の導入により、Ｉ型糖尿病に関するクオリティ・オブ・ライフは有意に改善された。Ｉ型糖尿病患者は反復的な血液モニタリングおよび皮下注射に耐えなければならないため、注射の頻度の減少は糖尿病治療における歓迎される進歩であろう。いずれの新規インスリン治療剤に関しても、１日１回の注射を達成するための薬物動態学的プロファイルの改善が大いに求められている。実際、最近、月１回投与のインスリンが動物モデルにおいて報告された（Ｇｕｐｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１３２４６（２０１０）；米国公開出願第２００９００９０２５８８１８号）。インスリンのＰＫプロファイルを改善するための多数の方法が研究されているが、本明細書に開示されているインビトログリコシル化またはインビボＮ−グリコシル化インスリン類似体は、他の手段では達成し得ない利益を糖尿病患者に与えうる。
治療用タンパク質は循環からの複数のクリアランス方式を有する。標的媒介性クリアランスは治療用タンパク質と受容体または標的分子との相互作用により引き起こされる。受容体または標的分子との嵌合の後、リガンド−受容体複合体はエンドサイトーシスにより細胞内に導かれ、ついで、分解のためにリソソームへと標的化され、および／またはエンドソーム内のプロテアーゼにより分解される。循環からのタンパク質のクリアランスのもう１つのメカニズムは腎クリアランスである。糸球体は腎臓の主要血液濾過単位である。インスリンを含む約５０ｋＤａ未満の治療用タンパク質は、しばしば、糸球体において濾過されて、尿中に排泄される。治療用タンパク質のサイズを約５０ｋＤａ以上に増加させると、糸球体における腎クリアランスは低下する。また、全体的に負の電荷を有する循環タンパク質は糸球体フィルター内の膜との反発を引き起こし、それによりクリアランスを低減する。また、末端シアル酸を欠く循環内の糖タンパク質は肝細胞膜におけるアシアロ糖タンパク質（Ａｓｈｗｅｌｌ−Ｍｏｒｅｌｌ）受容体と相互作用しうる。アシアル酸化タンパク質は肝臓内のレクチン媒介性クリアランスによりＰＫの低減を示しうる。タンパク質クリアランスのためのもう１つの主要経路は循環内のタンパク質分解である。分解メカニズムを低下させるための手段（例えば、ＤＰＩＶ消化に対して抵抗性となるように突然変異したＧＬＰ−１類似体を参照されたい）は全体的なＰＫおよび効力プロファイルに大きな影響を及ぼしうる。インスリンへの直鎖状ポリシアル酸重合体のインビトロコンジュゲート化はインスリンのＰＫプロファイルを改善（拡張）することが示されている（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４：５３２（２０１０）；Ｔｉｍｏｆｅｅｖら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６６：２５９（２０１０）；Ｂｅｚｕｇｌｏｖら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．３５：２７４（２００９）；Ｊａｉｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６２２：４２（２００３））。Ｓａｔｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１４０１３（２００４）は、グルタミン残基にコンジュゲート化された２個および３個のシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンを示す樹枝状構造を有するインスリン類似体が、拡張されたＰＫプロファイルを有していたことを開示している。しかし、種々の重合体および樹枝状構造の構築ならびにインビトロコンジュゲート化は複雑であり、高い経費を要しうる。
本明細書に示されているとおり、Ｂ鎖内にＰ２８Ｎ置換を有するインスリン類似体は、末端シアル酸残基を伴うＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように糖操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株において発現された。ノイラミニダーゼ処理後、末端ガラクトースを有するインスリンが得られた。該シアル酸化およびガラクトシル化インスリン類似体前駆体タンパク質をエンドペプチダーゼＬｙｓＣで処理して、ｄｅｓ（Ｂ３０）形態を得た。該ｄｅｓ（Ｂ３０）インスリン類似体はインスリン類似体において活性であるが、天然インスリンと比較して低減した効力を有し、Ｂ（Ｔｈｒ３０）を置換するトリプシン媒介性ペプチド転移反応を回避する。また、組換えヒトインスリン（ＮＯＶＯＬＩＮ）をＬｙｓＣで処理して、グリコシル化インスリンサンプルに対する比較体としてのｄｅｓ（Ｂ３０）形態を得た。図３はインスリン負荷試験（ＴＴＴ）における４つのインスリン類似体サンプルおよびビヒクル（インスリンを欠くバッファー）の薬物動態学的特性を示す。それらのＮ−グリコシル化インスリンサンプルは共に、ＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）と比較して改善または拡張されたＰＫプロファイルを示した。該シアル酸化インスリンサンプル（ＧＳ６．０）およびガラクトシル化インスリンサンプル（ＧＳ５．０）は、成熟ＮＯＶＯＬＩＮと比較してＡＵＣにおける統計的に有意な改善を示した。更に、シアル酸末端グリコフォームは、ガラクトース末端グリコフォームと比較して一層大きなＡＵＣ測定値を示した。
インビトログルコースレベルをマウスＩＴＴにおいてモニターしたところ、該シアル酸末端グリコフォームおよびガラクトース末端グリコフォームは共に、インスリン受容体における活性を保有していた（図４）。図３に示されているＡＵＣ測定値とは異なり、ＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）は、未処理ＮＯＶＯＬＩＮと比較して遥かに低減したグルコース低下活性を示した。重要なのは処理ＮＯＶＯＬＩＮと未処理ＮＯＶＯＬＩＮとの間の製剤化バッファー組成物における相違であり、これはインビボ活性に影響を及ぼしうる。全てのｄｅｓ（Ｂ３０）サンプルのための製剤化バッファーは同一であり、したがって、ＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）とのＮ−グリコシル化インスリンの比較は両方のＮ−グリコシル化サンプルに関するグルコース低下活性の増強を示した。実際、シアル酸末端グリコフォームは、全てのｄｅｓ（Ｂ３０）サンプルのなかで最長のグルコース低下活性を示し、これはＡＵＣ（曲線下面積）測定値の改善に関連づけられうる。総合すると、図３および４からのデータは、インスリンＢ鎖Ｐ２８Ｎ置換がインスリン受容体におけるインスリン活性の保持に適合していることを示しているだけでなく、それらの種々のグリコフォームがインスリンのインビボＰＫ／ＰＤプロファイルを有利に改変することをも示している。
更なるタンパク質工学および糖設計は、更に改善または修飾されたＰＫ／ＰＤプロファイルを有するインビトロまたはインビボグリコシル化インスリン類似体を与えうる。例えば、該インスリン類似体への追加的なシアル酸化Ｎ−グリカンの付加はＡＵＣ測定値の改善と共にインスリン類似体のｐＩを更に低下させうる。もう１つの実施形態においては、Ｂ鎖のＢ２８位のアスパラギンに結合したＮ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体の提供および該Ｎ−グリカンに結合したシアル酸の量の増加もＡＵＣを増加させうる。これは、トリシアル酸化およびテトラシアル酸化グリコフォームを得るために多アンテナグリカンを付加することにより達成されうる。シアル酸は、α−２，６およびα−２，３結合シアル酸に加えて、α−２，８結合でも付加されうる。シアル酸以外のグリコフォームも、受容体媒介性クリアランスまたは分解の低減により、ＰＫプロファイルを改善または修飾しうる。
タンパク質半減期の延長およびＡＵＣの増加のほかに、Ｎ−グリカン、特に、インスリン類似体のＢ２８またはＢ２９位に位置するＮ−グリカンは、六量体を形成する該インスリン類似体の能力を低減することにより、皮下注射後のバイオアベイラビリティの速度を増加させうる。したがって、これらの位置のＮ−グリカンは、迅速に作用するインスリン類似体を与えうる。Ｎ−グリカンのシア（ｓｈｅｅｒ）サイズ（１〜２ｋＤを超える）により、またはシアル酸によるＮ−グリカンへの負荷電の付加により、極めて迅速に作用するインスリンを与えるＮ−グリカンが構築されうる。
したがって、特定の実施形態においては、天然Ａ鎖、天然Ｂ鎖または配列番号１６２〜２５４に示されている配列の群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せを含む、天然インスリンのＰＫプロファイルおよび／またはＰＤプロファイルと比較して修飾されたＰＫプロファイルおよび／またはＰＤプロファイルを有するヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化ンスリン類似体を提供し、ここで、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端シアル酸残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、天然Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含む、天然インスリンのＰＫプロファイルおよび／またはＰＤプロファイルと比較して修飾されたＰＫプロファイルおよび／またはＰＤプロファイルを有するヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ここで、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端シアル酸残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端シアル酸残基を含むＮ−グリカンに結合している。
ｂ．ＩＲへの結合の改変
インスリンとインスリン受容体（ＩＲ）との相互作用はグルコースの取り込みに決定的に重要である。前記のとおり、受容体媒介性エンドサイトーシスはインスリンクリアランスのためのメカニズムの１つである。受容体生物学の一般的概念に基づけば、インスリンとＩＲとの間の極めて密接な相互作用は受容体媒介性エンドサイトーシスの増強およびＰＫの低下を招きうる。あるいは、ＩＲへの結合アフィニティの低下はＰＫを拡張させうるが、結合アフィニティが低下しすぎると、グルコース取り込みの低下も生じうる。進化は、膵臓によるインスリン放出の際の迅速なグルコース取り込みを生じさせるために内因性インスリンに関するこれらの力の釣り合いを保っている。しかし、皮下注射投与は結合関係の改変を要しうる。循環内の長時間作用性インスリンは、低血糖を避けるために、ＩＲへのインスリン結合の低減を要しうる。
Ｎ−グリカンは、ＩＲ結合をモジュレーションするための手段となる。図５に見られるとおり、該Ｎ−グリコシル化インスリンサンプルはＮ−グリカン依存的ＩＲ結合プロファイルを示した。ガラクトース末端Ｎ−グリカンを有するインスリンサンプルは、非グリコシル化インスリンに類似したインビトロＩＲ結合を示したが、シアル酸末端インスリンＮ−グリカンを有するインスリンサンプルはＩＲへの結合活性の低下を示した。同様に、インビトロＩＲシグナリングアッセイは、他のサンプルと比較して、シアル酸末端Ｎ−グリカンのインスリンサンプルの活性の低下を示した。該シアル酸化Ｎ−グリカンは、非シアル酸化Ｎ−グリカンを有するインスリン類似体と比較して、該インスリンのＰＫを拡張した。しかし、そのＰＫの拡張はＩＲにおける結合の低下により相殺される。これらのデータは、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体のＩＲ結合活性が、Ｂ２８位のアスパラギンに結合した特定のグリコフォームにより修飾されうることを示している。本明細書に示されている実施例（具体例）を考慮すると、インスリン−ＩＲ相互作用のモジュレーションは、インビボのＮ−結合グリコシル化により１以上のＮ−グリカンが該分子に付加されたグリコシル化インスリン類似体を得ることにより、あるいは該Ｎ−グリカンの１以上を該インスリン分子にインビトロで結合させることにより、あるいはそれらの両方の組合せにより達成されうる。
ｃ．ＩＧＦ−１Ｒへの結合の改変
インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）は、細胞増殖を招く分裂促進性受容体である。内因性インスリンおよび治療用インスリンはこの受容体に結合することが知られている。多数の癌細胞は異常細胞増殖のためにＩＧＦ−１Ｒを利用するため、治療用インスリンは、ＩＧＦ−１Ｒに結合し細胞増殖を誘導するそれらの能力に関して試験される。高いＩＧＦ−１Ｒ結合アフィニティを有することはインスリン類似体に不利であると一般にみなされている。インスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）は、ＦＤＡにより承認されているものの、ヒトインスリンより遥かに高いアフィニティでＩＧＦ−１Ｒに結合する。インスリン・グラルジンは１０年前から市販されており、現在、インスリン・グラルジンを使用している患者が癌のリスクの増大を有するという決定的な証拠は何ら存在しないようである。しかし、患者は長期にわたってインスリン・グラルジン治療を受け続けているため、癌リスクを更に理解するための研究が継続中である。これらの懸念ゆえに、野生型内因性ヒトインスリンの結合アフィニティより有意には大きくないＩＧＦ−１Ｒ結合アフィニティを有するインスリン類似体を得ることが望ましいであろう。
インスリンがＢ鎖の末端に実効負電荷を含有する場合、インスリンはＩＧＦ−１Ｒとの相互作用の低減を示すことを、公開されている研究結果は示している（Ｓｌｉｅｋｅｒら，前掲）。したがって、本発明者らは、シアル酸末端Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体がＩＧＦ−１Ｒ結合の低減を示すと仮定した。図５において見られるとおり、シアル酸末端Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体は、ＮＯＶＯＬＩＮ（組換えヒトインスリン）またはガラクトース末端Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体より一層低いアフィニティで、ＩＧＦ−１Ｒと相互作用する。したがって、Ｎ−グリカンの末端の少なくとも１つにシアル酸残基を含むグリコシル化インスリンは、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン・グラルジンのアフィニティより大きくないＩＧＦ−１Ｒ結合アフィニティを有するグリコシル化インスリン類似体となりうる。特定の実施形態においては、Ｎ−グリカンまたはグリカンの末端の少なくとも１つを有するグリコシル化インスリン類似体のアフィニティは、ＩＧＦ−１Ｒにおいて、天然インスリンとほぼ同じであるか、または天然インスリンより低い。
ｄ．肝特異的グリコシル化インスリン類似体に対する受容体の同時関与
肝臓は、タンパク質合成、脂質代謝、代謝産物の解毒および排泄ならびに炭水化物変換のような正常生理学における多数の決定的に重要な機能を有する。肝細胞は、これらの機能を行う主要細胞型であり、肝質量の７０％以上を構成する。門脈は胃腸管に端を発し、血液の約７５％を肝臓へ運び、残りは肝動脈からである。
食後状態では、グルコースレベルは上昇し、膵ベータ細胞はインスリンを分泌する。門脈は血液グルコースおよびインスリンを肝細胞へ運び、それにより、インスリンと細胞表面インスリン受容体との相互作用がグルコース取り込みを招く。インスリンおよびグルコースレベルが循環内で高いままである場合、グルコースはグリコーゲンに変換される。分泌インスリンの大部分は、インスリン受容体との相互作用の後、受容体媒介性エンドサイトーシスにより肝細胞により取り込まれ、残りは腎臓により血液から濾去される。あるいは、分泌インスリン分子は循環系に存在し続けて、筋肉、脂肪細胞または他の組織におけるグルコース取り込みを促進して、細胞代謝を支持しうる。食物摂取後、血液グルコースレベルは細胞グルコース取り込みの作用により低下する。グルコースレベルが低下すると、インスリン分泌は低下し、肝細胞におけるインスリン受容体シグナリングの欠如はグリコーゲン合成を停止させる。絶食状態に入って炭水化物が摂取されないと、低い基礎レベルのインスリンが膵ベータ細胞により分泌されて、血液グルコースを制御する。食物摂取が無ければ、時間が経つにつれて、血液グルコースレベルは正常未満に低下し、膵アルファ細胞はグルカゴンの分泌を増加させうる。グルカゴンは肝細胞に作用して、グリコーゲンの分解およびグルコースの放出を刺激して、細胞代謝を支持する。肝臓内のグリコーゲン貯蔵は、８〜１２時間の絶食状態に、血液グルコースの一次源として作用するのに十分である。炭水化物の摂取の後、血液グルコースレベルはグルカゴンの分泌を低下させ、インスリン放出を増加させて、肝臓および他の組織におけるグリコーゲン貯蔵を回復させる。
内因性ボーラス（食後）および基礎（絶食）インスリンは主に肝臓に作用し、肝臓においては、末梢筋肉および脂肪組織と比較して推定２〜３倍過剰なインスリン活性を示す。あるいは、皮下投与治療用インスリンの大部分は筋肉および脂肪組織上のインスリン受容体を関与させ、皮下注射インスリンの僅か１％が肝細胞に到達するに過ぎない（Ｃａｎｆｉｅｌｄら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９０：１１２（１９７２））。幾つかの研究からの結果が、末梢作用（例えば、肝臓への脂肪酸および糖新生基質の流動を減少させること）によりインスリンが肝グルコース産生を制御することを主張するために用いられている。一方、他の研究は、末梢組織に対する該ホルモンの間接的作用に加えて、肝グルコース産生の低下に対するインスリンの直接的作用の追加的な重要性を示している。更に、相当な研究が、グルコース負荷後の肝グルコース取り込みを門脈インスリンが有意に増加させうることを強調している。したがって、インスリンの肝作用は、（１）肝グルコース出力をより有効に低下させることにより、および（２）肝臓によるグルコース取り込みを増加させることにより、食後血糖の低下において重要な役割を果たしていることが明らかである。したがって、肝臓に対する治療用インスリンの標的化は内因性インスリンの天然生理学をより厳密に模倣するものあろう（Ｄａｖｉｓら，Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １５：，２２７（２００１））。肝特異的インスリン療法は、末梢高インスリン血症の結果であるアテローム性動脈硬化症、癌、低血糖および他の有害な代謝作用のような現在のインスリン療法の副作用の幾つかを低減しうることが提示されている（Ｇｅｈｏら，Ｊ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３：１４５１（２００９））。更に、最近のデータは、肝特異的インスリン（ＨＤＶ−Ｉ）が、肝刺激に要求される通常のインスリンの用量の１％未満しか要しないことを示している（Ｇｅｈｏら，前掲）。肝特異的インスリンの利点は２つある。第１に、肝臓におけるインスリン作用の増強は、肝グルコース取り込みを増加させながら肝グルコース出力を抑制するはずである。第２に、全身インスリン血症の軽減と共に食後血糖制御の改善が得られ、それにより、後続の低血糖のリスクが低減しうるであろう（Ｄａｖｉｓら，前掲）。
肝細胞に対するインスリン活性および門脈を介した肝臓へのインスリンの生理的運搬の重要性ゆえに、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体は肝細胞に対する標的化部分として使用されうる。該Ｎ−グリカンは受容体または輸送体のような細胞表面上のタンパク質を標的としうる。肝細胞の場合、アシアロ糖タンパク質受容体、ビオチン受容体および肝胆汁性ＡＢＣ輸送体は他の組織より高いレベルで発現され、インスリン標的化のための受容体の一例となりうる。
インスリンへのＮ−グリカンのインビボ付加を可能にするインスリン配列の突然変異は、該インスリン類似体が優先的に肝臓を標的化するのを可能にする。グリカンがＮ−グリカン構造を有するインビボグリコシル化またはインビトロＮ−グリコシル化の場合、該インスリン類似体へのＮ−グリカンの付加は外因性リンカーを必要としないであろう。なぜなら、Ｎ−グリカンは、該分子に結合している天然化学構造体だからである。該肝標的化インスリン類似体は、本明細書に記載されている任意のタンパク質工学または糖設計特性を有しうる。該肝標的化インスリンは、Ｎ−グリカンがＮ−結合グリコシル化またはコンジュゲート化により直接的に結合しているインスリン類似体を含む。該インスリンは、プロドラッグ、またはタンパク質の半減期を延長させる他の部分（すなわち、ＰＥＧ）をも含有しうる。また、肝特異的インスリン類似体は、ＩＲに対する効力の低減および／または速いＩＲオフ速度および／または遅い作用発現を回避するタンパク質結合を示すように設計されうる。
１．ＩＲおよびＡＳＧＰＲ
肝細胞への分子の標的化が、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）（Ａｓｈｗｅｌｌ−Ｍｏｒｅｌｌ受容体）を介して、成功裏に用いられている。このレクチンは、主として、自身の糖タンパク質の糖鎖から末端シアル酸残基を喪失して最後から２番目のガラクトース残基を露出している老衰赤血球の認識のために肝細胞により用いられる。ＡＳＧＰＲは肝細胞およびクッパー細胞の表面上で発現される。クッパー細胞は、補体被覆病原体およびアシアル酸化糖タンパク質に対する先天性免疫系を支持するために肝臓の洞様血管における細網内皮系の一部として機能する専門化マクロファージである。ＡＳＧＰＲは、末端ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびα−２，６−シアル酸を有する糖タンパク質に選択的に結合することを、幾つかの研究が示している（Ｓｔｅｉｒｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：３７７７（２００９））。ほとんどのレクチンと同様に、ＡＳＧＰＲと該グリカンとの間の相互作用の強度は、異なるグリカン構造に対する相対的結合アフィニティ、および複数のグリカン相互作用により生じるアビディティにより決定される。
グリコシル化インスリン類似体は、該インスリン類似体が肝臓に標的化されるように、必ずしも同時ではないがインスリン受容体とＡＳＧＰＲとの両方に結合しうる。ＡＳＧＲに結合するグリコシル化インスリン類似体は、末梢組織と比較して肝臓におけるインスリンの局所濃度の増加を示すであろう。結果として、肝臓においては、インスリン受容体は、筋肉および脂肪組織のインスリン受容体より速い速度で活性化されうる。あるいは、エンドサイトーシスにより取り込まれたグリコシル化インスリン類似体は、リソソームにおける分解の前にインスリン受容体シグナリングを活性化するための活性を保有しうる。ＡＳＧＰＲおよびＩＲに対する特定のグリコシル化インスリンの相対アフィニティは最適な活性のためにモジュレーションされうる。肝細胞と同様に、クッパー細胞もＡＳＧＰＲを発現するがＩＲを発現しないため、ＡＳＧＰＲによる分解の前にＩＲを活性化するために、クッパー細胞よりも肝細胞を標的化することが有益でありうる。これは、所望のインビボＰＫ／ＰＤプロファイルを示す最適なグリコシル化インスリン類似体分子を選択するためにＩＲおよびＡＳＧＰＲに対する結合アフィニティをモジュレーションするためのタンパク質工学および糖設計の両方により達成されうる。
ＡＳＧＰＲに結合しうる幾つかのＮ−グリカンが存在する。例えば、末端ガラクトース残基を有するＮ−グリカンはＡＳＧＰＲに対する適当な標的でありうる。ＡＳＧＰＲに結合することが知られている他の末端糖としては、ＧａｌＮＡｃおよびα−２，６シアル酸が挙げられる。該末端Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ／α−２，６シアル酸は、該グリコシル化類似体をＡＳＧＰＲへと標的化するＮ−グリカン構造を有するコンジュゲート化グリカン、あるいはビ−、トリ−またはテトラ−アンテナＮ−グリカンに含まれうる。あるいは、該グリコシル化インスリン類似体をＡＳＧＰＲに結合させるために、Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ／α−２，６シアル酸構造に基づく化学修飾糖または糖模倣体が特定され、Ｎ−グリカンに結合されうる。
したがって、特定の実施形態においては、天然Ａ鎖、天然Ｂ鎖、または配列番号１６２〜２５４に示されている群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せを含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端ガラクトースを含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、天然Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端ガラクトース残基を含むＮ−グリカンに結合している。
更に詳細な実施形態においては、天然Ａ鎖、天然Ｂ鎖、または配列番号１６２〜２５４に示されている群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せを含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端α−２，６−結合シアル酸残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、天然Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端α−２，６−結合シアル酸残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端α−２，６−結合シアル酸残基を含むＮ−グリカンに結合している。
したがって、特定の実施形態においては、天然Ａ鎖、天然Ｂ鎖、または配列番号１６２〜２５４に示されている群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せを含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端ＧａｌＮｃ残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、天然Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含むアシアロ糖タンパク質受容体標的化ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つのガラクトース残基を含むＮ−グリカンに結合している。
２．ＩＲおよびビオチン受容体
グリコシル化インスリン類似体は、該インスリン類似体が肝臓に標的化されるように、必ずしも同時ではないがインスリン受容体とビオチン受容体との両方に結合しうる。ビオチンはビタミンＨまたはＢ７とも称され、水溶性Ｂビタミンである。過去のデータは、ビオチン受容体が肝細胞の表面上に位置することを示している（Ｖｅｓｅｌｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４３：９１３（１９８７））。したがって、これはグリコシル化インスリン類似体の肝標的化の潜在的経路の一例である。
Ｎ−グリカン上に末端ガラクトースを有するインスリンの、コンピテント宿主における発現は、ガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）による酸化を可能にする。ビオチンまたはその変異体は該酸化ガラクトース部分に結合して、内因性ビオチン受容体とインビボで相互作用しうる。ビオチン受容体に結合するグリコシル化インスリン類似体は、末梢組織と比較して肝臓におけるインスリンの局所濃度の増加を示すであろう。結果として、肝臓においては、インスリン受容体は、筋肉および脂肪組織のインスリン受容体より速い速度で活性化されうる。あるいは、エンドサイトーシスにより取り込まれたグリコシル化インスリン類似体は、リソソームにおける分解の前にインスリン受容体シグナリングを活性化するための活性を保有しうる。
３．ＩＲおよび肝胆汁性受容体
グリコシル化インスリン類似体は、該インスリン類似体が肝臓に標的化されるように、必ずしも同時ではないがインスリン受容体と肝胆汁性受容体との両方に結合しうる。ＡＢＣ輸送体のような肝胆汁性受容体は、化学物質から血液を解毒するように機能する（Ｊｏｎｋｅｒら，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１４：４９０４（２００９））。過去のデータは、リポソームへのビリベルジンおよびディソフェニンのコンジュゲート化が肝胆汁性受容体を介した肝標的化を効率的にもたらしたことを示唆している（米国特許第４，６０３，０４４号、米国特許第４，８６３，８９６号、米国特許第７，１６９，４１０号）。Ｎ−グリカン上に末端ガラクトースを有するグリコシル化インスリン類似体の、コンピテント宿主における発現は、ガラクトースオキシダーゼ（ＧＡＯ）による酸化を可能にする。ついで、ビリベルジンおよびディソフェニンまたはそれらの変異体は該酸化ガラクトース部分に結合して、内因性肝胆汁性受容体とインビボで相互作用しうる。更に、肝特異的インスリンメカニズムを可能にするために、肝胆汁性表面タンパク質と相互作用する他の化学物質もインスリンにコンジュゲート化されうる。肝胆汁性受容体に結合するグリコシル化インスリン類似体は、末梢組織と比較して肝臓におけるグリコシル化インスリン類似体の局所濃度の増加を示しうる。結果として、肝臓においては、インスリン受容体は、筋肉および脂肪組織のインスリン受容体より速い速度で活性化されうる。あるいは、エンドサイトーシスにより取り込まれたグリコシル化インスリン類似体は、リソソームにおける分解の前にインスリン受容体シグナリングを活性化するための活性を保有しうる。
４．長期作用性肝特異的グリコシル化インスリン類似体
前記のとおりの幾つかのメカニズムによる肝臓へのインスリンの標的化は、１日当たりの用量の数を減少させるために更に最適化されうる。所望のインスリン療法は、主として肝臓において血液グルコースを制御するために内因性インスリンを模倣したものであり、追加的な有害なリスクを有さず、１日１回以下で投与されうる。前記のとおり、肝特異的インスリンは、インスリン受容体および標的化受容体（例えば、ＡＳＧＰＲ、ビオチン、肝胆汁性）の受容体媒介性クリアランスメカニズムによる薬物動態学的特性の低減を示しうる。ＰＫ特性が改善の必要性を示す場合、該肝特異的グリコシル化インスリン類似体はアミノ酸置換および／または改変により更に修飾されうる。
１つのそのような修飾は、インスリン・グラルジン（これは、中性ｐＨにおけるその不溶性ゆえに、基礎インスリン療法として作用する）の物理化学的特性を保持させることである。中性ｐＨ不溶性の結果として、１日１回の注射を可能にする皮下デポー剤における遅い再可溶化過程が生じる。インスリン・グラルジン分子は、Ｂ鎖の末端において２つのアルギニン残基を付加しＡ鎖の末端においてアスパラギンをグリシンへと置換するように設計された。これらの３つの変化は該タンパク質のｐＩを増加させて、それを低ｐＨ製剤化バッファー中では可溶性にしたが、生理的ｐＨでは不溶性にした。これらの変化は肝特異的グリコシル化インスリン類似体内に組込まれうる。１以上のガラクトース−またはＧａｌＮＡｃ−末端Ｎ−グリカンまたはグリカンを有するグリコシル化インスリン・グラルジンの発現は長時間作用性肝特異的（標的化）インスリン療法をもたらしうる。
したがって、特定の実施形態においては、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴＲＲ（配列番号２７）を有するＢ鎖とアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号３４）を有するＡ鎖とを含む長時間作用性肝特異的ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ここで、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴＲＲ（配列番号２７）を有するＢ鎖およびアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号３４）を有するＡ鎖、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含む長時間作用性肝特異的ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基を含むＮ−グリカンに結合している。
ｅ．グルコース応答性グリコシル化インスリン類似体
インスリンへの糖部分の化学結合により生理的血液グルコースレベルに応じてインスリンのバイオアベイラビリティをモジュレーションする概念はＭｉｃｈａｅｌ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＆ Ｃｅｒａｍｉ，前掲）により１９７９年に最初に導入された。該概念の大きな制約は、グリコシル化インスリン誘導体と相互作用するコンカナバリンＡの毒性であった。この最初の報告以来、グルコース調節性インスリンに関する潜在的改善に関する多数の報告が公開されているが、現在のところ、該糖をインビボＮ−結合グリコシル化により結合させたという報告は存在しない。
１９７９年のＢｒｏｗｎｌｅｅの概念以来、血液グルコースレベルが低い場合にインスリン貯蔵体内のインスリンを隔離するために、多種多様な方法が進展した。これらは、マンノース結合性レクチンであるコンカナバリンＡを含み、これは高い血液グルコース濃度で結合インスリン−糖複合体を遊離させることが示された。より最近になって、米国特許第７，５３１，１９１号ならびに国際出願番号ＷＯ２０１００８８２６１およびＷＯ２０１００８８２８６（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）は全て、外因性多価糖結合性分子（例えば、レクチンまたは修飾レクチン）に結合したインスリン−糖コンジュゲートを含む微粒子が患者に投与されうる系を開示しており、この場合、該微粒子から放出されるインスリン−糖コンジュゲートの量および持続時間はグルコースの血清中濃度の関数である。他の方法は、修飾レクチン、内因性受容体、内因性レクチンおよび／または糖結合性タンパク質を使用することを含む。そのような例には、マンノース受容体、マンノース結合性タンパク質およびＤＣ−ＳＩＧＮが含まれる。例えば、国際出願番号ＷＯ２０１００８８２９４は、高アフィニティ糖リガンドを含むように或るインスリン−コンジュゲートを修飾したところ、ＣｏｎＡのような外因性多価糖結合性分子の非存在下で糖濃度変化に応答するＰＫ／ＰＤプロファイルをそれらに示させることが可能であったことを開示している。マンノース結合特性を有する少なくとも３１個のヒトタンパク質が公知である。より大きなＣ型レクチンファミリーは、種々の糖部分への結合を伴う少なくとも６０個のヒトタンパク質を含む。これらのＣ型レクチンファミリーメンバーの幾つかは未知機能を示し、同様に、グルコース応答性インスリンに対する内因性結合相手として働きうるであろう。
グルコース応答性インスリンは、内因性インスリン放出の生理的拍動を模倣しうる１つの治療手段である。膵ベータ細胞からのインスリン放出を誘発する主要刺激は高血糖（高い血液グルコース）である。類似手段においては、高いグルコース濃度により保護プールから循環内に放出される治療用グリコシル化インスリンは振動的（ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ）様態で機能しうる。
例えば図２に示されているような種々のＮ−グリカンは、インスリンまたはインスリン類似体に結合している場合に、グルコース応答性インスリン療法を支持する様態で内因性タンパク質に結合するように機能しうる。少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を含むようにインスリンアミノ酸配列を修飾することは、グルコースの血清レベルに感受性であるＮ−グリコシル化インスリン類似体のインビボ産生を可能にしうる。末端マンノースまたはＧｌｃＮＡｃ残基で終わるＮ−グリカンはグルコース応答性Ｎ−結合グリコシル化インスリン類似体を与えうる。なぜなら、ヒトタンパク質のマンノース結合性ドメインと相互作用することが知られている主要糖はマンノースおよびＧｌｃＮＡｃ糖残基である。図４０に示されているとおり、Ｂ２８位のアスパラギンに連結されたＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカン構造を有するＮ−グリコシル化インスリン類似体は、マンノースレクチン相互作用を妨げるために使用される化学物質であるα−メチルマンノースに対して該インスリン類似体を応答性にした。更に詳細な実施形態においては、該グリカンは１以上のフコース残基を更に含みうる。
野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、グルコース応答性グリコシル化インスリン類似体を構築するのに有用でありうる高マンノース構造、ベータ−マンノース結合、ホスホマンノースおよびアルファ−１，６−マンノース結合を有するＮ−グリカンを産生する。該Ｎ−グリカンは、ベータ−１，２−マンノース、ホスホマンノースおよびアルファ−１，６マンノースを除去するように更に改変されうる。また、Ｎ−グリカンは、まず、末端グルコースでキャップ化され、これは小胞体内での成熟に際して除去される。そのようなグルコース末端構造もグリコシル化インスリン類似体内に含まれうる。グルコース応答性グリコシル化インスリン類似体内に含まれうる特定のＮ−グリカン構造には、少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２、およびＭａｎ１０ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンまたはグリカン；少なくとも１つの末端ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌまたはシアル酸残基を含むＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンまたはグリカン；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、コアフコースを有するＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、コアフコースを有するＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ５、コアフコースを有するＭａｎ５、１，３フコースを有する末端ＧｌｃＮＡｃ、およびＭａｎ５−ＮＡＮＡハイブリッドが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、少なくとも１つの末端マンノース残基を有する少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。更に詳細な実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は少マンノースまたは高マンノースＮ−グリカンのみを含む。更に詳細な実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体は、構造４３、５１、１０５および１０６から選択される少なくとも１つのＮ−グリカンを含む。
