MXPA05001331A - Metodo de expresion de gen en aves transgenicas utilizando un vector retroviral y aves transgenicas obtenidas de este modo. - Google Patents
Metodo de expresion de gen en aves transgenicas utilizando un vector retroviral y aves transgenicas obtenidas de este modo.Info
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Abstract
La presente invencion tiene por objetivo proporcionar una ave quimera transgenica G0 a la que se le transfiere un gen de anticuerpo usando un vector retroviral defectuoso en replicacion en replicacion, y produce un anticuerpo por la expresion del transgen; un metodo de produccion de un anticuerpo que comprende la recuperacion del anticuerpo expresado por el ave quimera transgenica G0 producida; y un metodo de produccion de un ave transgenica G0 que comprende la incubacion de un huevo fertil de ave, la inyeccion a los huevos fertilizados inmediatamente despues del inicio de la incubacion de un vector retroviral. Es decir, la presente invencion se refiere a un ave quimera transgenica G0 a la que se le transfiere un gen de anticuerpo usando un vector retroviral defectuoso en replicacion, y produce un anticuerpo por la expresion de un transgen.
Description
METODO DE EXPRESION DE GEN EN AVES TRANSGENICAS UTILIZANDO UN VECTOR RETROVIRAL Y AVES TRANSGENICAS OBTENIDAS DE ESTE MODO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un ave quimera transgénica GO que produce un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo scFv-Fc, en sangre y en huevos. Además, la invención se refiere a un método de producción de un anticuerpo, que comprende la producción de un ave quimera transgénica GO a la que se introdujo un gen exógeno de anticuerpo, con un vector retroviral defectuoso en replicación, y la recuperación de un anticuerpo producido en sangre, en albumen o en yema de huevo. Además, la presente invención también se refiere a un método de producción de un ave quimera transgénica GO que expresa eficientemente un transgen, y el ave quimera transgénica GO obtenible mediante dicho método de producción. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Como un medio de investigación para funciones de genes, las investigaciones sobre animales transgénicos incorporados con un gen exógeno en el hospedero han sido activamente conducidas . Estos animales transgénicos son útiles no solamente en investigación fundamental, sino también en aplicaciones industriales tales como mejoramiento de la producción, producción de sustancias, y donadores de
REF. : 161437 órganos de reemplazo. Un intento para provocar que la leche de vacas, cabras, ovejas, etc., produzca una sustancia biológicamente activa ha estado aproximándose al uso práctico. Como ejemplos típicos de los mismos, la al-antitripsina y la antitrombina están ahora en etapa clínica con miras a aplicaciones en productos farmacéu icos. Las aves de corral, típicamente codornices y pollos, han sido procreados por mucho tiempo para carne y huevos que ellas ponen, de este modo son también presumibles diversos procedimientos respecto al mejoramiento de la producción tal como la tolerancia a enfermedades y mejoramientos de la carne como cultivo para la investigación transgénica. Además, ya que las aves requieren un periodo corto para alcanzar la madurez sexual y pueden ser producidas en pequeños espacios, éstos son considerados como sistemas de expresión de proteínas de bajo costo y debido a su producción transgénica considerados como un medio de producción de productos farmacéuticos de anticuerpos y proteínas raras. Ya que los huevos de aves contienen una gran cantidad de proteína y éstos son puestos diariamente, se piensa que éstos se vuelven un sistema de producción eficiente si un producto transgénico puede ser sistemáticamente producido como una proteína recombinanue en huevos . Respecto a los anticuerpos monoclonales, los cuales han sido colocados en el mercado en muchos artículos y han llamado la atención como productos farmacéuticos en años recientes, la difusión de mercado de los mismos es prevenida, ya que éstos no pueden ser producidos en un sistema de expresión barato tal como Escherichia coli , y el valor unitario de los mismos es caro. Mientras tanto, las células de aves tienen funciones para constituir una proteína anticuerpo, y puede esperarse que las aves transgénicas sean un medio de producción de un anticuerpo para aplicaciones médicas, etc., que han sido convencionalmente difíciles de ser producidas en masa. Además, se piensa que estos productos proteicos tienen alta posibilidad para tener características ventajosas para las aplicaciones en medicina y agente de prueba tal como estabilidad mejorada en sangre al ser dotadas por una cadena de azúcar por las células del ave . Como se describió anteriormente, se espera que las aves transgénicas tengan aplicaciones como medios de producción de proteínas útiles, pero por otra parte, no obstante de los diversos intentos que han sido conducidos hasta ahora, todavía no ha sido encontrado un caso que acumule existosamente una proteína recombinante deseada en el huevo de un ave, a un nivel práctico. Además, un caso que produce exitosamente aves transgénicas que expresan una proteína que tiene una conformación que incluye una pluralidad de unidades tales como un anticuerpo a alta concentración, todavía no ha sido encontrado.
Harvey et al. (Harvey, A. J et al . (2002) Nature Biotechnology, 19, 396) produjeron un pollo quimera transgénico G0 utilizando un vector derivado del Virus de la Leucosis Aviar e introduciendo el gen de la ß-lactamasa dentro de un pollo, pero la cantidad de expresión de enzima al suero o al huevo fue tanto como de aproximadamente 50 a 250 ng/ml . Los pollos quimera transgénicos Gl a G3 producidos mediante la cópula de los pollos quimera transgénicos G0 incrementaron la cantidad de expresión de enzima por la introducción de genes dentro de células somáticas completas, pero el nivel incrementado permaneció tanto como de aproximadamente varios µ9/p?1, de este modo éstos están todavía lejos de la aplicación práctica. En general, para producir un animal transgénico, se utiliza un método que comprende la microinyeccion de ADN a un pronúcleo de un huevo fértil, pero este método no puede ser aplicado a las aves. Esto es debido a que es difícil obtener un embrión de una etapa de una sola célula, incluso si ésta puede ser obtenida, no existe tecnología para distinguir el núcleo en el huevo. Para la obtención del embrión de la etapa de una sola célula, es necesario obtener un huevo inmediatamente después de la fertilización de un oviducto de un ave hembra, y desarrollar el huevo normalmente. En años recientes, Perry estableció un sistema para obtener una célula de pre-escisión de gallina y el cultivo de la célula fuera del cuerpo (Perry, M. M (1988) Nature, 331) . No obstante, incluso con esta tecnología, es imposible distinguir el núcleo dentro del huevo e introducir un gen pretendido dentro del núcleo. Por lo tanto, la introducción del gen a un huevo fértil de ave ha sido restringida a la inyección del ADN hacia el citoplasma, y el uso de la bicapa lipídica de inclusión de ADN (liposoma) , un método de fosfato de calcio o un método de electroporación han sido también intentados. No obstante, con estas tecnologías, la eficiencia de introducción del gen es pobre, y la posibilidad de que el ADN plasmídico introducido sea introducido dentro de un cromosoma, es baja. Aunque el método de introducción del gen mediante microinyección pueden transferir eficientemente un ADN deseado a un huevo fértil, ya que el ADN plasmídico introducido no es incorporado dentro de un cromosoma del hospedero, el plásmido del transgen es omitido acompañado por la división de células somáticas del hospedero, de este modo no puede ser deseado el efecto estable de introducción del gen. En 1986, fue por primera vez reportado el ejemplo de producción de un pollo transgénico utilizando un vector retroviral (Salter, D. W. Et al. (1986) Poultry Sci . , 65). La tecnología de inyección de un vector retroviral dentro de un huevo fértil mediante el método de microinyección, es una tecnología alta en eficiencia de introducción de genes, y para las aves a las cuales no puede ser inyectado directamente el ADN dentro del núcleo, ese es el único método práctico para producir el transgénico estable insertado con un gen deseado dentro del cromosoma. Los presentes inventores han realizado investigaciones intensivas, y como resultado, encontraron un método de producción de un ave transgénica que comprende el uso de un vector viral seguro, defectuoso en replicación, que es también aplicado para la terapia génica, e introduciendo eficientemente un gen deseado (Publicación Abierta Japonesa 2002-176880) . Mediante este método, que hizo posible el producir de manera segura y eficiente un ave transgénica que tiene una pluralidad de copias de transgen. Además, se encontró también que el transgen es transmitido hacia la siguiente generación a una alta frecuencia por esta tecnología, y el uso de un ave transgénica como un sistema de producción de sustancias ha llegado al uso práctico. No obstante, ya que la mayoría de los genes introducidos a este tiempo son inactivados por el hospedero (llamado silenciamiento de genes o genes inperceptibles) en una etapa temprana de desarrollo, la cantidad de producción de proteína como resultado de la expresión del gen fue muy pequeña. Aunque el mecanismo biológico de inactivación de trnasgen no ha sido todavía aclarado, una tecnología de prevención de esta inactivación y expresión eficiente de un gen deseado, es indispensable para el desarrollo de aplicación de un ave transgénica. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Para especificar el tiempo del gen, el cual ha sido introducido a un huevo fértil utilizando un vector retroviral, que es inactivado después de la generación, los presentes inventores estudiaron cómo la cantidad de expresión cambia por la introducción de un vector en diversas etapas después de la fertilización utilizando un gen de expresión de la ß-galactosidasa, como un indicador. Como resultado, ellos encontraron que la cantidad de expresión del transgen cambia significativamente dependiendo del tiempo cuando es introducido el gen durante el desarrollo embrionario. De este modo, la invención ha sido completada. Es decir, la inactivación del transgen es notable con relación al gen introducido inmedia mente después de la deposición de los huevos, y la frecuencia de expresión del gen introducido después del lapso de un cierto periodo de tiempo después de la deposición de los huevos, es alta.. Los presentes inventores utilizaron este aviso y encontraron que si un gen exógeno es introducido a un embrión temprano después del lapso de tiempo específico del inicio de la incubación, que es dependiente de la especie del ave, se hace posible el expresar eficientemente un gen deseado sin la influencia de la inactivación por un hospedero. Además, cuando los inventores produjeron un vector incorporado con un gen que codifica para un anticuerpo quimera útil como productos farmacéuticos, por ejemplo un scFv-Fc (anticuerpo de cadena simple) , e introdujeron el vector a una codorniz para producir un ave quimera transgénica GO mediante este método, se encontró que un anticuerpo derivado del transgen es expresado a una alta concentración en sangre, albumen y yema de huevo. Es decir, el primer aspecto de la presente invención se refiere a: un método de producción de un ave quimera transgénica GO , que comprende la incubación de un huevo fértil del ave, la infección de un embrión primario después y excluyendo un periodo blastodérmico inmediatamente después de la deposición del huevo (etapa X) con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego la incubación del embrión, y un ave quimera transgénica GO producida mediante dicho método. El segundo aspecto de la presente invención se refiere a un ave quimera transgénica GO : a la que se le introduce un gen de anticuerpo ¦ exógeno con un vector retroviral defectuoso en replicación, y produce un anticuerpo derivado de un transgen en al menos uno de sangre, albumen y yema de huevo. El tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método de producción de un anticuerpo : que comprende la producción del ave quimera transgénica GO anteriormente mencionada, y la recuperación del anticuerpo de la sangre y/o de un huevo del ave quimera transgénica GO . Se confirmó que la expresión de un transgen por el ave quimera transgénica GO de la presente invención es mantenida aún cuando el ave quimera transgénica GO se desarrolle hasta el ave adulta. Por lo tanto, por la invención, se hace posible construir un sistema de producción práctico que comprende la introducción de un gen especifico dentro un ave, y la producción de una proteína deseada incluso después del crecimiento. Además, el transgen del ave quimera transgénica GO producida por la invención, es transmitido a la siguiente generación a una alta eficiencia de transmisión por cópula. Ya que el transgen es transmitido a la siguiente generación en la forma incorporada en el cromosoma, el sistema de producción por un ave transgénica puede proporcionar producción estable de la sustancia. Por la invención, la proteina deseada producida en una célula somática del ave transgénica, es secretada hacia la sangre, y puede ser utilizada mediante la separación del suero . Además, los inventores han encontrado que un anticuerpo que tiene la región constante que pertenece a la clase de IgG' humana y un anticuerpo que tiene la región constante de la IgG de codorniz, IgG de pollo o IgG de ratón son eficientemente transmitidos de la sangre a los huevos en codornices y pollos . Cuando el anticuerpo que tiene estas regiones constantes es expresado en el ave quimera transgénica GO , producida mediante el método de la invención, el anticuerpo secretado hacia la sangre es acumulado a una alta concentración en los huevos . Cuando la proteina deseada es adquirida mediante la introducción de un gen a los animales transgénicos, en mamíferos, la proteina es en general secretada en la leche y recuperada, pero en un ave transgénica, un objeto es acumulado en huevos, y recuperado y purificado a partir de la albumen y de la yema de huevo misma. En el huevo de gallina y similares, 30% del componente total es una proteína, y la proteína que aparece como el componente principal es la ovoalbúmina. Convencionalmente, como un método para expresar una proteína recombinante en huevos de aves transgénicas , se ha considerado utilizar un promotor de expresión de ovoalbúmina y similar, incorporando un gen que codifica para una proteína deseada en el lado corriente abajo (3'), y expresando un obje'tivo en la albumen en lugar de la ovoalbúmina . No obstante, en el método de la invención, se vuelve posible provocar la secreción de un anticuerpo expresado en una gran cantidad, por ejemplo el anticuerpo de la clase IgG, etc. bajo el control de un promotor constitutivo, por ejemplo, el promotor de la ß-actina de pollo, etc., en sangre para la acumulación del mismo en los huevos. En esta descripción, el promotor constitutivo se refiere a un promotor sistémicamente expresado. Además, para especificar la parte esencial para la transición hacia los huevos entre las estructuras del anticuerpo, los