CN102199627B - 表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法 - Google Patents

表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法 Download PDF

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表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，属于基因工程。步骤有：将NTN和TH基因分别插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点，用筛选出的模板和引物PCR扩增得到双顺反子表达盒，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV转录和翻译，电转感受态细胞BJ-5183，筛选阳性克隆，经鉴定转化XL-10(Gold)宿主菌,在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。本发明重组腺病毒Ad-NTN-TH感染宿主细胞后能稳定转录和共表达NTN和TH，表达的功能蛋白NTN在体外促进鸡胚背根神经节生长突触，还能促进胎鼠多巴胺能神经元的存活，酪氨酸羟化酶TH在体外催化L-Tyrosine反应生成L-DOPA。

Description

表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程，特别是表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法。 
背景技术
帕金森氏病（Parkinson’s Disease）是一种中枢神经系统变性疾病，以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死、多巴胺（DA）合成减少为特征的神经系统退行性疾病。主要临床表现：静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常，最后患者多死于由肺部感染引起的并发症。帕金森氏病主要发病于60岁以后，随着老龄人口的增加，在今后的10-15年中帕金森氏病的患病人数以及由此对国家和社会带来的经济负担将是巨大的。全世界已有高达400万的患病人数，而大约一半在我国。现阶段对于帕金森氏病的最有效的治疗方法是服用左旋多巴,长期服用左旋多巴会产生副作用，即症状波动和异动症。而手术治疗的效果对帕金森症状的缓解远远不及左旋多巴。由于神经细胞死亡后不能再生，目前临床上的治疗方法仅能缓解症状，不能从根本去除病因，也不能延缓疾病的进展，因此，必须寻找一种能够有效地抑制帕金森疾病而又无明显副作用的治疗方法。
基因治疗是一种新兴的疾病治疗方法，它主要通过病毒或非病毒载体将治疗基因递送到患者体内，研究表明，帕金森氏病的病理改变主要局限在黑质多巴胺能神经元的变性死亡，基因治疗的靶区明确，这非常有利于进行基因治疗的操作。神经营养因子（Neurturin，NTN）和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是帕金森氏病基因治疗的重要基因。实验证明，前者能在体外选择性地促进培养的大鼠胚胎中脑多巴胺能神经元的存活，促进神经元轴突纤维的生长和对多巴胺高亲和力摄取；后者是多巴胺生物合成过程中的限速酶，能催化酪氨酸转化成为左旋多巴（L-DOPA），左旋多巴在体内进一步生成多巴胺，增加TH的表达，可以促进酪氨酸向左旋多巴的转化，提高多巴胺的合成。目前，针对帕金森氏病的基因治疗主要采用单一治疗基因构建到不同的载体上，使治疗基因在动物模型中表达。国外目前有人采用酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase TH）和GTP环水解（GTP-Cyclohydrolase）组合对帕金森氏病的小鼠模型进行了基因治疗，取得了良好效果。与国外比较，国内使用的载体种类或载体的优越性方面远远落后，尚未构建双顺反子载体治疗帕金森氏病。
发明内容
本发明目的是表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，并通过检测其生物学活性证实所构建的该双顺反子重组腺病毒在感染的宿主细胞中得到成功地共表达。
本发明目的通过以下方式实现：
表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