したがって、Ｎ−グリカンが結合しておりグルコース応答性療法として働くインスリン類似体は以下の特性を有する。
該インビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体は、ヒトインスリン、現在市販されているインスリン類似体、一本鎖インスリンポリペプチドに対する１以上の追加的アミノ酸置換を含んでいても含んでいなくてもよく、親水性重合体、例えばＰＥＧ、または疎水性重合体、例えば脂肪酸、またはプロドラッグ部分を含有する類似体を更に含みうる。該オリゴ糖単位はマンノース単位を含有することが可能であり、天然および非天然糖を含みうる。該グリコシル化インスリン類似体は１以上のＮ−グリカンを含みうる。インビトロ反応を用いて、Ｎ−グリカン構造を有するグリカンが該ペプチド配列に結合するように、該グリコシル化インスリン類似体は合成法によっても製造されうる。特定の実施形態においては、該グルコース応答性インスリン類似体は、マンノース受容体以外の受容体を介したクリアランスを増強するオリゴ糖を含有する天然および非天然非マンノースを含有しうる。
多数の内因性マンノース結合性タンパク質は、先天性免疫を支持するように機能する。グリコシル化インスリン療法と組合される内因性糖結合性タンパク質は、血液グルコースに応答性であることに加えて、高マンノースタンパク質または病原体に結合する先天性免疫機能を保持しうるであろう。したがって、適切な糖結合性タンパク質を標的化すること、および該タンパク質と相互作用するグリカンのタイプが重要である。低減した副作用およびグルコース応答特性に関するＮ−結合および合成グリカン構造のスクリーニングが試験されうる。
したがって、特定の実施形態においては、天然Ａ鎖、天然Ｂ鎖、または配列番号１６２〜２５４に示されている群から選択されるアミノ酸配列を有するＡおよびＢ鎖ペプチドの任意の組合せを含むグルコース応答性ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端マンノース残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、天然Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチド、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含むグルコース応答性ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端マンノース残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端マンノース残基を含むＮ−グリカンに結合している。
ｆ．長時間作用性グルコース応答性グリコシル化インスリン類似体
前記のグルコース応答性インスリンの機能は、１日当たりの用量の数を減少させるために更に最適化されうる。前記のとおり、グルコース応答性インスリンは、インスリン受容体および標的化受容体（すなわち、マンノース受容体、マンノース結合性タンパク質、ＤＣ−ＳＩＧＮ）の受容体媒介性グリアランスメカニズムにより薬物動態学的特性の低減を示しうる。ＰＫ特性が改善の必要性を示す場合、該グルコース応答性グリコシル化インスリンタンパク質はアミノ酸付加および／または改変により更に修飾されうる。
１つの手段は、インスリン・グラルジン（これは、中性ｐＨにおけるその不溶性ゆえに、基礎インスリン療法として作用する）の物理化学的特性を保持させることである。中性ｐＨ不溶性の結果として、１日１回の注射を可能にする皮下デポー剤における遅い再可溶化過程が生じる。インスリン・グラルジン分子は、Ｂ鎖の末端において２つのアルギニン残基を含みＡ鎖の末端においてアスパラギンをグリシンへと置換するように設計された。これらの３つの変化は該タンパク質のｐＩを増加させて、それを低ｐＨ製剤化バッファー中では可溶性にしたが、生理的ｐＨでは不溶性にした。これらの変化は、少なくとも１つのＮ−結合グリコシル化部位を含むようにＡまたはＢ鎖を修飾することにより、本明細書に開示されているグルコース応答性グリコシル化インスリン法に組込まれうる。例えば、１つの実施形態においては、Ｂ鎖はアミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴＲＲ（配列番号２７）を有し、Ａ鎖はアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号３４）を有する。本明細書に開示されているＮ−結合グリコシル化を引き起こしうる宿主における、これらの配列をコードするグリコシル化インスリン前駆体遺伝子の発現は、長時間作用性グルコース応答性インスリンを与えうる。あるいは、該インスリン類似体は、Ｎ−グリカン構造を有するグリカンでインビトロでグリコシル化されうる。
したがって、特定の実施形態においては、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴＲＲ（配列番号２７）を有するＢ鎖とアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号３４）を有するＡ鎖とを含む長時間作用性グルコース応答性ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ここで、該ヘテロ二量体または一本鎖インスリン類似体における少なくとも１つのアスパラギン残基は、非還元末端に少なくとも１つの末端マンノース残基を含むＮ−グリカンに結合している。もう１つの実施形態においては、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＴＲＲ（配列番号２７）を有するＢ鎖およびアミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号３４）を有するＡ鎖、あるいは１、２、３、４、５個またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含むそれらの類似体を含む長時間作用性グルコース応答性ヘテロ二量体または一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を提供し、ただし、該インスリン分子は、非還元末端に少なくとも１つの末端マンノース残基を含む少なくとも１つのＮ−グリカンに結合しており、例えば、該分子の、少なくとも１つのＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨまたはＨｉｓのイミジゾール環は、少なくとも１つの末端マンノース残基を含むＮ−グリカンに結合している。
ｇ．ヒトレクチンとのグリコシル化インスリン類似体の相互作用
レクチンは、炭水化物部分に結合するタンパク質である。細胞内および細胞間グリカン運搬に関与し、防御分子として作用する、Ｃ型、Ｉ型、Ｐ型、ガレクチンおよびペントラキシン群を含む多数の型のレクチンが存在する（Ｋａｌｔｎｅｒ ＆ Ｇａｂｉｕｓ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４９１：７９（２００１））。Ｃ型、Ｓｉｇｌｅｃ（シグレック）およびガレクチン群はパターン認識受容体である（Ｄａｍ ＆ Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：２７０（２０１０））。Ｉ型の最も広範に特徴づけられているレクチンは、Ｓｉｇｌｅｃｓ、つまり、末端α−２，３／α−２，６／α−２，８シアル酸と相互作用するシアル酸結合性レクチンとして公知である（Ｃｒｏｃｋｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７：２５５（２００７））。ガレクチンはβ−ｇａｌおよびＬａｃＮＡｃ部分に対する特異性を有する（Ｄａｍ ＆ Ｂｒｅｗｅｒ，前掲）。Ｃ型レクチンは、以下の２つのファミリーに分類されるカルシウム依存性タンパク質である：Ｍａｎおよび／またはフコース末端グリカンへの結合を伴うマンノース（Ｍａｎ）特異的；Ｇａｌおよび／またはＧａｌＮＡｃへの結合を伴うガラクトース（Ｇａｌ）特異的（Ｄａｍ ＆ Ｂｒｅｗｅｒ，前掲）。Ｃ型レクチンのアフィニティは多価提示と共に増加し、したがって、グリカン構造に対する特異的アフィニティおよびアビディティが重要である。
効力を改善するための、合成炭水化物構造によるレクチンへの治療用タンパク質、分子または薬物の標的化が報告されている（Ｂｅｒｎａｒｄｅｓら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．８：４９８７−４９９６（２０１０）；Ｌｅｐｅｎｉｅｓら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４：４０４（２０１０））。また、合成または半合成グリカンはレクチンとの相互作用および後の糖タンパク質のインビボ生物学的分布に影響を及ぼすことが示されている（Ａｎｄｒｅら，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３９０：５５７（２００９））。Ｍａｎ特異的Ｃ型レクチンは、マンノース受容体、ＤＥＣ−２０５、Ｅｎｄｏ−１８０、ホスホリパーゼＡ２受容体、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ、ＬＳＥＣｔｉｎ、ＢＤＣＡ−２およびｄｅｃｔｉｎ−１のような抗原提示細胞にワクチンを標的化するために使用されている（Ｋｅｌｅｒら，Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１９５３（２００４））。Ｍａｎ特異的Ｃ型レクチンに関して、以下の受容体−リガンド関係が特定されている：マンノース受容体−マンノース、フコースおよびＧｌｃＮＡｃ；ｄｅｃｔｉｎ−１ −β−グルカン；ＤＣ−ＳＩＧＮ−マンナン（Ｍａｎ６／７／８／９のような高マンノース）、シアル酸化ルイス構造、アガラクトシル化グリカン（ＧｌｃＮＡｃ１Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２フコース、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２フコース；ＤＣ−ＳＩＧＮＲ −マンナン（Ｍａｎ６／７／８／９のような高マンノース）、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２フコース（Ｋｅｌｅｒら，前掲；Ｙａｂｅら，ＦＥＢＳ Ｊ．２７７：４０１０（２０１０）））。そのような構造は、インビボでグルコース応答性プロファイルを有するグリコシル化インスリン類似体を得るためにインスリン類似体を結合させるための好適な部分でありうる。
マンノースグリカンと相互作用するもう１つのレクチンは、マンナン結合性レクチンまたはマンノース結合性タンパク質としても公知であるマンノース結合性レクチン（ＭＢＬ）である。これは、先天性免疫系を支持するために血中を循環する分泌性タンパク質である。また、ＭＢＬは、レクチン媒介性補体カスケードを始動するように機能する。興味深いことに、ＭＢＬレベルは高可変性であり、ＭＢＬ欠損がヒト集団の３分の１以上で生じ、糖尿病患者において変動しうる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｒｅａｌら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４９：２４０２（２００６）；Ｆｏｒｔｐｉｅｄら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｔａｂ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２６：２５４（２０１０））。タンパク質グリケーションは高血糖と共に増加するため、ＭＢＬはマンノース、フコースおよびフルクトリシンへの結合の改変を示し、補体活性化および糖尿病の病理発生における役割に寄与しうると仮定されている（Ｆｏｒｔｐｉｅｄら，前掲）。また、ＭＢＬへのマンノースグリカンの結合は血液グルコースレベルに対して応答性であることが示されている（Ｉｌｙａｓら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２１６：１２６−１３１（２０１１）；２０１０年７月１日付けオンライン）。したがって、ＭＢＬへグリコシル化インスリンを標的化すること、およびグルコース応答活性でそれを機能させることが、第ＩＩＩ節および図２に記載されているような、マンノース、特に末端マンノースを含有するＮ−グリカンを使用して達成されうる。
Ｃ型レクチンのその他の主要クラスはＧａｌ特異的レクチンである。このクラスにおけるそのような受容体はアシアロ糖タンパク質Ｈ１およびＨ２受容体（ＡＳＧＰＲ）ならびにマクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）である。ＡＳＧＰＲは、末端ガラクトースおよびＧａｌＮＡｃを有するトリ−またはテトラ−アンテナグリカンに優先的に結合し、あるいは、ＭＧＬは、末端ＧａｌＮＡｃを有するグリカンに優先的に結合する（ｖａｎ Ｖｌｉｅｔら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：８３（２００８））。ＡＳＧＰＲは肝細胞の表面上に位置し、一方、ＭＧＬは未熟樹状細胞およびマクロファージ上に存在するため、肝特異的活性のためには、末端ガラクトースを有するトリ−またはテトラアンテナグリカンを使用することが最も好ましいかもしれないが、末端ＧａｌＮＡｃもインビボ活性に関して試験されるべきである。
ｈ．グリコシル化インスリン類似体のＰＤおよびＰＫ
本明細書に開示されている種々の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の薬物動態学的および／または薬力学的挙動は、グルコースおよびアルファ−メチル−マンノース（これらに限定されるものではない）を含む糖の血清中濃度の変動により修飾されうる。
例えば、薬物動態学的（ＰＫ）観点からは、糖（例えば、グルコース）の血清濃度が上昇すると、または糖の血清濃度が閾値を超える（例えば、正常グルコースレベルより高い）と、血清濃度曲線は上方に移動する。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、哺乳動物に投与された場合、絶食条件下と高血糖条件下とで実質的に異なる。本明細書中で用いる「実質的に異なる」なる語は、それらの２つの曲線が、スチューデントｔ検定により決定された場合に統計的に異なることを意味する（ｐ＜０．０５）。本明細書中で用いる「絶食条件」なる語は、５名以上の絶食非糖尿病個体からのデータを合わせることにより血清濃度曲線が得られたことを意味する。特定の実施形態においては、絶食非糖尿病個体は、採血時に糖尿病症状を示していない及び採血時前の１２時間以内に食事を摂っていない１８〜３０歳のヒトから無作為に選択される。本明細書中で用いる「高血糖条件」なる語は、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体とグルコースとの同時投与により高血糖状態（絶食条件下で観察される平均グルコース濃度を上回る、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬのグルコースＣｍａｘ）が誘発された５名以上の絶食非糖尿病個体から血清濃度曲線が得られたことを意味する。
本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体とグルコースとの同時投与は、検出可能なレベルで血清中に該グリコシル化インスリン類似体が存在する期間中にグルコースＣｍａｘが生じることを要するに過ぎない。例えば、グルコース注射（または摂取）は、該グリコシル化インスリン類似体の投与の直前、同時または直後に行われるように、その時機が調節されうるであろう。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体およびグルコースは、異なる経路で又は異なる位置において投与される。例えば、特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体は皮下投与されるが、グルコースは経口または静脈内投与される。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清Ｃｍａｘは、高血糖条件下では、絶食条件下と比較して高い。それに加えて又はその代わりに、特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体の血清曲線下面積（ＡＵＣ）は、高血糖条件下では、絶食条件下と比較して高い。種々の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体の血清消失速度は、高血糖条件下では、絶食条件下と比較して遅い。特定の実施形態においては、該グリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、１つの短い半減期および１つの長い半減期を有する２コンパートメント双指数（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）モデルにフィット（当てはめ）されうる。そのような長い半減期はグルコース濃度に特に感受性でありうる。したがって、特定の実施形態においては、そのような長い半減期は、高血糖条件下では、絶食条件下と比較して長い。特定の実施形態においては、該絶食条件は１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。特定の実施形態においては、該高血糖条件は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。他のＰＫパラメータ、例えば平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）などが、前記パラメータのいずれかの代わりに又はそれらと共に用いられうる、と理解されるであろう。
ヒト、イヌ、ネコおよびラットにおけるグルコース濃度の正常範囲は６０〜２００ｍｇ／ｄＬである。当業者は、種々の正常範囲（例えば、ミニブタにおけるグルコース濃度の正常範囲は４０〜１５０ｍｇ／ｄｌである）を有する種に関して、以下の値を外挿しうるであろう。一般に、５０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコース濃度は低血糖とみなされ、２００ｍｇ／ｄＬを超えるグルコース濃度は高血糖とみなされる。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体のＰＫ特性は、グルコースクランプ法（実施例を参照されたい）を用いて試験されることが可能であり、本明細書に開示されているインビトロまたはインビボグリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなどのグルコース濃度で投与された場合、実質的に異なりうる。それに加えて又はその代わりに、血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期は、それらの２つのグルコース濃度において実質的に異なりうる。後記のとおり、特定の実施形態においては、比較グルコース濃度として１００ｍｇ／ｄＬおよび３００ｍｇ／ｄＬが用いられうる。しかし、本開示は、以下のペア（それらに限定されるものではない）のいずれかを含む比較グルコース濃度の代替ペアを有するこれらの実施形態のそれぞれを含むと理解されるべきである：５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなど。したがって、特定の実施形態においては、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体のＣｍａｘは、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、より高い。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体のＣｍａｘは、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）高い。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体のＡＵＣは、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、より高い。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体のＡＵＣは、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）高い。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清消失速度は、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、より遅い。ある実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の血清消失速度は、それらの２つのグルコース濃度のうちの低いほうの濃度（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される１００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）速い。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、１つの短い半減期および１つの長い半減期を有する２コンパートメント双指数（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）モデルにフィットされうる。そのような長い半減期はグルコース濃度に特に感受性でありうる。したがって、特定の実施形態においては、そのような長い半減期は、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、より長い。
特定の実施形態においては、そのような長い半減期は、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、少なくとも５０％（例えば、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも４００％）長い。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線を２つの異なるグルコース濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で得、それらの２つの曲線を、１つの短い半減期および１つの長い半減期を有する２コンパートメント双指数（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）モデルを用いてフィットし、それらの２つのグルコース濃度で得られた長い半減期を比較する、方法を提供する。特定の実施形態においては、この方法は、本明細書に開示されている１以上のインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体のグルコース感受性を試験または比較するためのアッセイとして用いられうる。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体および該インスリンの非グリコシル化形態の血清濃度曲線を同一条件（例えば、絶食条件）下で得、それらの２つの曲線を、１つの短い半減期および１つの長い半減期を有する２コンパートメント双指数（ｂｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）モデルを用いてフィットし、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体および非グリコシル化形態に関して得られた長い半減期を比較する、方法を提供する。特定の実施形態においては、この方法は、該非グリコシル化形態または天然インスリンより迅速にクリアランスされる本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体を特定するためのアッセイとして用いられうる。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、高血糖条件下で哺乳動物に投与された場合、該類似体の非グリコシル化形態の血清濃度曲線と実質的に同じである。本明細書中で用いる「実質的に同じ」なる語は、スチューデントｔ検定により決定された場合に、それらの２つの曲線の間に統計的な差が存在しないことを意味する（ｐ＞０．０５）。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、絶食条件下で哺乳動物に投与された場合、該類似体の非グリコシル化形態の血清濃度曲線とは実質的に異なる。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の血清濃度曲線は、該類似体の非グリコシル化形態の血清濃度曲線と比較して、高血糖条件下で哺乳動物に投与された場合には実質的に同じであり、絶食条件下で投与された場合には実質的に異なる。
特定の実施形態においては、該高血糖条件は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。特定の実施形態においては、該絶食条件は１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。血清Ｔｍａｘ、血清Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、平均血清滞留時間（ＭＲＴ）、平均血清吸収時間（ＭＡＴ）および／または血清半減期のような前記ＰＫパラメータのいずれかが比較されうると理解されるであろう。
薬力学的（ＰＤ）観点からは、グルコース濃度が上昇すると、またはグルコース濃度が閾値を超える（例えば、正常グルコースレベルより高い）と、本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体の生物活性は増強しうる。特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の生物活性は、高血糖条件下と比較して絶食条件下で投与された場合に低い。
特定の実施形態においては、該絶食条件は１００ｍｇ／ｄＬ未満（例えば、８０ｍｇ／ｄＬ、７０ｍｇ／ｄＬ、６０ｍｇ／ｄＬ、５０ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。特定の実施形態においては、該高血糖条件は２００ｍｇ／ｄＬを超える（例えば、３００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ、６００ｍｇ／ｄＬなど）のグルコースＣｍａｘを含む。
特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体のＰＤ特性は、一定のグルコース濃度を維持するのに必要なグルコース注入速度（ＧＩＲ）を測定することにより試験されうる。そのような実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の生物活性は、５０および２００ｍｇ／ｄＬ、５０および３００ｍｇ／ｄＬ、５０および４００ｍｇ／ｄＬ、５０および５００ｍｇ／ｄＬ、５０および６００ｍｇ／ｄＬ、１００および２００ｍｇ／ｄＬ、１００および３００ｍｇ／ｄＬ、１００および４００ｍｇ／ｄＬ、１００および５００ｍｇ／ｄＬ、１００および６００ｍｇ／ｄＬ、２００および３００ｍｇ／ｄＬ、２００および４００ｍｇ／ｄＬ、２００および５００ｍｇ／ｄＬ、２００および６００ｍｇ／ｄＬなどのグルコース濃度で投与された場合、実質的に異なりうる。したがって、特定の実施形態においては、本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体の生物活性は、それらの２つのグルコース濃度のうちのうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、より高い。ある実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体の生物活性は、それらの２つのグルコース濃度のうちの高いほうの濃度（例えば、１００ｍｇ／ｄＬ グルコースと比較される３００ｍｇ／ｄＬ グルコース）で哺乳動物に投与された場合、少なくとも２５％（例えば、少なくとも５０％または少なくとも１００％）高い。
本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体に関するＰＤ挙動は、最小血液グルコース濃度（Ｔｎａｄｉｒ）に達するまでの時間、血液グルコースレベルが初期値の或る割合未満（例えば、初期値の７０％または１０ Ｔ７０％ ＢＧＬ）で維持される持続時間などを比較することにより観察されうる。一般に、本明細書に記載されているＰＫおよびＰＤ特性はいずれも、種々の公開されている薬物動態学的および薬力学的方法（例えば、皮下運搬に適した方法に関しては、Ｂａｕｄｙｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９：１７６−１８３（１９９８）を参照されたい）のいずれかにより決定されうる、と理解されるであろう。また、該ＰＫおよび／またはＰＤ特性は任意の哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ネコ、ミニブタ、イヌなど）において測定されうると理解されるべきである。
特定の実施形態においては、ＰＫおよび／またはＰＤ特性はヒトにおいて測定される。特定の実施形態においては、ＰＫおよび／またはＰＤ特性はラットにおいて測定される。特定の実施形態においては、ＰＫおよび／またはＰＤ特性はミニブタにおいて測定される。特定の実施形態においては、ＰＫおよび／またはＰＤ特性はイヌにおいて測定される。また、前記説明は、本明細書に開示されているグルコース応答性インビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体に関して記載されているが、外因性糖、例えばマンノース、Ｌ−フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、アルファ−メチルマンノースなどを含む他の糖に応答性である本明細書に開示されているインビボまたはインビトログリコシル化インスリン類似体に、同じ特性およびアッセイが適用される、と理解されるであろう。幾つかの態様においては、絶食および高血糖条件下でＰＫおよび／またはＰＤ特性を比較する代わりに、外因性糖の投与を伴う及び伴わない絶食条件下でＰＫおよび／またはＰＤ特性が比較されうる。本明細書に開示されているインビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリン類似体は、与えられた外因性糖の種々のＣｍａｘ値に応答するように設計されうる、と理解されるべきである。
Ｖ．Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を製造するための宿主細胞
一般に、インスリンおよびインスリン類似体の商業的製造には、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、および酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が使用されている。例えば、Ｔｈｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６７６６−６７７０（１９８０）、米国特許第４，９１６，２１２号、第５，６１８，９１３号および第７，１０５，３１４号はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるインスリンの製造を開示しており、ＷＯ２００９１０４１９９はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるインスリンの製造を開示している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるインスリンの製造は、Ｃｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５４０１−５４０４（１９８１）および米国特許第５，２２７，２９３号を含む多数の刊行物に開示されている。酵母宿主におけるインスリンの製造の利点は、インスリン分子が、適切なジスルフィド結合を有する適切にフォールドした立体配置で該宿主細胞から分泌されることであり、ついでそれはインビトロで酵素によりプロセシングされて、インスリンヘテロ二量体を与えうる。これとは対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において産生されるインスリンはインビボでプロセシングされずに、それは、不適切にフォールドした立体配置で封入体内に隔離される。該封入体は該細胞から回収され、一連の反応においてインビトロで加工されて、適切な立体配置のインスリンヘテロ二量体を与える。インスリンは、Ｎ−結合グリコシル化部位を欠いているため、通常は糖タンパク質とみなされないが、インスリンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてではなく酵母において製造された場合には、合成されたインスリンの小集団はＯ−グリコシル化されているらしい。これらのＯ−グリコシル化分子は汚染物だとみなされており、その除去のための方法が開発されている（例えば、米国特許第６，１８０，７５７号およびＷＯ２００９１０４１９９を参照されたい）。
しかし、本明細書に開示されているＮ−グリコシル化インスリン類似体の製造のためには、酵母および糸状菌のような下等真核生物が特に魅力的である。なぜなら、Ｎ−グリコシル化パターンが哺乳類様もしくはヒト様である又はヒト化されている、あるいは特定のＮ−グリカン種が優勢である糖タンパク質をそれらが発現するように、それらは遺伝的に修飾されうるからである。選択された内因性グリコシル化酵素を除去し、および／または外因性酵素を供給することにより（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，４４９，３０８号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり）、これは達成されうる。酵母におけるＯ−グリコシル化を低減するための一般的方法は国際出願番号ＷＯ２００７０６１６３１に記載されている。
したがって、本発明の特定の態様においては、宿主細胞は酵母細胞または糸状菌宿主細胞である。酵母および糸状菌宿主細胞には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、ピチア・リンドネリ（Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ））、ピチア・オプンチエ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・テルモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、ピチア・グエルクウム（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ）、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スチプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のアスペルギルス属種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム属種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）およびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
特定の実施形態においては、該宿主細胞は酵母宿主細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはオガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するそれらの突然変異体およびそれらの遺伝的操作変異体である。このようにして、特定の所望のグリコフォームが組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造されうる。所望により、コアフコシル化を伴う又は伴わない糖タンパク質が産生されうるように、グリコシル化の追加的な遺伝的操作が行われうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母の使用は更に有利である。なぜなら、糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％超（すなわち、３０モル％を超える）として存在しうるように、これらの細胞は糖タンパク質の比較的均一な組成物を産生しうるからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％超、５０モル％超、６０モル％超、７０モル％超、最も好ましくは８０モル％超で存在しうる。選択された内因性グリコシル化酵素を除去し、および／またはＧｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりに外在性酵素を供給することにより、それは達成されうる。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠損するように選択または操作されうる。例えば、酵母においては、そのようなα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性はＯＣＨ１遺伝子によりコードされており、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または発現破壊（ｏｃｈ１Δ）はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母における高マンノースまたは高マンノシル化Ｎ−グリカンの産生を抑制する（例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓら，米国特許第６，８０３，２２５号およびＣｈｉｂａら，ＥＰ１２１１３１０Ｂ１（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。したがって、１つの実施形態においては、Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を製造するための宿主細胞はＯＣＨ１遺伝子の欠失または発現破壊（ｏｃｈ１Δ）を含み、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む。
もう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。