anticuerpos modificados, los fragmentos Fab y Fe, fueron inoculados dentro de sangre de codorniz y de pollo para probar la habilidad de transición hacia los huevos. Como resultado, el fragmento Fe fue acumulado en los huevos, y se sugirió que la transición del anticuerpo hacia los huevos sea llevada a cabo a través del receptor de Fe . A partir de este aviso, como un método para utilizar universalmente el método de producción de un anticuerpo por un ave transgénica en huevos, como un método de producción general de proteina, es presumible un método de producción que comprende el diseño de un vector que produce una proteína, que tiene la estructura de la región constante de IgG humana (Fe) que es fusionada, produciendo un ave transgénica, la recuperación de una protelna que contiene un objetivo a partir de los huevos, y el corte de la porción Fe para purificar el objeto. Además, convencionalmente, cuando un anticuerpo fue producido utilizando un animal transgénico mamífero, ha sido señalado el problema de la dificultad en la separación y purificación del auto-anticuerpo que aparece en el animal de producción, y un anticuerpo deseado. Como una ventaja del método de producción de anticuerpo utilizando un ave como el animal de producción, se puede mencionar una facilidad de separación del auto-anticuerpo del ave y del anticuerpo recombinante en cuestión, ya que el auto-anticuerpo no es adsorbido sobre las columnas de protelna A y de proteína G. Como se mencionó anteriormente, aunque un anticuerpo monoclonal humano es útil como un producto farmacéutico, existe únicamente un medio de producción caro el cual utiliza un cultivo de células animales o fluido de ascitis de ratón, y su valor unitario alto previene la difusión en el mercado del mismo. En años reciente, es producido un scFv (anticuerpo de cadena simple) en el cual únicamente las regiones V de la cadena H y la cadena L del anticuerpo están unidas con una secuencia ligadora mediante técnica de manipulación por ingeniería genética, y esto tiene una ventaja de ser producible por Escherichia coli, de modo que llama la atención en vista de los costos. No obstante, estas proteínas llamadas anticuerpos de bajo peso molecular son bajas en estabilidad en sangre, de este modo son difíciles en utilidad práctica como usos terapéuticos y de prueba. Aunque un scFv-Fc, el cual es producido mediante la unión de una región Fe a un scFv, es estable también en sangre y se considera que es más práctico, éste no puede ser producido por Escherichia coli, y puede ser suministrado únicamente por un bioreactor utilizando una célula animal . Un scFv-Fc humanizado, el cual es producible mediante la unión de un Fe humano al scFv que tiene una región de enlace producida por otro animal tal como pollo, tiene un futuro promisorio también para usos terapéuticos. Cuando esta proteína pueda ser producida en masa por el ave quimera transgénica GO de la invención, su disponibilidad será alta. El ave quimera transgénica GO de la invención puede ser aplicada a la producción en masa de la proteína de anticuerpo que puede ser producido únicamente en una pequeña cantidad por la manera convencional, por ejemplo, un anticuerpo recombinante tal como scFv-Fc, el anticuerpo quimera, el anticuerpo monoclonal humano, etc, a bajo costo, y el uso del mismo prácticamente mediante recuperación y purificación . De este modo, en la presente invención, se describe un método de producción de expresión eficiente de un transgen en el ave quimera transgénica GO , utilizando un vector retroviral . También en la invención se describe un método de producción de un ave quimera transgénica GO que produce una proteína útil deseada en las células somáticas del ave, mediante la introducción de un gen específico. En la invención se describe además un sistema de producción de proteína bajo en costo de producción, el cual comprende provocar que las células del ave produzcan sustancias útiles como productos farmacéuticos y de prueba, tal como un anticuerpo tipo humano monoclonal, anticuerpo quimera, anticuerpo scFv-Fc, y proteína funcional que tiene una confirmación complicada, que no puede ser convencionalmente producida por Escherichia coli, etc., y la utilización de la misma por recuperación a partir del suero y de la sangre. Además, es también presumible el proporcionar una tecnología de modificación de las aves domésticas de una manera preferible, mediante la aplicación del método de producción de un ave quimera transgénica GO de la presente invención, y un ave modificada. Como las características de las aves domésticas, son preferidas la calidad mejorada de la carne, la resistencia aumentada a enfermedades, la tasa de crecimiento aumentada, y similares. Las aves tienen también diversas demandas para mascotas, y el método de producción de la invención puede ser también aplicado como un medio para el mejoramiento de la producción a características preferibles para mascotas tales como el mejoramiento en los colores de las plumas y disminución en la agresividad en un periodo corto . Además, usualmente, la producción transgénica de mamíferos, anfibios, peces y similares es actualmente llevada a cabo mediante una transferencia nuclear, pero la invención es también aplicable como una nueva tecnología eficiente y alternativa de producción de animales transgénicos . Es decir, la presente invención se refiere a un ave quimera transgénica G0 a la que se le introduce un gen de anticuerpo exógeno con un vector retroviral defectuoso en replicación, y produce un anticuerpo derivado de un transgen en al menos uno de la sangre, la albumen y la yema de huevo. La región constante del anticuerpo anterior es preferentemente una clase que pertenece a la IgG humana, una subclase que pertenece a la IgGl humana, IgG de codorniz, IgG de pollo, o IgG de ratón. El gen de anticuerpo es preferentemente controlado por un promotor constitutivo, y el promotor constitutivo anterior es preferentemente el promotor de la ß-actina de pollo. El vector retroviral anterior es preferentemente un vector derivado del virus de leucemia murina de oloney, y se prefiere un VSV-G pseudo tipo uno. El ave quimera transgénica G0 de la invención es preferentemente un pollo o codorniz. El anticuerpo anterior es preferentemente un anticuerpo quimera, y la cantidad de producción del anticuerpo . quimera anterior es preferentemente no menor de 0.5 µ9/p?1 , más preferentemente no menor de 5 µ9/t?1 en sangre. En albumen, éste es preferentemente no menor de 0.1 µ9/p?1, más preferentemente no menor de 1 µ9/t?1, y en yema de huevo, es preferentemente no menor de 0.1 µg/ml, más preferentemente no menor de 1 µ9/p?1. El anticuerpo anterior es preferentemente un anticuerpo scFv-Fc, y la cantidad de producción de anticuerpo scFv-Fc es p eferentemente no menor de 20 9/t?1, más preferentemente no menor de 2000 µ /t?1 en sangre. En albumen, éste es preferentemente no menor de 5 g/ml, más preferentemente no menor de 500 g/ml, y en yema de huevo, éste es preferentemente no menor de 5 µg/ l, más preferentemente no menor de 500 µ /??1. Un aspecto de la presente invención es también un método de la producción de un anticuerpo, que comprende la producción de un ave quimera transgénica G0 de la invención, y la recuperación del anticuerpo a partir de la sangre y/o los huevos del ave quimera transgénica G0. Un método " de producción de un ave quimera transgénica G0 que comprende la incubación de un huevo fértil de ave, la infección de un embrión temprano posteriormente y exclusivo de un periodo plastodérmico inmediatamente después de la deposición del huevo con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego la incubación del embrión, es también un aspecto de la invención. En el método de producción de un ave quimera transgénica GO de la invención, el tiempo de infección de un vector retroviral defectuoso en replicación, es preferentemente después de 24 horas o mayor a partir del inicio de la incubación. El método de infección de un vector retroviral defectuoso en replicación comprende preferentemente la microinyección del vector dentro de un corazón o vaso sanguíneo formado en un embrión temprano. El corazón o el vaso sanguíneo es formado preferentemente en el embrión temprano después de 24 horas o más a partir del inicio de la incubación. Respecto a la actividad del vector retroviral defectuoso en replicación que va a ser microínyectado, el vector tiene preferentemente el título no menor de 1 x 107 cfu/ml, más preferentemente tiene el título no menor de 1 x 108 cfu/ml, y todavía no menor de 1 x 109 cfu/ml. El vector retroviral anterior es preferentemente un vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney, y es preferido un VSV-G psuedo-tipo uno. El ave quimera transgénica GO producida por la invención es preferentemente un pollo o codorniz. El transgen incorporado dentro del vector retroviral defectuoso en replicación, anterior contiene preferentemente una secuencia génica no derivada de un retrovirus . La secuencia génica anterior no derivada de un retrovirus es preferentemente una secuencia génica controlada por el promotor de la ß-actina de pollo, y es preferentemente una secuencia génica que codifica para un gen de anticuerpo o gen de proteína de fusión. El gen de anticuerpo anterior es preferentemente un gen de anticuerpo quimera, y es preferido un gen de anticuerpo scFv-Fc. El ave quimera transgénica GO producida por el método de producción de un ave quimera transgénica GO de la invención, es también un aspecto de la presente invención. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la estructura de la construcción vector p SCVNAAp de un vector retroviral defectuoso en replicación. Neor representa un gen de resistencia a la neomicina y Ampr representa un gen de resistencia a la ampicilina. PAACÍ representa un gen promotor de ß-actina. ß-Gal representa un gen de expresión de la ß-galactosidada . ?+ representa una secuencia de señal de empaquetamiento. 5'LTR y 3'LTR cada uno representa una secuencia de repetición terminal larga de MoMLV.
La Figura 2 muestra la relación entre el tiempo de introducción de un gen y la expresión de actividad de la ß-galactosidasa en una codorniz quimera transgénica GO . El eje horizontal muestra el tiempo de incubación (hr) , y el eje vertical muestra la actividad de ß-galactosidasa expresada en mUnidad/mg. La Figura 3 muestra la relación entre el tiempo de introducción de un gen y la expresión de actividad de la ß-galactosidasa en un pollo quimera transgénico GO . El eje horizontal muestra el tiempo de incubación (hr) , y el eje vertical muestra la actividad de la ß-galactosidasa expresada en mUnidad/mg . La Figura 4 muestra la relación entre el título del vector retroviral introducido, y la expresión de actividad de la ß-galactosidasa en una codorniz quimera transgénica GO . El eje horizontal muestra el título del virus expresado en cfu/ml , y el eje vertical muestra la actividad de ß-galactosidasa expresada en mUnidad/mg. La Figura 5 muestra la relación entre el título del vector retroviral introducido, y la expresión de actividad de la ß-galactosidasa en una codorniz quimera transgénica GO . El eje horizontal muestra el título del virus expresado en cfu/ml, y el eje vertical muestra la actividad de ß-galactosidasa expresada en mUhidad/mg.
La Figura 6 muestra el anticuerpo IgG humano acumulado en huevos de codorniz . El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del resultado del mismo experimento , llevado a cabo con tres codornices . La Figura 7 muestra el anticuerpo IgG humano acumulado en huevos de pollo . El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del resultado del mismo experimento , llevado a cabo con tres pollos . La Figura 8 muestra el fragmento Fab acumulado en huevos de codorniz . El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del mismo resultado experimental , llevado a cabo con tres codornices . . La Figura 9 muestra el fragmento Fab acumulado en huevos de pollo . El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del mismo resultado experimental llevado a cabo con tres pollos . La Figura 10 muestra el fragmento Fe aojmulado en huevos de codorniz . El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del mismo resultado experimental , llevado a cabo con tres codornices . La Figura 11 muestra el fragmento Fe acumulado en huevos de pollo. El valor del anticuerpo muestra el valor promedio del mismo resultado experimental llevado a cabo con tres pollos . La Figura 12A- 12C muestra las estructuras de las construcción vector de expresión del anticuerpo anti -CD2 , pMSCV/GAAL (Figura 12A) , pMSCV/GÁAH (Figura 12B ) , y pMSCV/GAALIH (Figura 12C) ) . Ampr representa un gen de resistencia a al ampicilina . AACÍ representa un gen promotor de ß-actina. ?+ representa una secuencia de señal de empaquetamiento . GFP representa un gen de la proteína fluorescente verde . L representa un gen de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD2. H representa un gen de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD2. 5'LT y 3'LTR cada uno representa una secuencia de repetición terminal larga de MoMLV . La Figura 13 muestra la estructura de la construcción vector de expresión del anticuerpo scFv-Fc, pMSCV/GÁAscFv-Fc . Ampr representa un gen de resistencia a la ampicilina. ???? representa un gen promotor de la ß-actina. ?+ representa una secuencia de señal de empaquetamiento. GFP representa un gen de la proteína fluorescente verde. scFv-Fc representa un gen del anticuerpo scFv-Fc. 5'LTR y 3'LTR cada uno representan una secuencia de repetición terminal larga de MoMLV. La Figura 14 muestra la cantidad de scFv-Fc expresado en suero de codorniz quimera transgénica GO . El eje horizontal muestra el número individual, y el eje vertical muestra la concentración de un anticuerpo scFv-Fc
(µg/ l) . La Figura 15 muestra la cantidad de un scFv-Fc expresado en huevos de codorniz quimera transgénica GO . El eje horizontal muestra la fecha de recolección de los huevos desde el inicio de la deposición, y el eje vertical muestra la concentración de un anticuerpo scFv-Fc ^g/ml) . La Figura 16 muestra el resultado del análisis de scFv-Fc purificado mediante SDS-PAGE. La banda 1 muestra el marcador de bajo peso molecular (LM ) , y la banda 4 muestra el marcador de alto peso molecular (HMW) . La banda 2 y la banda 3 muestran los resultados de la electroforesis de un scFv-Fc sometido a tratamiento de reducción y scFv-Fc que no es sometido a tratamiento de reducción, respectivamente. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De aquí en adelante, la presente invención es descrita con detalle. El ave quimera transgénica GO de la invención es el ave a la que se le introdujo un gen de anticuerpo exógeno con un vector retroviral defectuoso en replicación, y produce un anticuerpo derivado de un transgen en sangre, albumen o yema de huevo. El ave que va a ser utilizada en la práctica de la invención no está particularmente restringida, y por e emplo, se pueden mencionar aves de corral domésticas, domesticadas para alimentación, deposición de huevos y fines similares, tales como un pollo, pavo, pato, avestruz y codorniz, y aves de mascota. Entre ellas, un pollo y una codorniz son los proferidos en vista de la fácil disponibilidad y fertilidad como especies productoras de huevos.
