CN113388005A

CN113388005A - 增强成骨细胞活性的多肽及其在治疗骨科疾病中的应用

Info

Publication number: CN113388005A
Application number: CN202110739702.1A
Authority: CN
Inventors: 魏化伟; 张伦; 杨承刚
Original assignee: Beijing Zeqin Biomedical Co ltd
Current assignee: Beijing Zeqin Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN115322245A; CN113388005B

Abstract

本发明公开了增强成骨细胞活性的多肽及其在治疗骨科疾病中的应用，所述多肽能够促进骨形成。本发明的多肽化学性质稳定，容易低成本大规模合成，且生物相容性高，无毒性，可广泛用于骨科疾病的预防和治疗。

Description

增强成骨细胞活性的多肽及其在治疗骨科疾病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及增强成骨细胞活性的多肽及其在治疗骨科疾病中的应用。

背景技术

现在，随着我国交通和工业快速发展，每年因创伤和疾病所致骨缺损患者达数百万，其治疗及康复困难，引起患者劳动能力不同程度伤失，造成患者家属极度身心痛苦，给社会带来严重经济负担，是迫切需要解决的问题。

现有抗骨质疏松药物的开发、治疗靶点几乎都集中于骨重建(骨形成与骨吸收的动态平衡)，即如何抑制骨吸收或促进骨形成。临床中抗骨质疏松药物也基于这两点而分为抗骨吸收药物，如二膦酸盐类、降钙素等，以及促骨形成药物如特立帕肽等；然而前者在抑制骨吸收的同时也会抑制骨形成，使得其长期应用的不良反应发生率明显增加；而后者在促进骨形成的同时亦促进了骨吸收，使用2年后可能使骨折发生率增加。直至今日，尚没有任何一种抗骨吸收药物只抑制骨吸收而不抑制骨形成，也没有任何一种促骨形成药只促骨形成而不促骨吸收，极大限制了临床药物的有效性和应用范围。目前骨重建调节药物主要包括二膦酸盐、降钙素、选择性雌激素受体调节剂、甲状旁腺素类似物、RANKL抑制剂等，其中只有甲状旁腺素类似物是一种骨重建调节多肽类药物，这一药物来源于本身具备骨重建调节作用的激素：甲状旁腺素。目前国内外均没有基于非激素的多肽类药物出现。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供活性高、毒性小的增强成骨细胞活性的多肽。

本发明的第二个目的在于提供上述多肽在促进骨矿化，促进骨形成、预防和/治疗骨科疾病方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种多肽，所述多肽的核心序列包含脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸。

进一步，所述多肽的核心序列含有3-60个氨基酸，所述脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸的个数比例是(1～3)：(1～8)：1。

进一步，所述多肽的核心序列具有如下通式：(PGAPGP、PGAPG、PGAP、PGA、GAPGP、APGP、PGP、或APG)n，其中，n为自然数；

进一步，在本发明的具体实施方案中，n为1至5。

本发明还提供编码本发明多肽的核酸；包含编码该多肽的核酸的载体；和包含该载体的宿主细胞。

本发明还提供包含本发明多肽的药物组合物。该药物组合物可以用于治疗、改善或防止骨科疾病的方法中，其中该方法包括向患者施用治疗有效量的本发明的多肽、核酸或药物组合物。

本发明还提供治疗个体的方法，包括施用治疗有效量的本发明的多肽、核酸或药物组合物。所提供的方法包括治疗罹患或有危险罹患骨科疾病的个体，包括向个体施用治疗有效量的一种或多种本发明的多肽、核酸或药物组合物。本发明还提供促进骨形成、促进骨矿化的方法。本发明还提供了增强成骨细胞活性、促进成骨细胞或其前体细胞分化、增殖、成熟、钙化的方法，包括使细胞接触有效量的本发明的多肽、核酸或药物组合物。

本发明还提供了本发明的多肽、核酸、载体、宿主细胞、药物组合物的应用。

本发明的这些和其它方面，包括其它特征、优点和实施方式，将在以下详细描述和本发明权利要求书中进一步详细地描述和阐释。

附图说明

图1显示不同长度多肽的活性检测图；

图2显示多肽两端延长无关氨基酸后的活性检测图；

图3显示掺入非天然D型氨基酸的多肽活性检测图；

图4显示经修饰的多肽活性检测图；

图5显示多肽偶联物的活性检测图；

图6显示多肽缓释剂型的活性检测图；

图7显示野生型小鼠HE染色图和Micro-CT扫描结果图，其中A：骨小梁和皮质骨扫描图；B：骨小梁HE染色图；C：骨小梁数目；D：骨小梁厚度；

图8显示野生型小鼠给予多肽后双荧光标记实验结果图；

图9显示野生型小鼠给予多肽后Von Kossa染色结果图；

图10显示野生型小鼠给予多肽后矿化指标Dmp-1染色结果图；

图11显示OVX小鼠给予多肽后Micro-CT扫描结果图，其中A：第五腰椎的整体扫描图；B：第五腰椎骨小梁扫描图；

图12显示OVX小鼠给予多肽后双荧光标记实验结果图；

图13显示骨折小鼠给予多肽后荧光双标实验结果图；

图14显示骨折小鼠给予多肽后Micro-CT扫描结果图；

图15显示用于评价多肽的生物安全性的ELISA实验结果图，其中，A：BUN；B：CK；C：ALT；

图16显示用于评价多肽的生物安全性的H&E染色图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解，仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。然而，本领域技术人员可以毫不费力地认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