もう１つの実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩまたはＧｎＴ Ｉ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生されたＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体をヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることが可能である。あるいは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物をマンノシダーゼＩＩで、ついでヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生させることが可能である。
もう１つの実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，６２５，７５６号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質およびその組成物を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生されたＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を除去するヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることが可能であり、あるいは該ヘキソサミニダーゼを該宿主内で共発現させて、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物を産生させることが可能である。
もう１つの実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩまたはＧｎＴ ＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生されたＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を、末端ＧｌｃＮＡｃ残基を除去するヘキソサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物組を産生させることが可能であり、あるいは該ヘキソサミニダーゼを該宿主内で共発現させて、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物を産生させることが可能である。
もう１つの実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２もしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む糖タンパク質およびその組成物を産生しうる下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生されたＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生させることが可能であり、あるいは該ガラクトシダーゼを共発現させて、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体、例えば、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生させることが可能である。
もう１つの実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生されたＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはその混合物を主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物を産生させることが可能であり、あるいは該ノイラミニダーゼを該宿主細胞内で共発現させて、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物、例えば、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生させることが可能である。
もう１つの態様においては、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを有する糖タンパク質を産生しうる前記宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。米国特許第７，６２５，７５６号（その開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）は、マンノシダーゼＩＩＩ酵素を発現し、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に有する糖タンパク質およびその組成物を産生しうる下等真核宿主細胞の使用を開示している。
前記宿主細胞はいずれも、米国特許第７，５９８，０５５号および米国公開特許出願第２００７／００３７２４８号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴ ＩＩＩ）および／または多アンテナ（ＧｎＴ ＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩおよびＧｎＴ ＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含みうる。
更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。
もう１つの実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質およびその組成物、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを主に含むＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体組成物を産生する。
一般に、酵母および糸状菌は、フコースを含むＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得ない。したがって、ＧＤＰ−フコースおよびフコシルトランスフェラーゼを合成するための経路を含むように宿主細胞が特に修飾されていない限り、本明細書に開示されているＮ−グリカンはフコースを欠くであろう。したがって、Ｎ−グリカンがフコースを含む糖タンパク質を得ることが望ましい特定の態様においては、前記宿主細胞のいずれかは、フコシルトランスフェラーゼと、フコースを産生しフコースをＥＲまたはゴルジに輸送するための経路とを含むように更に修飾される。有するＮ−グリカンの１以上がフコシル化されている糖タンパク質をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が産生しうるようにするために、ピチア・パストリスを修飾するための方法の例は、公開国際出願番号ＷＯ ２００８１１２０９２（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。本発明の特定の態様においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、ＧＤＰ−フコース輸送体およびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を含むように更に修飾される。特定の態様においては、該フコシルトランスフェラーゼは、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，６−フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
前記の種々の宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含みうる。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。
宿主細胞は更に、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂ（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）の一方または両方を欠失または破壊することにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を除去するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を包含し、更に詳細な態様においては、それは、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失または破壊することをも含みうる。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
宿主細胞は更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）］の１以上を欠失または発現破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ ２００７／０６１６３１（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはアルファ−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）］を包含する。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊すること、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊すること、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞は更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかを含みうる。
Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用されうるベンジリデンチアゾリジンジオンの例としては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。
特定の実施形態においては、少なくとも１つの内因性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性α−１，２−マンノシダーゼをも発現する。
ＰＭＴ遺伝子欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占拠を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるα−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性α−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占拠および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要しうるため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびα−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内因性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性α−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われうる。
したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を製造するのに有用でありうる。Ｏ−グリコシル化の低減または排除は、全抗体のような糖タンパク質が分泌経路を横断し細胞表面へ輸送される際の、全抗体のような糖タンパク質の構築および輸送に有益な効果をもたらすらしい。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された糖タンパク質（例えば、抗体フラグメント）の収率が、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる収率と比較して増加する。
α−マンノシダーゼに耐性である、β−結合マンノース残基を有するＮ−グリカンおよびＯ−グリカンの可能性を減少させ又は排除するために、β−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４）の１以上を欠失または破壊することにより、α−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を除去するために、組換え糖操作ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を遺伝的に操作する（米国特許第７，４６５，５７７号、米国特許第７，７１３，７１９号および公開国際出願番号ＷＯ２０１１０４６８５５（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。また、ＢＭＴ２とＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の１以上との欠失または破壊は、宿主細胞タンパク質に対する抗体に対する検出可能な交差反応性を低減または排除する。
特定の実施形態においては、該宿主細胞はＡｌｇ３ｐタンパク質活性を示さず、あるいはＡＬＧ３遺伝子からの発現の欠失または破壊（例えば、該宿主細胞をａｌｇ３Δにする、Ａｌｇ３ｐをコードするオープンリーディングフレームの欠失または破壊）を有する［公開米国出願第２００５０１７０４５２号またはＵＳ２０１００２２７３６３（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり］。Ａｌｇ３ｐはＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチル アルファ−１，３−マンノシルトランスフェラーゼであり、これは、脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図２，ＧＳ １．３）のアルファ−１，６−アームのマンノース残基へアルファ−１，３−結合でマンノース残基を転移して、脂質結合Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の合成のための前駆体である脂質結合Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２（図２，ＧＳ １．４）を産生し、ついでこれは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移され、ついでグルコース（Ｇｌｃ）残基の除去に付される。Ａｌｐ３ｐタンパク質活性を欠く宿主細胞においては、脂質結合Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖はオリゴサッカリルトランスフェラーゼにより糖タンパク質のアスパラギン残基に転移されうる。α１，２−マンノシダーゼを更に含むそのような宿主細胞において、該糖タンパク質に結合しているＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２オリゴ糖はトリ−マンノース（少マンノース）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造（図２，ＧＳ ２．１）へと切断される。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ １．３）は、図２に示されているＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ ２．０）から区別され、これは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ＰＰ−ドリチル アルファ−１，３マンノシルトランスフェラーゼ（Ａｌｇ３ｐ）を発現する宿主細胞において産生される。
したがって、ＡＬＧ３遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ３Δ）を含み、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞におけるＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物の製造方法であって、該インスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ １．３）構造を主に有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む製造方法を提供する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、エンドマンノシダーゼ活性［例えば、完全長エンドマンノシダーゼ、またはキメラエンドマンノシダーゼ（これは、細胞標的化シグナルペプチドに融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、エンドマンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される；米国特許第７，３３２，２９９号を参照されたい）］および／またはグルコシダーゼＩＩ活性［完全長グルコシダーゼＩＩ、またはキメラグルコシダーゼＩＩ（これは、細胞標的化シグナルペプチドに融合したグルコシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、グルコシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される；米国特許第６，８０３，２２５号を参照されたい）］を発現する。特定の態様においては、該宿主細胞は更に、ＡＬＧ６（α１，３−グルコシルトランスフェラーゼ）遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ６Δ）を含み、これはａｌｇ３Δ宿主細胞における糖タンパク質のＮ−グリカン占拠を増加させることが示されている（例えば、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（ＧＳ １．３）または少マンノースＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の遺伝的操作を開示しているＤｅ Ｐｏｕｒｃｑら，ＰｌｏＳＯｎｅ ２０１２；７（６）：ｅ３９９７６．Ｅｐｕｂ ２０１２年６月２９日を参照されたい）。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ６をコードする核酸配列はＥＭＢＬデータベース，アクセッション番号ＣＣＣＡ３８４２６に開示されている。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は更に、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）を含む。
更に、ＡＬＧ３遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ３Δ）を含み、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される）を含むキメラα１，２−マンノシダーゼをコードする、該キメラα１，２−マンノシダーゼを過剰発現する核酸分子を含み、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を含む下等真核宿主細胞におけるＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体およびその組成物の製造方法であって、該インスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造を主に有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む製造方法を提供する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、エンドマンノシダーゼ活性［例えば、完全長エンドマンノシダーゼ、またはキメラエンドマンノシダーゼ（これは、細胞標的化シグナルペプチドに融合したエンドマンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、エンドマンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される）］および／またはグルコシダーゼＩＩ活性［完全長グルコシダーゼＩＩ、またはキメラグルコシダーゼＩＩ（これは、細胞標的化シグナルペプチドに融合したグルコシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、グルコシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される）］を発現または過剰発現する。特定の態様においては、該宿主細胞は更に、ＡＬＧ６遺伝子の欠失または破壊（ａｌｇ６Δ）を含む。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は更に、ＯＣＨ１遺伝子の欠失または破壊（ｏｃｈ１Δ）を含む。実施例１４は、キメラα１，２−マンノシダーゼおよび完全長エンドマンノシダーゼ過剰発現するａｌｇ３Δピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の構築を示す。実施例１５において、該宿主細胞は、少マンノースＮ−グリカンを有するインスリン類似体を産生することが示された。他の酵母または糸状菌において、類似宿主細胞が構築されうる。
更に詳細な実施形態においては、前記ａｌｇ３Δ宿主細胞は更に、特定のハイブリッドまたは複合Ｎ−グリカンを主に有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させるための、既に開示されている追加的な哺乳類またはヒトグリコシル化酵素（例えば、ＧｎＴ Ｉ、ＧｎＴ ＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ）を含みうる。
糖タンパク質の収率は、幾つかの場合には、哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、あるいは１以上の内因性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換することにより改善されうる。また、宿主細胞における哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質の発現も該細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するらしい。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能が低減または排除されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類またはヒトホモログの少なくとも１つをコードするベクターが細胞内で発現される、本発明における宿主細胞が更に含まれる。また、該内因性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も含まれる。更に詳細な態様においては、下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。組換えタンパク質の収率の改善およびＯ−グリコシル化の低減または制御のためにヒトシャペロンタンパク質が導入される、宿主細胞のシャペロンの使用の具体例は、公開国際出願番号ＷＯ ２００９１０５３５７およびＷＯ ２０１００１９４８７（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。前記と同様に、該内因性シャペロンタンパク質の１以上をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは前記のとおりに１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現させることに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失されている、下等真核宿主細胞が更に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内因性ＰＭＴ遺伝子の機能が低減、破壊または欠失されている。
本明細書に開示されている方法は、糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾された任意の宿主細胞を使用することが可能であり、ここで、主要Ｎ−グリカンは複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択され、ここで、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群、Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群、またはＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、ハイブリッドＮ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択され、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２およびＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２からなる群から選択される。もう１つの実施形態においては、該主要Ｎ−グリカンは少マンノース、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２である。
組換え宿主細胞において産生される糖タンパク質上のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させるために、内因性宿主細胞ヘテロオリゴマーオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含む１以上の必須サブユニットの致死突然変異を機能的に抑制しうる１以上の異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を、該宿主細胞内での該糖タンパク質の発現の前または該発現と同時に、該組換え宿主細胞において過剰発現させる。リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａタンパク質、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｂタンパク質およびリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＳＴＴ３遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制することが示されている単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである（Ｎａｓｅｂら，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １９：３７５８−３７６８（２００８））。Ｎａｓｅｂら（同誌）は更に、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質がＷＢＰ１、ＯＳＴ１、ＳＷＰ１およびＯＳＴ２遺伝子座の欠失の致死表現型を抑制しうることを示した。Ｈｅｓｅら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９：１６０−１７１（２００９））は、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ａ（ＳＴＴ３−１）、ＳＴＴ３Ｂ（ＳＴＴ３−２）およびＳＴＴ３Ｄ（ＳＴＴ３−４）タンパク質がＯＳＴ２、ＳＷＰ１およびＷＢＰ１遺伝子座の欠失を機能的に相補しうることを教示している。ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２５８７８（公開国際出願番号ＷＯ２０１１１０６３８９；これを参照により本明細書に組み入れることとする）に示されているとおり、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）タンパク質は、宿主細胞により産生される異種糖タンパク質（例えば、抗体）のＮ−グリコシル化部位占拠を増加させうることが本明細書中の実施例に示されているΔｗｂｐ１、Δｏｓｔ１、Δｓｗｐ１およびΔｏｓｔ２突然変異の少なくとも１つの致死表現型とΔｓｔｔ３突然変異の致死表現型とを抑制しうる異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼである。
したがって、前記の１つの態様においては、酵母または糸状菌宿主細胞におけるＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞を準備し、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることを含む。
前記のもう１つの態様においては、Ｎ−グリコシル化部位占拠が８３％を超える主要Ｎ−グリカン種を含有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の、酵母または糸状菌宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質）をコードする核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞を準備し、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、Ｎ−グリコシル化部位占拠が８３％を超える該Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることを含む。前記の特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９４％である。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９９％である。
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする第１核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする第２核酸分子とを含む、特定のＮ−グリカン種を主に有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生するように遺伝的に操作された酵母または糸状菌宿主細胞を提供し、ここで、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子が発現される。これは内因性ＳＴＴ３遺伝子（これは、酵母においては、ＳＴＴ３遺伝子である）の発現を含む。
一般に、前記方法および宿主細胞においては、該異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、ＯＴａｓｅ複合体の少なくとも１つの必須タンパク質の突然変異の致死表現型を機能的に抑制しうる。更に詳細な態様においては、ＯＴａｓｅ複合体の必須タンパク質はＳＴＴ３遺伝子座、ＷＢＰ１遺伝子座、ＯＳＴ１遺伝子座、ＳＷＰ１遺伝子座またはＯＳＴ２遺伝子座あるいはそれらのホモログによりコードされる。更に詳細な態様においては、例えば、該単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼはリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質である。
プロモーターは、遺伝子発現を制御するためのＤＮＡ配列要素である。特に、プロモーターは転写開始部位を特定し、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター要素を含みうる。選択されるプロモーターは、選択される個々の宿主系において機能しうると予想されるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、オガタエア・ミヌタ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母が使用される場合には、酵母プロモーターが使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌プロモーターが使用されるであろう。酵母プロモーターの例には、ＧＡＰＤＨ、ＡＯＸ１、ＳＥＣ４、ＨＨ１、ＰＭＡ１、ＯＣＨ１、ＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５、ＣＵＰ１、ＭＦα１、ＦＬＤ１、ＰＭＡ１、ＰＤＩ、ＴＥＦ、ＲＰＬ１０およびＧＵＴ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｒｏｍａｎｏｓら，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８（１９９２）は酵母プロモーターおよび発現ベクターの総説を記載している。Ｈａｒｔｎｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３６：ｅ７６（ｐｕｂ ｏｎ−ｌｉｎｅ ６ Ｊｕｎｅ ２００８）は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における異種タンパク質の微調整発現のためのプロモーターのライブラリーを記載している。
本明細書に開示されている核酸分子に機能的に連結されるプロモーターは構成的プロモーターまたは誘導プロモーターでありうる。誘導プロモーター、例えばＡＯＸ１プロモーターは、誘導因子に応答して、転写因子の結合に際して、増加または減少した速度での転写を導くプロモーターである。本明細書中で用いる転写因子には、プロモーターの調節または制御領域に結合して転写に影響を及ぼしうる任意の因子が含まれる。宿主細胞における転写因子のプロモーター結合能またはＲＮＡ合成は、該宿主を誘導因子にさらす又は宿主細胞培地から誘導因子を除去することにより制御されうる。したがって、誘導プロモーターの発現を調節するためには、誘導因子を宿主細胞の増殖培地に加えるか又は該増殖培地から除去する。そのような誘導因子には、糖、ホスファート、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、寒冷などが含まれうる。例えば、酵母において一般的に用いられる誘導因子はグルコース、ガラクトースなどである。
選択される転写終結配列は、選択される個々の宿主細胞において機能しうるものである。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母宿主細胞が宿主細胞である場合には、酵母転写終結配列が発現ベクターにおいて使用されるが、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）またはトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のような宿主細胞においては真菌転写終結配列が使用されるであろう。転写終結配列には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列（ＳｃＣＹＣ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３転写終結配列（ＡＬＧ３ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ６転写終結配列（ＡＬＧ６ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列（ＡＬＧ１２ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列（ＡＯＸ１ ＴＴ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１転写終結配列（ＯＣＨ１ ＴＴ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列（ＰＭＡ１ ＴＴ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。他の転写終結配列が実施例および当技術分野において見出されうる。
酵母を遺伝的に操作するためには、組換え宿主細胞を構築するために、必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を該酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能および薬物耐性マーカーを含む選択マーカーが使用されうる。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ゼオシンなどが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能は、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異を有する利用可能な酵母株と共に用いられる。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国特許第７，４７９，３８９号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている［例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、米国特許第７，５１４，２５３号、米国公開出願第２００９０１２４００号およびＷＯ２００９／０８５１３５（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい］。挿入部位の例には、ピチア（Ｐｈｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピチアＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピチアＭＣＡ遺伝子、ピチアＣＹＭ遺伝子、ピチアＰＥＰ遺伝子、ピチアＰＲＢ遺伝子およびピチアＬＥＵ遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎ Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されており、ＨＩＳおよびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ １４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０に記載されている。
