JPH0928235A

JPH0928235A - 骨減少症モデルトランスジェニック動物

Info

Publication number: JPH0928235A
Application number: JP7201798A
Authority: JP
Inventors: Norihiro Tada; 昇弘多田; Masahiro Sato; 正宏佐藤; Toru Ikeda; 通池田; Katsuiku Hirokawa; 勝▲いく▼ 広川
Original assignee: Hoechst Japan Ltd
Current assignee: Sanofi Aventis KK
Priority date: 1995-07-17
Filing date: 1995-07-17
Publication date: 1997-02-04
Also published as: WO1997003555A1

Abstract

(57)【要約】【構成】サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ
配列及びニワトリベーターアクチンプロモーターのＤＮ
Ａ配列の下流に、オステオポンチン遺伝子をコードする
ＤＮＡ配列を含む外来性遺伝子が組み込まれたことによ
り、オステオポンチンが骨中で過剰に発現され骨芽細胞
及び破骨細胞の活性が低下して骨量の減少を生じた骨減
少症モデルトランスジェニック動物。【効果】上記トランスジェニック動物は、骨芽細胞の
活性化及び破骨細胞の分化誘導、活性をさらに抑制させ
る能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、一般的に代謝性骨疾患
の治療に関連した薬、特に破骨細胞の活性を抑えるよう
な薬の開発に有効な骨減少症モデルトランスジェニック
動物に関する。更に詳しくは、サイトメガロウイルスエ
ンハンサー／ニワトリベーターアクチンプロモーター領
域及びオステオポンチンをコードする外来性遺伝子が組
み込まれた骨減少症モデルトランスジェニック動物に関
する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】骨粗
鬆症は、骨密度が低下する骨疾患で、疼痛および骨折の
頻度を上昇させることにより、日常生活の質的低下をも
たらす。現在、特に高齢化社会の到来に伴い、老人性骨
粗鬆症が増加傾向になっている。

【０００３】近年、骨の細胞生物学的及び分子生物学的
研究が活発に展開されつつあり、近い将来に骨粗鬆症の
病態解明が期待されている。また、研究の進展に伴って
骨粗鬆症の治療薬あるいは診断薬の研究開発も活発に行
われている。これらの薬物の生理学的及び薬効薬理学的
効果を調べるためには、ヒト骨粗鬆症に類似した病態を
示す適切なモデル動物の開発が非常に重要である。現
在、この目的で繁用されているモデル動物は、外科的に
作成した卵巣摘出雌ラットがあるにすぎない。しかし、
このモデル動物を用いた解析だけでは、種々の病態及び
要因を包括している骨粗鬆症に対する薬物の効果を調べ
るには不十分である。即ち、薬物の効果を正しく調べる
ためには、複数のタイプの異なるモデル動物を使い分け
ることが望ましい。

【０００４】骨粗鬆症の成因に大きく関与する骨の再形
成（リモデリング）は、破骨細胞による骨の吸収と、そ
れに引き続く骨芽細胞による骨の形成の２つの相に大き
く分けることができる。この２つの異なる細胞系列間の
機能的共役関係は、両者の間の緊密な細胞間応答機構に
より保たれているものと考えられる。

【０００５】最近の発生工学の発展により、人為的に外
来性遺伝子を組み込んだトランスジェニック動物（Tran
sgenic animals）の作成が可能になった（Gordon J and
Ruddle F, Science, 214, 1244〜1246, 1981）。卵へ
の外来性遺伝子の導入方法には、外来性遺伝子を微小ピ
ペットに吸入し、これを１細胞期卵の前核内へ注入する
顕微注入法 (Gordon et al., 1980) 、あるいはウイル
スを介して感染させる方法があり、外来性遺伝子を組み
込んだ卵は形質転換卵とよばれる（Gordon J et al., P
roc Natl Acad Sci USA 77, 7380〜7384, 1980 ; Jaeni
sch R et al.,Cell 32, 209〜216, 1983）。この形質転
換卵を、偽妊娠させた仮親（里親）の生殖器道（卵管ま
たは子宮）に移植することにより、成長させることがで
きる。得られた成体のトランスジェニック動物は、外来
性遺伝子を自らの染色体に組み込んでおり、且つ適切な
プロモーターの影響下、外来性遺伝子を発現することが
できる。こうして取り込まれた外来性遺伝子は、トラン
スジーン（Transgene）と呼ばれている。種々のプロモ
ーター領域を選択しトランスジーンと組み合わせること
により、受精卵から成体に至る各ステージに特異的なト
ランスジーンを発現させることができる。その発現の結
果、トランスジーンによりコードされる蛋白質がトラン
スジェニック動物内で生産される。特にその蛋白質が動
物にとって重要な機能を果たす場合は、その個体の発生
のある時点で、個体の表現型に何らかの変化を引き起こ
すこともあり得、ヒトのある遺伝病に類似した形質を引
き起こすことも可能である。また、トランスジェニック
動物が、トランスジーンを自らの染色体に取り込んでい
るかどうかは、ＰＣＲ法やサザンブロット法等の解析に
より確かめられる。もし、この取り込みが確認された
ら、この動物は、in vivoにおける遺伝子発現解析、例
えば、ノーザンブロット法や免疫抗体法等による解析に
利用される。