Como el vector retroviral que va a ser utilizado en la invención, se pueden mencionar los vectores derivados del virus de la leucemia murinode Moloney (MoMLV) , virus de la leucosis Aviar (ALV) , y similares. Entre ellos, aquellos derivados de MoMLV son los preferidos, pero la invención no está limitada a éstos. En consideración de la seguridad, el virus utilizado en general como un vector transgénico es un virus defectuoso en autorreplicación producible mediante la supresión de cualquier o todas las tres especies de genes gag, pol y env que son necesarios para la replicación de las partículas virales . Para infectar eficientemente una célula de ave con este vector viral, los vectores virales obtenibles al convertir artificialmente una proteína de recubrimiento a un VSV-G (origen del virus de la estomatitos vesicular) pseudo-tipo uno, son los preferidos, pero la invención no está limitada a este tipo de virus. Los vectores de pseudo tipo viral preparados utilizando una célula de empaquetamiento, el virus auxiliar y similares, son introducidos dentro de un embrión temprano, vaso sanguíneo, y el corazón mediante el método de microinyección general (Bosselman R. A et al. (1989) Science 243, 533). Como el método de introducción de genes, puede ser mencionado además de aquel, los métodos de lipofección, electroporación y similares.
El gen que va a ser introducido dentro del ave en la práctica de la invención no está particularmente restringido, pero está constituido con un gen marcador, un gen estructural para expresar una proteína deseada, un gen promotor que controla la expresión de estos genes, un gen de señal secretora, y similares. Como el gen marcador anterior, se puede mencionar un gen de resistencia a la neomicina, gen de la ß-galactosidasa, gen LacZ, y un gen que codifica para una proteína de fluorescencia tal como GFP (proteína fluorescente verde) . El gen estructural anteriormente mencionado para expresar una proteina deseada, no está particularmente restringido, y se puede mencionar un gen que codifica para un anticuerpo o una enzima, etc., útil en el campo de la industria de los genes tal como un anticuerpo monoclonal humano, y similar. También utilizables son los genes de otras sustancias útiles biológicamente activas.
Particularmente preferidos son los genes estructurales de los anticuerpos exógenos tales como un gen de anticuerpo que tiene la región constante que pertenece a la clase IgG humana, el gen de anticuerpo que tiene la región constante que pertenece a la subclase IgGl humana, el gen de anticuerpo que tiene la región constante de la IgG de codorniz, IgG de pollo, o IgG de ratón, con miras a su acumulación preferible en huevos . Además , preferido como el gen estructural anterior es un gen estructural de un anticuerpo quimera. El anticuerpo quimera se refiere a un anticuerpo constituido de dos o más especies diferentes de características genéticas. Convencionalmente, los anticuerpos médicos producidos por el hibridoma de ratón son derivados de ratones, de este modo ha existido un problema de que ocurra rechazo por el sistema inmune cuando se administra a cuerpos humanos . Como el anticuerpo quimera anteriormente mencionado, se pueden mencionar, por ejemplo, los anticuerpos quimera, en los cuales el defecto es mejorado al sustituir las regiones diferentes de aquellas que se enlazan con una proteína antigénica entre los anticuerpos de ratón, con anticuerpos humanos para no provocar rechazo, tal como un anticuerpo anti-CD2 humano, el anticuerpo anti-receptor CD20, y el anticuerpo anti-TNF, y algunos de ellos han sido ya colocados en el mercado como productos farmacéuticos . Todavía más preferentemente, como el gen estructural anterior existe un gen estructural de un anticuerpo scFv-Fc. Entre los anticuerpos recombinantes médicos, existe un grupo llamado "anticuerpos de bajo peso molecular" . En la inmunoglobulina IgG, existe un dominio que comprende heterodímeros de VH y VL llamado Fv: el fragmento de la región variable que se enlaza directamente con un antígeno. El dominio Fv solo, tiene una habilidad suficiente de enlace al antigeno aún cuando éste tenga únicamente aproximadamente 1/5 del peso molecular con relación a IgG. Aquel obtenible mediante el enlace artificialmente entre los dominios VH y VL con un ligador peptídico, es un anticuerpo de bajo molecular llamado scFv: la cadena simple Fv, y ha sido ya conocido como poseedor de estabilidad mejorada en comparación con VH y VL solos. Powers et al. (Powers, D.B et al. (2000) J Immunol Method. 251, 123) han encontrado que al fusionar una porción Fe derivada de la IgGl humana al scFv, la estabilidad en sangre se incrementa. Este anticuerpo scFv-Fc se piensa que es útil para aplicaciones médicas, pero no es producido por Escheríchia coli, que es un sistema de producción en masa de bajo costo. Como otra secuencia génica preferible anteriormente mencionada, se puede mencionar un gen estructural de una proteína de fusión'. Un grupo de proteínas artificiales en la cual partes de dos o más especies de proteínas son fusionadas por recombinación génica es llamada una proteína de fusión. Entre aquellas que ya han sido puestas en uso práctico como productos farmacéuticos, existe la TNFR-Fc preparada mediante la fusión de Fe de inmunoglobulina a un receptor de TNF, LFA3-Fc preparado mediante la fusión de Fe a LFA3 , o similares. Estas son proteínas artificiales diseñadas para tener actividad biológica más fuerte mediante la fusión de Fe que va a ser solubilizada . En el ave quimera transgenica GO de la invención, mediante el uso del gen del anticuerpo monoclonal humano, el gen de anticuerpo quimera, y el gen de anticuerpo scFv-Fc mencionados anteriormente como el gen que va a ser introducido en el ave, los productos farmacéuticos de anticuerpo que han sido convencionalmente difíciles de producir, pueden ser producidos en masa a bajo costo. Por ejemplo, en el caso del ave quimera transgenica GO a la que se le introdujo un gen de anticuerpo quimera, el contenido de anticuerpo en la sangre es preferentemente no menor de 0.5 µg/ml, más preferentemente no menor de 5 µg/ml . En albumen, éste es preferentemente no menor de 0.1 g/mlí más preferentemente no menor de 1 µg/ml, y en yema de huevo, es preferentemente no menor de 0.1 µ9/t?1, más preferentemente no menor de 1 µg/ml . Además, en el caso del ave quimera transgénica G0 a la que se le introdujo un gen del anticuerpo scFv-Fc, el contenido de anticuerpo en la sangre es preferentemente no menor de 20 g/ml/ más preferentemente no menor de 2000 µ /t?1. En albumen, éste es preferentemente no menor de 5 µ9/??1, más preferentemente no menor de 500 µ9/t?1, y en yema de huevo, es preferentemente no menor de 5 µ9/p?1, más preferentemente no menor de 500 g/ml . Como el gen promotor anteriormente mencionado, se puede mencionar un promotor constitutivo. Es preferible cuando el gen del anticuerpo es controlado por el promotor constitutivo ya que la expresión del gen del anticuerpo es estabilizada. Como un promotor constitutivo más preferible, se puede mencionar el promotor de la ß-actina de pollo. El método para la producción de un anticuerpo de la invención comprende la producción del ave quimera transgénica GO de la invención, y la recuperación de un anticuerpo a partir de la sangre y/o del huevo del ave quimera transgénica GO anterior . Enseguida, se describe el método de producción del ave quimera transgénica GO de la invención . Como un método de producción, se puede mencionar uno que comprende la incubación de un huevo fértil de ave, infectando un embrión temprano después y exclusivo de un periodo blastodérmico inmediatamente después de la deposición del huevo con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego incubando el embrión. Además, se puede mencionar un método como un método de producción de la invención que comprende la incubación de un huevo fértil de ave, la infección de un embrión temprano después del lapso de 24 horas o más del inicio de la incubación, con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego, incubando el embrión. Es más preferido un método que comprende la microinyeccion de un vector retroviral defectuoso en replicación, a un corazón o vaso sanguíneo formado en el embrión temprano. Es decir, el método de producción del ave quimera transgénica GO de la invención comprende la microinyeccion de un vector retroviral defectuoso en replicación, a un huevo fértil después del lapso de tiempo especifico desde la deposición del huevo. Tomando un pollo como un ejemplo para el desarrollo temprano de un huevo fértil después de la deposición, primeramente, el huevo fértil fertilizado dentro de un oviducto comienza la división después de aproximadamente 1.5 horas a partir de la fertilización. El huevo en el cual es iniciada la división discoidal con el estado de citoplasma que está conectado, es dividido por un día antes de ser liberado hacia afuera del cuerpo, y se vuelve un embrión llamado blastodermo que consiste de aproximadamente 60,000 células (periodo blastodérmico ) . Este blastodermo es observado como un anillo blanco con un diámetro de 3 a 4 mm en el centro de la yema del huevo. Este embrión está divido en capas superior e inferior para formar un blastocele. La deposición del huevo ocurre aproximadamente en el tiempo en que se forma el hipoblasto. Se forma la estría primitiva, el blastodermo llega a tener estructura triple, por ejemplo las capas superior, intermedia e inferior, y luego se forma el triploplasto . Después de esto, un embrión se forma y se desarrolla, y se empolla en el día 22 de la ovulación. El periodo de blastodermo es también llamado una etapa X. Ya que una célula productora se genera a partir de una parte de la célula de esa etapa, el huevo fértil de este periodo es convencionalmente utilizado como un objetivo de la introducción del gen. En la práctica de la invención, el tiempo cuando un huevo fértil en un periodo de blastodermo inmediatamente después de la deposición, es colocado bajo la condición ambiental adecuada para el empollamiento , por ejemplo, en el caso de los pollos, la temperatura de 37.7 a 37.8°C y la humedad de 50 a 70%, es ajustada como la hora 0, la cual fue establecida como el inicio de la incubación, y fueron conducidos los diversos tratamientos con los lapsos de tiempo. Se observó la formación de un sistema de vasos sanguíneos sobre la yema del huevo después de 35 horas sobre el inicio de la incubación en codornices, y aproximadamente después de 50 horas en pollos, se observó el latido del órgano que va a ser diferenciado a un corazón. Para la incubación o empollamiento del huevo fértil al que se le introdujo el gen anterior, el método comprende el uso de un cascarón de huevo artificial desarrollado por los presentes inventores (Kamihira, M. et al. (1998) Develop. Growth Differ., 40, 449) y similares, puede ser aplicador. Como el vector retroviral defectuoso en replicación, el gen que va a ser introducido y el ave transgénica, que son utilizados en el método de producción de la invención, se pueden mencionar los mismos que aquellos del ave quimera transgénica G0 anteriormente mencionada.