酵母細胞の形質転換は当技術分野でよく知られており、例えば、自体公知方法によるプロトプラスト形成およびそれに続く形質転換により行われうる。該細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖させるのに適した任意の通常の培地でありうる。分泌Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体の相当な割合は、適切にプロセシングされた形態で培地内に存在し、以下のものを含む（それらに限定されるものではない）種々の方法により培地から回収されうる：遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離、あるいはイオン交換マトリックスまたは逆相吸収マトリックスによる該インスリン前駆体の捕捉、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清または濾液のタンパク質性成分の沈殿、およびそれに続く、種々のクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどによる精製。
該分泌Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体は、所望により、米国特許第５，３９５，９２２号および欧州特許第７６５，３９５Ａ号（それらの両方を参照により明示的に本明細書に組み入れることとする）に記載されているＮ−末端伸長またはスペーサーペプチドを含みうる。Ｎ末端伸長またはスペーサーは、シグナルペプチドまたはプロペプチドとＢ鎖のＮ末端との間に位置するペプチドである。分泌経路を通過する間にシグナルペプチドおよびプロペプチドが除去された後、該Ｎ末端伸長ペプチドは該Ｎ−グリコシル化インスリン前駆体に結合したままである。したがって、発酵中、Ｂ鎖のＮ末端はＤＰＡＰのような酵母プロテアーゼのタンパク質分解活性から保護される。Ｎ末端伸長またはスペーサーペプチドの存在は、該タンパク質の化学的加工中のＮ末端アミノ基の保護としても役立ちうる。すなわち、それはＢＯＣ（ｔ−ブチル−オキシカルボニル）または同様の保護基の代用となりうる。該Ｎ末端伸長またはスペーサーは、Ｌｙｓ残基において該末端伸長が除去されるように塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）に特異的であるタンパク質分解酵素により、回収Ｎ−グリコシル化インスリン前駆体から除去されうる。そのようなタンパク質分解酵素の例としては、トリプシン、アクロモバクター・リチクス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）またはリソバクター・エンザイモゲネス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃが挙げられる。
培地内への分泌および回収の後、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体は、該随意的なＮ末端伸長またはスペーサーペプチドおよびＣペプチドを除去するための種々のインビトロ処理に付されて、Ｎ−グリコシル化ｄｅｓＢ３０インスリンを与えうる。ついで該Ｎ−グリコシル化ｄｅｓＢ３０インスリンは、Ｂ３０にＴｈｒを付加することにより、Ｂ３０インスリンへと変換されうる。Ｌ−トレオニンエステルの存在下で該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体をトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃで消化することによる該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体からＢ３０ヘテロ二量体への変換、およびそれに続く、塩基性または酸性加水分解による該トレオニンエステルからＬ−トレオニンへの変換が行われうる（米国特許第４，３４３，８９８号または第４，９１６，２１２号（それらの開示を参照により明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり）。また、該Ｎ−グリコシル化ｄｅｓＢ３０インスリンは、米国特許第５，７５０，４９７号および米国特許第５，９０５，１４０号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおり、アシル化誘導体に変換されうる。
本明細書に開示されている方法は哺乳類、植物および昆虫細胞における使用に応用されうる。動物細胞の例には、ＳＣ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ細胞、ＣＶ−Ｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス細胞、ヒト細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、Ｔ−ＦＬＹ細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０、ＮＳＯ細胞、ニンジン細胞およびそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。昆虫細胞には、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の細胞が含まれる。これらの細胞は、特定の又は主として特定のＮ−グリカンを有する免疫グロブリンを該細胞が産生可能となるように遺伝的に操作されうる。例えば、米国特許第６，９４９，３７２号は、昆虫細胞におけるシアル酸化糖タンパク質の製造方法を開示している。Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４−６２２（２００４）、Ｋａｎｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：６８０−６８８（２００６）、Ｋａｎｄａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１７：１０４−１１８（２００６）ならびに米国公開出願第２００５／０２１６９５８および第２００７／００２０２６０号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、Ｎ−グリカンがフコースを欠くか又は減少したフコースを有する免疫グロブリンを産生しうる哺乳類細胞を開示している。米国公開特許出願第２００５／００７４８４３号（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、二分岐Ｎ−グリカンを有する抗体の、哺乳類細胞における製造を開示している。
哺乳類、昆虫または植物細胞における発現カセットの発現を調節するために選択される調節可能なプロモーターは、選択される細胞型における機能性に関して選択されるべきである。適当な調節可能なプロモーターの例には、テトラサイクリン調節可能プロモーター（例えば、Ｂｅｒｅｎｓ ＆ Ｈｉｌｌｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３１０９−３１２１（２００３）を参照されたい）、ＲＵ ４８６誘導可能プロモーター、エクジソン誘導可能プロモーターおよびカナマイシン調節可能系が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのプロモーターは、実施例に記載されている発現カセットにおいて例示されているプロモーターの代わりに使用されうる。捕捉部分は、選択される細胞型における使用に適した細胞表面アンカータンパク質に融合されうる。ＧＰＩタンパク質を含む細胞表面アンカータンパク質は哺乳類、昆虫および植物細胞に関してよく知られている。ＧＰＩアンカー融合タンパク質はＫｅｎｎａｒｄら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏ．８：Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊｅｎｋｉｎｓ編．Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）ｐｐ．１８７−２００（１９９９）に記載されている。安定な組換え体を作製するために発現カセットを宿主細胞ゲノム内に組込むためのゲノム標的化配列が、実施例に例示されているゲノム標的化および組込み配列の代わりに使用されうる。安定および一過性トランスフェクト化哺乳類、昆虫および植物宿主細胞を作製するためのトランスフェクション方法は当技術分野でよく知られている。本明細書に開示されているとおりにトランスフェクト化宿主細胞が構築されたら、本明細書に開示されているとおりに、該細胞を、関心のある免疫グロブリンの発現に関してスクリーニングし、選択することが可能である。
したがって、前記のもう１つの態様においては、哺乳類、植物または昆虫宿主細胞におけるＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質］をコードする少なくとも１つの核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む哺乳類または昆虫宿主細胞を準備し、該インスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を産生させることを含む。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンを含有する特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように、例えば、ヒト様Ｎ−グリカン、または該宿主細胞に通常は内在しないＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
前記のもう１つの態様においては、インスリンまたはインスリン類似体のＮ−グリコシル化部位占拠が８３％を超えているインスリンまたはインスリン類似体の、哺乳類または昆虫宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３タンパク質）をコードする核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された哺乳類または昆虫宿主細胞を準備し、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該インスリンまたはインスリン類似体のＮ−グリコシル化部位占拠が８３％を超えている該インスリンまたはインスリン類似体を産生させることを含む。更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカン、または該宿主細胞に通常は内在しないＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
前記方法の更に詳細な実施形態においては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子が発現される。
前記の特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９４％である。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９９％である。
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質）をコードする第１核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする第２核酸分子とを含む哺乳類または昆虫宿主細胞を提供し、ここで、該内因性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子が発現される。
また、特定の実施形態においては、高等真核細胞、組織または生物は、植物界、例えばコムギ、イネ、トウモロコシ、ニンジン、タバコなどに由来するものでありうる。あるいは、コケ植物細胞が、例えば、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、フナリア（Ｆｕｎａｒｉａ）、スファグヌム（Ｓｐｈａｇｎｕｍ）、セラトドン（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ）、マルチャンシア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）およびスフェロカルポス（Ｓｐｈａｅｒｏｃａｒｐｏｓ）属の種から選択されうる。典型的な植物細胞は、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）のコケ植物細胞であり、これはＷＯ ２００４／０５７００２およびＷＯ ２００８／００６５５４（それらの開示の全てを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。植物細胞を使用する発現系は更に、特定のＮ−グリカンを主に有する糖タンパク質を該細胞が産生することを可能にする改変されたグリコシル化経路を有するように操作されうる。例えば、該細胞は、コアフコスルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはコアフコスルトランスフェラーゼを有さないように、および／またはキシロシルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはキシロシルトランスフェラーゼを有さないように、および／またはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの機能不全を有するように若しくはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを有さないように遺伝的に操作されうる。あるいは、ガラクトース、フコースおよび／またはキシロースは、該残基を除去する酵素での処理により、免疫グロブリンから除去されうる。当技術分野で公知である、Ｎ−グリカンからガラクトース、フコースおよび／またはキシロース残基を遊離させる任意の酵素、例えばα−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼおよびα−フコシダーゼが使用されうる。あるいは、１，３−フコシルトランスフェラーゼおよび／または１，２−キシロシルトランスフェラーゼおよび／または１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼにより基質として利用され得ない修飾Ｎ−グリカンを合成する発現系が使用されうる。植物細胞におけるグリコシル化経路を修飾するための方法は米国特許第７，４４９，３０８号、第６，９９８，２６７号および第７，３８８，０８１号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されており、これらは、ヒト様Ｎ−グリカンを有する組換え糖タンパク質を産生するように植物を遺伝的に操作するための方法を開示している。ＷＯ ２００８００６５５４（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、キシロースまたはフコースを含有しない糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物における糖タンパク質、例えば抗体の製造方法を開示している。ＷＯ ２００７００６５７０（その開示を参照により本明細書に組み入れることとする）は、動物またはヒト様糖グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するようにコケ植物、有毛虫、藻類および酵母を遺伝的に操作するための方法を開示している。
したがって、前記のもう１つの態様においては、特定のＮ−グリカン種を主に有するＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の、植物宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする核酸分子と、少なくともＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む、哺乳類またはヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物宿主細胞を準備し、該インスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることを含む。
前記のもう１つの態様においては、該インスリンまたはインスリン類似体のＮ−グリコシル化部位占拠が８３％を超えるＮ−グリカン種を主に有するインスリンまたはインスリン類似体の、植物宿主細胞における製造方法を提供し、該方法は、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子とを含む、特定のＮ−グリカン種を主に有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作された植物宿主細胞を準備し、該インスリンまたはインスリン類似体を発現させるための条件下、該宿主細胞を培養して、該Ｎ−グリコシル化部位占拠が８３％を超える該Ｎ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を産生させることを含む。
前記方法のもう１つの実施形態においては、内因性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子が発現される。
前記方法の特定の実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９４％である。更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリコシル化部位占拠は少なくとも９９％である。
更に、異種単一サブユニットオリゴサッカリルトランスフェラーゼ［例えば、リーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄタンパク質］をコードする第１核酸分子と、少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を有するインスリンまたはインスリン類似体をコードする第２核酸分子とを含む植物宿主細胞を提供し、ここで、内因性宿主細胞オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴａｓｅ）複合体を含むタンパク質をコードする内因性宿主細胞遺伝子が発現される。
ＶＩ．徐放製剤
ある実施形態においては、インビボＮ−グリコシル化またはインビトログリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を徐放様態（すなわち、可溶性組換えヒトインスリンより持続的な吸収プロファイルを示す形態）で投与することが有利でありうる。これは、典型的なグルコース変動時間尺度に、より厳密に関連した時間尺度で（すなわち、分単位ではなく時間単位で）、グルコースの変動に応答しうるグリコシル化インスリンの持続レベルを与えるであろう。ある実施形態においては、該徐放製剤は、非高血糖条件（すなわち、絶食条件）下で哺乳動物に投与された場合、該グリコシル化インスリンの０次放出を示しうる。持続的吸収プロファイルをもたらす任意の製剤が使用されうる、と理解されるであろう。ある実施形態においては、これは、該グリコシル化インスリンを、全身循環内へのその放出特性を遅らせる他の成分と組合せることにより達成されうる。例えば、ＰＺＩ（プロタミン亜鉛インスリン）製剤がこの目的に使用されうる。幾つかの場合には、該亜鉛含量は約０．０５〜約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンの範囲である。
したがって、ある実施形態においては、本開示の製剤は約０．０５〜約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含み、例えば、約０．２〜約１０ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体、例えば、約１〜約５ｍｇプロタミン／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。
ある実施形態においては、本開示の製剤は約０．００６〜約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含み、例えば、約０．０５〜約０．５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体、例えば、約０．１〜約０．２５ｍｇ亜鉛／ｍｇグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。
ある実施形態においては、本開示の製剤は、約１００：１〜約５：１、例えば、約５０：１〜約５：１、例えば、約４０：１〜約１０：１の範囲の比（ｗ／ｗ）でプロタミンおよび亜鉛を含む。ある実施形態においては、本開示のＰＺＩ製剤は、約２０：１〜約５：１、例えば、約２０：１〜約１０：１、約２０：１〜約１５：１、約１５：１〜約５：１、約１０：１〜約５：１、約１０：１〜約１５：１の範囲の比（ｗ／ｗ）でプロタミンおよび亜鉛を含む。
ある実施形態においては、本開示の製剤は抗微生物保存剤（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン）を含む。ある実施形態においては、該抗微生物保存剤はｍ−クレゾールである。例えば、ある実施形態においては、製剤は約０．１〜約１．０％ ｖ／ｖ ｍ−クレゾールを含みうる。例えば、約０．１〜約０．５％ ｖ／ｖ ｍ−クレゾール、例えば、約０．１５〜約０．３５％ ｖ／ｖ ｍ−クレゾールを含みうる。
ある実施形態においては、本開示の製剤は等張化剤としてポリオール（例えば、マンニトール、プロピレングリコールまたはグリセロール）を含む。ある実施形態においては、該等張化剤はグリセロールである。ある実施形態においては、該等張化剤は塩、例えばＮａＣｌである。例えば、製剤は約０．０５〜約０．５Ｍ ＮａＣｌ、例えば、約０．０５〜約０．２５Ｍ ＮａＣｌ、または約０．１〜約０．２Ｍ ＮａＣｌを含みうる。
ある実施形態においては、本開示の製剤は或る量の非グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を含む。ある実施形態においては、製剤においては、グリコシル化インスリン類似体：非グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体のモル比は約１００：１〜１：１、例えば、約５０：１〜２：１または約２５：１〜２：１の範囲である。
本開示はまた、小分子製剤の分野でよく知られている標準的な徐放（持続放出）製剤の使用を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５を参照されたい）。
本開示はまた、グリコシル化インスリン類似体を徐々に送達（運搬）するための、ポンプまたは遅延拡散に基づく装置の使用を含む。ある実施形態においては、長時間作用性となるように該インスリンを修飾することにより、長時間作用性製剤が（追加的または代替的に）提供されうる。例えば、該インスリン類似体はインスリン・グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）またはインスリン・デテミル（ｄｅｔｅｍｉｒ）でありうる。インスリン・グラルジンは典型的な長時間作用性インスリン類似体であり、これにおいては、Ａｓｎ−Ａ２１がグリシンにより置換されており、２つのアルギニンがＢ鎖のＣ末端に付加されている。これらの変化の効果は、等電点を変化させて、ｐＨ４において比較的可溶性である溶液を生成することである。インスリン・デテミルはもう１つの長時間作用性インスリン類似体であり、これにおいては、Ｔｈｒ−Ｂ３０が欠失しており、Ｃ１４脂肪酸鎖がＬｙｓ−Ｂ２９に結合している。
図１は、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を産生するようにインビボでグリコシル化されうる、天然インスリンアミノ酸配列内のＮ−結合グリコシル化部位を生成する、天然インスリンアミノ酸配列に突然変異が施されうる例を示す。示されている突然変異は単独であっても組合されていてもよい。ＡおよびＢ鎖ペプチド（それぞれ配列番号３３および２５）に関して示されているアミノ酸配列は野生型ヒトインスリンのものである。Ｎ−グリコシル化部位を与える類似突然変異は、リスプロ（ｌｉｓｐｒｏ）、アスパルト（ａｓｐａｒｔ）、グルリシン（ｇｌｕｌｉｓｉｎｅ）、グラルジン（ｇｌａｒｇｉｎｅ）およびデテルミル（ｄｅｔｅｒｍｉｒ）を含むいずれかの他のインスリン類似体からも構築されうる。 図２は、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）でアスパラギン残基に結合しうる又はいずれかのアミノ酸に結合しうるＮ−グリカン構造の例を示す。 図３は２つのグリコシル化インスリン類似体の薬物動態を示す。Ｐ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ．５．０（ガラクトース末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体およびＰ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ６．０（シアル酸末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体に関するインスリン負荷試験（ＩＴＴ）中の循環インスリン類似体レベルがＮＯＶＯＬＩＮ ＲおよびＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）と比較して示されている。 図４は２つのＮ−グリコシル化インスリン類似体のインビボ活性を示す。Ｐ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ．５．０（ガラクトース末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体およびＰ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ６．０（シアル酸末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体に関するマウスＩＴＴ中のグルコースレベルがＮＯＶＯＬＩＮ ＲおよびＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）と比較して示されている。 図５はインスリンおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）受容体における２つのＮ−グリコシル化インスリン類似体のインビトロ活性を示す。Ｐ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ．５．０（ガラクトース末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体およびＰ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）ＧＳ６．０（シアル酸末端Ｎ−グリカン）インスリン類似体に関するインスリン受容体結合、インスリン受容体リン酸化およびＩＧＦ−１受容体結合がＮＯＶＯＬＩＮ ＲおよびＮＯＶＯＬＩＮ ｄｅｓ（Ｂ３０）と比較して示されている。 図６は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ４３６２の地図を示し、該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＡＡＫからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーに融合したＴＡ５７プロペプチドに融合したＹｐｓ１ｓｓペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図７は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ７６７９の地図を示し、該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列Ａ（１０×ＨＩＳ）ＡＫからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーペプチドに融合したＴＡ５７プロペプチドに融合したＹｐｓ１ｓｓペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図８は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ７６８０の地図を示し、該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図９は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ９２９０の地図を示し、該プラスミドは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図１０は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ９２９５の地図を示し、該プラスミドは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端ＨＩＳスペーサーペプチドに融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図１１は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ９３１０の地図を示し、該プラスミドは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図１２は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであるプラスミドｐＧＬＹ９３１１の地図を示し、該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＴＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ（配列番号３２）からなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端ＭＹＣスペーサーペプチドに融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン前駆体融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは株ＹＧＬＹ１２８９７およびＹＧＬＹ１２９００の構築を示す。どちらの株も、シアル酸末端Ｎ−グリカンを含む、本明細書に開示されているインスリン類似体を含む糖タンパク質を産生しうる。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは株ＹＧＬＹ１２８９７およびＹＧＬＹ１２９００の構築を示す。どちらの株も、シアル酸末端Ｎ−グリカンを含む、本明細書に開示されているインスリン類似体を含む糖タンパク質を産生しうる。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは株ＹＧＬＹ１２８９７およびＹＧＬＹ１２９００の構築を示す。どちらの株も、シアル酸末端Ｎ−グリカンを含む、本明細書に開示されているインスリン類似体を含む糖タンパク質を産生しうる。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは株ＹＧＬＹ１２８９７およびＹＧＬＹ１２９００の構築を示す。どちらの株も、シアル酸末端Ｎ−グリカンを含む、本明細書に開示されているインスリン類似体を含む糖タンパク質を産生しうる。 図１４はプラスミドｐＧＬＹ６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ６は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−５’）を含む核酸分子に一方の側で及びピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−３’）を含む核酸分子に他方の側で隣接しているサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２）を含む核酸分子を含有する。 図１５はプラスミドｐＧＬＹ４０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４０は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−５’）を含む核酸分子に一方の側で及びＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−３’）を含む核酸分子に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有する。 図１６はプラスミドｐＧＬＹ４３ａの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４３ａは、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣り合ったケイ・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＧｌｃＮＡｃ Ｔｒａｎｓｐ．）を含む核酸分子を含有する。前記の隣り合った遺伝子は、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域（ＰｐＰＢＳ２−５’）からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に一方の側で、およびＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ２−３’）を含む核酸分子に他方の側で隣接している。 図１７はｐＧＬＹ４８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４８は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣り合っている、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨ Ｐｒｏｍ）を含む核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列（ＳｃＣＹＣ ＴＴ）を含む核酸分子に３’末端において機能的に連結されたＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＧｌｃＮＡｃ Ｔｒａｎｓ．）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、ここで、該発現カセットは全体として、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−５’）からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に一方の側で、およびＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−３’）からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に他方の側で隣接している。 図１８はプラスミドｐＧＬＹ４５の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４５は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＮＯ１−５’）を含む核酸分子に一方の側で及びＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４−３’）を含む核酸分子に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有する。 図１９はプラスミドｐＧＬＹ１４３０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１４３０は、プラスミドｐＧＬＹ１４３０は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＣＯ−ＮＡ１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（コドン最適化されている）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＦＢ８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＤＥ１遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＡＤＥ１ ５’およびＯＲＦ）、ならびにＡＤＥ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＤＥ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＳＥＣ４はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターであり、ＯＣＨ１ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列であり、ＳｃＣＹＣ ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１ Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ３ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。 図２０はプラスミドｐＧＬＹ５８２の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５８２は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）、および（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＨＩＳ１遺伝子の５’領域（ＰｐＨＩＳ１−５’）およびＨＩＤ１遺伝子の３’領域（ＰｐＨＩＳ１−３’）に隣接している。ＰＭＡ１はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣ ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１ Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。 図２１はプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂは、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＫＤ５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＴＣ５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＲＧ１遺伝子の５’領域（ＰｐＡＲＧ１−５’）およびＡＲＧ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＲＧ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣ ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１ Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。 