【０００６】遺伝子の発現を制御するのは、目的蛋白質
をコードする遺伝子の上流に置かれているプロモーター
及びエンハンサーとよばれる遺伝子の特定の領域であ
る。プロモーターは、ＤＮＡを鋳型にｍＲＮＡ合成（転
写）を開始するＤＮＡ上のシグナルで、特徴的な塩基配
列を持っており、ＲＮＡポリメラーゼの作用により目的
蛋白のｍＲＮＡ合成が開始される。このプロモーター領
域のさらに上流に、エンハンサーと呼ばれるＤＮＡの転
写効率を増強させる働きを持つ特殊なＤＮＡ塩基配列を
組み込んでおくと目的蛋白の生産効率をより高めること
ができる。

【０００７】個体がトランスジーンで形質転換されたと
いう報告、あるいはその結果、個体の表現型が変わった
という報告はこれまでにいくつかなされており、特に P
almiter R.D. and Brinster R.L. (Annu. Rev. Genet.,
vol.20, p.465〜499: 1986)や Gordon J.W. (In. Rev.
of Cytobiol., vol.115, p.171〜229: 1989) 等の総説
に詳しく述べられている。これらのトランスジェニック
動物は、１）発生過程での遺伝子発現の個体レベル（in
vivo）での解析、２）遺伝病の克服または軽減に向け
た研究等の分野でも利用され得る。

【０００８】これまで、骨疾患の分野では、異常コラー
ゲン遺伝子を過剰発現させたトランスジェニック動物が
知られている。骨基質の有機成分は、Ｉ型のコラーゲン
を主体（約９０％）とし、様々の非コラーゲン性蛋白質
が残りの約１０％を構成している。このコラーゲンに関
して、異常Ｉ型コラーゲン遺伝子の過剰発現によるドミ
ナントネガテイブノックアウト (dominant negative kn
ockout) により骨形成不全症様の病態を示すトランスジ
ェニックマウスが作製された (Stacey A. et al., Natu
re, vol. 332, p.131〜136, 1988; Pereira R. et al.,
J. Clin. Invest., vol. 91, p.709〜716, 1993)。更
に、異常II型やＸ型コラーゲン遺伝子を導入されたトラ
ンスジェニックマウスでも骨の石灰化の遅延を伴う軟骨
形成障害が認められている (Vandenberg P. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p.7640〜7644, 19
91; Jaceno O. et al., Nature, vol.365, p.56〜61, 1
993)。これらのトランスジェニックマウスに見られる病
態の原因として、例えば、II型コラーゲンを形成する３
本の鎖のうち１本でも短い異常なコラーゲンが含まれる
と、コラーゲン線維の安定性が低下し、軟骨の組織形成
が阻害されることによる等が考えられている。また、こ
れらの病態は、ヒトの脊椎骨幹端部の形成障害 (spondy
lometaphyseal dysplasia)や骨端軟骨異形成症 (metaph
yseal chondrodysplasia) に極めて類似していることが
知られている。しかし、残念ながらこれらトランスジェ
ニックマウスは、出生直後に死亡するか、あるいは生殖
能が欠けているため、疾患モデルとして系統を確立し、
充分な病態解析を行うことは不可能であった。従って、
さらに骨疾患モデルとして適切な系統化ができるトラン
スジェニック動物の作出が強く望まれている。

【０００９】骨中には、非コラーゲン性タンパク質は約
２００種類存在していることが知られている（Delmas
P.D. et al., Calcif. Tissue Int., vol.36, p.308〜3
16, 1984)。特に骨中で含量が多いのは、オステオカル
シン、オステオネクチン及びオステオポンチンであり
(Termine J.D. et al., J. Biol. Chem., vol.256, p.1
0403〜10408, 1981)、主に骨芽細胞から分泌される。

【００１０】骨非コラーゲン性タンパク質のうちオステ
オポンチンは骨特有のシアロ蛋白質（bone sialoprotei
n, BSP）として、1986年 Oldbergら（Oldberg A. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.83, p.8819〜88
23，1986）により、そのｃＤＮＡがクローニングされ
た。そのｃＤＮＡの塩基配列から推定されたこのＢＳＰ
のアミノ酸配列の中には、細胞接着配列であるＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列が見つけられた。このＲ
ＧＤ配列により骨基質中のミネラルと細胞との橋渡しに
関与するという意味で上記シアロ蛋白質はオステオポン
チンと命名された。