El transgen incorporado al' vector retroviral defectuoso en replicación, anteriormente mencionado, contiene preferentemente una secuencia génica no derivada del retrovirus . En la presente, en el método de producción de la invención, como el "gen no derivado del retrovirus", se puede mencionar el gen estructural anterior, el gen promotor, el gen de señal de secreción, ? similares. La secuencia génica anterior no derivada del retrovirus es preferentemente una secuencia génica controlada por el promotor de ß-actina de pollo, y una secuencia génica que codifica para un gen de anticuerpo o una proteína de fusión, es preferido. En el método de producción de la invención, es preferible mi croinyectar un vector retroviral defectuoso en replicación, que tenga títulos no menores de 1 x 107 cfu/ml , preferentemente no menor de 1 x 108 cfu/ml , más preferentemente no menor de 1 x 109 cfu/ml en vista de la introducción eficiente del gen. El ave a la que se le introduce el gen dentro del huevo fértil por el método de producción de la invención, se desarrolla como un ave transgénica que tiene un transgen en sus células somática en forma de mosaico. El ave transgénica de primera generación es llamada el ave quimera transgéníca GO . Tal ave quimera transgéníca GO obtenida mediante el método de producción de la invención es también un aspecto de la invención. Cuando el ave de segunda y tercera generación nacido por cópula del ave quimera transgéníca GO y un ave no transgéníca, o el ave quimera transgéníca GO cada una es generada a partir de una célula productora que tiene un transgen en el cromosoma, el ave nacida se desarrolla como un individuo que contiene el transgen dentro de las células somáticas del cuerpo entero. La progenie que hereda el transgen del individuo del ave quimera transgéníca GO son llamadas aves transgénicas Gl , G2 , G3 a través de las generaciones. Mediante la cópula del ave quimera transgéníca GO de la invención con un ave no transgéníca alogénica o la cópula con el ave quimera transgéníca tipo GO, el transgen puede ser transmitido a la progenie, y también un ave transgéníca completa que tiene el transgen en las células somáticas del cuerpo entero, puede ser producida. Ya que el ave transgéníca completa tiene células somáticas que tienen un transgen a una alta proporción, se puede esperar que la cantidad de producción de la 'proteína recombinante derivada de un transgen sea incremen ada en comparación con el ave quimera transgénica GO . Además, al establecer la línea del ave transgénica que transmite establemente el transgen, se hace posible estabilizar la calidad de un sistema de producción de proteínas. MEJOR MODALIDAD PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION En lo subsiguiente, la presente invención se describe con detalle por medio de ejemplos, no obstante, estos ejemplos no son limitantes del alcance de la invención. (Ejemplo 1) Preparación de una construcción de vector de expresión de ß-galactosidasa Construcción de vector de expresión de ß-galactosidasa, pMSCVAAP se produjo como sigue. 1. Un fragmento del promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV) fue cortado a partir del plásmido pLXRN (producto de BD Biosciences Clontech) utilizando .las enzimas de restricción Xhol y HindIII, y luego insertado dentro de los sitios Xhol y HindIII del plásmido pBluescriptIISK (+) (producto de Stratagene) para producir el plásmido pBlue/RSV. 2. Un fragmento del gen de la ß-galactosidasa (ß-Gal) fue cortado a partir del plásmido pCMVp* (producto de BD Biosciences Clontech) utilizando la enzima de restricción Notl, y luego insertado dentro del sitio Notl del plásmido pZeoSV2 (+) (producto de Invitrogen Corporation) . El plásmido que tiene la estructura de un gen de ß-Gal que es insertado en la misma dirección que el promotor T7 fue llamado pZeo/lacZ . 3 . Un fragmento del promotor RSV fue cortado a partir de pBlue/RSV utilizando las enzimas de restricción Xhol y PstI . Un fragmento del gen ß-Gal fue cortado a partir de pZeo/lacZ utilizando las enzimas de restricción PstI y Xhol . Un fragmento vector del plásmido pL HX (producto de BD Biosciences Clontech) tratado con la enzima de restricción Xhol se ligó a los dos fragmentos cortados anteriores para producir el plásmido ??,?? ß . . Un fragmento que contiene una serie de repeticiones terminales largas 5 ' (LTR) del virus del sarcoma murino de Moloney (MoMuSV) , la señal de empaquetamiento del virus y un gen de resistencia a la neomicina (Neor) se cortó a partir de pLNHX utilizando las enzimas de restricción SacII y Xhol, y luego se ligó a un fragmento vector de pLXRN tratado con las enzimas de restricción SacII y Xhol para producir el plásmido pLXL . 5 . Un fragmento del gen ß-gal fue cortado a partir de pZeo/lacZ utilizando las enzimas de restricción HindIII y Xhol , y luego se ligó a un fragmento vector de pLXL tratado con las enzimas de restricción HindIII y Xhol para producir el plásmido pLZL . 6 . Mediante PCR (94°C/15 segundos, 55°C/30 segundos, 72°C/1.5 minutos : 35 ciclos; la polimerasa KDD-Plus-DNA. (producto de Toyobo Co., Ltd.)) utilizando dos oligonucleótidos de guimiosintesis 5'-cggtctagaggaattcagtggttcg-3' (SEQ ID NO: 1) y 5'-ccaggatccgacgttgtaaaacgacg-3 ' (SEQ ID NO: 2; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI) como cebadores, el fragmento de la región 5' de un promotor híbrido (promotor Miw) del promotor RSV y el promotor de la ß-actina de pollo (Act) se amplificaron a partir del plásmido pMiwZ (Suemori et al., 1990, Cell Diff. Dev. 29: 181 a 185), se cortó con las enzimas de restricción BamHI y MunI, y luego se insertó dentro de los sitios BamHI y MunI del plásmido pGREEN LANTERN-1 (producto de Gibco BRL) para producir el plásmido pGmiw5' . 7. Un fragmento de la región central del lado 5' del promotor Miw se cortó de pMiwZ utilizando las enzimas de restricción MunI y Clal, y luego se insertó dentro de los sitios MunI y Clal de pGmiw5' para producir el plásmido pGmiw5'-2. 8. Un fragmento que contenia la región 5' del promotor Miw y la región central del lado 5' se cortó a partir de pGmiw5'-2 utilizando las enzimas de restricción BamHI y EcoRI, y luego se insertó dentro de los sitios BamHI y EcoRI de pBluescript IISK (+) para producir el plásmido pBlue/Miw5' . 9. Mediante PCR (98°C/l5 segundos, 60°C/30 segundos, 72°C/30 segundos: 35 ciclos) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5'-ccaaagcttgccgcagccattgcctttt-3 ' (SEQ ID NO: 3; la porción subrayada es el sitio de, la enzima de restricción HindIII) y 5 ' - atacctaggggctggctgcggaggaac-3 ' (SEQ ID NO: 4; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Blnl) como cebadores, un fragmento de la región 3' del promotor Miw se amplificó a partir de pMiwZ, cortada con la enzima de restricción HindIII y Blnl, y luego se ligó a un fragmento vector de pLXL tratado con las enzimas de restricción HindIII y Blnl para producir el plásmido LMiw3 ' . 10. Un fragmento de la región central del lado 3 ' del promotor Miw se cortó a partir de pMiwZ utilizando las enzimas de restricción EcoRI y MboII. Un fragmento de la región 3' del promotor Miw se cortó de pLMiw3 ' utilizando las enzimas de restricción MboII y Kpnl . Los dos fragmentos cortados anteriores fueron insertados dentro de los sitios EcoRI y Kpnl de pBlue/Miw5' para producir el plásmido pBlue/Miw. 11. Un fragmento que contiene la longitud completa del promotor Miw se cortó a partir de pBlue/Miw utilizando las enzimas de restricción BamHI y Blnl, y luego se ligó a un fragmento vector de pLXL tratado con las enzimas de restricción BamHI y Blnl para producir el plásmido pLML . 12. Un fragmento del promotor Act se cortó a partir de pLML utilizando las enzimas de restricción Smal y Xbal , y luego se insertó dentro de los sitios EcoRV y Xbal de pBluescript IISK (+) para producir el plásmido pBlue/Act. 13. Un fragmento del promotor Mi fue cortado a partir pLML utilizando las enzimas de restricción HindIII y BglII, y luego se ligó a un fragmento vector de pLZL tratado con las enzimas de restricción HindIII y BamHI para producir el plásmido ????ß? . 14. Un fragmento del promotor Act fue cortado a partir de pBlue/Act utilizando las enzimas de restricción Salí y Blnl . Un fragmento del gen ß -Gal fue cortado a partir de pLMPL utilizando las enzimas de restricción Blnl y BglII . Los dos fragmentos cortados anteriormente fueron ligados a un fragmento vector de ????? ß tratado con las enzimas de restricción Xhol y BglII para producir el plásmido ?????ß . 15. Mediante PCR (98°C/l5 segundos, 60°C/30 segundos, 68°C/2 minutos: 30 ciclos) utilizando dos oligonucleótidos de guimiosíntesis 5'-tttagctagctgcagctcagtgcatgcac -3 ' (SEQ ID NO: 5; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Nhel) y 5' -ataatctagaaacgcagcgactcccgc-3 ' (SEQ ID NO: 6; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xbal) como cebadores, un fragmento promotor de la actina defectuoso en intron (AAct) fue amplificado a partir de pMiwZ, y luego un fragmento que contenía una parte del promotor AAct se cortó utiliznaod las enzimas de restricción Xhol (el sitio de la enzima de restricción Xhol aparece en un fragmento de amplificación) y Xbal. Un fragmento que contiene una porción remanente del promotor AAct y el gen ß-Gal se cortó a partir de pL A utilizando las enzimas de restricción Blnl y BglII. Los dos fragmentos cortados anteriormente fueron ligados a un fragmento vector de pL P tratado con las enzimas de restricción Xbal y BglII para producir el plásmido pL AAp . 16. Un fragmento que contiene una serie de genes
Neor, el promotor AAct, y el gen ß-Gal se cortó a partir de pLNAA utilizando las enzimas de restricción Blnl y BglII, y luego se ligó a un fragmento vector de pLXL tratado con las enzimas de restricción Blnl y BglII para producir el plásmido pLNAAP-2. 17. Un fragmento que contenía una serie de genes Neor, el promotor AAct, y el gen ß-Gal se cortó a partir de pLNAAp-2 utilizando las enzimas de restricción BamHI y BglII, y luego se ligó a un fragmento vector del plásmido pMSCVneo (producto de BD Biosciences Clpntech) tratado con las enzimas de restricción BamHI y BglII. El plásmido en el cual los sitios BamHI y BglII desapareció fue nombrado pMSCVNÁA . La estructura de la construcción vector pMSCV AAp del vector retroviral defectuoso en replicacion, producido de este modo, fue mostrado en la Figura 1. (Ejemplo 2) Preparación de un vector retroviral de expresión de ß-galactosidasa Con el fin de preparar un vector retroviral a partir de la construcción vector MSCV ÁA producida en el Ejemplo 1, 5 x 106 células de empaquetamiento GP293 (producto de BD Biosciences Clontech) fue sembrado en una caja de cultivo de 100 mm de diámetro y cultivado. El medio' de cultivo fue cambiado por un medio DMEM de carne (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) , y se introdujeron 8 pg de pMSCV AA dentro de las células GP293 anteriores, mediante el método de lipofección. Después del lapso de 48 horas, los sobrenadantes de cultivo que contenían las partículas virales fueron recuperados y filtrados a través de un filtro de acetilcelulosa de 0.45 µt? (Advantech Co., Ltd.) para eliminar las impurezas. La solución obtenida fue adicionada con polibreno (producto de Sigma Corporation) para ser de 10 µg/ml para preparar una solución viral. La solución viral preparada fue agregada a las células GP293 cultivadas separadamente, y después del cultivo por 48 horas, las células fueron sucesivamente cultivadas en un cultivo que contenía 600 9/?t?1 de G418 (producto de GIBCO BRL) para obtener la cepa GP293 establemente transformada con G418. La cepa establemente transformada, obtenida fue cultivada en una caja de 10 mm de diámetro para ser 80% confluente, y se introdujeron 16 µg del vector pVSV-G a ese mediane el método de lipofección. Después del lapso de 48 horas, se recuperaron 12 mi del sobrenadante de cultivo que contenía las partículas virales. Este sobrenadante de cultivo fue sometido a centrifugación a 50,000 g y 4°C por 1.5 horas para precipitar el virus. Después de la eliminación del sobrenadante, 50 µ? de Tris-HCl 50 mM (pH 7.8), cloruro de sodio 130 mM y solución EDTA 1 mM, se agregaron al precipitado que contenía las partículas virales. Luego, la mezcla se dejó reposar a 4°C toda la noche y se suspendió perfectamente para recuperar una solución del virus. El vector viral de alto título, obtenido de este modo, fue 108 a 109 cfu/ml. El título viral fue medido como sigue. El día antes de la medición, 7 x 104 células NIH3T3 (adquirida de American Type Culture Collection) se sembraron en una caja de 35 mm de diámetro y se cultivaron. La solución viral diluida a 10"2 hasta 10"6 se agregó a cada caja en 1 mi. Después del lapso de 48 horas, la proporción de las células que expresaron GFP (proteína fluorescente verde) se determinó mediante un microscopio de fluorescencia, y el titulo se determinó mediante la siguiente fórmula de cálculo. Título viral = (número de células) x (proporción de dilución) x (porción de expresión) (cfu/ml) . (Ejemplo 3) . Inyección del vector retroviral a un embrión de codorniz Un huevo fértil de codorniz de la línea WE (Japan Bio Science Laboratory CO., Ltd.) fue utilizado. Al tiempo cuando este huevo fértil fue colocado en una incubadora con un dispositivo de rotación automática de huevos integrado (producto de Showafuranki Co. , Ltd.; tipo P-008) a 37.9°C y humedad de 65%, fue ajustado como el tiempo de inicio de la incubación (0 horas) . Luego, la incubación se llevó a cabo mientras que se giraba el huevo a 90 grados cada 15 minutos. Al inicio de la incubación, el cascarón del huevo fértil fue esterilizado con etanol al 70%, y la porción extrema angosta fue cortada con un cortador de diamante (MINIMO 7C710, producto de Minitor Co . , Ltd.) en un círculo de 2 cm de diámetro para exponer el embrión. Mientras que se observaron el blastodermo con un microscopio estereoscópico fue rayado, se preparó una aguja mediante plegamiento del extremo para tener un diámetro de aproximadamente 20 µ?a a partir de un tubo de vidro (CD-1, producto de Olympus Corporation) utilizando un extractor de micropipeta (PC-10, producto de Olympus Corporation) , y aproximadamente 2 µ? de la solución viral preparada en el Ejemplo 2 se microinyectó en el centro de la cavidad blastodérmica utiliznaod un microinyector (Transjector 5246, producto de Eppendorf, Co., Ltd.) . Después de rellenar albumen hasta el borde cortado de este cascarón, película de Teflón (MilliWrap, producto de Millipore Corporation) y envoltura de cloruro polivinilideno (Sarán rap, producto de Asahi Kasei Corporation) se utilizaron para cubrir el huevo utilizando albumen como una pasta. Luego, la incubación se llevó a cabo mientras que se hacía girar el huevo a 90°C cada 15 minutos. Después del lapso de 12 y 24 horas desde el inicio de la incubación, se inyectó virus al huevo fértil de la misma manera. Después de aproximadamente 36 horas desde el inicio de la incubación, se confirmó la generación de un vaso sanguíneo sobre la superficie de la yema del huevo; una parte del mismo latía, de este modo se observó que una parte del mismo se vuelve un campo cardiaco con un microscopio estereoscópico. Después del lapso de 36, 48 y 55 horas desde el inicio de la incubación, 2 µ? de la solución del virus preparada en el Ejemplo 2, se microinyectaron al corazón utilizando un microinyector.