（1）首先利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN，再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN-TH，以该重组质粒为模板，P1：5’-TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’为上游引物，P2：5’-GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC-3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点，经过PCR扩增得到双顺反子表达盒；
（2）将上述双顺反子表达盒PCR扩增，其产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，利用该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有的PCMV启动子和PolyA尾被分别转录和翻译；
（3）将步骤（2）获得的重组穿梭质粒pShuttleCMV-NTN-TH用PmeI和CIAP分别线形化和5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183；
（4）涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，用PacI酶切，切出3.0kb和4.5kb片段为阳性克隆，得到pShuttleCMV-NTN-TH和pAdEasy-1同源重组的重组腺病毒质粒；
（5）将步骤（4）筛选出的重组腺病毒质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold)宿主菌,大量扩增上述质粒后抽提，使上述质粒浓度达到0.1ug/ul，线性化并转染AD-293细胞，在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。
上述步骤（5）中，重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒方法是：
（1）将长满T-25细胞培养瓶的AD-293细胞用PBS洗3次，每次10ml；加入1ml浓度为0.125%胰蛋白酶消化细胞，加入10ml生长液（DMEM高糖+10%FBS）重悬细胞，使细胞分散成单个细胞，传入60mm细胞培养皿中，5ml/孔；37℃，5% CO2，培养12小时；转染前用Opti-MEM洗细胞2次，3ml/孔，最后加入3ml Opti-MEM，37℃，5% CO2孵育1小时；
（2）取经过PacI酶切线性化的质粒约4ug（50ul）与200ulOpti-MEM混匀；
（3）取10ul Lipofectin2000和240u lOpti-MEM混匀，室温孵育5min后与步骤（2）所混匀的质粒再混匀得到产物，室温孵育20min；
（4）将步骤（1）孵育的细胞取出，晃动平皿，把步骤（3）产物与脂质体的混合物滴加至AD-293细胞中；37℃，5% CO2孵育6小时后将溶液吸出，加入5ml生长液（DMEM高糖+10%FBS），观察和收集上清液中串珠状病变细胞。
     本发明积极效果和所具有的特点是：
本发明选择NTN和TH作为治疗基因组合，并以具有遗传背景清楚、遗传毒性较低和安全性等优点的腺病毒载体作为基因治疗的载体，成功构建了同时携带有NTN和TH基因的重组腺病毒Ad-NTN-TH。该双顺反子重组腺病毒在感染相应的宿主细胞后能够稳定的转录和共表达NTN和TH，表达的功能蛋白NTN能够在体外促进鸡胚背根神经节生长出突触，该蛋白还能促进胎鼠多巴胺能神经元的存活；同时，表达的酪氨酸羟化酶TH能够在体外反应体系中催化L-Tyrosine反应生成L-DOPA，表明重组腺病毒Ad-NTN-TH表达产物同时具备NTN和TH两种蛋白的功能，为动物实验打下了很好的基础。如果能将该双顺反子重组腺病毒导入患有帕金森氏病的动物模型中，各司其责，通过NTN和TH基因的组合，联系和配合治疗帕金森氏病，发挥组合基因相互协调功能，即一方面利用神经营养因子促进多巴胺能神经元的存活，提高可合成多巴胺神经元的数量；另一方面通过加强酪氨酸羟化酶的表达提高单个多巴胺能神经元对多巴胺的合成，从不同的生理过程共同增加黑质神经细胞对多巴胺的分泌，更好地缓解模型动物帕金森氏病症状，填补国内对于帕金森氏病多基因治疗并推动我国对帕金森氏病治疗手段的研究进程。
附图说明
图1是双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA。
图2是双顺反子表达盒。
图3是双顺反子重组穿梭质粒的构建
图4是重组腺病毒质粒pAdEasy-NGF/NTN-TH的筛选结果图。其中，1 、2 是重组腺病毒质粒经 Pac I 酶切分别产生3.0 kb和 4.5kb的片段。
图5是双顺反子重组腺病毒在AD-293中的包装产生的细胞病变图（250×）。