【００１１】オステオポンチンは、細胞接着、伸展活性
のあることから注目されているタンパク質である。Denh
ardtらは、マウス JB6 epidermal cell line C 122 を
発ガンプロモーターであるTPA（12-0 tetradecanoylpho
rbol−13−acetate）で処理することにより誘導された
１.６ＫｂのｍＲＮＡのｃＤＮＡをクローニングし、２
ａｒと命名した (Smith J.H. et al., J. Cell Bioche
m., vol.34, p.13〜22,1987) が、このｃＤＮＡの塩基
配列を調べた結果、Oldbergらのオステオポンチンと同
じものであることが分かった。Butlerらもラットの骨か
ら４４ｋＤのリンタンパク質を分離し、その生化学的性
質を詳しく調べた結果、オステオポンチンと同じタンパ
ク質であることが分かった (Prince C.W. et al., J.
Biol. Chem., vol.262, p.2900〜2907, 1987 )。従っ
て、オステオポンチンは骨特有のシアロ蛋白質Ｉ（bone
sialoprotein Ｉ）、４４ｋＤリン蛋白質（phosphopro
tein）及び２ａｒと呼ばれているものと同じ蛋白質であ
る。

【００１２】オステオポンチンは、免疫組織化学的手法
により、骨中では、骨前駆細胞（osteoprogenitor cel
l）、骨芽細胞及び骨細胞（Mark M.P. et al., J. Hist
ochem. Cytochem., vol.35, p.707〜715, 1987）に、ま
た、骨組織以外では、腎臓、ニューロン、内耳の感覚及
び分泌細胞など（Mark M.P. et al., Cell Tissues Re
s., vol.251, p.23〜30, 1988）にも存在することが報
告されている。更に、ノーザンブロット（Northern blo
t）法やin situハイブリダイゼーション（ in situ hyb
ridization）法により、骨組織以外に腎臓、胎盤（Yoon
K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol.14
8, p.1129〜1136, 1987; Nomura S. et al., J. Cell B
iol., vol.106, p.441〜450, 1988）及び動脈硬化を起
こしている血管近傍の平滑筋 (Ikeda T. et al., J. Cl
in. Invest., vol. 92, p.2814〜2820, 1993）で発現の
あることが報告されている。

【００１３】骨及び歯の発生過程におけるオステオポン
チンの発現についてはMarkらが報告している (Mark M.
P. et al., Differentiation，vol.37, p.123〜136, 19
88)。即ち、軟骨性化骨の場所では軟骨ー骨移行部の軟
骨細胞のみが、また、骨発生においてはアルカリホスフ
ァターゼの出現と殆ど同時に、骨形成細胞で発現を認め
ている。歯の発生過程においては、オステオポンチンは
石灰化の始まる前の象牙芽細胞（odontoblast）で合成
され、歯芽（predentin）に分泌される。

【００１４】しかしながら、以上のような組織化学的な
成果にもかかわらず、オステオポンチンの生理学的機能
は、今だ全ては明らかになってはいない。だが、いくつ
かのオステオポンチンの生理機能を示唆している報告が
ある。

【００１５】即ち、骨代謝においては、オステオポンチ
ン中に細胞接着配列があることから細胞同志を接着さ
せ、伸展させる活性のあることが確認されており（Some
rman M.J. et al., Matrix, vol.9, p.49〜54, 198
9）、この細胞接着の機構を介して骨の細胞の代謝を調
節しているものと考えられてる。骨の細胞の分化過程に
おけるオステオポンチンの発現が、前骨芽細胞では少な
く、基質合成を活発に行う形成期骨芽細胞になると上昇
し、石灰化骨組織を形成する幼若骨細胞において最も盛
んになり、骨形成を終了した成熟骨芽細胞では発現が下
がることが明らかになっており、オステオポンチンが骨
の石灰化に重要な機能を有することも示唆されている
（Stein G.S. et al., FASEB J., vol.4, p.3111〜312
3, 1990)。また、オステオポンチンが腎尿細管にも発現
すること（Nomura S. et al., J. Cell Biol., vol.10
6, p.441〜450, 1988）、及び 1α, 25(OH)₂ vitamin D
₃、PTH 等によって調節されること (Noda M. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p.9995〜9999, 1
990; Noda M. et al., J. Cell Biol., vol.108, p.713
〜718, 1989) などから、これらの細胞による骨の電解
質交換においてオステオポンチンが何らかの機能をもつ
ことが推察される。さらに、オステオポンチンが破骨細
胞のアンカーとなり得る可能性も報告された (Reinholt
F.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., vol.87,
p.4473〜4475, 1990）ことを考慮すると、骨扁平細胞
（bone lining cells）や骨細胞によるオステオポンチ
ンの産生が骨のリモデリング、特に破骨細胞による骨吸
収において、破骨細胞の分化、誘導及び機能発現等に重
要な役割を持つことが示唆される。軟骨組織において
は、静止軟骨細胞、増殖軟骨細胞及び肥大軟骨細胞等に
オステオポンチンの発現が認められていないことから、
軟骨形成にオステオポンチンは関与していないことが考
えられる。しかし、石灰化軟骨のうち特に血管侵入部位
の近傍の細胞に顕著なオステオポンチンの発現が認めら
れていることから、この部位における軟骨組織のリモデ
リングにオステオポンチンが関与していることが示唆さ
れている。今後、オステオポンチンの骨組織における役
割を明確にするためには、さらに、骨リモデリングの際
の局在性の変化や細胞レベルにおける局在性を検討する
必要があると思われる。また、骨組織以外に悪性腫瘍の
転移や神経系組織の機能発現にある種の重要な役割を果
たしているとも考えられている。