(Ejemplo 4) Inyección del vector retroviral a un embrión de pollo Se utilizó un huevo fértil de pollo (Japan Bio Science Laboratory CO., Ltd.). Al tiempo cuando este huevo fértil fue colocado en una incubadora con un dispositivo automático integral de rotación de huevo (producto de Showafuranki Co., Ltd.; tipo P-008) a 37.9°C y humedad de 65%, se ajustó como el tiempo de inicio de la incubación (0 horas) . Luego, la incubación se llevó a cabo mientras que se giraba el huevo a 90 grados cada 15 minutos. Al inicio de la incubación, el cascarón del huevo fértil se esterilizó con etanol al 70%, y la porción del extremo angosto del huevo se cortó con un cortador de diamante (MINIMO 7C710, producto de Minitor Co., Ltd.) en un círculo de 3.5 cm de diámetro para exponer el embrión. Mientras que se observaba el blastodermo con un microscopio estereoscópico, se picó con una aguja preparada mediante plegamiento del extremo para tener un diámetro de aproximadamente 20 µt? a partir de un tubo de vidrio (CD-1, producto de Olympus Corporation) utilizando un extractor de micropipeta (PC-10, producto de Olympus Corporation), y se microinyectaron aproximadamente 2 µ? de la solución viral preparada en el Ejemplo 2, en el centro de la cavidad blastodérmica utilizando un microinyector (Transjector 5246, producto de Eppendorf, Co., Ltd.). Después de rellenar con albumen hasta el borde cortado de este cascarón, película de Teflón (MilliWrap, producto de Millipore Corporation) y envoltura de cloruro de plivinilideno (Sarán Wrap, producto de Asahi asei Corporation) se utilizaron para cubrir el huevo utilizando albumen como una pasta. Luego, la incubación se llevó a cabo mientras que se rotaba el huevo a 90 grados cada 15 minutos. Después del lapso de 12 y 24 horas desde el inicio de la incubación, el huevo fértil se trató de la misma manera. Después de aproximadamente 50 horas desde el inicio de la incubación, se observó la generación de un vaso sanguíneo sobre la superficie de la yema de huevo; una parte del mismo se pulsó, de este modo se observó que una parte del mismo se vuelve un campo cardiaco con un microscopio estereoscópico. Después del lapso de 50, 55 y 60 horas desde el inicio de la incubación, 2 µ? de la solución del virus preparada en el Ejemplo 2 se microinyectaron al corazón utilizando un microinyector. (Ejemplo 5) Medición de la actividad de ß-galactosidasa Después del lapso de 115 horas desde el inicio de la incubación, el embrión fue retirado del cascarón, y se lavó con PBS (solución amortiguadora de fosfato) para eliminar una membrana que encierra el embrión. El embrión retirado fue finamente cortado, y se le agregaron 0.8 mi de un amortiguador de reacción (cloruro de potasio 10 mM, cloruro de magnesio 1 mM, Tritón X-100 0.1% (producto de Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), 2 -mercaptoetanol 5 mM (producto de Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), y amortiguador de fosfato 2 mM pH 7.5), y se sometió a desintegración ultrasónica para obtener un líquido celular. 0.6 mi del líquido celular se incubaron a 37°C por 10 minutos, y se agregó 0.1 mi de un líquido preparado mediante la disolución de 4 mg/ml de o-nitrofß???-ß-D-galactopiranósido (ONPG) (producto de Sigma Corporation) en amortiguador de fosfato 0.1 M (pH 7.5) calentado de antemano. Después de la reacción, se agregaron 0.3 mi de carbonato de sodio 1 M (producto de Wako Puré Chemical Industries, Ltd.) y se midió la fuerza de la longitud de onda a 420 nm con un medidor de adsorción. La actividad de ß-galactosidasa fue expresada en término de la unidad de ONPG (1 unidad: actividad con la cual 1 µt??? de o-nitrofenol es generada por minuto) . El experimento fue llevado a cabo tres veces, y el valor promedio del mismo fue utilizado como la actividad de ß-galactosidasa . La relación entre el tiempo de introducción del gen y el resultado de la medición de la actividad de la ß-galactosidasa de los pollo y de las codornices se mostró en la Figura 2 y en la Figura 3. En las codornices, el gen de la ß-galactosidasa se introdujo después de 48 horas de la incubación, y en los pollos, aquel introducido después de 55 horas fue expresado más fuerte que aquellos introducidos anteriormente. Estos hallazgos sugieren que el mecanismo de inactivación (silenciamiento) del retrovirus para los genes exógenos que tienen los huevos fértiles de ave, es notable inmediatamente después de la fertilización, pero se llega a debilitar con el lapso de tiempo. De este modo, se vuelve posible producir un ave quimera transgériica GO que expresa eficientemente el transgen sin ser inactivado por la introducción de un gen deseado a un huevo fértil, después del lapso de un tiempo específico, el cual depende de la especie del ave. (Ejemplo 6) Eficiencia de la expresión del gen por el título viral La solulucíón viral a 1 x 108 cfu/ml preparada en el Ejemplo 2 se diluyó con solventes de dilución (Tris-HCl 50 mM (pH 7.8), cloruro de sodio 130 mM, y solución de EDTA 1 mM) en tres etapas de 10 veces, 100 veces, y 1000 veces. De este modo, se prepararon soluciones virales con títulos de 1 x 107, 1 x 106, y 1 x 105 cfu/ml. Se incubaron huevos fértiles de codorniz, y a los corazones en desarrollo temprano después de 48 horas, se les microinyectaron 2 µ? de las soluciones virales preparadas. De la misma manera, como un control, se inyectaron 2 µ? del solvente de dilución solo, a un corazón en desarrollo temprano después de 48 horas.
Después del lapso de 115 horas desde el inicio de la incubación, se midió la actividad de ß-galactosidasa de acuerdo al Ejemplo 5. La relación entre el título viral y el resultado de expresión del gen en las codornices, se mostró en la Figura . De la misma manera, huevos fértiles de pollo fueron incubados, y a corazones en desarrollo temprano después de 55 horas, se microinyectaron 2 µ? de las soluciones virales preparadas. Como un control, 2 µ? del solvente de dilución solo se inyectaron a un corazón en desarrollo temprano después de 55 horas. Después del lapso de 115 horas desde el inicio de la. incubación, se midió la actividad de ß-galactosidasa de acuerdo al Ejemplo 5. La relación entre el título viral y el resultado de la expresión del gen, en pollos, se mostró en la Figura 5. En la codorniz y el pollo inyectados con 1 x 108 cfu/ml de virus, se observó actividad notable de ß-galactosidasa, y en aquellos inyectados con las menores concentraciones, las cantidades de expresión fueron bajas. Se sugirió que el título viral afecta en gran medida la expresión del transgen, es decir, para expresar eficientemente el transgen con el ave quimera transgénica G0 de la invención, es efectivo el uso del vector defectuoso en replicación, de alto título.
(Ejemplo 7) Habilidad de transición de un anticuerpo humano a un huevo de codorniz y de pollo Una mezcla que comprende los anticuerpos humanos que tienen tres subclases (IgG 1, 2 y 3) (producto de Cosmo Bio Co., Ltd.) y las tres especies correspondientes de los fragmentos de anticuerpo (Fab-1, Fab-2, Fab-3, Fc-1, Fc-2, y Fc-3) (productos de Cosmo Bio Co., Ltd.) se diluyeron con PBS para ser de 100 pg/ml. 100 µ? de las soluciones diluidas fueron inyectados dentro de las venas bajo las alas de las codornices adultas (tres aves) o de los pollos adultos (tres aves) . Los huevos fueron recolectados a partir del siguiente día hasta el 20° día de la inyección del anticuerpo dentro de las venas, y los anticuerpos transferidos a los huevos fueron cuantificados . La yema de huevo y el albumen o clara se diluyeron al 50% (P/V) y 10% (V/V) con PBS, respectivamente, y se preservaron en estado congelado para ser utilizados como muestras de medición. (Ejemplo 8) Cuantificación de un anticuerpo en huevos mediante el método de ELISA Un anticuerpos IgG anti-humano -(producto de Cosmo
Bio Co., Ltd.) diluido con PBS se colocó en placas de ELISA en 100 µ?/????, y se dejó reposar a 4°C toda la noche. Cada placa se lavó con 200 µ? de PBS-solución de Tween 20 al 0.05% tres veces, y luego PBS-solución de Tween 20 al 0.5%-2% de leche descremada se agregaron en los pozos a 150 µ?/????. Después de permitir que las mezclas reposaran a temperatura ambiente por 2 horas, los pozos fueron lavados con 200 µ? de solución de PBS-Tween 20 al 0.05% tres veces. Luego, las muestras de sangre, de albumen y de yema de huevo se colocaron en éstos a 120 µ?, y las mezclas se dejaron reposar a 4°C toda la noche. Después de devolver estas placas de ELISA hasta la temperatura ambiente, cada pozo fue lavado con solución de PBS-Tween 20 tres veces, el anticuerpo IgG anti-humano marcado con peroxidasa (POD) (producto de Cosrao Bio Co., Ltd.) diluido con solución de PBS-Tween 20 al 0.05%, se colocó en cada pozo a 100 µ?/????, y se dejó reposar por 1 hora a temperatura ambiente . Los pozos se lavaron con solución de PBS-tween 20 al 0.05% cuatro veces, y 100 µ? de un líquido de coloración (preparado mediante la disolución de 10 mg de o-fenilendiamina (producto de Katayama Chemical Industry Co. , Ltd.) en 1 mi de metanol, diluyendo con agua destilada para ser de 100 mi, y agregando 10 µ? de peróxido de hidrógeno (producto de Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) se agregó a los pozos. Luego, se agregaron 50 µ? áe ácido sulfúrico 8 M para apagar la reacción, y la intensidad de fluorescencia a 490 nm fue determinada con un lector de placa para calcular la concentración a partir de la curva de calibración estándar. El resultado fue obtenido medíante el promedio de las concentraciones de anticuerpo de las muestras obtenidas a partir de tres codornices y pollos. El anticuerpo estándar para la construcción de la curva de calibración estándar (producto de Cosmo Bio Co . , Ltd.) se diluyó con yema de huevo al 50%-PBS (P/V) . Las concentraciones de anticuerpo acumuladas en los huevos de codorniz y pollo se muestran en las Figuras 6 y 7. Las concentraciones de los fragmentos Fab y Fe acumuladas en los huevos de codorniz y pollo se muestran en las Figuras 8, 9, 10 y 11. En codornices y pollos, se encontró que el anticuerpo IgG humano, en las subclases IgG2 humana e IgGl humana, fueron eficientemente acumulados en huevos. Además, ya que el fragmento Fe mostró alta habilidad de transición a los huevos, se sugirió que el receptor de Fe interviene en la transición de IgG humana. (Ejemplo 9) Producción de una construcción del vector de expresión de anticuerpo anti-CD2 Construcciones vector para la expresión del anticuerpo anti-CD2, pMSCV/GAAH, pMSCV/GAAL, y pMSCV/GÁALIH se produjeron como sigue. 1. El ARNm fue obtenido de la célula hibridoma
D253-15-6 que produce el anticuerpo humano (IgM) (American Type Culture Collection HB-8789) utilizando el Equipo de Purificación de ARNm Quick Prep Micro (producto de Pharmacia K.K.), y una biblioteca de ADNc fue preparada utilizando el Equipo de Síntesis de ADNc de Primera Hebra (producto de Pharmacia .K.) a partir del ARNm obtenido. Mediante PCR (94°C/1 minuto, 50°C/l minuto, 72°C/1.5 minutos: 25 ciclos; ADN-polimerasa Taq (producto de PerkinElmer, Inc.)) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5'-atcctcgagaggccaaagtacagtg-3 ' (SEQ ID NO: 7); la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xhol) y 5'-cccggatccctaacactctcccctgttgaagct-3' (SEQ ID NO: 8; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI) como cebadores, un fragmento génico de la región constante ? de la cadena L del anticuerpos humano (hQ) se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc anteriormente mencionada, cortada con las enzimas de restricción Xhol y BamHI, y luego se insertó dentro de los sitios Xhol y BamHI del plásmido pBluescript IIKS (-) ,
(producto de Stratagene) para producir el plásmido pBlue/hQ. 2. De la misma manera, mediante PCR utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5' -agcggccgctacaggtgtccactccgacatcgtgatgacccagtctcc-3 ' (SEQ ID NO: 9; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Notl) y 5 ' -cctctcgaggatagaagttattcagcaggcacac-3 ' (SEQ ID NO: 10; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xhol) como cebadores, un fragmento del gen de la región variable de la cadena L del anticuerpo humano (hVL) se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc, se cortó con las enzimas de restricción Notl y Xhol, y luego se insertó dentro de los sitios Notl y Xhol de pBluescript IIKS (-) para producir el plásmido pBlue/hVL. 3. De la misma manera, mediante PCR utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5'-acctcgagcgtggccgttggctgcctcgcaca-3 ' (SEQ ID NO: 11; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xhol) y 5 ' -actaagcttacgttgtacagggtgggtttacc-3 ' (SEQ ID NO: 12; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción HindIII) como cebadores, un fragmento génico de la región constante µ de la cadena H del anticuerpo humano
(???µ) se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc, cortada con las enzimas de restricción Xhol y HindIII, y luego insertada dentro de los sitios Xhol y HindIII de pBluescrip IIKS (-) para producir el plásmido pBlue/hCp. 4. De la misma manera, mediante PCR utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5'-agcggccgctacaggtgtccactccgaggtgcagctggtggagtctgg-3 ' (SEQ ID NO: 13; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Notl) y 5 ' -cacgctcgaggtatccgacggggaattctcacagga-3' (SEQ ID NO: 14; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xhol) como cebadores, un fragmento génico de la región variable de la cadena H del anticuerpo humano (hVH) se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc anterior, cortada con enzimas de restricción Notl y Xhol, y luego insertada dentro de los sitios Notl y Xhol de pBluescript IIKS (-) para producir el plásmido pBlue/hVH. 5. A partir de pBlue/hCK, el fragmento del gen hC se cortó utilizando las enzimas de restricción Xhol y BamHI , y luego insertado dentro de los sitios Xhol y BamHI del plásmido pCEP4 (producto de Invitrogen Corporation) para producir el plásmido pCEP4/hCK. 6. Dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5'-cccaagcttgatctccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctg-3 ' (SEQ ID NO: 15); la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción HindIII) y 5'-cccggatcctcagtcaaggcgccttcgcatgaagaggccgatccccagggccaccaccagc agcaagaggagggcccc-3 ' (SEQ ID NO: 16; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI) se recocieron sobre 21 pares de bases con un extremo 3' complementaria para producir un fragmento génico de la región de penetración de la membrana del receptor del factor de crecimiento epidérmico (TM) mediante reacción de síntesis de doble hebra de ADN utilizando la ADN-polimerasa T4 (Takara Shuzo Co., Ltd.).- El fragmento del gen TM obtenido fue tratado con las enzimas de restricción HindIII y BamHI, y luego insertado dentro de los sitios HindIII y BamHI de pBluescript IIKS (-) para producir el plásmido pBlue/TM.