图6是双顺反子重组腺病毒电镜观察结果图。
图7是RT-PCR检测重组双顺反子腺病毒在Vero细胞中的转录图。
图8是双顺反子重组腺病毒感染Vero细胞后48小时免疫荧光分别检测NTN和TH的表达结果，包括(A) Ad-NTN-TH感染Vero 细胞48小时表达的NTN; (B) Ad-NTN-TH感染Vero 细胞48小时表达的TH； (C)、 (D) Ad-LacZ感染Vero细胞后48小时对照。
    图9是激光共聚焦显微镜观察HJ326感染Vero细胞后进行NTN和TH的荧光双标记，包括(A)Dylight488标记的TH ；(B)Cy3标记的NTN; (C) 共聚焦; (D) 对照。
图10是Vero细胞接种Ad-NTN-TH后48小时收获条件培养基Western Blot
1, Ad-NTN-TH感染细胞48h后的条件培养基； 2, Ad-LacZ感染细胞48h后的条件培养基
图11是鸡胚背根神经节培养实验，包括：（A）Ad-NTN 感染细胞条件培养基组;（B）Ad-NTN-TH 感染细胞条件培养基组;（C）Ad-LacZ感染细胞条件培养基对照组。
图12是胎鼠多巴胺能神经元培养实验及免疫组化鉴定。
图13是毛细管电泳法测定双顺反子重组病毒感染Vero细胞后表达TH的活性。
     以下结合附图做进一步说明。 
具体实施方式
（一）双顺反子重组腺病毒的构建和包装
利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN后再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选到重组质粒pcDNA3.0BA-NTN-TH后，以该重组质粒为模板，P1：5’-TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’为上游引物，P2：5’-GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC-3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点PCR扩增到双顺反子表达盒，见图1、图2。
将上述双顺反子表达盒PCR扩增产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，由于该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有PCMV启动子和PolyA尾。表达盒插入后两个基因分别具有各自的启动子和PolyA，能够分别被转录和翻译，见图3。
将重组穿梭质粒pShuttleCMV-NTN-TH先后用PmeI线形化和CIAP进行5`去磷酸化，产物最后经纯化后和腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183。涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，与pAdEasy-1成功进行同源重组的克隆能被PacI酶切出3.0kb或者4.5kb的片段，结果见图4。
筛选出的重组质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold),大量扩增质粒、质粒大量抽提，使质粒浓度达到0.1ug/ul。将质粒进行线性化后转染AD-293细胞，使重组腺病毒质粒能够在AD-293细胞中包装重组腺病毒。
（二）重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装重组腺病毒方法
将长满T-25细胞培养瓶的AD-293细胞用PBS洗3次，每次10ml；加入1ml浓度为0.125%胰蛋白酶消化细胞，加入10ml生长液（DMEM高糖+10%FBS）重悬细胞，使细胞尽量分散成单个细胞，传入60mm细胞培养皿中，5ml/孔。37℃，5% CO2，培养12小时。转染前用Opti-MEM洗细胞2次，3ml/孔。最后加入3ml Opti-MEM，37℃，5% CO2孵育1小时。取经过Pac I酶切线性化后的质粒约4ug（50ul）与200ulOpti-MEM混匀；取10ul Lipofectin2000和240ulOpti-MEM混匀，室温孵育5min后与上述质粒混匀，室温孵育20min。将孵育的细胞取出，把质粒与脂质体的混合物滴加至细胞中，同时晃动平皿。37℃，5% CO2孵育6小时后将溶液吸出，加入5ml生长液，于8天后开始观察细胞病变。细胞在整个视野下，局部出现细胞变圆、肿胀和聚集形成串珠状，且在之后的2-3天内，病变速度加快，细胞病变从局部迅速向整体扩散，最终多数的细胞已经脱落形成串珠状，漂浮于上清液中，见图5。