【００１６】よって、本発明が解決しようとする課題
は、より有用な代謝性骨疾患モデルを提供するととも
に、オステオポンチンの骨組織における機能を明らかに
することである。より詳しくは、オステオポンチンを動
物の個体内で過剰発現させることにより、骨のリモデリ
ングに破綻を来した状態のトランスジェニック非ヒト脊
椎動物、好ましくは、トランスジェニックマウスを発生
工学的、遺伝子工学的手法を用いて作成することであ
る。

【００１７】

【課題を解決するための手段】オステオポンチンをコー
ドする遺伝子断片を非ヒト脊椎動物、好ましくは、マウ
スの１細胞期胚の前核に顕微注入し、次いでこの注入さ
れた胚を、偽妊娠メスに移植し、該マウスを飼育すると
トランスジェニック動物が産れる。このトランスジェニ
ック動物は、骨のリモデリングに関与するとされるオス
テオポンチンを過剰発現すると考えられる。注入された
遺伝子断片には、トランスジェニック動物内で非特異的
に様々なタイプの細胞でオステオポンチンを発現せしめ
るようなプロモーターが含まれている。このプロモータ
ーの制御下でオステオポンチンを骨芽細胞あるいは破骨
細胞で過剰発現させることにより、これらの細胞の活性
自体を変化せしめるとともに、結果として、骨のリモデ
リングに破綻を来すことが考えられる。このように、本
発明のトランスジェニック動物は、骨のリモデリングに
おけるオステオポンチンの役割を解明できるばかりでは
なく、骨疾患の有用なモデルになり得る。

【００１８】本発明は、サイトメガロウイルスエンハン
サーのＤＮＡ配列及びニワトリベーターアクチンプロモ
ーターのＤＮＡ配列の下流に、オステオポンチン遺伝子
をコードするＤＮＡ配列を含む外来性遺伝子が組み込ま
れた骨減少症モデルトランスジェニック動物に関する。
本発明の重要な点は、オステオポンチンを強力なプロモ
ーターの制御下、骨組織を含むどのタイプの組織でも過
剰発現させることができることである。即ち、オステオ
ポンチンの生体内での機能は、骨組織以外にも広範囲に
わたっており、これらの組織における作用機序はほとん
ど不明である。従って、骨組織に止まらず、広く各組織
へのオステオポンチンの作用を解明できる可能性があ
る。そのために限定なく全ての体細胞において転写を開
始させるニワトリベータアクチンプロモーターおよび転
写効率を強力に増強する働きを有するサイトメガロウイ
ルスエンハンサーが組み換え遺伝子に組み込まれた。

【００１９】本発明は、オステオポンチン遺伝子がマウ
ス由来であることを特徴とする骨減少症モデルトランス
ジェニック動物に関する。本発明は、非ヒト脊椎動物が
マウスであることを特徴とする骨減少症モデルトランス
ジェニック動物に関する。

【００２０】さらに、本発明は骨組織において海綿骨梁
及び皮質骨の減少、骨端軟骨板直下の軟骨細胞柱の不規
則な配列を呈することを特徴とする骨減少症モデルトラ
ンスジェニック動物に関する。本トランスジェニック動
物は、オステオポンチンの過剰発現により骨減少症様病
態を示すことが明らかになっており、従って本発明は骨
のリモデリングの破綻の機序等を in vivo で研究する
ための有用な系を提供するものである。さらに骨疾患の
治療薬の探索にも利用できるものである。例えば、検定
されるべき薬剤は、対照動物、即ち本発明のトランスジ
ェニックマウスでない動物群（非トランスジェニックマ
ウス等）及び本発明のトランスジェニックマウスに同時
に投与される。この薬剤は、トランスジェニックマウス
の病態が改善され得るに充分な期間を越えて連続的に投
与されるであろう。この充分な期間を経て薬剤を投与さ
れた後、トランスジェニックマウス及び対照の非トラン
スジェニックマウスは、骨組織の解析に供されることと
なる。そして、上記パラメーターを比較することによ
り、薬剤の効能についてひとつの決定を下すことができ
る。

【００２１】即ち、本発明の目的は、オステオポンチン
を骨組織及び他の組織で強力に発現せしめるために必要
なＤＮＡ配列、所謂、組み換えＤＮＡを有するトランス
ジェニック動物を提供することである。さらに、本発明
の有用性としては、このトランスジェニック動物がオス
テオポンチンの in vivo における作用解明、骨減少症
の発症機序の解明及び骨疾患治療薬の in vivo スクリ
ーニングのために用いることができることである。

【００２２】本発明のトランスジェニック動物がオステ
オポンチンを大量に合成することによって、骨組織にお
ける海綿骨梁及び皮質骨の減少等を生ぜしめ、所謂、低
回転型の骨減少症を発症するため、この発症要因として
のオステオポンチンの骨組織における作用機序を解明す
ることができる。これらの作用機序を解明することによ
り、ヒト骨減少症との共通性を明らかにすることができ
る。