7. A partir de ?????ß/???µ, el fragmento del gen ??µ fue cortada utilizando las enzimas de restricción Xhol y Hindlll, y luego insertado dentro de los sitios Xhol y Hindlll de pBlue/TM para producir el plásmido pBlue/hC TM. 8. A partir de pBlu/hC^TM, un fragmento que contenía una serie de genes ??µ y el gen TM fue cortado utilizando las enzimas de restricción Xhol y BamHI , y luego insertado dentro de los sitios Xhol y BamHI de pCEP4 para producir el plásmido ?0??4/?0µ??. 9. Se cortó pCEP4/hC TM con la enzima de restricción BamHI, y el extremo se trató para ser liso con la ADN-polimerasa T4 para producir el plásmido pCEP4/hC TMAB mediante autoligadura . 10. Mediante mutagénesis específica del sitio utilizando un oligonucleótido de quimiosíntesis 5'-tgaagacagatggcgccgccacagttcgttt-3 ' (SEQ ID NO: 17; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción NarI) , el sitio de la enzima de restricción NarI se introdujo dentro del extremo 3 ' de hVL contenido en pBlue/hVL sin cambiar los codones de aminoácidos para producir el plásmido pBlue/hVLN. 11. Mediante mutagénesis específica del sitio utilizando un oligonucleótido de quimiosíntesis 5'-tggggcggatgcggatcctgaggagacggt-3 ' (SEQ ID NO: 18; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI,), el sitio de la enzima de restricción BamHI fue introducido dentro del extremo 3 ' de hVL contenido en pBlue/hVL sin cambiar los codones de aminoácidos para producir el plásmido pBlue/hVHB. 12. El ARNm fue obtenido de la célula hibridoma
TS2/18.1.1 productora de anticuerpo de ratón anti-CD2 humano (American Type Culture Collection HB-195) utilizando el Equipo de Purificación de ARNm Quick Prep Micro, y una biblioteca de ADNc fue preparada utilizando el Equipo de Síntesis de ADNc First-Strand a partir el ARNm obtenido. Mediante PCR utilizando los oligonucleótidos de quimiosintesis 5 ' -cgcggccgcctcagggaaagtttgaagatg-3 ' (SEQ ID NO: 19; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Notl) y 5 ' -cggcgccgccacagtccgttttatttccagcttggt-3' (SEQ ID NO: 20; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción NarI) como cebadores, un fragmento de gen de la región variable de la cadena L del anticuerpo de ratón (mVL) fue amplificado a partir de la biblioteca de ADNc anterior, cortada con las enzimas de restricción Notl y NarI, y luego insertada dentro de los sitios Notl y NarI de pBlue/hVLN para producir el plásmido pBlue/mVL. 13. De la misma manera, mediante PCR utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5'-cgcggccgcgaacacggamccctcaccatg-3 ' (SEQ ID NO: 21; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Notl) y 5'-cggatcctgcagagacagtgaccagagt-3 ' (SEQ ID NO: 22; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI) como cebadores, un fragmento de gen de la región variable de la cadena H del anticuerpo de ratón (mVH) se amplificó a partir de la biblioteca de ADNc anteriormente mencionada, se cortó con las enzimas de restricción Notl y BamHI, y luego se insertó dentro de los sitios Notl y BamHI de pBluescript IIKS (-) para producir el plásmido pBlue/mVH. 14. A partir de pBlue/mVL, el fragmento del gen mVL fue cortado con las enzimas de restricción Notl y Xhol, y luego se insertó dentro de los sitios Notl y Xhol de pCEP4/hCK para producir el plásmido pCEP4/lgLK. 15. A partir de pBlue/hVHB, el fragmento del gen hVH fue cortado con las enzimas de restricción Notl y Xhol, y luego insertado dentro de los sitios Notl y Xhol de ????4/??µ???? para producir el plásmido ????4/?¾?µ??. 16. A partir del pBlue/mVH, el fragmento del gen mVH fue cortado con las enzimas de restricción Notl y BamHI, y luego ligado a un fragmento vector de ????4/1?¾?µ?? tratado con las enzimas de restricción Notl y BamHI para producir el plásmido ????4/¾?µ??. 17. A partir del plásmido pMSCVneo (producto de BD Biosciences Clontech) , un fragmento que contenía una serie de promotores de fosfoglicerato-cinasa murina (PGK) y el gen Neor, fue retirado con las enzimas de restricción BglII y BamHI, y el plásmido pMSCV fue producido mediante autoligadura del f agmento vector remanente . 18. A partir del plásmido pGREEN LANTERN-1 (producto de Gibco BRL) , el fragmento del gen GFP fue cortado con la enzima de restricción Notl, y luego insertado dentro del sitio Notl de pZeoSV2 (+) . El plásmido que tiene la estructura del gen GFP que se inserta en la misma dirección que el promotor T7 fue nombrado pZeo/GFP. 19. A partir de pZeo/GFP, el fragmento del gen GFP fue cortado con las enzimas de restricción EcoRI y Xhol, y luego ligado a un fragmento vector de pMSCV tratado con las enzimas de restricción EcoRI y Xhol para producir el plásmido pMSCV/G. 20. El ARNm fue obtenido de la célula de mieloma
IM-9 productora del anticuerpo humano (IgGl) (Colección Japonesa de Research Bioresources 0024) utilizando el equipo de aislamiento de ARNm (producto de Roche Ltd.), y se preparó una biblioteca de ADNc utilizando ReverTra Ace (producto de Toyobo Co., Ltd.) a partir del ARNm obtenido. Mediante PCR (95°C/2 minutos, 52°C/30 segundos, 74°C/3 minutos: 30 ciclos; ADN-polimerasa Pfu (producto de Promega Corporation)) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5'~ caagcttcaagggcccat-3 ' (SEQ ID NO: 23) y 5'-atttacccggagacaggga-3 ' (SEQ ID NO: 24), un fragmento de gen de la región constante ?? de la cadena H del anticuerpo humano (hCyl) fue amplificado a partir de la biblioteca de ADNc anterior. Además, mediante PCR (94°C/15 segundos, 58°C/30 segundos, 68°C/l minuto: 30 ciclos; la KOD-plus-ADN-polimerasa) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5 ' -ataggatccgctagcttcaagggcccatcg-3 ' (SEQ ID NO: 25; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción BamHI) y 5 ' -agcaagctttcatttacccggagacaggga-3 ' (SEQ ID NO: 26; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción HindIII) , como cebadores, el fragmento del gen hCyl fue amplificado a partir del producto de PCR anterior, cortado con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, y luego insertado dentro de los sitios BamHI y HindIII de pBluescript
IISK (+) para producir el plásmido pBlue/hCyl. 21. A partir de ????4/¾?µ??, el fragmento del gen mVH fue cortado con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. A partir de pBlue/hCyl, el fragmento del gen hCyl fue cortado con las enzimas de restricción BamHI y HindIII. A un fragmento vector del plásmido pETBlue-2 (producto de Novagen, Inc.) tratado con la enzima de restricción HindIII, los anteriores dos fragmentos cortados fueron ligados para producir el plásmido pETBlue/lgHyl . ¦ 22. A partir de pETBlue/lgHyl , un fragmento del gen de la cadena ?? del anticuerpo H (IgHyl) se cortó con la enzima de restricción HindIII, y se insertó dentro del sitio HindIII de pMSCV/G. El plásmido que tenía la estructura de
IgHyl que es insertado en la misma dirección que el gen GFP, fue nombrado pMSCV/GH. 23. Mediante PCR (94°C/15 segundos, 50°C/30 segundos, 68°C/l minuto: 10 ciclos; 94°C/l5 segundos, 62°C/30 segundos, 58°C/l minuto: 30 ciclos) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5 ' -acgcgtcgacgtgcatgcacgctcattg-3 ' (SEQ ID NO: 27; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Salí) y 5'-acgcgtcgacaacgcagcgactcccg-3 ' (SEQ ID NO: 28; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Salí) como cebadores, el fragmento del promotor ct fue amplificado a partir de pMiwZ, cortado con la enzima de restricción Salí, e insertado dentro del sitio Salí de pETBlue-2 para producir el plásmido pETBlue/ÁAct . 24. A partir de pETBlue/ÁAct , el fragmento promotor AAct fue cortado con la enzima de restricción Salí, e insertado dentro del sitio Xhol de pMSCV/GH. El plásmido que tenía la estructura del promotor AAct que se insertó en la misma dirección que el gen IgHyl, fue nombrado pMSCV/GAAH. 25. Mediante PCR (95°C/30 segundos, 50°C/30 segundos, 74°C/2 minutos: 10 ciclos; 95°C/30 segundos, 60°C/30 segundos, 74°C/2 minutos: 30 ciclos; ADN-polimerasa Pfu) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5'-aatgtcgacatggtgtccacttctcagctc-3 ' (SEQ ID NO: 29; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Salí) y 5' -ttcgtcgacctaacactctcccctgttgaa-3 ' (SEQ ID NO: 30; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Salí ) como cebadores , un fragmento del gen de la cadena ? del anticuerpo L ( IgLK) se amplificó a partir de pCEP4/lgLK, cortado con la enzima de restricción Salí , y luego insertado dentro del sitio Salí de pETBlue-2 para producir el plásmido pETBlue/lgLK . 26 . A partir de pETBlue/AAct , el fragmento del promotor ct fue cortado con la enzima de restricción Salí , y luego insertado dentro del sitio Xhol de pMSCV/G. El plásmido que tenía la estructura del promotor Ahct que se insertó en la misma dirección que el gen GFP, fue nombrado pMSCV/G . 27 . A partir de pETBlue/lgLK, el fragmento del gen IglK fue cortado con la enzima de restricción Salí , y luego insertado dentro del sitio Salí de pMSCV/GAA . El plásmido que tenía la estructura del fragmento del gen de IgLK que se insertó en la misma dirección que el promotor AAct fue nombrado pMSCV/GÁAL . 28 . Mediante PCR (94°C/15 segundos, 60°C/30 segundos, 68°C/l minuto: 30 ciclos) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5 ' -acgcgtcgaccgcccctctccctccccc-3 ' ( SEQ ID NO : 31 ; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Salí) y 5 ' -ccgctcgagattatcatcgtgtttttcaaaggaaaaccacgtc-3 ' (SEQ ID NO: 32 ; la porción subrayada es el sitio de la enzima de restricción Xhol) como cebadores, el fragmento IRES fue amplificado a partir del plásmido pLXIN (producto de BD Biosciences Clontech) , cortado con las enzimas de restricción Salí y Xhol, y luego insertado dentro de los sitios Salí y Xhol de pETBlue-2 para producir el plásmido pETBlue/lRES . 29. A partir de pETBlue/ IRES , el fragmento de IRES fue cortado con las enzimas de restricción Salí y Xhol, y luego insertado dentro del sitio Salí de p SCV/GAAH. El plásmido que tenía la estructura de IRES que se insertó en la misma dirección que el gen de IgHyl, fue nombrado pMSCV/GAAIH. 30. A partir de pETBlue/lgLK, el fragmento del gen IgLK fue cortado con la enzima de restricción Salí, y luego insertado dentro del sitio Salí de pMSCV/GAAIH. El plásmido que tenia la estructura del fragmento del gen de IgLK que se insertó en la misma dirección que el promotor AAct, fue nombrado pMSCV/GAALIH . La construcción vector producida de este modo del vector retroviral defectuoso en replicación pMSCV/GAAH, pMSCV/GAAL y pMSCV/GAALIH se muestran en la Figura 12.