将获得的双顺反子重组腺病毒命名为Ad-NTN-TH，病毒收获液经复染后在电镜下进行观察，确认病毒的存在（结果见图6）。
（三）外源基因在重组腺病毒Ad-NTN-TH中的表达检测
（1）双顺反子重组腺病毒Ad-NTN-TH在Vero细胞中的转录
离心收集原代病变细胞，用PBS重悬细胞，37℃和-80℃之间反复冻融细胞4次。将上清病毒液感染新的AD-293细胞，对原代病毒进行扩增和传代。向长满90% Vero细胞的T-25细胞培养瓶中接种病毒Ad-NTN-TH，感染复数MOI=5，感染48小时后，用细胞刮刀将细胞刮下，离心收集细胞，抽提细胞总RNA，以Oligo（dT）为引物,逆转录酶M-MLV合成cDNA第一链，以合成的cDNA第一链为模板，PCR分别扩增嵌合基因NTN、TH基因，RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳证实嵌合NTN、TH均能能够在Vero细胞中很好的转录，见图7
（2）免疫荧光分别检测重组腺病毒Ad-NTN-TH在Vero细胞中的表达
将Vero细胞传至含有盖玻片的6孔板，待细胞爬片以后将重组病毒接至玻片上，感染复数MOI=5，37℃，5% CO2，孵育48h。爬片细胞经预冷的2%多聚甲醛/0.2% TritonX-100/PBS(pH=7.4), 4℃处理15min,再置于冰冷的甲醇中5min，PBS清洗1-2遍。加入封闭液封闭30min后加入一抗，37℃结合90min。经PBS清洗3次后加入FITC标记二抗孵育30min，PBS清洗后荧光显微镜下观察，实验组可见有明显荧光，表明感染双顺反子重组腺病毒的细胞能够同时表达两种外源蛋白质NTN和TH，结果见图8。
（3）激光共聚焦检测重组腺病毒Ad-NTN-TH共表达NTN和TH
 将Vero细胞传至细胞培养皿中，12小时后接种pAdEasy-Neurturin plus TH，同时接种pAdEasy-LacZ作为对照，一抗为小鼠抗TH（R&D MAB1423）和山羊抗NTN（R&D AF387），二抗为Dylight 488 标记的抗小鼠IgG及Cy3标记的抗山羊IgG，激光共聚焦显微镜下观察。结果显示，两种蛋白能够同时表达，且能够同时被不同的标记物标记，见图9。
（4）免疫印迹检测重组腺病毒Ad-NTN-TH中NTN基因表达后的分泌情况
 免疫荧光单标记和双标记证实了病毒在感染Vero细胞后能在胞内同时表达NTN和TH。由于TH是在胞质中执行生物学功能，因此不需要分泌到胞外。但是NTN必须被分泌至胞外才能行使其生物学功能，所以我们需要用免疫印记实验（Western Blot）来验证NTN是否被成功分泌至胞外，结果见图10，表明pAdEasy-Neurturin plus TH所表达的NTN前体蛋白能够被细胞加工并能分泌至胞外，NTN能以二聚体的活性形式存在于培养上清液中。
（四）体外活性测定
（1） NTN对培养的鸡胚背根神经节的培养实验
    向长满90%Vero细胞的培养瓶中接种Ad-NTN-TH病毒，感染复数MOI=5，感染后加入无血清MEM细胞培养液，48小时后离心收集上清液，0.22um滤膜过滤除菌，即为NTN条件培养基。
    取9日龄鸡胚，在无菌条件下剥离背根神经节，置入经多聚赖氨酸包被的24孔培养板中，培养液为Neural Basal（B27）+NTN条件培养基（1:1），对照孔加入Ad-LacZ收获的条件培养基。37℃，5% CO2孵育48小时后观察结果。结果显示,在加入条件培养基后48小时，实验组加入NTN条件培养基的神经节向四周呈现放射状的神经轴突生长，而对照组加入Ad-LacZ的条件培养基的神经节无类似的生长状态（图11）
（2） 胎鼠多巴胺能神经元培养实验
取孕14天的SD大鼠，处死。在无菌条件下打开腹腔，取出胎鼠，用眼科镊打开颅腔，将整个脑组织取出，找到中脑腹侧区。切下这部分组织，放入冰冷Hanks溶液中，剥离脑膜，血管等组织后，将中脑组织剪碎，经胰酶消化，离心弃上清，加入生长液吹打分散细胞，将细胞加入经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，置于37℃培养24小时，24小时候更换为B27无血清培养基和条件培养基，37℃，5%CO2培养，每三天换液一半，于7天、14天、21天观察结果。将最后的细胞进行免疫组化鉴定其是否是多巴胺能神经元。结果显示，Ad-NTN-TH重组病毒培养形成的条件培养基，其中的NTN能够对胎鼠多巴胺能神经元具有保护作用，最后的免疫组化结果提示，培养21天后阳性测试组中有较多的多巴胺能神经元，而对照组中无多巴胺能神经元，结果见图12。
（3）毛细管电泳法测定Ad-NTN-TH重组病毒中酪氨酸羟化酶的活性