図２２はプラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）は、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、これは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４ ５’）に一方の側で、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４ ３’）に他方の側で隣接している。 図２３はプラスミドｐＧＬＹ３４１９（ｐＳＨ１１１０）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）は、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、これは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１ ５’）に一方の側で、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１ ３’）に他方の側で隣接している。 図２４はプラスミドｐＧＬＹ３４２１（ｐＳＨ１１０６）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）は、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有し、これは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３ ５’）に一方の側で、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３ ３’）に他方の側で隣接している。 図２５はｐＧＬＹ２４５６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２４５６は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（コドン最適化されたもの）（ＣＯ ｍＣＭＰ−Ｓｉａ Ｔｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（コドン最適化されたもの）（ＣＯ ｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（コドン最適化されたもの）（ＣＯ ｈＣＭＰ−ＮＡＮＡＳ）、（５）ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（コドン最適化されたもの）（ＣＯ ｈＳＩＡＰ Ｓ）、および（６）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチドにＮ末端において融合したマウスａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）（ｃｏｍＳＴ６−３３）をコードする６つの発現カセットを含有する。全体はＴＲＰ２遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＰｐＴＲＰ２ ５’）ならびにＴＲＰ２遺伝子の３’領域（ＰｐＴＲＰ２−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＣＹＣ ＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＴＥＦ Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターであり、ＰｐＴＥＦ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１終結配列であり、ＰｐＡＬＧ３ ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ｐＧＡＰはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。 図２６はｐＧＬＹ５０４８（ｐＳＨ１２７５）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５０４８（ｐＳＨ１２７５）は、ＳＴＥ１３遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、ならびに（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５または転写単位をコードする発現カセットを含有する。 図２７はプラスミドｐＧＬＹ５０１９（ｐＳＨ１２４６）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５０１９（ｐＳＨ１２４６）は、ＤＡＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）ＯＲＦをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、これは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の５’ヌクレオチド配列に一方の側で、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の３’ヌクレオチド配列に他方の側で隣接している。 図２８はプラスミドｐＧＬＹ５０８５（ｐＳＨ１３１２）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５０８５（ｐＳＨ１３１２）は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生に関与する第２セットの遺伝子をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に導入するためのＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、ヒグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）をコードする発現カセットでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子が置換されていること、および該プラスミドがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ５遺伝子を標的化すること以外は、プラスミドＹＧＬＹ２４５６に類似している。それらの６つの縦列カセットは、ＴＲＰ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に一方の側で隣接しており、ＴＲＰ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に他方の側で隣接している。 図２９はプラスミドｐＧＬＹ５１９２の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５１９２は、該株を液胞局在化受容体（Ｖｐｓ１０−１ｐ）活性欠損状態にするためにＶＰＳ１０−１遺伝子のＯＲＦを欠失するように構築された組込みベクターである。該プラスミドは、ＶＰＳ１０−１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に一方の側で及びＶＰＳ１０−１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有する。 図３０はプラスミドｐＧＬＹ３６７３の地図である。プラスミドｐＧＬＹ３６７３は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）をコードする発現カセットを含有する。 図３１はプラスミドｐＧＬＹ７６０３の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ７６０３は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＶＰＳ１０−１遺伝子座を標的化しＬｍＳＴＴ３Ｄを発現する組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に３’末端において機能的に連結された、Ｐ．における最適な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、選択のために、該プラスミドは、ｌａｃＺ反復配列を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有する。どちらのカセットも、ＶＰＳ１０−１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に一方の側で、およびＶＰＳ１０−１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に他方の側で隣接している。 図３２はプラスミドｐＧＬＹ３５８８の地図を示す。該プラスミドは、ＡＯＸ１遺伝子座を標的化する組込みプラスミドであり、該プラスミドは、ＡＯＸ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に一方の側で及びＡＯＸ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有する。 図３３Ａおよび３３Ｂは実施例３における株ＹＧＬＹ２１０５８およびＹＧＬＹ１６４１５の構築を示す。 図３３Ａおよび３３Ｂは実施例３における株ＹＧＬＹ２１０５８およびＹＧＬＹ１６４１５の構築を示す。 図３４は実施例４における株ＹＧＬＹ２３５６０およびＹＧＬＹ２４００５の構築を示す。 図３５Ａは実施例５における株ＹＧＬＹ２３６０５の構築を示す。 図３５Ｂは実施例５における株ＹＧＬＹ２３６０５の構築を示す。 図３６は実施例６における株ＹＧＬＹ２１０８０、ＹＧＬＹ２１０８１およびＹＧＬＹ２１０８３の構築を示す。 図３７は、株ＹＧＬＹ２１０５８において産生されたＮ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体の分析を示す。該還元１６．５％ トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）ポリアクリルアミドゲルは、該類似体がＮ−グリコシル化されたことを示している。該Ｎ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体を培養上清流体から精製し、該Ｎ−グリカンをＰＮＧアーゼ消化により遊離させた。該類似体の観察されたＮ−グリカン組成は約７５％ Ａ２（ビシアル酸化）（配列番号２８２）であり、約１６％はＡ１（モノシアル酸化）であり、約５％はハイブリッドＭａｎ５であった。 図３８は、精製されたＮ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体（図３９Ａ）および脱グリコシル化プロインスリン類似体前駆体（図３８Ｂ）のポジティブＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの分析を示す。プロインスリン類似体前駆体に結合したＮ−結合グリコフォームが図３８Ａにおいて注釈されており、対応する構造が図３７に示されている。 図３８は、精製されたＮ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体（図３９Ａ）および脱グリコシル化プロインスリン類似体前駆体（図３８Ｂ）のポジティブＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの分析を示す。プロインスリン類似体前駆体に結合したＮ−結合グリコフォームが図３８Ａにおいて注釈されており、対応する構造が図３７に示されている。 図３９は、株ＹＧＬＹ２１０５８において産生され、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣカラム上で複数のプールへと分離されたＮ−グリコシル化プロインスリン類似体の分析を示す。種々のプール化画分のアリコートをゲル電気泳動により分析し、プール１、２および３におけるＮ−グリコシル化プロインスリン類似体に関して該Ｎ−グリカン組成を決定した。 図４０は、Ｂ２８位に結合したＮ−グリカンを有するインスリンＢ：Ｐ２８Ｎ ｄｅｓ（Ｂ３０）類似体のインビボ活性を示す。１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを２時間絶食させた後、ＧＳ２．１またはＧＳ５．０ Ｎ−グリカン組成を有するインスリンｄｅｓ（Ｂ３０）類似体をｓ．ｃ．注射により投与した。α−メチルマンノースの存在下および非存在下、血液グルコースに対する影響を時間の関数として決定した。 図４１は、０、１、２または３個のＮ−グリカンを含有する種々のインスリン前駆体配列の産生の分析を示す。無細胞培養上清流体を４〜２０％ 勾配還元アクリルアミドゲル内にローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて処理した。クーマシーブルー染色によりインスリン類似体前駆体を可視化した。 図４２は、Ｎ末端スペーサーを含むプレ−プロインスリン類似体前駆体からＮ−グリコシル化インスリン類似体を製造するための方法の概要図である。 図４３は、Ｎ末端スペーサーを欠くプレ−プロインスリン類似体前駆体からＮ−グリコシル化インスリン類似体を製造するための方法の概要図である。 図４４は、５時間にわたる低ｐＨおよび６５℃におけるインスリンの安定性に対する電荷およびＮ−グリカンの影響を示す。Ａ２ Ｎ−グリカン（ＧＳ６．０）もしくはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン（ＧＳ２．１）を含むＮ−グリコシル化Ｂ：Ｐ２８Ｎ ｄｅｓＢ３０インスリン類似体または脱グリコシル化Ｂ：Ｐ２８Ｄ ｄｅｓＢ３０インスリンの繊維化をＮＯＶＯＬＩＮと比較した。標的化インスリン形態（１ｍｇ／ｍｌ）の溶液を、１００ｍＭ ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を使用して調製された０．５ｍｌ円錐チューブ内に移した。バイアルを、６５℃に設定されたＰＣＲ装置内に配置した。４４０ｎｍ〜５００ｎｍの蛍光スキャンと共にＴｅｃａｎプレートリーダーを使用して、０時間および５時間の時点で、該サンプルのアリコートをＴｈｉｏＴ蛍光により測定した。 図４５はプラスミドｐＧＬＹ６３０１の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ６３０１は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＵＲＡ６遺伝子座を標的化しＬｍＳＴＴ３Ｄを発現する組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に３’末端において機能的に連結された、Ｐ．における最適な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦをコードする核酸分子を含み、選択のために、該プラスミドは、ヒ素耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３遺伝子を含む核酸分子を含有する。 図４６Ａおよび４６Ｂは実施例１１におおける株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を示す。 図４６Ａおよび４６Ｂは実施例１１におおける株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を示す。 図４７はプラスミドｐＧＬＹ９３１６の地図を示し、これは、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列を使用する空発現カセットを含む。 図４８は実施例１１における株ＹＧＬＹ２６５８０の構築を示す。 図４９Ａおよび４９Ｂは実施例１１における株ＹＧＬＹ２６７３４の構築を示す。 図４９Ａおよび４９Ｂは実施例１１における株ＹＧＬＹ２６７３４の構築を示す。 図５０はプラスミドｐＧＬＹ１１０９９の地図を示し、これは、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドであり、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＡＡＫ（配列番号１３９）からなるＣペプチドに融合したＮＧＴ（−２）トリペプチド付加およびＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーペプチドに融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチドを含むインスリン融合タンパク質をコードする発現カセットを含む。 図５１はｐＧＬＹ１１６２のプラスミド地図を示し、これは、ＡＯＸ１ｐにより駆動されるＴ．ｒ．マンノシダーゼＩを発現するようにＰＲＯ１遺伝子座において組込まれるＫＩＮＫＯプラスミドである。ＰＲＯ１遺伝子座におけるｐＧＬＹ１１６２の組込みはＰＲＯ１オープンリーディングフレームの遺伝的破壊を引き起こさず、選択はＵＲＡ５カセットによる。 図５２Ａは、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに経時的に効果を及ぼすＮ−グリコシル化インスリン類似体２１０−２−Ｂの投与を示し、該効果は、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに及ぼすＲＨＩの効果と同等である。 図５２Ｂは、絶食正常ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合の経時的な血液グルコースレベルに対するＮ−グリコシル化インスリン類似体２１０−２−Ｂ（Ｂ−２およびＢ２８のＡｓｎ残基に連結された少マンノース）の効果と組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の効果との比較を示す。 図５３Ａは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５２Ｂに示されているデータを示す。 図５３Ｂは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５２Ａに示されているデータを示す。 図５４Ａは、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに経時的に効果を及ぼすＮ−グリコシル化インスリン類似体２００−２−Ｂの投与を示し、該効果は、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに及ぼすＲＨＩの効果と同等である。 図５４Ｂは、絶食正常ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合の経時的な血液グルコースレベルに対するＮ−グリコシル化インスリン類似体２００−２−Ｂ（Ｂ−２およびＢ２８のＡｓｎ残基に連結されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の効果と組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の効果との比較を示す。 図５５Ａは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５４Ｂに示されているデータを示す。 図５５Ｂは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５４Ａに示されているデータを示す。 図５６Ａは、組換えタンパク質発現のために誘導されたクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からの分泌インスリン類似体前駆体を検出するウエスタンブロットのイメージを示す。 図５６Ｂは、組換えタンパク質発現のために誘導されたクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からの分泌インスリン類似体前駆体を検出するウエスタンブロットのイメージを示す。 図５７Ａは、２つのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを含む接続ペプチド（配列番号３０３）により天然ヒトＢ鎖ペプチドに連結された天然ヒトＡ鎖ペプチドを含むグリコシル化インスリン類似体ＧＳＣＩ−７の構造を示す。 図５７Ｂは、Ｂ２８位に結合したＮ−グリカンを有するＧＳＣＩ−７のインビボ活性を示す。１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを２時間絶食させた後、ＧＳ２．１またはＧＳ５．０ Ｎ−グリカン組成を有するインスリンｄｅｓ（Ｂ３０）類似体をｓ．ｃ．注射により投与した。α−メチルマンノースの非存在下および存在下、血液グルコースに対する効果を時間の関数として決定した。 以下の実施例は、本発明の更なる理解を促すことを意図したものである。
実施例１
この実施例は、トリ−アミノ酸配列Ａｓｎ Ｘａａ （Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を有するＮ−グリコシル化部位を得るためのアスパラギン残基によるＢ鎖の２８位のプロリン残基の置換を含むヒトインスリン類似体をコードするプラスミド発現ベクターの構築を例示する。これらの発現ベクターは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるタンパク質発現のために設計されているが、挙げられているインスリン類似体ＡおよびＢ鎖をコードする核酸分子は、Ｎ−グリコシル化糖タンパク質を産生しうる他の宿主細胞、例えば哺乳類細胞および真菌、植物、昆虫または細菌細胞（ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾された宿主細胞を含む）におけるタンパク質発現のために設計された発現ベクター内に組込まれうる。
以下に開示する発現ベクターはプレ−プロインスリン類似体前駆体分子をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体をコードするベクターの、酵母宿主細胞における発現中に、該プレ−プロインスリン類似体前駆体は分泌経路に輸送され、ここにおいて、シグナルペプチドが除去され、該分子は、天然ヒトインスリンと同じ立体配置を有するジスルフィド結合により合体した構造へとフォールドしたＮ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体へとプロセシングされる。ついで該Ｎ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体は分泌経路を経由して輸送され、ここで、該Ｎ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体上のＮ−グリカンが修飾される。ついで該Ｎ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体は小胞へと導かれ、ここにおいて、該プロペプチドが除去されてＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体分子が形成され、ついでこれは宿主細胞から分泌され、それは、トリプシンまたはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化を用いてインビトロで更に加工されて、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体ヘテロ二量体を与えうる。
プラスミドｐＧＬＹ４３６２（図６）は、ＴＲＰ２遺伝子座またはＡＯＸ１ｐ遺伝子座を標的化するロールイン（ｒｏｌｌ−ｉｎ）組込みプラスミドであり、ヒトインスリンＡ鎖（配列番号３３）に融合したアミノ酸配列ＡＡＫ（配列番号３１）からなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したＮ末端スペーサー（配列番号２２）に融合したＴＡ５７プロペプチド（配列番号２１）に融合したＹｐｓ１ｓｓペプチド（配列番号２０）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードする発現カセットを含む。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号６に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号５に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。Ｎ末端スペーサーを有するプロインスリンは、配列番号３６に示されているアミノ酸配列を有し、Ｎ末端スペーサーを有さないプロインスリン類似体は、配列番号３７に示されているアミノ酸配列を有する。該発現カセットは、誘導性ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号１１８）に５’末端において、そしてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号５８）に３’末端において機能的に連結された融合タンパク質をコードする核酸分子（配列番号５）を含む。形質転換体の選択のために、該プラスミドは、ゼオシンＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１２２）が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＥＦプロモーター配列を有する核酸分子（配列番号１２３）に５’末端において、そしてサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号５８）に３’末端において機能的に連結されている。該プラスミドは更に、ＴＲＰ２遺伝子座を標的化するための核酸分子を含む。
Ｙｐｓ１ｓｓペプチドは、米国特許第５，６３９，６４２号および第５，７２６，０３８号（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている合成リーダーまたはシグナルペプチドである。該ＴＡ５７プロペプチドおよびＮ末端スペーサーはＫｊｅｌｄｓｅｎら，Ｇｅｎｅ １７０：１０７−１１２（１９９６）ならびに米国特許第６，７７７，２０７号および第６，２１４，５４７号（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。他の合成プロペプチドは米国特許第５，３９５，９２２号、第５，７９５，７４６号および第５，１６２，４９８号ならびにＷＯ９８３２８６７（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
プラスミドｐＧＬＹ７６７９（図７）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、ヒトインスリンＡ鎖（配列番号３３）に融合したアミノ酸配列Ａ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ（配列番号３２）からなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したＮ末端スペーサーペプチド（配列番号２２）に融合したＴＡ５７プロペプチド（配列番号２１）に融合したＹｐｓ１ｓｓペプチド（配列番号２０）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。Ｎ末端スペーサーを有するプロインスリンは、配列番号３６に示されているアミノ酸配列を有し、Ｎ末端スペーサーを有さないプロインスリン類似体は、配列番号３７に示されているアミノ酸配列を有する。
プラスミドｐＧＬＹ７６８０（図８）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、ヒトインスリンＡ鎖（配列番号３３）に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１９）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号９に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列は米国特許第６，７７７，２０７号、第４，５４６，０８２号および第４，８７０，００８号（それらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。該プロインスリン類似体は、配列番号３７に示されているアミノ酸配列を有する。
プラスミドｐＧＬＹ９２９０（図９）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖（配列番号３４）に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１９）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号１２に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号１１に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体が分泌経路に進入した場合、該プレ−プロインスリン類似体前駆体のプロセシングは、配列番号３８に示されているアミノ酸配列を有するプロインスリン類似体を生成する。
プラスミドｐＧＬＹ９２９５（図１０）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖（配列番号３４）に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したＮ末端ＨＩＳスペーサーペプチド（配列番号２３）に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１９）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号１４に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号１３に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。また、該発現カセットはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列を含む。Ｎ末端スペーサーを有するプロインスリンは、配列番号４１に示されているアミノ酸配列を有し、Ｎ末端スペーサーを有さないプロインスリン類似体は、配列番号３８に示されているアミノ酸配列を有する。
プラスミドｐＧＬＹ９３１０（図１１）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、Ｎ２１Ｇ置換を有するヒトインスリンＡ鎖（配列番号３４）に融合したアミノ酸配列ＲＲからなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１９）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号１２に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号１１に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。また、該発現カセットはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列を含む。該プレ−プロインスリン類似体前駆体が分泌経路に進入した場合、該プレ−プロインスリン類似体前駆体のプロセシングは、配列番号２８に示されているアミノ酸配列を有するプロインスリン類似体を生成する。
プラスミドｐＧＬＹ９３１１（図１２）はｐＧＬＹ４３６２に類似しているが、該発現カセットは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＴＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ（配列番号３２）からなるＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖（配列番号２６）に融合したＮ末端ＭＹＣスペーサーペプチド（配列番号２４）に融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１９）を含むプレ−プロインスリン類似体前駆体をコードしている。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有し、配列番号１５に示されているヌクレオチド配列によりコードされている。Ｎ末端スペーサーを有するプロインスリンは、配列番号４０に示されているアミノ酸配列を有する。また、該発現カセットはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列を含む。
プラスミドｐＧＬＹ９３１２はｐＧＬＹ９３１１に類似しているが、該発現カセットをコードするヌクレオチド配列は、代替的コドン最適化アルゴリズム（配列番号１７）を使用してピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）コドン使用頻度に関して最適化されている。表１は前記発現カセットの要素を要約している。
プラスミドｐＧＬＹ９３１６（図４７）は、表１に挙げられているインスリン発現プラスミドｐＧＬＹ１１０７４、ｐＧＬＹ１１０８４、ｐＧＬＹ１１０８５、ｐＧＬＹ１１０８７、ｐＧＬＹ１１０８８、ｐＧＬＹ１１０９８、ｐＧＬＹ１１０９９（図５１）、ｐＧＬＹ１１１０１、ｐＧＬＹ１１１６４、ｐＧＬＹ１１４６４およびｐＧＬＹ１１４６５を作製するために使用した空発現プラスミドである。プラスミドｐＧＬＹ９３１６はｐＧＬＹ４３６２に類似している。ただし、該発現カセットはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロペプチド（配列番号１４８）を含有するが、インスリン前駆体配列を含有しない。表１に挙げられている派生インスリン前駆体発現プラスミドは、ＭｌｙＩおよびＦｓｅＩを使用して、ヒトインスリン配列変異体に融合したＮ末端スペーサーペプチド（配列番号１４９）をコードするインスリン前駆体ＤＮＡをクローニングすることにより構築された。該インスリン変異体をコードする核酸分子は、配列番号１２７をコードする配列番号１２６（ｐＧＬＹ１１０７４）、配列番号１２９をコードする配列番号１２８（ｐＧＬＹ１１０８４）、配列番号１３１をコードする配列番号１３０（ｐＧＬＹ１１０８５）、配列番号１３３をコードする配列番号１３２（ｐＧＬＹ１１０８７）、配列番号１３５をコードする配列番号１３４（ｐＧＬＹ１１０８８）、配列番号１３７をコードする配列番号１３６（ｐＧＬＹ１１０９８）、配列番号１３９をコードする配列番号１３８（ｐＧＬＹ１１０９９）、配列番号１４１をコードする配列番号１４０（ｐＧＬＹ１１１０１）、配列番号１４３をコードする配列番号１４２（ｐＧＬＹ１１１６４）、配列番号１４５をコードする配列番号１４４（ｐＧＬＹ１１４６４）、および配列番号１４７をコードする配列番号１４６（ｐＧＬＹ１１４６５）である。これらのベクターにより産生されるプロインスリン類似体前駆体配列は表１に挙げられている。また、該発現カセットはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列を含む。
Figure 2014525922
 該プレ−プロインスリン類似体前駆体をコードする発現カセットを含有する発現ベクターを、Ｎ−結合糖タンパク質を産生しうる酵母宿主細胞内に形質転換する。図４２および図４３に例示されているとおり、該プレ−プロインスリン類似体前駆体は、宿主細胞ゲノム内に組込まれた発現カセットから発現される。該プレ−プロインスリン類似体前駆体は分泌経路を目的地とし、ここにおいて、それはジスルフィド結合によりフォールドし、Ｎ−グリコシル化される。該Ｎ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体はゴルジ装置内で更にプロセシングされ、ついで小胞に輸送され、ここにおいて、該プロペプチドが除去され、該Ｎ−グリコシル化プレ−プロインスリン類似体前駆体分子が該宿主細胞から培地内に分泌され、それは精製され、ＣペプチドおよびＮ末端ペプチドを除去するためにインビトロ（細胞外）で更に加工されて、Ｎ−結合Ｎ−グリカンを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体ヘテロ二量体を与えうる。トリプシンまたはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃでのインビトロ加工の後に前記前駆体から産生された個々のＮ−グリコシル化インスリン類似体はＢ３０ チロシン残基を欠いており、したがって、該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体はｄｅｓＢ３０類似体である。しかし、当技術分野で公知のとおり、ｄｅｓＢ３０インスリン類似体は、天然インスリンの場合と実質的に異ならない、インスリン受容体における活性を有する。
実施例２
シアル酸化Ｎ−グリカンを産生しうるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を以下のとおりに構築した。該株の構築は図１３Ａ〜１３Ｄに図示されている。簡潔に説明すると、該株を以下のとおりに構築した。
株ＹＧＬＹ８３１６は、既に記載されている方法（例えば、米国特許第７，４４９，３０８号、米国特許第７，４７９，３８９号、米国公開出願第２００９０１２４０００号、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９０８５１３５、ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ ２０：１２７９（２００３）、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２（２００３）、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）を用いて野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ １１４３０から構築した。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドにおいて作製した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されたヌクレオチド配列に関しては、天然ヌクレオチド配列をＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により解析し、その結果を用いて、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現に関してコドンが最適化されたヌクレオチド配列を得た。