【００２３】本発明のトランスジェニック動物は通常の
動物と同様に飼育することができ、この系統を維持する
ための特別な飼育および餌は必要としない。

【００２４】

【実施例】次に、実施例を示して本発明をさらに具体的
に説明する。以下の実施例は、遺伝子断片、組換え遺伝
子構築体、トランスジェニックマウス等をどのように作
成するか等を完全に開示し、記載することを目的とした
ものであり、本発明はこの実施例によって限定されるも
のではない。

【００２５】実施例１プラスミドｐβＡ／ＯＰＮの構
築マウスで発現させるべき目的遺伝子は以下のように作成
した。はじめに、上記標的遺伝子を発現させるためのベ
クターを作成した。ニワトリベーターアクチンプロモー
ターとその上流にサイトメガロウイルスエンハンサーを
有する哺乳動物発現ベクター pCAGGS（Niwa H. et al.,
Gene, vol.108, p.193〜200, 1991）より２.３ｋｂ断
片をSal Ｉ／Pst Ｉ消化により切り出し、これをクロー
ニングベクター pBluescript（Stratagene社より購入）
の Sal Ｉ／PstＩ部位へ挿入し、pBsCAG−２ベクターを
構築した。サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワト
リベーターアクチンプロモーターは、哺乳動物の多種多
様な細胞において強い活性が認められており、現在、in
vivo における外来性遺伝子発現を強力に促進するプロ
モーター系として有用であることが判っている。この
２.３ｋｂ断片の中には、上記エンハンサー／プロモー
ターの他に、ウサギベーターグロビン遺伝子の一部（第
２イントロン、第３エクソン、３′側非翻訳領域から成
る）が含まれている。通常、ｃＤＮＡ等の発現させたい
目的遺伝子は、ウサギベーターグロビン遺伝子の第３エ
クソンのＥｃｏＲＩ部位に挿入されることによりその転
写効率が改善されることが知られている（Brinster R.
L. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, vol.85, P.83
6〜840）。この pBsCAG−２のＥｃｏＲＩ部位に目的遺
伝子であるマウスオステオポンチンのｃＤＮＡ断片を挿
入し、トランスジェニックマウス発現用プラスミドｐβ
Ａ／ＯＰＮ−１を構築した（図１）。マウス１細胞期胚
へのＤＮＡ導入には、これら組換え遺伝子構築体よりＳ
ａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化により遺伝子を単離し、これ
を用いた。

【００２６】また、この構築体には、ＤＮＡを消化した
り、繋げたり、ＤＮＡ断片を単離する等の操作が行われ
たが、このためには Maniatis T. et al (Molecular Cl
oning , A Laboratory Manual, 1982) の標準的ＤＮＡ
組み換え技術が用いられた。また、インサートの結合部
周辺のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシング法により
確認された。

【００２７】実施例２外来性遺伝子（βＡ−ＯＰＮ）
のマウス受精卵への注入及びその受精卵の移植および導
入されたトランスジーンの確認実験動物として受精卵採取用にＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄及び
Ｂ６Ｃ３Ｆ１雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ×Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅＮ）、ＤＮＡ注入後の受精卵移植用の受容雌（レシピ
エント）としてＩＣＲの雌マウスを用いた。また、移植
用レシピエントに偽妊娠誘起を施すため、精管を切断し
たＩＣＲの雄マウスとレシピエントを交配させた。ま
ず、過排卵誘起を施すため、Ｂ６Ｃ３Ｆ１雌マウスに妊
馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）及びヒト絨毛性
性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を４８時間間隔で各々５Ｉ
Ｕ腹腔内に投与後、直ちにＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスと
同居させた。翌日、Ｂ６Ｃ３Ｆ１雌マウスの腟に腟栓
（プラグ）が形成されているものを交配が成立したマウ
スと判断した。交配が確認されたマウスを屠殺し、卵管
から顆粒層細胞及び卵丘細胞に囲まれた受精卵（前核期
卵）を回収した。回収された受精卵は１％ヒアルロニダ
ーゼ（スプラーゼ、持田製薬）を含むＭ１６培養液（Wh
ittingham D．G.,J．Reprod.Fert.，Suppl．vol.14，p.
7〜21，1971）中に導入し、顆粒層細胞及び卵丘細胞を
除去した後、ＤＮＡを注入するまでＭ１６培養液中にて
３７℃、５％ＣＯ₂、９５％空気の気相下で培養され
た。培養は、３５mm径のサスペンジョンカルチャーデイ
ッシュ（suspension culture dish）（No．171099，Nun
c社）内に滴下した５０mlＭ１６培養液の微小滴中に受
精卵を浮遊させ、上部を流動パラフィン（white light
mineral oil，Fisher社より購入）で覆った状態で行わ
れた。