(Ejemplo 10) Producción de la codorniz quimera transgénica G0 que expresa el anticuerpo anti-CD2 De acuerdo al Ejemplo 2, se prepararon tres especies de vectores retrovirales a partir de las construcciones vector pMSCV/GÁAH , pMSCV/GAAL y pMSCV/GAALIH . Los títulos de estos vectores retrovirales fueron medidos y se encontró que eran de 108 cfu/ml hasta 109 cfu/ml. Los vectores retrovirales obtenidos fueron microinyectados a corazones de huevos fértiles de codorniz después de 36 horas a partir del inicio de la incubación, de acuerdo al Ejemplo 3, y los huevos fueron incubados mientras que se hacían girar los huevos a 90 grados cada 15 minutos a 37.9°C y humedad de 65%. Con el fin de provocar que un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, sea expresado en animales transgéni eos , es presumible un método que comprende la introducción de un vector que expresa una cadena ligera, y un vector que expresa una cadena pesada individualmente, y un método que comprende la división de los genes que expresan una cadena ligera, y los genes que expresan una cadena pesada, con una secuencia tal como IRES, y · la introducción del mismo como el mismo vector. De este modo, la inyección fue llevada a cabo separadamente en el caso donde pMSCV/GÁAH y pMSCV/GÁAL fueron infectados al mismo tiempo (Ejemplo 11 y Ejemplo Experimental 1) , y un caso donde un vector preparado mediante pMSCV/GÁALIH fue introducido solo (Ejemplo 11 y Ejemplo Experimental 2) . Después de 48 horas desde el inicio de la incubación, se confirmó que la generación procedió normalmente, y luego el embrión con el virus introducido fue transferido a un huevo de gallina de tamaño S en el cual se perforó un circulo de 4 cm de diámetro sobre el extremo ancho del huevo . Con la colocación del embrión hacia arriba para ser expuesto al aire, se agregaron 0.5 mi de lactato de calcio (producto de Sigma Corporation) en solución, suspendido en albumen a la concentración de 50 mg/ml, y el huevo fue sellado con envoltura utlizando albumen como una pasta. El huevo fue nuevamente colocado en una incubadora, y se incubó por 13 días a 37.9°C y humedad 65% con rotaciones a 60 grados cada hora. Luego, la rotación se detuvo y el huevo se dej reposar. Cuando el embrión cambió a respiración pulmonar, se realizó un pequeño orificio sobre la envoltura con una aguja, para ayudar a la respiración. Cuando la sangre en el corioalantoides se redujo, se tomo un pollo bebé de la incubadora y se empolló . (Ejemplo 11) Determinación de la concentración del anticuerpo anti-CD2 en suero y en huevo Codornices quimera transgénicas GO empolladas en el
Ejemplo 10 fueron criadas por un mes para desarrollar polluelos bebés. Después de 30 y 60 días, la sangre fue muestreada de las venas bajo las alas de las codornices transgénicas GO desarrolladas, para obtener muestras de sangre. La sangre obtenida fue centrifugada por 10 minutos a 15,000 rpm, y se determinó la cantidad de anticuerpo anti-CD2 del suero, obtenido como sobrenadante. Después de 1.5 meses desde el empollamiento, los huevos fueron recolectados de las codornices transgénicas hembra que comenzaron a poner huevos, y la cantidad del anticuerpo anti-CD2 en el albumen (clara) y la yema del huevo preparada de acuerdo al Ejemplo 7, se determinó mediante el método de ELISA de acuerdo al Ejemplo 8. Los resultados de la cuantificación del Ejemplo Experimental 1 y del Ejemplo Experimental 2 fueron mostrados. (Ejemplo Experimental 1) La codorniz quimera transgénica G0 (número de identificación individual #1113) infectada simultáneamente con los vectores (3 a 4 x 108 cfu/ml) preparados a partir de pMSCV/GAAH y p SCV/GÁAL expresaron el anticuerpo anti-CD2 a concentraciones de 0.6 µ9/t?1 en yema de huevo, y 0.5 µ9/a?1 en albumen . (Ejemplo Experimental 2) La codorniz quimera transgénica G0 (#4202) a la que se le introdujo un vector preparado a partir de pMSCV/GAALIH
(5 x 108 cfu/ml) solo, expresó 5.2 µ9/p?1 del anticuerpo anti-CD2 en suero . (Ejemplo 12) Producción de una construcción vector de expresión del anticuerpo scFv-Fc La construcción vector de expresión del anticuerpo scFv-Fc, pMSCV/scFv-Fc se produjo como sigue. 1. Dos oligonucleótidos de quimiosintesis que tienen los extremos 5' fosforilados , 5'-ctagaccatgaggtctttgctaatcttggtgctttgcttcctgcccctggctgctctgggg -3' (SEQ ID NO: 33; ctaga es el extremo del sitio de reconocimiento Xbal , y gg es el extremo del sitio de reconocimiento HaelII) y 5'-ccccagagcagccaggggcaggaagcaaagcaccaagattagcaaagacctcatggt-3 ' (SEQ ID NO: 34; ce es el extremo del sitio de reconocimiento Xbal, y t es el extremo del sitio de reconocimiento HaelII) fueron recocidos para preparar un fragmento génico de la señal de secreción de lisozima. Mediante PCR (94°C/15 segundos, 58°C/30 segundos, 68°C/l minuto: 30 ciclos; KOD-Plus-ADN-polimerasa) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5' -gcgtttaaagtgacgttggacgtccg-3 ' (SEQ ID NO: 35; tttaaa es el sitio de la enzima de restricción Dral) y 5 ' -attaggatccgcgcttaaggacggtcagg-3 ' (SEQ ID NO: 36; ggatcc es el sitio de la enzima de restricción BamHI) como cebadores, un fragmento del gen scFv fue amplificado a partir del plásmido pPDS/scFv que contenía un gen de un anticuerpo de hebra simple (scFv) preparado a partir del gen de la región variable del anticuerpo de pollo de la célula HUC2-13 (Nakamura et al., 2000, y Cytotechonology 32: 191-198), y cortado con las enzimas de restricción Dral y BamHI. Los dos fragmentos anteriormente preparados fueron insertados dentro de los sitios Xbal y BamHI de pBluescript IISK (+) para producir el plásmido pBlue/scFv. 2. El fragmento del gen scFv fue cortado con las enzimas de restricción Notl y BamHI a partir de pBlue/scFv, y luego insertado dentro de los sitios Notl y BamHI de pCEP4 para producir el plásmido pCEP4/scFv. 3. El ARNm fue obtenido a partir de la célula de mileoma IM-9 productora de IgGl humana, utilizando el equipo de aislamiento de A Nm, y se preparó una biblioteca de ADNc utilizando ReverTra Ace a patir del ARNm obtenido. Mediante PCR (95°C/2 minutos, 52°C/30 segundos, 74°C/3 minutos: 30 ciclos; ADN-polimerasa Pfu) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosíntesis 5 ' -caagcttcaagggcccat-3 ' (SEQ ID NO: 23) y 5 ' -atttacccggagacaggga-3 ' (SEQ ID NO: 24) como cebadores, el fragmento del gen hCyl fue amplificado a partir de la biblioteca de ADNc anterior. Además, mediante PCR (94°C/15 segundos, 58°C/30 segundos, 68°C/l minuto: 30 ciclos,- KOD-plus-ADN-polimerasa) utilizando dos oligonucleótidos de quimiosintesis 5 ' -attaggatccgagcccaaatcttgtgacaaaactc-3 ' (SEQ ID NO: 37; ggatcc es el sitio de la enzima de restricción BamHI) y 5 ' -agcaagctttcatttacccggagacaggga-3 ' (SEQ ID NO: 26; aagctt es el sitio de la enzima de restricción HindIII) como cebadores, un fragmento del gen de la región Fe (Fe) de la cadena ?? del anticuerpo H humano se amplificó a partir del producto de PCR anterior, cortado con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, y luego insertado dentro de los sitios BamHI y HindIII de pBluescript IISK (+) para producir el plásmido pBlue/Fc. 4. A partir de pCEP4/scFv, un fragmento del gen scFv fue cortado con las enzimas de restricción HindIII y
BamHI. A partir de pBlue/Fc, un fragmento del gen Fe fue cortado con las enzimas de restricción BamHI y HindIII. Los dos fragmentos cortados anteriores fueron insertados dentro del sitio HindIII de pBluescript IISK (+) para producir el plásmido pBlue/scFv-Fc . 5. A partir de pBlue/scFv-Fc, un fragmento del gen que tiene la estructura de la cadena ??-Fc del anticuerpo H humano, que está ligado a una región variable del anticuerpo de cadena simple de pollo (scFv-Fc) se cortó con la enzima de restricción HindIII, y se ligó a un fragmento vector de pMSCV/GAAH tratado con la enzima de restricción HindIII. El plásrnido que tenia- la estructura de un gen scFv-Fc que está ligado en la misma dirección que el promotor AAct fue nombrado pMSCV/GAAscFv-Fc . La estructura de la construcción vector producida de este modo pMSCV/GÁAscFv-Fc del vector viral retrospectivo defectuoso en replicación, se mostró en la Figura 13. (Ejemplo 13) Producción de las codornices quimera transgénicas GO que expresan el anticuerpo scFv-Fc De acuerdo al Ejemplo 2, se preparó un vector retroviral a partir de la construcción vector pMSCV/GAAscFv-Fc. El título de este vector retroviral fue determinado y se encontró que era de 108 cfu/ml a 109 cfu/ml. De acuerdo al Ejemplo 3, la solución obtenida del vector viral fue mícroineyctada de los corazones de huevos fértiles de codorniz después de 36 horas desde el inicio de la incubación. Los huevos fueron empollados de acuerdo al Ejemplo 10 para producir codornices quimera transgénicas GO . (Ejemplo 14) Determinación de la concentración de scFv-Fc en suero y en huevo Las codornices quimera transgénicas GO producidas en el Ejemplo 13 fueron creadas para desarrollar polluelos bebés. Después del lapso de 30 y 60 días, la sangre fue muestreada de las venas bajo las alas de las codornices quimera transgénicas G0 desarrolladas (número de identificación individual #3303, #3306, #3310, #3311 y #3313) para obtener muestras de sangre. La sangre obtenida fue centrifugada a 15,000 rpm por 10 minutos, y la cantidad de los anticuerpos scFv-Fc fue determinada a partir del suero obtenido como sobrenadante. Los huevos fueron recolectados de las codornices transgénicas hembras que comenzaron a poner huevos (número de identificación individual #3310) después de 1.5 meses desde el empol lamiento , y la cantidad del anticuerpo scFv-Fc en albumen y en yema de huevo preparado de acuerdo al Ejemplo 7, fue cuantificado mediante el método de ELISA de acuerdo al Ej emplo 8. La curva de calibración estándar fue construida utilizando un scFv-Fc purificado. La construcción vector pMSCV/ scFv-Fc producida en el Ejemplo 12 fue introducida dentro de la célula GP293 mediante el método de lipofección, y el sobrenadante de cultivo fue centrifugado a 3000 rpm y 4°C por 10 minutos, para retirar los materiales sólidos. Mientras que se enfriaba, este sobrenadante fue agitado y gradualmente se le agrego sulfato de amonio finamente triturado, para estar a una saturación del 50% (313 g de sulfato de amonio/1000 mi de agua) para precipitar la proteína. La mezcla se dejó reposar a 4°C toda la noche, y se centrifugó a 15,000 rpm y 4°C por 10 minutos para precipitar completamente la proteina. La proteína precipitada fue luego disuelta en una pequeña cantidad de PBS , y dializada por 2 litros de PBS tres veces para retirar el sulfato de amonio . El lavado inicial de la columna de proteína G para la purificación (producto de Perseptive Biosystems, Inc.) se llevó a cabo utilizando 10 mi de un amortiguador de enlace (NaHP04-2H20 1.56 g/litro, NaHP04-12H20 7.16 g/litro), 10 mi de un amortiguador de lavado (ácido acético 20%, agua destilada 80%) , y 10 mi del amortiguador de enlace (velocidad de flujo 2 ml/minuto) en este orden. El líquido con proteína disuelto en PBS se hizo fluir a 1 ml/minuto y un scFv-Fc fue adsorbido sobre una columna. Mediante el flujo de 20 mi del amortiguador de enlace a 1.7 ml/minuto, la proteína innecesaria fue retirada, y se utilizó un amortiguador de elución (preparado con glicina 7.507 g/litro y HCl 2 N a pH de 2.5 a 3.0) a 1.5 ml/minuto, para eluir el scFv-Fc. La fracción eluida fue dializada con 2 litros de PBS tres veces, para obtener un scFv-Fc purificado, y la concentración de la proteína fue cuantificada a partir de la adsorción a una longitud de onda de 280 nin. La cantidad del scPv-Fc en suero sanguíneo muestreado después de 30 y 60 días de las codornices quimera transgénicas G0 producidas en el Ejemplo 14, se mostró en la Figura 14. La codorniz quimera transgénica G0 a la que se le introdujo un gen de expresión del anticuerpo scFv-Fc, expresó aproximadamente 2 mg/ml hasta 4 mg/ml del anticuerpo en suero en el 30° día, y tres de cinco aves también mostraron el mismo grado de cantidad de expresión. A partir del día en que la codorniz quimera transgénica G0 (#3310) comenzó a poner huevos, la cantidad de scFv-Fc en la yema de huevo y en el albumen fue mostrada en la Figura 15. El anticuerpo fue expresado en aproximadamente 500 µ9/p?1 a 1 mg/ml en albumen y yema de huevo. Incluso existió una ligera variación desde el inicio de la puesta de huevos hasta el día 17, se mantuvo una cantidad de expresión estable. (Ejemplo 15) Confirmación de la estructura scFv-Fc A partir de 1 mi de suero de la codorniz quimera transgénica G0 producida en el Ejemplo 13, se purificó un scFv-Fc a partir de precipitación con sulfato de amonio y la columna de proteína G de acuerdo al Ejemplo 10. El scFv-Fc purificado fue analizado mediante SDS-PAGE, y el resultado se mostró en la Figura 16. A partir de la banda no tratada, fue mostrado él peso molecular de scFv-Fc de aproximadamente 120 kDa. Ya que el peso molecular del scFv-Fc sometido a tratamiento de reducción fue