酵母株をエレクトロポレーション（エレクトロポレーターＢｉｏ Ｒａｄの製造業者により推奨されている標準的な技術を用いるもの）により形質転換した。一般に、酵母形質転換は以下のとおりであった。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株を５０ｍＬのＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））内で約０．２〜６の光学密度（「ＯＤ」）まで一晩増殖させた。氷上の３０分間のインキュベーションの後、２５００〜３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞をペレット化した。培地を除去し、該細胞を氷冷無菌１Ｍ ソルビトールで３回洗浄した後、０．５ｍｌの氷冷無菌１Ｍ ソルビトールに再懸濁させた。１０μＬのＤＮＡ（５〜２０μｇ）および１００μＬの細胞懸濁液をエレクトロポレーションキュベット内で一緒にし、氷上で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションは、予め定められたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロトコール（２ｋＶ、２５μＦ、２００オーム）に従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌにおいて行い、その直後に、１ｍＬのＹＰＤＳ回収培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍ ソルビトール）を加えた。該形質転換細胞を室温（２６℃）で４時間〜一晩回収した後、該細胞を選択培地上でプレーティングした。
プラスミドｐＧＬＹ６（図１４）は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターである。それは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２；配列番号４６）を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４７）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号４８）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ６を線状化し、該線状化プラスミドを野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ １１４３０内に形質転換して、ＳｃＳＵＣ２遺伝子がＵＲＡ５遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１−３を選択した。これはウラシルに対して栄養要求性である。
プラスミドｐＧＬＹ４０（図１５）は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（配列番号４９）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子（配列番号５０）に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５１）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５２）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＯＣＨ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２−３を選択した。これはＵＲＡ５に対して原栄養性である。株ＹＧＬＹ２−３を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけがＯＣＨ１遺伝子座内に残存した幾つかの株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ４−３を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ４３ａ（図１６）は、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＭＮＮ２−２、配列番号５３）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５４）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５５）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４３ａをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＫｌＭＮＮ２−２遺伝子およびＵＲＡ５遺伝子がＢＭＴ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国特許第７，４６５，５５７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ６−３を選択した。これはウラシルに対して原栄養性である。株ＹＧＬＹ６−３を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ８−３を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ４８（図１７）は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（配列番号５６）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子（配列番号５７）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列を含む核酸分子（配列番号５８）に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５９）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ８−３内に形質転換して、マウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体およびＵＲＡ５遺伝子をコードする発現カセットがＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１０−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１２−３を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ４５（図１８）は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６１）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６２）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４５をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１２−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ＭＮＮ４遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１４−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１６−３を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ１４３０（図１９）は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ＮＡ）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＩＮＫＯ（Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ ｗｉｔｈ ｌｉｔｔｌｅ ｏｒ Ｎｏ Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ）組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種ＤＮＡの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第２００９０１２４０００号に記載されている。ＮＡ１０をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２リーダー１０をコードする核酸分子（配列番号６４）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号６３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号６５）に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子（配列番号６６）に機能的に連結されている。ＭｍＴｒをコードする発現カセットは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体ＯＲＦのマウスホモログをコードする核酸分子（配列番号５６）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターを含む核酸分子（配列番号６７）に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列を含む核酸分子（配列番号６８）に機能的に連結されている。ＦＢ８をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２−ｍリーダー８をコードする核酸分子（配列番号７０）に５’末端において融合している、マウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号６９）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号７１）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列（配列番号７２）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７３）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１４３０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１６−３内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＡＤＥ１ ＯＲＦの直後のＡＤＥ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２７９８を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、今やウリジン、ヒスチジンおよびアデニンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ３７９４を選択した。これは、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生しうる。
プラスミドｐＧＬＹ５８２（図２０）は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位、および（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＳｃＧＡＬ１０をコードする発現カセットは、ＳｃＧＡＬ１０ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号７４）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号６５）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子（配列番号６６）に機能的に連結されている。キメラガラクトシルトランスフェラーゼＩをコードする発現カセットは、ＫＲＥ２−ｓリーダー３３をコードする核酸分子（配列番号７６）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧａｌＴ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号７５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。ＤｍＵＧＴをコードする発現カセットは、ＤｍＵＧＴ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号７７）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号７８）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列を含む核酸分子（配列番号７９）に機能的に連結されている。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８０）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８１）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５８２を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３７９４内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＨＩＳ１遺伝子座内に相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ３８５３を選択した。これはヒスチジンに対して栄養要求性であり、ウリジンに対して原栄養性である。
プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂ（図２１）は、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＣ）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＤ５３をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５３をコードする核酸分子（配列番号８３）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号８２）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＨＩＳ１発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位（配列番号８４）を含む核酸分子を含む。ＴＣ５４をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５４をコードする核酸分子（配列番号８６）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号８５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの３つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８７）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８８）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３８５３内に形質転換して、それらの３つの縦列発現カセットがＡＲＧ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ４７５４を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジンおよびヒスチジンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ４７９９を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ３４１１（図２２）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号８９）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号９０）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４７９９内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ６９０３を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ７４３２およびＹＧＬＹ７４３３を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ３４１９（図２３）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号９１）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号９２）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７４３２およびＹＧＬＹ７４３３内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７６５６およびＹＧＬＹ７６５１を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ７９３０およびＹＧＬＹ７９４０を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ３４２１（図２４）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号９３）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号９４）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７９３０およびＹＧＬＹ７９４０内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７９６１およびＹＧＬＹ７９６５を選択した。これらはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。
プラスミドｐＧＬＹ２４５６（図２５）は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（ｍＣＭＰ−Ｓｉａ Ｔｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ｈＣＳＳ）、（５）ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ｈＳＰＳ）、（６）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したマウスα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（ｍＳＴ６）をコードする６つの発現カセット、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位を含有する。マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＣＭＰ Ｓｉａ Ｔｒａｎｓｐ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧＮＥ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９６）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子をコードする発現カセットは（配列番号９７）を含む。ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＣＳＳ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９８）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＳＩＡＰ Ｓ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号９９）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。キメラマウスα−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２シグナルペプチドをコードする核酸分子に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＳＴ６触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号１００）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ２遺伝子の５’領域およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）からのヌクレオチド配列（配列番号１０１）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０２）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２４５６をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７９６１内に形質転換して、それらの６つの発現カセットがＴＲＰ２ ＯＲＦの直後のＴＲＰ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ８１４６を選択した。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ９２９６を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ５０４８（図２６）は、ＳＴＥ１３遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、ならびに（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５または転写単位をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（アミノ酸配列番号１０５をコードする配列番号１０４）に５’末端において融合している、ティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号１０３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの２つの縦列カセットは、一方の側では、ＳＴＥ１３遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０６）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＳＴＥ１３遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０７）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０４８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９２９６内に形質転換して、幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ９４６９およびＹＧＬＹ９４６５を選択した。該株は、単一マンノースＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を産生しうる（公開米国出願第２００９０１７０１５９号を参照されたい）。
プラスミドｐＧＬＹ５０１９（図２７）は、ＤＡＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）発現カセット［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ １３ａ，Ｄ−６１３５２ Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ １５：１５４１（１９９９）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＲ３１３８７．１およびＣＡＲ３１３８３．１を参照されたい］をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する。ＮＡＴＲ発現カセット（配列番号１０８）は、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（配列番号１０９）およびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（配列番号１１０）に対して機能的に調節され、その全体は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号１１１）に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＤＡＰ２遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号１１２）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９４６９内に形質転換して、該ＮＡＴＲ発現カセットがＤＡＰ遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ９７９７を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ５０８５（図２８）は、シアル酸化Ｎ−グリカンの産生に関与する第２セットの遺伝子をピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）内に導入するためのＫＩＮＫＯプラスミドである。該プラスミドは、ヒグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）をコードする発現カセットでピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子が置換されていること、および該プラスミドがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ５遺伝子を標的化すること以外は、プラスミドＹＧＬＹ２４５６に類似している。該ＨＹＧＲ耐性カセットは配列番号１１３である。ＨＹＧＲ発現カセット（配列番号１１３）は、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に対して機能的に調節されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ １５：１５４１（１９９９）を参照されたい）。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の５’領域およびＯＲＦ（これは終止コドンで終わる）からのヌクレオチド配列（配列番号１１４）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１１５）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５０８５を株ＹＧＬＹ９７９７内に形質転換して幾つかの株を得、それらから株ＹＧＬＹ１２９００およびＹＧＬ１２８９７を選択した。
実施例３
この実施例は株ＹＧＬＹ２１０５８およびＹＧＬＹ１６４１５の構築を記載する。どちらの株も、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、プラスミドｐＧＬＹ４３６２における発現カセットによりコードされるＢ鎖の２８位にＮ−グリコシル化部位を含むインスリン類似体を発現することが可能である。ＹＧＬＹ９７９７からの株の構築を図３３Ａ〜３３Ｂに示す。
実施例２からの株ＹＧＬＹ１２９００をプラスミドｐＧＬＹ４３６２で形質転換した。該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＡＡＫを有するＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーに融合したＴＡ５７プロペプチドに融合したＹｐｓ１ｓｓドメインを含むグリコシル化インスリン類似体前駆体分子の発現をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において可能にする発現プラスミドである。該形質転換により幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２１０５８を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＡＡＫを有するＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
実施例２からの株ＹＧＬＹ１２８９７を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ１３６５８を選択した。
プラスミドｐＹＧＬＹ５１９２（図２９）は、該株を液胞局在化受容体（Ｖｐｓ１０−１ｐ）活性欠損状態にするためにＶＰＳ１０−１遺伝子のＯＲＦを欠失するように構築された組込みベクターである。該プラスミドは、ＶＰＳ１０−１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１１７）に一方の側で及びＶＰＳ１０−１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１１６）に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列を含む核酸分子（配列番号５０）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子（配列番号４９）を含有する。プラスミドをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１３６５８内に形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ１５６９１を選択した。株ＹＧＬＹ１５６９１をプラスミドｐＧＬＹ４３６２で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ１６４１５を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したアミノ酸配列ＡＡＫを有するＣペプチドに融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
実施例４
この実施例は株ＹＧＬＹ２３５６０およびＹＧＬＹ２４００５の構築を記載する。どちらの株も、ガラクトース末端Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、プラスミドｐＧＬＹ９３１２における発現カセットによりコードされるＢ鎖の２８位にＮ−グリコシル化部位を含むインスリン類似体を発現することが可能である。株ＹＧＬＹ７９６５からの株の構築を図３４に示す。
プラスミドｐＧＬＹ３６７３（図３０）は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０４）に５’末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号１０３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号１１８）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子（配列番号５８）に機能的に連結されている。該カセットは、一方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号１１９）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１２０）に隣接している。該プラスミドはＰｐＡＲＧ１遺伝子を含有する。プラスミドｐＧＬＹ３６７３を実施例２からの株ＹＧＬＹ７９６５内に形質転換して幾つかの株を得、それらのうち、株ＹＧＬＹ８３２３を選択した。
株ＹＧＬＹ２３５６０を作製するために、株ＹＧＬＹ８３２３をプラスミドｐＧＬＹ９３１２で形質転換した。該プラスミドは、ヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチド“ＴＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ”に融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端ＭＹＣスペーサーペプチドに融合したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ接合因子シグナル配列およびプロ−ペプチドを含むグリコシル化インスリン類似体前駆体分子の発現をピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）において可能にする発現プラスミドである。該形質転換により幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２３５６０を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチド“ＴＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ”に融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端ＭＹＣスペーサーペプチドを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
株ＹＧＬＹ２４００５を作製するために、株ＹＧＬＹ８３２３を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ８４０５を選択した。
プラスミドｐＹＧＬＹ３５８８（図３２）は、ＡＯＸ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、該プラスミドは、ＡＯＸ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１２４）に一方の側で及びＡＯＸ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１２５）に他方の側で隣接している、ｌａｃＺ反復配列（ｌａｃＺ反復）（プラスミドｐＹＧＬＹ６を参照されたい）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有する。
プラスミドｐＹＧＬＹ３５８８を株ＹＧＬＹ８４０５内に形質転換して、ウリジンに対して原栄養性である幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ１３１８６を選択した。株ＹＧＬＹ１３１８６をプラスミドｐＧＬＹ９３１２で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２４００５を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチド“ＴＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫ”に融合したＰ２８Ｎ置換を有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端ＭＹＣスペーサーペプチドを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
実施例５
この実施例は実施例２の株ＹＧＬＹ９４６５からの株ＹＧＬＹ２３６０５の構築を記載する。該株は、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、プラスミドｐＧＬＹ９３１２における発現カセットによりコードされるＢ鎖の２８位にＮ−グリコシル化部位を含むインスリン類似体を発現することが可能である。該株は、誘導プロモーターに機能的に連結されたリーシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＳＴＴ３Ｄ（ＬｍＳＴＴ３Ｄ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を更に含む。ＬｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子の含有はＮ−グリコシル化部位占拠を増加させることが示されている（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５８７８を参照されたい）。ＹＧＬＹ９４６５からの該株の構築を図３５Ａ〜Ｂに示す。
実施例２に記載されているプラスミドｐＧＬＹ５０１９は、ＤＡＰ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたナーセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴＲ）発現カセット［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ １３ａ，Ｄ−６１３５２ Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ １５：１５４１（１９９９）を参照されたい］をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する。プラスミドｐＧＬＹ５０１９を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９４６５内に形質転換して、該ＮＡＴＲ発現カセットがＤＡＰ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ９７８１を選択した。