【００２８】外来性遺伝子は、上述の方法で調製したプ
ラスミドｐβＡ／ＯＰＮ−１を宿主大腸菌にて大量増幅
の後、抽出された。更に、プラスミドを精製するため
に、塩化セシウムによる超遠心、臭化エチジユウム（et
hidium bromide）の除去及び透析処理を行った。精製さ
れたプラスミドは、制限酵素 Sal Ｉ，Not Ｉ及び Sca
Ｉにより消化された後、０.８％アガロースゲル電気泳
動により、目的の外来性遺伝子（βＡ−ＯＰＮ，約３.
７ｋｂ）が単離された。外来性遺伝子は、注入操作直前
にリン酸緩衝液（pH ７.２）にて希釈したものを用い
た。この外来性遺伝子は、既報（Hogan B．et al.，In
Manipulating the Mouse Embryo.，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，1986）に準じて、受精卵に注入さ
れた。即ち、培養液中で受精卵を保持用ガラスピペット
で保持した後、微細な注入用ガラスピペットを用いてＤ
ＮＡ溶液を約２pl（２,０００コピー）ずつ受精卵の雄
性前核内に注入した。

【００２９】注入操作後、受精卵は、精管を切断された
成熟ＩＣＲ雄マウスと交配した偽妊娠１日目の成熟ＩＣ
Ｒ雌マウスの卵管内へ移植した。卵管移植後、分娩満期
まで飼育し、産仔を得た。分娩後、得られた産仔は、生
後４週齢で離乳させ、このマウスの尾部の先端部分約１
cmを麻酔下で切断するとともに耳にパンチングし、個体
識別した。尾部の組織よりＤＮＡを抽出、精製した後、
サザンブロット法によって導入した遺伝子断片がマウス
の染色体に組み込まれていることを確認した。即ち、制
限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで完全に消化させた１０
mgのＤＮＡを０.８％アガロースゲル電気泳動し、ナイ
ロンフィルター（GeneScreen Plus，NEN，U.S.A．）に
ＤＮＡを転写した。フィルターは、風乾後、ハイブリダ
イゼーションに供した。ハイブリダイゼーションは、常
法（Maniatis T．et al.，1982）に従ってＯＰＮ遺伝子
断片をプローブとし、導入遺伝子断片のマウス染色体へ
の組み込みを確認した。

【００３０】これらの結果を、下記の表１に示した。計
３回の実験で、２１７個の受精卵に遺伝子注入操作を行
い１７８個（８２％）の受精卵が操作後生存していた。
この生存卵すべてを７匹のレシピエントに移植した結
果、すべてのレシピエントが妊娠し、妊娠１９日目に帝
王切開術を実施することにより３４匹（１９％）の産仔
を摘出した。摘出された産仔は、蘇生後、予め準備して
おいた当日出産した里親（ＩＣＲ雌マウス）に保育させ
た。これらの産仔の内、１６匹（７.４％）において、
胎盤より抽出された染色体ＤＮＡに導入遺伝子が確認さ
れたが、この内１匹は里親に食殺されたため、その後の
解析はできなかった。

【００３１】

【表１】

【００３２】食殺されずに生存した１５匹のトランスジ
ェニックマウスは、すべて順調に発育し離乳した。これ
ら１５匹のトランスジェニックマウスより各々Ｆ１マウ
スを得、トランスジーンの伝達性を調べたところ、１匹
のトランスジェニックマウス（βＡＯＰＮ−３０５）を
除いて、すべてトランスジーンをＦ１マウスに伝達し
た。得られたトランスジェニックマウスの性状を、下記
の表２に示した。

【００３３】

【表２】

【００３４】各トランスジェニックマウスにおけるトラ
ンスジーンのコピー数は、ライン間で異なっており、コ
ピー数と発現の程度には関連性が認められなかった。こ
こでいうコピー数とはトランスジーン１分子を１コピー
単位とする。コピー数が複数あるものはトランスジーン
が２分子以上連続した形で連がった状態でホストの染色
体上に組み込まれている。得られたトランスジェニック
マウスのうち、骨での発現が強い４つのライン（βＡＯ
ＰＮ−２０２，−２０３，−６０１，−７０１）の尾部
組織にトランスジーンが存在することをサザンブロッテ
ィングにより確認した。トランスジェニックマウスにお
いては、トランスジーン由来ｍＲＮＡの証拠である約
１.４Ｋｂｐの位置にバンドが認められた。

【００３５】βＡＯＰＮ−２０２初代トランスジェニッ
クマウスは、外見上正常様であったが、突然死亡したた
め解析が不可能であった。しかし、Ｆ１マウスでは、生
後３週齢頃より発育遅延が観察され、それ以降、漸次そ
の傾向が顕著になった。これらのマウスは、すべてトラ
ンスジェニックであった。