将293细胞传至8个大罗氏瓶，待细胞铺满90%后中毒。48小时后离心收集细胞，用40μM MES-Na pH=7.0洗涤细胞两次，最后将细胞重悬后超声波破碎细胞。在0.5ml的离心管中配制左旋酪氨酸在酪氨酸羟化酶的作用下转化为左旋多巴的体外反应体系：40μM MES-Na,PH=7.0;200μM L-Tyrosine;100mM 2-mercaptoethanol;1mM RBPH4; 约0.02mg/mlTH,体系总体积200μl。37℃水浴2小时。                                                   
反应2小时后12000rpm离心1min，取上清用毛细管电泳仪（P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System）分析样品组分。将上述3个样品用毛细管分析，电泳的程序如下：20psi灌注分离缓冲液5min,0.6psi进样8s,分离电压为20KV，分离时间为15min，通过紫外分光（OD280）检测样品中L-DOPA的含量。
通过毛细管电泳分析发现,在活性测定中的三个反应组在反应以后的成分发生了变化，实验组在加入重组TH蛋白后，出现了迁移时间为6.467min的一个吸收峰，与L-DOPA标准品的迁移时间6.856min吻合，而对照组中未检测到相应迁移时间的吸收峰（图13）。表明双顺反子重组病毒Ad-NTN-TH表达的TH具有酪氨酸羟化酶活性，能够在体外将左旋酪氨酸转化为L-DOPA。

Claims (2)

1.表达神经营养因子和酪氨酸羟化酶双顺反子重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
（1）首先利用EcoRV和Xhol酶切位点将NTN基因插入双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA多克隆位点B中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN，再通过BamHI和EcoRI酶切位点将TH基因插入该质粒多克隆位点A中，筛选出重组质粒pcDNA3.0BA-NTN-TH，以该重组质粒为模板，P1：5’-TTGTCGACACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3’为上游引物，P2：5’-GGGATATCTTAGCCAATGGCACTCAGCGC-3’为下游引物，并引入SalI和EcoRV两个酶切位点，经过PCR扩增得到双顺反子表达盒；
（2）将上述双顺反子表达盒PCR扩增，其产物进行切胶回收，插入腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中，利用该穿梭质粒的多克隆位点上下游分别具有的PCMV启动子和PolyA尾被分别转录和翻译；
（3）将步骤（2）获得的重组穿梭质粒pShuttleCMV-NTN-TH用PmeI和CIAP分别线形化和5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy-1同时电转感受态细胞BJ-5183；
（4）涂布含有卡那霉素的LB平板筛选阳性克隆，用PacI酶切，切出3.0kb和4.5kb的片段为阳性克隆，得到pShuttleCMV-NTN-TH和pAdEasy-1同源重组的重组腺病毒质粒；
（5）将步骤（4）筛选出的重组腺病毒质粒经过鉴定后转化XL-10(Gold)宿主菌,大量扩增上述质粒后抽提，使上述质粒浓度达到0.1μg/μl，线性化并转染AD-293细胞，在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是在步骤（5）中，该重组腺病毒质粒在AD-293细胞中包装成双顺反子重组腺病毒方法是：
（1）将长满T-25细胞培养瓶的AD-293细胞用PBS洗3次，每次10ml；加入1ml浓度为0.125%胰蛋白酶消化细胞，加入10ml生长液：DMEM高糖+10%FBS以重悬细胞，使细胞分散成单个细胞，传入60mm细胞培养皿中，5ml/孔；37℃，5% CO2，培养12小时；转染前用Opti-MEM洗细胞2次，3ml/孔，最后加入3ml Opti-MEM，37℃，5% CO2孵育1小时；
（2）取经过PacI酶切线性化的质粒4μg与200μlOpti-MEM混匀；
（3）取10μl Lipofectin2000和240μlOpti-MEM混匀，室温孵育5min后与步骤（2）所混匀的质粒再混匀得到产物，室温孵育20min；
（4）将步骤（1）孵育的细胞取出，晃动平皿，把步骤（3）产物与脂质体的混合物滴加至AD-293细胞中；37℃，5% CO2孵育6小时后将溶液吸出，加入5ml生长液：DMEM高糖+10%FBS，观察和收集上清液中串珠状病变细胞。
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