株ＹＧＬＹ９７８１をプラスミドｐＧＬＹ５０８５（実施例２）で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ１２９０３およびＹＧＬＹ１２９０５を選択した。ついで株ＹＧＬＹ１２９０３を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ１４２９４を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ７６０３（図３１）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）においてＶＰＳ１０−１遺伝子座を標的化する組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号１１８）に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号５８）に３’末端において機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における最適な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１２１）を含み、選択のために、該プラスミドは、ｌａｃＺ反復配列を含む核酸分子（配列番号５０）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子（配列番号４９）を含有する。どちらのカセットも、ＶＰＳ１０−１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１１７）に一方の側で、およびＶＰＳ１０−１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１１６）に他方の側で隣接している。
プラスミドｐＧＬＹ７６０３を株ＹＧＬＹ１４２９４内に形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２２８１２を選択した。
株ＹＧＬＹ２２８１２をプラスミドｐＧＬＹ９３１０で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２３６０５を選択した。該株は、Ｎ２１Ｇ置換を含有するヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチドＲＲに融合した置換Ｐ２８Ｎを含有するヒトインスリンＢ鎖を含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
実施例２６
この実施例は実施例５の株ＹＧＬＹ１２９０５からの株ＹＧＬＹ２１０８３およびＹＧＬＹ２１０８０の構築を記載する。該株は、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、プラスミドｐＧＬＹ９３１２における発現カセットによりコードされるＢ鎖の２８位にＮ−グリコシル化部位を含むインスリン類似体を発現することが可能である。ＹＧＬＹ１２９０５からの株の構築を図３６に示す。
株ＹＧＬＹ１２９０５をプラスミドｐＧＬＹ７６８０で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２１０８３を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチドＲＲに融合した置換Ｐ２８Ｎを含有するヒトインスリンＢ鎖を含むグリコシル化プロインスリン類似体を産生しうる。
また、株ＹＧＬＹ１２９０５をプラスミドｐＧＬＹ７６７９で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２１０８０およびＹＧＬＹ２１０８１を選択した。該株は、ヒトインスリンＡ鎖に融合したＣペプチドＡ（１０×ＨＩＳ）ＡＫに融合した置換Ｐ２８Ｎを含有するヒトインスリンＢ鎖に融合したＮ末端スペーサーペプチドを含むＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。
実施例７
種々のＮ−グリコシル化インスリン類似体を産生しうる株は以下のとおりに増殖されうる。５００ｍＬのＢＳＧＹ培地を含有する２つの２．８リットル（Ｌ）のバッフル付きフェルンバッチ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコに２ｍＬの関連株のリサーチ・セル・バンク（Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ）を接種することにより、初代培養を調製する。４８時間のインキュベーションの後、バイオリアクターに接種するために該細胞を移す。該発酵バッチ培地は培地１リットル当たりに以下のものを含有する：４０ｇのグリセロール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１８．２ｇ ソルビトール（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２．３ｇのリン酸二水素カリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）、１１．９ｇのリン酸水素二カリウム（ＥＭＤ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、１０ｇの酵母エキス（Ｓｅｎｓｉｅｎｔ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、２０ｇのＨｙ−Ｓｏｙ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＮＹ）、１３．４ｇのＹＮＢ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）および４×１０−３ｇのビオチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
１５Ｌ 凹底ガラス（オートクレーブ可能）および４０Ｌ ＳＩＰバイオリアクター（それぞれ、８Ｌおよび２０Ｌの開始容量）（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内で発酵を行った。以下の条件で、単純バッチ様態で該発酵を行った：２４±１℃の温度；３０％ ＮＨ４ＯＨの添加により維持される６．０±０．１のｐＨ；約０．７±０．１ｖｖｍの気流；２０％飽和の溶存酸素［撹拌速度（２５０〜８００ｒｐｍ）のフィードバック制御のカスケード化およびそれに続く０．１ｖｖｍまでの注入気流への純酸素の補給により維持される］。溶存酸素濃度の急激な増加により認められるグリセロールの初期仕込みの消失の後、１００＋／−１０ｇ／Ｌ（湿潤細胞重量）の細胞密度に達する。この時点で、溶存酸素制御を切断し、３５〜９０ｍｍｏｌ／Ｌ／時の範囲内の一定の酸素取り込み速度を可能にする一定速度に撹拌を固定する。ついで、ｐＨを６．０から５．２±０．１に変化させると共に、１００％メタノール供給溶液の添加を開始する。メタノールを０．１５％±０．０２％の濃度で過剰状態に維持する。これは、メタノール・センサー（Ｍｅｔｈａｎｏｌ Ｓｅｎｓｏｒ）（Ｒａｖｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）からのフィードバックにより制御される。該メタノール相は７２±８時間継続する。該発酵の終了時に、１３，０００×ｇで３０分間の遠心分離により上清を得る。
本明細書に開示されている形質転換酵母株のタンパク質発現は、１％ 酵母エキス、２％ ペプトン、１００ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）、１．３４％ 酵母窒素ベース、４×１０−５％ ビオチンおよび１％ グリセロールからなる緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）を含有する振とうフラスコ内で２４℃で行われうる。タンパク質発現のための誘導培地は、ＢＭＧＹにおけるグリセロールの代わりに１％ メタノールからなる緩衝化メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）である。Ｏ−グリコシル化を制御または低減したい場合には、誘導培地を加えた時点で、メタノール中のＰｍｔインヒビター、例えばＰｍｔｉ−３（５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸）（公開国際出願番号ＷＯ２００７０６１６３１を参照されたい）またはＰｍｔｉ−４（以下の構造
Figure 2014525922
 を有する米国公開出願第２０１１００７６７２１号の実施例４化合物）を１８．３μＭの最終濃度で増殖培地に加える。細胞を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
ＳｉｘＦｏｒｓファーメンター・スクリーニング・プロトコール（Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）は、表２に示されているパラメータに従った。
Figure 2014525922
 接種後約１８時間の時点で、３５０ｍＬの培地Ａ（以下の表３を参照されたい）＋４％グリセロールを含有するＳｉｘＦｏｒｓ容器に、関心のある株を接種する。少量（１００％メタノール中、０．２ｍｇ／ｍＬで０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３を接種物と共に加えた。約２０時間の時点で、１７ｍＬ、５０％ グリセロール溶液（グリセロール・フェッドバッチ供給；以下の表４を参照されたい）＋大量（４ｍｇ／ｍＬで０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３またはＰｍｔｉ−４のボーラスを容器ごとに加える。溶存酸素（ＤＯ）濃度の正の急上昇により示されるグリセロールの消費が認められる２６時間の時点で、メタノール供給（以下の表５を参照されたい）を０．７ｍＬ／時間で連続的に開始する。同時に、もう１つの量のＰｍｔｉ−３またはＰｍｔｉ−４（４ｍｇ／ｍＬ ストック、０．３ｍＬ）を容器ごとに加える。約４８時間の時点で、もう１つの量（４ｍｇ／ｍＬで０．３ｍＬ）のＰｍｔｉ−３またはＰｍｔｉ−４を容器ごとに加える。接種後約６０時間の時点で、培養物を回収し、加工する。
Figure 2014525922
 実施例８
この実施例においては、株ＹＧＬＹ２１０５８を増殖させるために使用した培地から抽出したＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体をＮ−結合グリコシル化に関して分析した。該類似体は、配列番号３６に示されているアミノ酸配列を有する一本鎖分子である。該培地のアリコートをＰＮＧアーゼまたはノイラミニダーゼで処理し、該処理サンプルを、対照としての未処理アリコートと共に、還元１６．５％ ＴＲＩＣＩＮＥポリアクリルアミドゲル上で分離した。図３７は、該インスリン類似体前駆体がＮ−グリコシル化されたことを示している。ＰＮＧアーゼ消化により遊離したＮ−グリカンを正および負イオンＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析し、その結果を図３８に示す。図３７に示されているとおり、該インスリン類似体前駆体の観察されたＮ−グリカン組成は約７５％ Ａ２（ビシアル酸化）であり、約１６％はＡ１（モノシアル酸化）であり、約５％はハイブリッドＭａｎ５であった。図３７はまた、主要インスリン前駆体種の構造を示す。該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体のインビトロ加工は、主要Ｎ−グリカンがビ−シアル酸化された、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体組成物を与えるであろう。予想されるＮ−グリカン組成は、約７５：１６：５：３ｍｏｌ％の比の、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２：ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２：Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２：ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２と予想されるであろう。
該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を精製するために、上清培地をＳｏｒｖａｌｌ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ＲＣ（ｋｅｎｄｏ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）における１３，０００ｇで１５分間の遠心分離により清澄化し、ついでｐＨを４．５に調節し、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ０．２μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して濾過した。濾液をＣａｐｔｏ ＭＭＣカラム、マルチモード陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（同じｐＨに調節されたもの）にローディングした。ｐＨ７での溶出の後で得られたプールを集め、ＲＥＳＯＵＲＣＥ ＲＰＣカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＳＯＵＲＣＥ １５Ｃが充填された逆相カラムクロマトグラフィー、ポリスチレン／ジビニルベンゼンから構成される強固な単分散１５μｍビーズに基づく重合体逆相クロマトグラフィー媒体内にローディングした。該樹脂をｐＨ３．５で平衡化し、同じｐＨでの１２．５％〜２０％ ２−プロパノールの段階溶出を用いて溶出した。画分を集め、図３９に示されているとおり、７つの群にプールした。それらの７つの群を還元１６．５％ ＴＲＩＣＩＮＥポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。各グリコフォームの相対量を定量するために、Ｎ−グリコシダーゼＦで遊離したグリカンを２−アミノベンジジン（２−ＡＢ）で標識し、ＨＰＬＣにより分析した（Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：５０２２−５０２７（２００３）およびＨａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１３：１４４１−１４４３（２００６）に記載されているとおりに行った）。
タンパク質１モル当たりのシアル酸のモルの比として糖タンパク質上の全シアル酸含量を検出するために、以下のアッセイを用いた。以下の方法を用いて、シアル酸を酸加水分解により糖タンパク質サンプルから遊離させ、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。約１０〜１５μｇのタンパク質サンプルをリン酸緩衝食塩水中にバッファー交換した。４００μＬの０．１Ｍ 塩酸を加え、該サンプルを８０℃で１時間加熱した。ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ）における乾燥の後、該サンプルを５００ｍＬの水で再構成させた。ついで１００μＬをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析に付した。該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体プール１〜３の収率およびＮ−グリカン組成も決定し、結果を図３９に示す。
Ａ２、Ｇ２、Ｇ０またはＧ−２ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体の組成を得るために、後記の酵素工程のために、Ｎ−グリカン組成に基づいて該プールを選択した。これらのＮ−グリカンは、連続的な酵素消化により、Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体類似体上で生成した。該酵素反応条件は、該製造業者により推奨されているものを用いた。Ａ２ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体をアセチル−ノイラミニルヒドラーゼ（Ｓｉａｌｉｄａｓｅ，Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ）で消化して、Ｇ２ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を得た。Ｇ２ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体をβ１−４ガラクトシダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ）で消化して、Ｇ０ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を得た。Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体Ｇ０をβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ヘキソサミニダーゼ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ）で消化して、Ｇ−２ Ｎ−グリカンを有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を得た。前記種の全てに適用された最後の酵素工程は、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体を完全に消化して、天然ヒトインスリンＡ鎖ペプチドおよびｄｅｓ（Ｂ３０）Ｂ：Ｐ２８Ｎ Ｂ鎖ペプチドを有するＮ−グリコシル化インスリンヘテロ二量体［ここで、２８位のＡｓｎはＡ２ Ｎ−グリカン（ＧＳ６．０）、Ｇ２ Ｎ−グリカン（ＧＳ５．０）、Ｇ０ Ｎ−グリカン（ＧＳ４．０）またはＧ−２ Ｎ−グリカン（ＧＳ２．１）に結合している］を得るためのものであった。種々の類似体のＢ鎖のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号２９４、２９５、２９６および２９７に示されている。
酵素消化後、得られたＮ−グリコシル化ｄｅｓ（Ｂ３０）Ｂ：Ｐ２８Ｎインスリンヘテロ二量体を、前記のとおりにＳＯＵＲＣＥ １５ＲＰＣを使用して精製した。最終プールを２５ｍＭ 第２リン酸ナトリウム（無水物）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１．６％ グリセロール（ｐＨ７．４）中で製剤化した。この最終製剤化タンパク質を該インビトロおよびインビボ研究の全てにおいて使用した。並行して、市販のＮＯＶＯＬＩＮ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して消化して、対照として使用するためのｄｅｓ（Ｂ３０）形態を得た。前記のとおりに、精製および製剤化を行った。
実施例９
ＧＳ２．１およびＧＳ５．０インスリン類似体のグルコース応答性を研究するために、１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを２時間絶食させた後、ＧＳ２．１またはＧＳ５．０をｓ．ｃ．注射により投与した。同時に、動物にα−メチルマンノース溶液（塩類液中の２１．５％ ｗ／ｖ、１０ｍｌ／ｋｇ）またはビヒクルをｉ．ｐ．投与した。高濃度では、α−メチルマンノースはｃ型レクチンと糖タンパク質（特に、マンノース、ＧｌｃＮＡｃまたはフコース残基を末端に有するもの）との間の相互作用を競合的に抑制することが知られている。時間０、ついで注射の３０、６０、９０および１２０分後、グルコメーター（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ＬｉｆｅＳｃａｎ；Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を使用して、血液グルコースを測定した。時間０のグルコース（１００％として）に対して標準化された値を用いて、グルコース曲線上面積（Ａｒｅａ−Ｏｖｅｒ ｔｈｅ−Ｃｕｒｖｅ）（ＡＯＣ）を計算した。
図４０に示されているとおり、１８ｎｍｏｌ／ｋｇで投与された、末端ガラクトースを含有するＧＳ５．０は１２０分間の研究時間中にグルコースを低下させた。α−メチルマンノースの注射は、ＧＳ５．０により誘導されたグルコース低下に対する検出可能な追加的な効果を及ぼさなかった。これとは対照的に、末端マンノースを含有するＧＳ２．１は、単独で投与された場合、ＧＳ５．０と比較して低い度合ではあったがグルコースを低下させた。しかし、α−メチルマンノースの存在下では、ＧＳ２．１は、６０および９０分の時点で、ＧＳ５．０より良好な又はより大きな効力でグルコースを低下させた。α−メチルマンノースの存在下および非存在下のグルコースＡＵＣ（％）は、ＧＳ２．１に関しては有意に異なっていたが、ＧＳ５．０に関しては変化は検出されなかった。グルコースはマンノース結合性ｃ型レクチンと糖タンパク質との間の相互作用を、α−メチルマンノースより低い効力でではあるが抑制することが知られている。これらのデータは、ＧＳ２．１がグルコース応答様態でグルコースを低下させうることを示しており、これは恐らく、マンノース受容体のようなマンノース結合性レクチンによるものであろう。
実施例１０
この実施例は、０、１、２または３個のＮ−グリカンを含有するＮ−グリコシル化プロインスリン類似体前駆体の製造を示す。該Ｎ−グリカンはＧＳ１．０（Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２）またはＧＳ２．０（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）のいずれかであった。
実施例１の表１に示されている発現ベクターのそれぞれを株ＹＧＬＹ２６２６８内に別々に形質転換した。株ＹＧＬＹ２６２６８は、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くＧＦＩ１．０株であるが、ＬｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子の存在により高いＮ−グリコシル化部位占拠を伴う高マンノースＮ−グリカン（Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２）を有する糖タンパク質を産生する。
各トランスフェクションからの３個のクローンをＭｉｃｒｏ２４リアクター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）内で培養し、メタノールの添加に際して組換えタンパク質を誘導した。得られた培養上清流体を各形質転換からの３個の異なるクローンから単離し、還元４〜２０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のゲル電気泳動によりタンパク質発現に関して分析し、該タンパク質をクーマシーブルー染色で可視化した。ＹＧＬＹ２６５８０およびＹＧＬＹ２６７３４と称される２つの対照株をこれまでの形質転換において作製し、該実験実施に加えた。
該ゲル電気泳動の結果を図４１に示す。結果は、Ｎ−結合グリコシル化部位を有するプロインスリン前駆体類似体が主にＭａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンでＮ−グリコシル化され、Ｎ−グリカンの推定数に合致したタンパク質分子量（各Ｎ−グリカンは約１７２０ダルトンの分子量を有する）で泳動したことを示している。ｐＧＬＹ１１１６４によりコードされるプロインスリン前駆体類似体はグリコシル化されなかった。なぜなら、それはＢ２８位にアスパラギン残基を含有していたが、それはＢ３０位のトレオニン残基を欠き、したがって、完全なＮ−結合グリコシル化モチーフを欠いていたからである。
対照株ＹＧＬＹ２６７３４は、図４１に示されているゲルのレーン１８において、１個のＮ−グリコシル化部位を含有する類似体（例えば、１３−１４）に対応する位置で泳動していると思われるプロインスリン類似体前駆体を産生した。しかし、該プロインスリン類似体前駆体は両方の位置でグリコシル化されている。移動度の変化は、ＧＦＩ１．０株において産生されたプロインスリン類似体前駆体のＮ−グリカンと比較した場合の該Ｎ−グリカンのサイズの減少によるものである。該高マンノースＮ−グリカンは約１７２０ダルトンの平均分子量を有するが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンは約１２５７ダルトンの分子量を有し、その差は約４６３ダルトンである。２個のＮ−グリコシル化部位が存在するため、サイズの全体的減少は約９２６ダルトンである。高マンノースＮ−グリカンを有するプロインスリン類似体前駆体とＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎーグリカンを有するものとの間の分子量におけるこの相違は、該ゲルにおいて示されるそれぞれのプロインスリン類似体前駆体の移動度に影響を及ぼす。
実施例１１
この実施例は実施例１０の株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を記載する。株ＹＧＬＹ２６２６８は、ＧＳ１．０（Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生することが可能であり、ＬｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子を含み、これは、ｌｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子を欠く株と比較して、Ｎ−グリコシル化部位占拠の増加をもたらすことがＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２５８７８に示されている。
株ＹＧＬＹ２６２６８の構築を図４６に示す。簡潔に説明すると、株ＹＧＬＹ１６−３を、既に記載されているプラスミドｐＧＬＹ３４１９で形質転換して、幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ６６９８およびＹＧＬＹ６６９７を選択した。それらの２つの選択された株を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して、幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ６７２０およびＹＧＬＹ６７１９を選択した。
株ＹＧＬＹ６７２０およびＹＧＬＹ６７１９をそれぞれ、既に記載されているプラスミドｐＧＬＹ３４１１で形質転換して、幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ６７４９およびＹＧＬＹ６７４３を選択した。それらの２つの選択された株を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して、幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ７７４９およびＹＧＬＹ６７７３を選択した。
株ＹＧＬＹ７７４９およびＹＧＬＹ６７７３をそれぞれ、既に記載されているプラスミドｐＧＬＹ３４２１で形質転換して、幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ７７６０およびＹＧＬＹ７７５４を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ６３０１は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＵＲＡ６遺伝子座を標的化するロールイン組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号１１８）に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号５８）に３’末端において機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦをコードする核酸分子を含む。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３ ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号２５５）は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子（配列番号２５７）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子（配列番号５８）に機能的に連結されている。該プラスミドは更に、ＵＲＡ６遺伝子座（配列番号２５６）を標的化するための核酸分子を含む。５’末端においてＥｃｏＲＩ部位に、そして３’末端においてＦｓｅＩ部位に隣接したコドン最適化ＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦ（ｐＧＬＹ６２８７）をコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＦｓｅＩで消化されたプラスミドｐＧＦＩ３０ｔ内にクローニングすることにより、プラスミドｐＧＬＹ６３０１を構築した。
株ＹＧＬＹ７７６０を、既に記載されているｐＧＬＹ６３０１でトランスフェクトして幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２６２６８を選択した。株ＹＧＬＹ２６２６８を、前記実施例１の表１に挙げられている代替的インスリン発現プラスミドで形質転換した。表１からの全てのインスリン発現プラスミドは、制限部位ＭｌｙＩおよびＦｓｅＩを使用してインスリン前駆体遺伝子をプラスミドｐＧＬＹ９３１６（図４７）内にクローニングすることにより作製され、配列番号１２６（ｐＧＬＹ１１０７４）、配列番号１２８（ｐＧＬＹ１１０８４）、配列番号１３０（ｐＧＬＹ１１０８５）、配列番号１３２（ｐＧＬＹ１１０８７）、配列番号１３４（ｐＧＬＹ１１０８８）、配列番号１３６（ｐＧＬＹ１１０９８）、配列番号１３８（ｐＧＬＹ１１０９９）、配列番号１４０（ｐＧＬＹ１１１０１）、配列番号１４２（ｐＧＬＹ１１１６４）、配列番号１４４（ｐＧＬＹ１１４６４）、および配列番号１４６（ｐＧＬＹ１１４６５）に示されているオープンリーディングフレームを有する。ＹＧＬＹ２６２６８由来のクローンは、Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２構造を主に有する糖タンパク質を産生しうるＧＦＩ１．０株である。
この実験における対照株であるＹＧＬＹ２６５８０およびＹＧＬＹ２６７３４は、配列番号１５６に示されているアミノ酸配列を有するＮ−グリコシル化インスリン類似体前駆体をプラスミドｐＧＬＹ１１０９９から産生する。該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体前駆体は、２つのＮ−グリカン、すなわち、Ｂ（−２）位に１つ、およびＢ２８位に１つのＮ−グリカンを有する。ＹＧＬＹ２６５８０およびＹＧＬＹ２６７３４は共に、インスリン発現プラスミドｐＧＬＹ１１０９９を含有するが、ＹＧＬＹ２６５８０は、Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン構造を主に有する糖タンパク質を産生するＧＦＩ１．０株であり、一方、ＹＧＬＹ２６７３４は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン構造を主に有する糖タンパク質を産生するＧＦＩ２．０株である。株ＹＧＬＹ２６５８０の構築は図４８に示されており、実施例１２に記載されており、一方、株ＹＧＬＹ２６７３４の構築は図４９Ａ〜４９Ｂに示されており、実施例１３に記載されている。プラスミドｐＧＬＹ１１０９９の地図を図５０に示す。
実施例１２
株ＹＧＬＹ２６５８０の構築を図４８に示す。該株は、ＧＳ１．０（Ｍａｎ（８−１２）ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ−グリカンを有する、ｐＧＬＹ１１０９９によりコードされるインスリン類似体を産生する対照株であり、ＬｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子を含む。
簡潔に説明すると、株ＹＧＬＹ７７６０をプラスミドｐＧＬＹ１１０９９でトランスフェクトして幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２６１８９を選択した。プラスミドｐＧＬＹ１１０９９（図５０）は、Ｂ−２位およびＢ２８位にＮ−グリコシル化部位を含むインスリン類似体をコードしている。該プラスミドによりコードされるプロインスリン前駆体類似体のアミノ酸配列を配列番号１５６に示す。
株ＹＧＬＹ２６１８９を、既に記載されているプラスミドｐＧＬＹ６３０１でトランスフェクトして幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２６５８０を選択した。
実施例１３
株ＹＧＬＹ２６７３４の構築を図４９に示す。該株は、ＧＳ２．０（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ−グリカンをＢ（−２）位およびＢ２８位に有する、ｐＧＬＹ１１０９９によりコードされるインスリン類似体前駆体を産生する対照株であり、ＬｍＳＴＴ３Ｄ遺伝子を含む。該グリコシル化インスリン類似体前駆体はグリコシル化インスリン類似体２００−２−Ｂへとインビトロで加工される。２００−２−Ｂは、アミノ酸配列Ｎ ＊ ＧＴＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ ＊ Ｋ（配列番号２９３）［ここで、１位および３１位（Ｂ−２およびＢ２８）のＡｓｎ残基Ｎ＊はそれぞれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している］を有する、天然インスリンＡ鎖およびＢ鎖を含むヘテロ二量体（ｄｅｓ（Ｂ３０））である。株ＹＧＬＹ２６７３４の構築は以下のとおりである。
株ＹＧＬＹ７７５４を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ８２５２を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ１１６２（図５１）は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０４）に５’末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該カセットは、一方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号１１９）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号１２０）に隣接している。該プラスミドは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有する。プラスミドｐＧＬＹ１１６２を株ＹＧＬＹ８２５２内に形質転換して幾つかの株を得、得られた株から株ＹＧＬＹ８２９２を選択した。株ＹＧＬＹ８２９２を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ９０６０を選択した。
株ＹＧＬＹ９０６０を、既に記載されているｐＧＬＹ３５８８で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２４９５７を選択した。株ＹＧＬＹ２４９５７をプラスミドｐＧＬＹ６３０１で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２４９６４を選択した。株ＹＧＬＹ２４９６４をプラスミドｐＧＬＹ１１０９９で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２６７３４を選択した。
株ＹＧＬＹ２６７３４の発酵の後、インスリン類似体前駆体を無細胞発酵上清から精製し、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼで処理して、実施例１５に記載されているインビトロおよびインビボ試験のためのｄｅｓ（Ｂ３０）ヘテロ二量体２００−２−Ｂを得た。
実施例１４
この実施例は株ＹＧＬＹ２９３６５の構築を記載する。株ＹＧＬＹ２９３６５は、ＧＳ２．１（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）Ｎ−グリカンをＢ（−２）位およびＢ２８位に有するグリコシル化インスリン類似体前駆体を産生しうる。該グリコシル化インスリン前駆体はグリコシル化インスリン類似体２１０−２−Ｂへとインビトロで加工される。２１０−２−Ｂは、アミノ酸配列Ｎ ＊ ＧＴＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ ＊ Ｋ（配列番号２９２）［ここで、１位および３１位（Ｂ−２およびＢ２８）のＡｓｎ残基Ｎ＊はそれぞれ、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（少マンノース）Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している］を有する、天然インスリンＡ鎖およびＢ鎖を含むヘテロ二量体（ｄｅｓ（Ｂ３０））である。
株ＹＧＬＹ２９３６５の構築は、図４９Ａに示され実施例１３に記載されている株ＹＧＬＹ９０６０から開始する多数の遺伝的修飾の産物である。
株ＹＧＬＹ９０６０をプラスミドｐＧＬＹ７１４０で形質転換した。プラスミドｐＧＬＹ７１４０は、ＹＯＳ９遺伝子座を標的化するノックアウトベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子（配列番号４９）または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子（配列番号５０）に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＹＯＳ９遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３０６）に隣接しており、他方の側では、ＹＯＳ９遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３０７）に隣接している。Ｙｏｓ９ｐはＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路に関連づけられており（Ｋｉｍら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：７４１−７５１（２００５）を参照されたい）、ＹＯＳ９遺伝子の欠失はグリコシル化タンパク質の収率を改善しうる。プラスミドｐＧＬＹ７１４０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ９０６０内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＹＯＳ９遺伝子座内に挿入されている幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２３３２８を選択した。株ＹＧＬＹ２３３２８を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存している株ＹＧＬＹ２３３６０を得た。