【００３６】実施例３トランスジーン由来のｍＲＮＡ
発現トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現は、βＡＯＰＮ−ト
ランスジェニック１４ライン、すべてのＦ１マウスにお
いて、ノーザンブロット解析及びＲＴ−ＰＣＲ法により
確認した。トランスジェニックＦ１マウス及び同腹の非
トランスジェニックＦ１マウスの脳、肺、腎臓、脾臓、
小腸、骨格筋及び頭蓋冠より、全ＲＮＡを単離した。ノ
ーザンブロット解析には、２０mgの全ＲＮＡを１.１％
アガロース／１.１Ｍホルムアルデヒドゲル電気泳動
し、次いで、これをナイロン膜フィルターに移した。プ
レハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション
液〔５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ NaCl，１５m
M Na−citrate，pH７.４）、５０％ホルムアミド、５m
MＥＤＴＡ、５mg／mlの変性サケＤＮＡ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ試薬等を含む〕の中で、４２℃にて２時間行っ
た。次いで、ランダムにプライミングしたｃＤＮＡプロ
ーブ（オステオポンチン遺伝子断片）を熱変性させた
後、これをハイブリダイゼーション液に加え、ハイブリ
ダイゼーションを行った。反応は、４２℃にて１８時間
行い、洗浄は、０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、５６
℃、２０分間行った。フィルターは、−８０℃にて２４
〜７２時間暴露した（増感スクリーン＋コダックＸＡＲ
−５フィルム使用）。１４ラインのＦ１トランスジェニ
ックの上記の主要臓器について、ノーザンブロット解析
を実施したところ、比較的種々の臓器で高い発現を示す
ライン（βＡＯＰＮ−２０２，２０３，６０１，７０
１）及び低い発現を示すかあるいは、まったく発現して
いないライン（βＡＯＰＮ−３０３，３０４，３０７，
４０２，５０１，５０２，５０４，６０２，６０３，６
０４）に分別することができた。これらの高発現ライン
は、解析した臓器のうち腎臓、小腸、骨格筋及び頭蓋冠
において高い発現が認められた。そこで、これらトラン
スジェニックマウスの内、オステオポンチンｍＲＮＡの
発現レベルが高く、且つその子孫に表現型の変化が認め
られたラインを選択し、これらの選択されたライン（β
ＡＯＰＮ−２０２）について詳細な病態解析を行った。
なお、非トランスジェニックマウスは、トランスジーン
由来ｍＲＮＡの発現は全く認められなかった。

【００３７】実施例４トランスジェニックマウスの骨
組織における病理学的解析本解析は、トランスジェニックＦ１及びＦ２マウス（β
ＡＯＰＮ−２０２）について実施した。動物をペントバ
ルビタール酸ナトリウムにて深麻酔することにより屠殺
した後、上記の主要臓器に加えて、大腿骨及び腰椎を各
々摘出した。これらの組織を１０％ホルマリン緩衝液に
て固定した後、パラフィンに包埋し、約２mmの連続薄切
標本を作製した。なお、骨組織については、薄切標本を
作製する前に、１４％ＥＤＴＡに約１週間浸漬すること
により脱灰処置を施した。これらの標本について、ヘマ
トキシリンーエオシン染色を行うと共に、骨標本につい
ては、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を
常法に従って行った。染色後の標本は、光学顕微鏡下に
て異常の有無を観察した。

【００３８】トランスジェニックＦ２マウス（βＡＯＰ
Ｎ−２０２）の腰椎における病理組織像の写真を図２に
示す。βＡＯＰＮ−２０２の腰椎（図２Ａ）では、非ト
ランスジェニックマウスの腰椎（図２Ｂ）と比べ、軟骨
でできた成長板直下の石灰化軟骨及び一次海綿骨梁の形
成が乏しいことが観察された。また、βＡＯＰＮ−２０
２の大腿骨における病理学的所見も腰椎と同様であっ
た。更に、βＡＯＰＮ−２０２の大腿骨について、ＴＲ
ＡＰ染色を施したところ、非トランスジェニックマウス
と比べ、骨梁が乏しいこと以外に、赤く染まったＴＲＡ
Ｐ陽性細胞が少ないことが観察された。このことは、Ｔ
ＲＡＰ陽性細胞、即ち破骨細胞の活性が低下しているこ
とを示している。従って、この病態は、骨量の減少が骨
吸収の亢進によるものではなく、骨形成の不全によるも
のであることが考えられ、骨芽細胞自体の活性も低下し
ていることが示唆された。なお、骨組織以外の臓器の病
理像は、何ら異常を認めなかった。

【００３９】実施例５ in situ ハイブリダイゼーショ
ン法によるトランスジェニックマウスの骨組織における
オステオポンチンｍＲＮＡの検出トランスジェニックマウスの骨組織中で過剰発現したオ
ステオポンチンｍＲＮＡの発現状態を調べるため、in s
itu ハイブリダイゼーション法による検出を試みた。な
お、本解析には、トランスジェニックＦ１及びＦ２マウ
ス（βＡＯＰＮ−２０２）について実施した。

【００４０】生後２９週令のβＡＯＰＮ−２０２の大腿
骨を採取し、パラホルムアルデヒドから調製した４％リ
ン酸緩衝ホルマリンで一日浸漬し、固定した。なお、こ
れらのマウスは、浸漬固定前に上記の固定液にて予め環
流固定を行った。固定した大腿骨は、７０％、８０％、
９０％、９５％及び１００％のエタノール中で脱水、キ
シレン中で透徹後、非脱灰状態のままメタクリレート系
樹脂に包埋した。包埋した組織から、硬組織用ミクロト
ーム（Reichert−Jung社製）を用いて厚さ３μmの非脱
灰骨組織切片を作製した。