aproximadamente una mitad de aquellos no tratados (aproximadamente 60 kDa) , se encontró que el scFv-Fc producido por una codorniz quimera transgénica G0, forma un dímero por un enlace S-S. Estos correspondieron a la característica estructural del scFv-Fc que tiene un residuo de cisteina involucrado con un enlace S-S en la porción Fe, de este modo se sugirió que el scFv-Fc producido por una codorniz quimera transgénica G0 conservó la estructura correcta . (Ejemplo 16) Producción de pollos quimera transgénicos G0 que expresan la proteína de fusión TNFR-Fc De acuerdo al Ejemplo 9, se produjo la construcción del vector de expresión TNFR-Fc, y se produjo un vector retroviral de acuerdo al Ejemplo 2. El título de este vector retroviral fue de 1.7 x 107 cfu/ml . La solución vector viral obtenida fue microinyectada a corazones de huevos fértiles de pollo después de 55 horas desde el inicio de la incubación, de acuerdo al Ejemplo 4, y se empollaron de acuerdo al Ejemplo 10 para producir pollos quimera transgénicos GO . La solución fue inyectada a ocho huevos fértiles, y cuatro aves fueron empolladas . El TNFR-Fc en suero fue cuantificado de acuerdo al Ejemplo 14, y se encontró que es expresado TNFR-Fc de 50 9/t?1 a lo máximo. POSIBILIDAD DE APLICACIÓN INDUSTRIAL El ave quimera transgénica GO de la presente invención puede expresar eficientemente un gen introducido utilizando un vector retroviral defectuoso en replicación, sin provocar inactivación. Además, el método de producción de un ave quimera transgénica GO de la presente invención hace posible introducir un gen de un anticuerpo quimera, por ejemplo de un anticuerpo scFv-Fc, y producir aves capaces de expresar de manera eficiente el anticuerpo en sangre y en huevos. Además, el método de producción de un anticuerpo de la presente invención comprende la producción de un ave quimera transgénica GO que produce un anticuerpo quimera, por ejemplo un anticuerpo scFv-Fc, recuperando y purificando el anticuerpo a partir del suero y los huevos del ave, de este modo se hace posible la producción eficiente de un anticuerpo.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (59)
1. Un ave quimera transgénica GO, caracterizada porque : se le introduce un gen de anticuerpo exógeno con un vector retroviral defectuoso en replicación, y produce un anticuerpo derivado de un transgen en al menos uno de sangre, albumen (clara de huevo) , y yema de huevo .
2. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: una clase de una región constante del anticuerpo es la IgG humana.
3. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: una subclase de una región constante del anticuerpo es IgGl humana .
4. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: la región constante del anticuerpo es IgG de codorniz, IgG de pollo o IgG de ratón.
5. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque : el gen del anticuerpo es controlado por un promotor constitutivo .
6. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque: el promotor constitutivo es el promotor de la ß-actina .
7. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque : el vector retroviral es un vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney
8. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 7, caracterizada porque : el vector retroviral es un VSV-G pseudo-tipo uno.
9. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque : el ave es un pollo o codorniz.
10. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque : el anticuerpo es un anticuerpo quimera.
11. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque : contiene no menos de 0.5 µ9/t?1 del anticuerpo en sangre .
12. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque : contiene no menos de 5 g/ml del anticuerpo en sangre .
13. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque : contiene no menos de 0.1 µ9/p?1 del anticuerpo en albumen .
14. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque : contiene no menos de 1 µg/ml del anticuerpo en albumen.
15. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque : contiene no menos de 0.1 µg/ml del anticuerpo en yema de huevo .
16. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque : contiene no menos de 1 µ9/??1 del anticuerpo en yema de huevo .
17. El ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque: el anticuerpo es un anticuerpo scFv-Fc.
18. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque : contiene no menos de 20 µ9/t?1 del anticuerpo en sangre .
19. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque : contiene no menos de 2000 µg/ml del anticuerpo en sangre.
20. El ave quimera transgénica G0 de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque : contiene no menos de 5 µ9/p?1 del anticuerpo en albumen .
21. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque : contiene no menos de 500 µ9/??1 del anticuerpo en albumen.
22. El ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque : contiene no menos de 5 µg/ml del anticuerpo en yema de huevo .
23. El ave quimera transgénica G0 de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque : contiene no menos de 500 µg/ml del anticuerpo en yema de huevo .
24. Un método de producción de un anticuerpo, caracterizado porque: comprende la producción de ave quimera transgénica G0 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, y la recuperación del anticuerpo de la sangre y/o un huevo del ave quimera transgénica G0.
25. Un método de producción de un ave quimera transgénica GO, caracterizado porgue: comprende la incubación de un huevo fértil de ave, la infección de un embrión temprano después y exclusivo de un periodo bl astodérmico inmediatamente después de la deposición del huevo con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego el empollamiento del embrión.
26. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque: comprende la incubación de un huevo fértil de ave, la infección de un embrión temprano después del lapso de 24 horas o más desde el incio de la incubación con un vector retroviral defectuoso en replicación, y luego el empollamiento del embrión.
27. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con las reivindicaciones 25 ó 26, caracterizado porque: comprende la incubación de un huevo fértil de ave, y la mi croinyección de un vector retroviral defectuoso en replicación, a un corazón o vaso sinaguineo formado en el embrión temprano.
28. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porgue: comprende la incubación de un huevo fértil de ave, y la microinyección de un vector retroviral defectuoso en replicación, a un corazón o vaso sanguíneo formado en el embrión temprano, formado después del lapso de 24 horas o más desde el inicio de la incubación.
29. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque : comprende la microinyección de un vector retroviral defectuoso en replicación, que tiene el titulo no menor de 1 x 107 cfu/ml .
30. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque: comprende la microinyección de un vector retroviral defectuoso en replicación, que tiene el titulo no menor de 1 x 108cfu/ml.
31. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque: comprende la microinyección de un vector retroviral defectuoso en replicación, que tiene el título no menor de 1 x 109cfu/ml.
32. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, caracterizado porque : el vector retroviral es un vector derivado del virus de la leucemia murina de Moloney.
33. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, caracterizado porque : el vector retroviral es un VSV-G pseudo-tipo uno .
34. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, caracterizado porque : el ave es un pollo o una codorniz.
35. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34, caracterizado porque : una secuencia génica no derivada de un retrovirus está contenida en un transgen incorporado dentro de un vector retroviral defectuoso en replicación.
36. El método de producción de un ave quimera transgéníca GO de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque: la secuencia génica no derivada de un retrovirus es una secuencia génica controlada por el promotor de ß-actina de pollo.
37. El método de producción de un ave quimera transgéníca GO , de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque: la secuencia génica no derivada de un retrovirus es una secuencia génica que codifica para un gen de anticuerpo.
38. El método de producción de un ave quimera transgéníca GO de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque: el gen de anticuerpo es un gen de anticuerpo quimera .
39. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque: el gen de anticuerpo es un gen de anticuerpo scFv-Fc .
40. El método de producción de un ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, caracterizado porque: la secuencia génica no derivada de un retrovirus es una secuencia génica que codifica para un gen de proteína de fusión.
41. Un ave quimera transgénica GO caracterizada porque: es producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40.
42. Un método de producción de un ave transgénica, caracterizado porque comprende la cópula del ave quimera transgénica GO producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40, con un ave para cópula tipo alogénica, y luego el empollamiento del huevo.
43. El método de producción de un ave transgénica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque: el ave de cópula tipo alogénica es el ave transgénica GO producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40, o una progenie de la misma.
44. Un ave transgénica Gl , caracterizada porque : es obtenible mediante la cópula del ave transgénica GO producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40, con un ave de cópula tipo alogénica, y luego el empollamiento del huevo.
45. El ave transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque: el ave de cópula tipo alogénica es el ave transgénica G0 producida mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 40, o una progenie de la misma.
46. Un método de producción de un ave transgénica, caracterizada porque comprende la cópula adicional del ave transgénica Gl de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 ó 45, y luego el empollamiento del huevo.
47. Un ave transgénica G2 o una progenie de la misma, caracterizada porque: es obtenible mediante la cópula adicional del ave transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, y luego el empollamiento del huevo .
48. Un método de producción de una proteína, caracterizado porque: comprende la extracción de la proteína objetivo de una célula somática, la sangre o un huevo del ave transgénica producida mediante el método de conformidad con las reivindicaciones 42, 43 ó 46.
49. Un huevo puesto por el ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque: contiene no menos de 1 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
50. Un huevo puesto por el ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque: contiene no menos de 20 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
51. Un huevo puesto por el ave quimera transgénica GO de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque: contiene no menos de 100 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
52. Un huevo puesto por el ave quimera transgénica G0 de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque: contiene no menos de 200 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
53. Un huevo puesto por el ave quimera transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44 ó 45 o una progenie de la misma, caracterizada porque: contiene no menos de 1 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
54. Un huevo puesto por el ave transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44 ó 45 o una progenie de la misma, caracterizada porque: contiene no menos de 20 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
55. Un huevo puesto por el ave transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44 ó 45 o una progenie de la misma, caracterizada porque: contiene no menos de 100 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
56. Un huevo puesto por el ave transgénica Gl de conformidad con la reivindicación 44 ó 45 o una progenie de la misma, caracterizada porque: contiene no menos de 200 mg de una proteína heterogénea derivada de un transgen.
57. Un método de selección de un ave quimera transgénica de línea germinal, caracterizado porque: comprende la confirmación de un transgen en el esperma de un ave transgénica GO macho.
58. Un método de selección de un ave transgénica, caracterizado porgue: comprende la confirmación de una expresión de la proteína derivada del transgen, en sangre.
59. Un método de selección de un ave quimera transgénica G0, caracterizado porque: comprende la confirmación de una expresión de la proteína derivada del transgen, en sangre.
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