プラスミドｐＧＬＹ５５０８を形質転換することにより、株ＹＧＬＹ２４５４２を作製した。プラスミドｐＧＬＹ５５０８は、ＡＬＧ３遺伝子座を標的化するノックアウトベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＡＬＧ３遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３０８）に隣接しており、他方の側では、ＡＬＧ３遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列を含む核酸分子（配列番号３０９）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５５０８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ２３３６０内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子が二重交差相同組換えによりＡＬＧ３遺伝子座内に挿入されている幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２４５４２を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ１０１５３は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＵＲＡ６遺伝子座を標的化しＬｍＳＴＴ３Ａ、ＬｍＳＴＴ３ＢおよびＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦをコードするロールイン組込みプラスミドである。ＬｍＳＴＴ３タンパク質の過剰発現は該インスリン類似体のＮ−グリコシル化部位占拠を増強しうる。ＬｍＳＴＴ３Ａをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に３’末端において機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦ（配列番号３１０）をコードする核酸分子を含む。ＬｍＳＴＴ３Ｂをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に３’末端において機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｂ ＯＲＦ（配列番号３１１）をコードする核酸分子を含む。ＬｍＳＴＴ３Ｄをコードする発現カセットは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に３’末端において機能的に連結された、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化されたＬｍＳＴＴ３Ｄ ＯＲＦ（配列番号１２１）をコードする核酸分子を含む。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＲ３ ＯＲＦをコードする発現カセットを含み、ここで、該ＯＲＦをコードする核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＲＬ１０プロモーター配列を有する核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を有する核酸分子に機能的に連結されている。プラスミドｐＧＬＹ１０１５３を株ＹＧＬＹ２４５４２内に形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２４５６１を選択した。株ＹＧＬＹ２４５６１を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存している株ＹＧＬＹ２４５８６を得た。
株ＹＧＬＹ２４５８６を、ＡＴＴ１遺伝子を破壊するプラスミドｐＧＬＹ５９３３で形質転換した。ＡＴＴ１遺伝子の破壊は発酵中の細胞適合性を改善しうる。該プラスミドの顕著な特徴は、それが、ＡＴＴ１遺伝子の５’または上流領域を含む核酸分子（配列番号３１２）に一方の末端で及びＡＴＴ１遺伝子の３’または下流領域をコードする核酸分子（配列番号３１３）に他方の末端で隣接している前記ＵＲＡ５発現カセットを含むことである。ＹＧＬＹ２７３０３をプラスミドｐＧＬＹ５９３３で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２７３０３を選択した。株ＹＧＬＹ２７３０３をプラスミドｐＧＬＹ１１０９９（図５０）で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、株ＹＧＬＹ２８１３７を選択した。
プラスミドｐＧＬＹ１２０２７は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）におけるＵＲＡ６遺伝子座を標的化しマウスエンドマンノシダーゼＯＲＦをコードするロールイン組込みベクターである。完全長マウスエンドマンノシダーゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における有効な発現のためにコドン最適化された完全長マウスエンドマンノシダーゼＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３１４）を含み、これは、誘導可能なピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター配列を有する核酸分子に５’末端において、および転写終結配列、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１転写終結配列（配列番号３１５）に３’末端において機能的に連結されている。形質転換体を選択するために、該プラスミドは、アシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（配列番号１０９）およびアシビア・ゴシッピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（配列番号１１０）に機能的に調節されたＮＡＴＲ発現カセット（配列番号１０８）を含む。該プラスミドは、ＵＲＡ６遺伝子座を標的化するための、既に記載されている核酸分子を更に含む。株ＹＧＬＹ２８１３７をプラスミドｐＧＬＹ１２０２７で形質転換して幾つかの株を得、これらのうち、ＹＧＬＹ２９３６５を選択した。
株ＹＧＬＹ２９３６５の発酵の後、該インスリン類似体前駆体を無細胞発酵上清から精製し、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼで処理して、実施例１５に記載されているインビトロおよびインビボ試験のためのｄｅｓ（Ｂ３０）ヘテロ二量体２１０−２−Ｂを得た。
実施例１５
この実施例は、グルコース応答特性を示す２つのＮ−グリコシル化インスリン類似体を示す。第１のインスリン類似体は２１０−２−Ｂと称され、アミノ酸配列Ｎ ＊ ＧＴＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ ＊ Ｋ（配列番号２９２）［ここで、１位および３１位（Ｂ−２およびＢ２８）のＡｓｎ残基Ｎ＊はそれぞれ、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（少マンノース）Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している］を有する、天然インスリンＡ鎖およびＢ鎖を含むヘテロ二量体（ｄｅｓ（Ｂ３０））である。第２の類似体は２００−２−Ｂと称され、アミノ酸配列Ｎ ＊ ＧＴＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ ＊ Ｋ（配列番号２９３）［ここで、１位および３１位（Ｂ−２およびＢ２８）のＡｓｎ残基Ｎ＊はそれぞれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している］を有する、天然インスリンＡ鎖およびＢ鎖を含むヘテロ二量体（ｄｅｓ（Ｂ３０））である。該Ｎ−グリコシル化インスリン類似体はＢ：ＮＧＴ（Ｎ末端における）、Ｂ：Ｐ２８Ｎ，ｄｅｓ（Ｂ３０）である。
これらの類似体の活性を評価するために、３つのインビトロアッセイを行った。ヒトインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−ｂ）への結合を、ＩＲ−ｂを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対する、放射能標識ヒトインスリンとの該類似体の競合において決定し、ＩＣ５０値として示した。ＩＲ−ｂを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＩＲ−ｂのリン酸化を評価することにより、ＩＲ−ｂの機能的活性化を決定し、ＥＣ５０値として示した。ヒトマンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＭＲＣ１のエクトドメインに対する、ユウロピウム標識マンノースＢＳＡとの該類似体の競合において決定し、ＩＣ５０値として示した。組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の結合と比較された、該類似体のＩＲ−ｂ結合、ＩＲ−ｂリン酸化およびＭＲＣ１結合のインビトロ特性を、表７に示す。
Figure 2014525922
 正常血糖および低血糖条件下のＭＲＣ１へのインスリン類似体のインビボ結合は、生じる血液グルコース低下に関連していないインスリンクリアランスの代替経路となりうる。一方、高血糖条件は、ＭＲＣ１への該類似体の結合に関してグルコースが競合するのを可能にし、ＩＲ結合、クリアランスおよび血液グルコースの関連低下の、より高い速度を招きうる。したがって、ＭＲＣ１結合を欠損しているインスリン類似体、例えば組換えヒトインスリンは、重篤な低血糖を引き起こす可能性を伴って全ての血液グルコース状態において完全に活性でありうる。したがって、グルコース応答性を評価するために、類似体２１０２−Ｂおよび２００−２Ｂをユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ミニブタモデルにおいて試験した。正常なユカタンミニブタにアロキサンを投与し、回復させ、Ｉ型糖尿病のモデルにおいてＮＰＨインスリンの毎日２回の皮下注射を行った。５頭の正常ミニブタおよび５糖の糖尿病ミニブタを２時間絶食させた後、該インスリン類似体を皮下（ｓ．ｃ．）注射により投与した。グルコメーターを（例えば、ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｕｌｔｒａ ＬｉｆｅＳｃａｎ；Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）使用して、時間０分ならびに注射後８、１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３６０、４２０および４８０分の時点で、血液グルコースを測定した。絶食した正常および糖尿病ミニブタにおける１つのそのような実験の結果を図５２Ａ〜５５Ｂに示す。
図５２Ａは、絶食糖尿病ミニブタに２．０ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）投与されたＮ−グリコシル化インスリン類似体２１０−２−Ｂが血液グルコースレベルに経時的に効果を及ぼすことを示しており、該効果は、絶食糖尿病ミニブタに０．９ｎｍｏｌ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに及ぼすＲＨＩの影響と同等である。
図５２Ｂは、絶食正常ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合の経時的な血液グルコースレベルに対するＮ−グリコシル化インスリン類似体２１０−２−Ｂ（Ｂ−２およびＢ２８のＡｓｎ残基に連結された少マンノース）の効果と組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の効果との比較を示す。この図は、２．０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与された２１０−２−Ｂが、０．９ｎｍｏｌ／ｋｇで投与されたＲＨＩにより引き起こされる血液グルコースレベルの変化より小さい変化を引き起こすことを示している。この図はまた、２１０−２−Ｂに関して観察されるグルコースレベルの変化が、重篤な低血糖を引き起こす可能性がより小さいことを示している。
図５３Ａは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５２Ｂに示されているデータを示し、図５３Ｂは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５２Ａに示されているデータを示す。これらの図は、２１０−２−Ｂがグルコース応答様態で血液グルコースレベルに影響を及ぼすことを示している。図５３Ｂはまた、２１０−２−Ｂが絶食糖尿病ミニブタにおいて血液グルコースレベルを制御していることを示している。
図５４Ａは、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに経時的に効果を及ぼすＮ−グリコシル化インスリン類似体２００−２−Ｂの投与を示し、該効果は、絶食糖尿病ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合に血液グルコースレベルに及ぼすＲＨＩの効果と同等である。この図は、血液グルコース低下効果において、５ｎｍｏｌ／ｋｇの２００−２−Ｂが０．９ｎｍｏｌ／ｋｇのＲＨＩと同等であることを示している。
図５４Ｂは、絶食正常ミニブタに皮下（ｓ．ｃ．）投与された場合の経時的な血液グルコースレベルに対するＮ−グリコシル化インスリン類似体２００−２−Ｂ（Ｂ−２およびＢ２８のＡｓｎ残基に連結されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）の効果と組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の効果との比較を示す。この図は、５．０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与された２００−２−Ｂが、０．９ｎｍｏｌ／ｋｇで投与されたＲＨＩにより引き起こされる血液グルコースレベルの変化より小さい変化を引き起こすことを示している。この図はまた、２００−２−Ｂに関して観察されるグルコースレベルの変化が、重篤な低血糖を引き起こす可能性がより小さいことを示している。
図５５Ａは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５４Ｂに示されているデータを示し、図５５Ｂは、ベースラインからの血液グルコースの変化として再プロットされた、図５４Ａに示されているデータを示す。これらの図は、２００−２−Ｂがグルコース応答様態で血液グルコースレベルに影響を及ぼすことを示しており、図５３Ｂは、２００−２−Ｂが絶食糖尿病ミニブタにおいて血液グルコースレベルを制御していることを示している。
実施例１６
この実施例は酵母クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）における２つのインスリン類似体前駆体の発現を示す。第１のインスリン類似体は、配列ＥＥＡＥＡＥＡＥＰＫＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮ ＊ ＫＴＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３０５）（ここで、コンセンサスＮ−グリカンモチーフを得るためにＢ２８位のＰｒｏ残基はＡｓｎで置換されており、Ｂ２８位のＡｓｎ残基Ｎ＊はマンノシル化Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している）を有する一本鎖前駆体である。第２のインスリン類似体前駆体は、配列ＥＥＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＥＰＫＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＮＫＡＡＫＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３０４）（ここで、Ｂ２８位のＰｒｏ残基はＡｓｎで置換されているが、Ｂ３０ Ｔｈｒ残基の除去ゆえにＮ−グリカンを欠いている）を有する一本鎖前駆体である。
図５６Ａは、組換えタンパク質発現のために誘導されたクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からの分泌インスリン類似体前駆体を検出するウエスタンブロットのイメージを示す。この株においては、Ｂ２８位にＮ−グリカンを有する分泌インスリン類似体前駆体（配列番号１５４）をコードするＤＮＡがＫｌＬＡＣ４プロモーターの後にクローニングされており、生じたプラスミドがＯＣＨ１欠損株Ｋ３４内にエレクトロポレーションにより形質転換される（米国特許第７，４４９，３０８号を参照されたい）。３つのランダムな形質転換体を、ＢＭＧａｌＹ（３％）を含有する培地内でインスリン類似体前駆体発現のために誘導し、無細胞上清を遠心分離により得た。ついで、標準的な反応条件に従い、Ｎ−グリカンを除去するために、該無細胞上清のアリコートをＰＮＧアーゼと共にインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に適用した。タンパク質を膜に移し、標準的なウエスタン技術により抗インスリン抗体でプローブした。そのような処理の結果を図５６Ａに示す。この図においては、ＰＮＧアーゼの非存在下（「−」で示されている）のランダム発現クローンの全３個の上清のウエスタンブロットは、ＰＮＧアーゼで処理された同じ上清の場合（「＋」で示されている隣接レーン）より高い分子量を有する交差反応性バンドを示している。該データは、クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）において発現された配列番号１５４のインスリン類似体前駆体バンドが、酵素ＰＮＧアーゼで脱グリコシル化されうるＮ−結合グリカンを含有することを示している。
分子量の変化が、該インスリン類似体前駆体のＮ−グリコシル化によるものであり、Ｂ２８におけるＡｓｎでの置換によるものではないことを更に実証するために、第２のインスリン類似体前駆体遺伝子をクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）発現ベクター内にクローニングし、得られた株をタンパク質発現のために誘導した。図５６Ｂは、組換えタンパク質発現のために誘導されたクライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）からの分泌インスリン類似体前駆体を検出するウエスタンブロットのイメージを示す。この株においては、Ｂ：Ｐ２８Ｎ置換を有するが、Ｂ３０にＴｈｒを欠いており、したがってＮ−グリカンを欠いている分泌インスリン類似体前駆体（配列番号３０４）をコードするＤＮＡがＫｌＬＡＣ４プロモーターの後にクローニングされており、生じたプラスミドがＯＣＨ１欠損株Ｋ３４内にエレクトロポレーションにより形質転換される。３つのランダムな形質転換体を、ＢＭＧａｌＹ（３％）を含有する培地内でインスリン類似体前駆体発現のために誘導し、無細胞上清を遠心分離により得た。ついで、標準的な反応条件に従い、Ｎ−グリカンを除去するために、該無細胞上清のアリコートをＰＮＧアーゼと共にインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に適用した。タンパク質を膜に移し、標準的なウエスタン技術により抗インスリン抗体でプローブした。そのような処理の結果を図５６Ｂに示す。この図においては、ＰＮＧアーゼの非存在下（「−」で示されている）のランダム発現クローンの全３個の上清のウエスタンブロットは、ＰＮＧアーゼで処理された同じ上清の場合（「＋」で示されている隣接レーン）と同じ分子量を有する交差反応性バンドを示している。Ｂ３０位のＴｈｒ残基の欠如によりＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、Ｘ≠Ｐｒｏ）のＮ−グリカントリペプチドモチーフが除去され、酵素ＰＮＧアーゼでの処理により分子量が変化しなかったため、クライベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）において発現された配列番号３０４のインスリン類似体前駆体バンドはＮ−結合グリカンを含有していないことを、該データは示している。
実施例１７
この実施例は、グルコース応答特性を示す一本鎖Ｎ−グリコシル化インスリン類似体を示す。該インスリン類似体はＧＳＣＩ−７と称され、２つのＮ−グリカンを含有する１２アミノ酸のＣペプチドにより連結された天然インスリンＢ鎖およびＡ鎖を含む一本鎖インスリン類似体であり、アミノ酸配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴＧＹＧＮ ＊ ＳＳＲＲＡＮ ＊ ＱＴＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３０３）［ここで、３４位および４０位（Ｃ４およびＣ１０）のＡｓｎ残基Ｎ＊はそれぞれ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンにβ１結合で共有結合している］を有する（図５７Ａに示されているとおり）。
該インスリン類似体ＧＳＣＩ−７は、ＧＳＣＩ−７タンパク質配列をコードするＤＮＡ発現カセットを含有するプラスミドを、図４９Ｂに既に記載されているＹＧＬＹ２４９６４と同じ遺伝子型および遺伝的修飾を有する宿主株ＹＧＬＹ２４９６２内に形質転換することにより作製された。得られた株を発酵し、精製して、２つのＮ−グリカンを含有する一本鎖インスリン類似体ＧＳＣＩ−７を得た。活性のアッセイの前に一本鎖特性を保持させるために、該類似体ＧＳＣＩ−７をＬｙｓＣ、トリプシンまたは別のエンドプロテイナーゼにより処理することはしなかった。
ＧＳＣＩ−７の活性を評価するために、３つのインビトロアッセイを行った。ヒトインスリン受容体アイソフォームＢ（ＩＲ−ｂ）への結合を、ＩＲ−ｂを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対する、放射能標識ヒトインスリンとの該類似体の競合において決定し、ＩＣ５０値として示した。ＩＲ−ｂを過剰発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＩＲ−ｂのリン酸化を評価することにより、ＩＲ−ｂの機能的活性化を決定し、ＥＣ５０値として示した。ヒトマンノース受容体Ｃ型１（ＭＲＣ１）への結合を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＭＲＣ１のエクトドメインに対する、ユウロピウム標識マンノース−ＢＳＡとの該類似体の競合において決定し、ＩＣ５０値として示した。組換えヒトインスリン（ＲＨＩ）の結合と比較された、該類似体のＩＲ−ｂ結合、ＩＲ−ｂリン酸化およびＭＲＣ１結合のインビトロ特性を、表８に示す。
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 ＧＳＣＩ−７のグルコース応答性を調べるために、２頭の非糖尿病ユカタン（Ｙｕｃａｔａｎ）ミニブタを一晩絶食させた後、０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇ ＧＳＣＩ−７の静脈内注射を行った。同時に、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（２．６７ｍｌ／ｋｇ／時間）または無菌α−メチルマンノース溶液（αＭＭ）（２．６７ｍｌ／ｋｇ／時間の速度でのリン酸緩衝食塩水中の２１．２％ ｗ／ｖ）の静脈内投与を動物に行った。高濃度では、α−メチルマンノース（αＭＭ）はｃ型レクチンと糖タンパク質（特に、マンノース、ＧｌｃＮＡｃまたはフコース残基を末端に有するもの）との間の相互作用を競合的に抑制することが知られている。手持ちサイズのグルコメーターを使用して、注射後−６０、０、１、２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４５、６０および９０分の時点で血液グルコースを測定した。
図５７Ｂに示されているとおり、末端マンノース含有Ｎ−グリカンを含有するＧＳＣＩ−７の０．６９ｎｍｏｌ／ｋｇでの投与は、ＰＢＳと共に注射された場合、９０分間の研究時間中に、血液グルコースを明らかには低下させなかった。しかし、α−メチルマンノースを同じ容量のＧＳＣＩ−７と共に注射したところ、より良好またはより大きな効力でグルコースが低下した。グルコースは、α−メチルマンノースよりは低い効力でではあるが、マンノース結合性ｃ型レクチンと糖タンパク質との間の相互作用を抑制することが知られている。これらのデータは、一本鎖類似体ＧＳＣＩ−７がグルコース応答様態で血液グルコースレベルを低下させうることを示しており、これはマンノース受容体のようなマンノース結合性レクチンにより引き起こされると考えられる。
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本発明は、例示されている実施形態に関して本明細書中で説明されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当業者および本明細書における教示の読者は、その範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (29)

  1. アミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３３）を含むＡ鎖ペプチドおよびアミノ酸配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１６１）を含むＢ鎖ペプチドを有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物であって、
    該Ａ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つがＮ−グリカンに共有結合しており、
    該インスリンまたはインスリン類似体が１７個までのアミノ酸置換を更に含んでいてもよく、ならびに／または該Ａ鎖ペプチドもしくはＢ鎖ペプチドのＮ末端に、該Ａ鎖ペプチドもしくはＢ鎖ペプチドのＣ末端に、Ｎ末端において該Ｂ鎖ペプチドのＣ末端に、およびＣ末端において該Ａ鎖ペプチドのＮ末端に、あるいはそれらの組合せで共有結合している３〜３５アミノ酸のポリペプチドを更に含んでいてもよい、組成物。
  2. 該Ｎ−グリカンがＡｓｎ残基のアミド基にβ１結合で共有結合している、請求項１記載の組成物。
  3. 該Ａｓｎ残基が天然Ａ鎖ペプチドのアミノ酸１０もしくは２１位または天然Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸３、２５または２８位に存在し、ただし、該Ａｓｎが該Ｂ鎖の３位に存在する場合には、該Ｂ鎖ペプチドの５位のアミノ酸はＳｅｒまたはＴｈｒであり、該ＡｓｎがＡ鎖の２１位に存在する場合には、該Ａ鎖ペプチドは該ＡｓｎのＣ末端にアミノ酸配列Ｘａａ−ＳｅｒまたはＸａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）のジペプチドを更に含む、請求項２記載の組成物。
  4. アミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘａａ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（ここで、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）を有するトリペプチドが該Ａ鎖のＮ末端または該Ｂ鎖のＮ末端もしくはＣ末端にペプチド結合で共有結合している、請求項１記載の組成物。
  5. 該Ｎ−グリカンがヒスチジン、システインまたはリシン残基において該インスリンまたはインスリン類似体に結合している、請求項１記載の組成物。
  6. 該インスリンまたはインスリン類似体がヘテロ二量体または一本鎖である、請求項１記載の組成物。
  7. 該Ｂ鎖ペプチドが３０位のトレオニン残基を欠いている、請求項１記載の組成物。
  8. 該Ｎ−グリカンが少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）、高マンノース、ハイブリッドまたは複合グリカンである、請求項１記載の組成物。
  9. 該Ｎ−グリカンが、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリカン構造またはフコシル化Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；またはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造；フコシル化または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；またはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造；あるいはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造からなる群から選択される構造を有するフコシル化または非フコシル化グリカンからなる、請求項１記載の組成物。
  10. 該インスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が該Ｎ−グリカンを含む、請求項１記載の組成物。
  11. （ａ）複数のグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体、および（ｂ）医薬上許容される担体を含む医薬組成物であって、（ａ）における各グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体が少なくとも１つのＮ−グリカンを有し、ここで、主要Ｎ−グリカンが、高マンノース、ハイブリッド、複合または少マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）Ｎ−グリカンからなる、医薬製剤。
  12. 該Ｎ−グリカンが、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン構造またはフコシル化Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン構造；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２またはＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２構造；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；またはＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造；フコシル化または非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；またはＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造；あるいはＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２；ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２；およびＮＡＮＡ（１−４）Ｇａｌ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造からなる群から選択される構造を有するフコシル化または非フコシル化グリカンからなる、請求項１１記載の医薬製剤。
  13. 該インスリンまたはインスリン類似体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がＮ−グリコシル化されている、請求項１１記載の医薬製剤。
  14. インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合させて、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、溶液中のインスリンまたはインスリン類似体を安定化させ、あるいは溶液中のインスリンまたはインスリン類似体の原線維化を低減するための方法であって、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体が、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体より、溶液中で安定であり、または低減した原線維化を有する、方法。
  15. 該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させる、請求項１４記載の方法。
  16. （ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、
    （ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
    （ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、
    （ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させる、請求項１４記載の方法。
  17. インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性を変化させるための方法であって、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的特性が、該Ｎ−グリカンに結合していないインスリンまたはインスリン類似体と比較して変化している、方法。
  18. 該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させる、請求項１７記載の方法。
  19. （ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、
    （ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
    （ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、
    （ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させる、請求項１７記載の方法。
  20. インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基に、末端ガラクトース残基を含むＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、肝臓内の受容体を主に標的化するインスリンまたはインスリン類似体の製造方法であって、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体が肝臓内の受容体を主に標的化する、製造方法。
  21. 該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させる、請求項２０記載の製造方法。
  22. （ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、
    （ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
    （ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、
    （ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させる、請求項２０記載の製造方法。
  23. インスリンまたはインスリン類似体のアミノ酸残基にＮ−グリカンを結合させて、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることを含む、糖尿病の治療に使用された場合にグルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有するインスリンまたはインスリン類似体の製造方法であって、該Ｎ−グリカンに結合したグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体が、グルコースの血清濃度に感受性である少なくとも１つの薬物動態学的または薬力学的特性を有する、製造方法。
  24. 該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビトロで結合させる、請求項２３記載の製造方法。
  25. （ａ）糖タンパク質を産生しうる宿主細胞を準備し、
    （ｂ）Ｎ−結合グリコシル化部位を含むインスリンまたはインスリン類似体をコードする核酸分子を該宿主細胞内に導入し、
    （ｃ）グリコシル化プロインスリンもしくはプロインスリン類似体前駆体または該グリコシル化インスリン類似体を産生する条件下および培地内で該宿主細胞を培養し、
    （ｄ）該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体を該培地から回収し、該グリコシル化プロインスリンまたはプロインスリン類似体前駆体をインビトロで加工して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得、あるいはグリコシル化インスリン類似体を該培地から回収して、該グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体を得ることにより、該Ｎ−グリカンを該アミノ酸残基にインビボで結合させる、請求項２３記載の製造方法。
  26. １以上のＮ−グリカンを有するインスリンまたはインスリン類似体と医薬上許容される担体とを含む組成物であって、そのような１以上のＮ−グリカンが、そのような１以上のＮ−グリカンを有するインスリンまたはインスリン類似体の薬物動態学的または薬力学的特性の少なくとも１つを、糖尿病の治療に使用された場合にグルコースの血清濃度に対して感受性にする、組成物。
  27. 糖尿病の治療のための、請求項１〜１０または２６のいずれか１項記載の組成物。
  28. アミノ酸配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３３）を含むＡ鎖ペプチドおよびアミノ酸配列ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦ（配列番号１６１）を含むＢ鎖ペプチド（および糖尿病治療用の医薬上許容される担体）を有するグリコシル化インスリンまたはインスリン類似体であって、
    該Ａ鎖ペプチドまたはＢ鎖ペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも１つがＮ−グリカンに共有結合しており、
    該インスリンまたはインスリン類似体が１７個までのアミノ酸置換を更に含んでいてもよく、ならびに／またはＮ末端、Ｃ末端、あるいはＮ末端において該Ｂ鎖のＣ末端に、およびＣ末端において該Ａ鎖ペプチドのＮ末端に共有結合している３〜３５アミノ酸のポリペプチドを更に含んでいてもよい、グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体。
  29. 糖尿病の治療のための製剤または組成物の製造のための、本明細書に開示されているＮ−グリコシル化インスリンまたはインスリン類似体の使用。
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