【００４１】マウスオステオポンチンのｃＤＮＡからＳ
Ｐ６及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、〔³⁵Ｓ〕Ｕ
ＴＰで標識したアンチセンスＲＮＡを合成してプローブ
として用いた。次いで、上記の非脱灰骨組織切片上で、
プローブを既報（Nomura S．et al.，J．Cell Biol.，v
ol．106，p．441〜450，1988）に従ってハイブリダイズ
させた。ハイブリダイゼーション後、コダックＮＴＢ−
３乳剤をコーテイングして４Ｃで２〜３週間露光した。
露光した標本は現像処理後、明視野及び暗視野顕微鏡で
銀粒子の出現を観察した。

【００４２】βＡＯＰＮ−２０２の大腿骨における in
situ ハイブリダイゼーションの結果の写真を図３に示
す。βＡＯＰＮ−２０２の骨でのオステオポンチンの発
現は、トランスジェニックマウスの方がかえって少な
く、（図３Ａ）骨髄を含めた軟組織での発現も非トラン
スジェニックマウスの方が多いことがわかった（図３
Ｂ）。骨組織の変化はβＡＯＰＮ−２０２において骨梁
の長さは十分にあるものの、数と太さが減少しているこ
とが観察された。これは、骨形成が阻害された場合に認
められる所見であると考えられる。これらのことからβ
ＡＯＰＮ−２０２では骨梁の減少に伴ってオステオポン
チンの発現が少なくなることが示唆された。

【００４３】トランスジェニックマウスの全身写真を図
４に示す。図４Ａは、βＡＯＰＮ−２０２Ｆ２マウス
（写真左端）及び非トランスジェニックマウス（写真右
端）の全身写真であり、図４Ｂはトランスジェニックマ
ウスの全身写真である。トランスジェニックマウスは、
非トランスジェニックマウスと比べ、小さく、体重は非
トランスジェニックマウスの約半分である。

【００４４】

【発明の効果】本発明のトランスジェニック動物は、オ
ステオポンチンの骨中での過剰発現により骨芽細胞及び
破骨細胞の活性を低下せしめた結果、骨量の減少を生じ
るものである。その病態は、ヒトにおける低回転型の骨
粗鬆症にきわめて類似しており、有用なモデルになり得
る。従って、本トランスジェニック動物は、骨芽細胞の
活性化及び破骨細胞の分化誘導、活性をさらに抑制させ
る能力に関する薬剤の効果検定に利用できる。例えば、
検定されるべき薬剤は、対照動物、即ち本発明のトラン
スジェニック動物でない動物群（非トランスジェニック
動物等）及び本発明のトランスジェニック動物に同時に
投与される。この薬剤は、本トランスジェニック動物の
病態が改善され得るに充分な期間を越えて連続的に投与
されるであろう。この充分な期間を経て薬剤を投与され
た後、トランスジェニック動物及び対照の非トランスジ
ェニック動物は、骨組織の解析に供されることとなる。
そして、上記パラメーターを比較することにより、薬剤
の効能についてひとつの決定を下すことができる。更
に、このような骨疾患を呈する動物を用いて、骨形成と
骨吸収との共役機構を解明することは、骨粗鬆症の発現
機序の解明のみならず、その根本的な治療法あるいは予
防法の確立の上でもきわめて重要である。

【図面の簡単な説明】

【図１】サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配
列及びニワトリベーターアクチンプロモーターのＤＮＡ
配列の下流に、オステオポンチン遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列さらにウサギベターグロビン遺伝子を有するプ
ラスミドｐβＡ／ＯＰＮ−１のプラスミドマップを表し
た図である。

【図２】トランスジェニックＦ２マウス（βＡＯＰＮ−
２０２）の腰椎（Ａ）および非トランスジェニックマウ
スの腰椎（Ｂ）における病理組織の顕微鏡写真である。

【図３】トランスジェニックマウス（βＡＯＰＮ−２０
２）の大腿骨（Ａ）および、非トランスジェニックマウ
スの大腿骨（Ｂ）におけるｉｎｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーションの顕微鏡写真である。

【図４】トランスジェニックマウス（βＡＯＰＮ−２０
２）および非トランスジェニックマウスの全身の形態写
真（Ａ）並びに上記トランスジェニックマウスの全身の
形態写真（Ｂ）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者広川勝▲いく▼ 東京都板橋区南町52番地の１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サイトメガロウイルスエンハンサーのＤ
ＮＡ配列及びニワトリベーターアクチンプロモーターの
ＤＮＡ配列の下流に、オステオポンチン遺伝子をコード
するＤＮＡ配列を含む外来性遺伝子が組み込まれた骨減
少症モデルトランスジェニック動物。
【請求項２】オステオポンチン遺伝子がマウス由来で
あることを特徴とする、請求項１に記載の骨減少症モデ
ルトランスジェニック動物。
【請求項３】非ヒト脊椎動物がマウスであることを特
徴とする、請求項１または２に記載の骨減少症モデルト
ランスジェニック動物。
【請求項４】骨組織において海綿骨梁及び皮質骨の減
少、骨端軟骨板直下の軟骨細胞柱の不規則な配列を呈す
ることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかの項
に記載の骨減少症モデルトランスジェニック動物。