多肽

在一些实施方案中，本发明的多肽包括所述多肽的变体，所述变体与本发明的上述多肽的氨基酸序列具有80％及以上同源性，该变体和上述多肽的功能相同或相似。例如，所述变体的氨基酸序列可以是与上述多肽的氨基酸序列具有85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％、98％、或99％同源性的序列。以下本发明的多肽称为野生型多肽。

术语“变体”是指与野生型多肽“基本上相似”的多肽。如果两个分子具有基本上相似的结构(即，如通过在默认参数下设置的BLASTp比对所确定，它们在氨基酸序列上至少50％相似)并且在至少一种相关功能上基本上相似，则一个分子被认为与另一个分子“基本上相似”。变体与野生型多肽在一个或多个氨基酸缺失、添加、取代或侧链修饰上不同，但保留野生型分子的一种或多种特定的功能或生物活性。氨基酸取代包括其中氨基酸被替换为不同的天然存在的或非天然编码的氨基酸残基的改变。一些取代可被分类为“保守的”，在这种情况下，多肽中含有的氨基酸残基被替换为与极性、侧链官能度或大小相关的另一种具有相似性质的天然存在的氨基酸。如本文所述，变体包括的取代也可为“非保守的”，其中肽中存在的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸取代(例如用不带电荷的或亲水的氨基酸取代带电荷的或疏水的氨基酸)，或可替代地，其中天然存在的氨基酸被非天然编码的氨基酸取代。

“非天然编码的氨基酸”指，非常规氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、或硒代半胱氨酸的氨基酸。可以与术语“非天然编码氨基酸”作为同义词使用的其它术语是“非天然氨基酸”、“非天然的氨基酸”、“非天然发生的氨基酸”、和各种带连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括，但不限于，通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码的氨基酸(包括但不限于20种常规氨基酸或吡咯赖氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸、和硒代半胱氨酸)而形成的、但本身不能通过翻译复合物天然地掺入生长的肽链中的氨基酸。此类非天然氨基酸的实例包括但不限于N-乙酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖氨基-L-苏氨酸、和O-磷酸酪氨酸。

非天然编码氨基酸典型地可以是具有与20种天然氨基酸中使用的取代基侧链不同的任何取代基侧链的任何结构。由于本发明的非天然编码氨基酸与天然氨基酸的不同典型地仅在于侧链结构，故该非天然编码氨基酸可以与其它氨基酸，包括但不限于，天然的或非天然编码的氨基酸，以和天然多肽中酰胺键形成的方式相同的方式，形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有区别于天然氨基酸的侧链基团。例如，R任选地可以包含烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼(hydrazine)、氰基、卤代、酰肼(hydrazide)、链烯基、炔基、醚、硫羟基(thiol)、硒代、磺酰基、硼酸(borate)、硼化(boronate)、二氧磷基(phospho)、膦酰基(phosphono)、膦(phosphine)、杂环、烯酮(enone)、亚胺(imine)、醛、酯、硫羰酸(thioacid)、羟胺、氨基基团等、或其任何组合。可以适用于本发明的其它有意义的非天然氨基酸包括，但不限于，包含可光激活的交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、金属结合性氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新官能基团的氨基酸、共价地或非共价地与其它分子相互作用的氨基酸、光笼蔽的(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸例如糖取代的丝氨酸、其它糖修饰的氨基酸、含酮氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学断裂的和/或可光断裂的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长的侧链(包括但不限于，聚醚或长链烃，包括但不限于，大于约5个或大于约10个碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧还活性氨基酸、含有氨基硫羰酸的氨基酸、和含有一个或多个毒性部分的氨基酸。

进一步，所述变体是在前面所述的多肽的氨基端和/或羧基端添加1至3个氨基酸获得的。

进一步，所述变体是在前面所述的多肽的氨基端和/或羧基端添加1至3个无关氨基酸获得的。

可用于本发明的无关氨基酸包括甘氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸。

在本发明的具体实施例中，所述变体是在PGAPGP多肽的氨基端或羧基端添加1至3个甘氨酸获得的。

在本发明的具体实施例中，所述变体是在PGAPGP多肽的氨基端和羧基端同时添加1至2个甘氨酸获得的。

进一步，所述变体是在前面所述的多肽的氨基端或羧基端添加3个氨基酸构成的寡肽获得的。

在本发明的具体实施例中，所述变体是前面所述的多肽的氨基端或羧基端添加RGD寡肽获得的。

在本发明的具体实施例中，所述变体将PGAPGP多肽任意位置的氨基酸替换为非天然D型氨基酸后获得的。

在一些实施方案中，本发明还公开了含有本发明的多肽的衍生物。所述多肽衍生物包括经本发明的多肽经常规修饰获得的产物、多肽与异源肽连接形成的融合蛋白、多肽与其他化合物连接形成的偶联物。

所述的常规修饰为氨基化、甲基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、豆蔻酰化、非金属化学元素修饰、固定化修饰等。

在一些实施方案中，本发明多肽与异源肽融合。异源肽的例子包括但不限于：人血清白蛋白(HAS)、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、聚组氨酸、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、甘露糖结合蛋白(MBP)、或上述任何异源多肽的片段。一些实施方案中，异源肽融合在本发明多肽的氨基末端。在其它或备选实施方案中，异源多肽融合在本发明多肽的羧基末端。对于亲和纯化，可以使用亲和色谱的相关基质，例如谷胱甘肽、α淀粉酶。可以选择异源肽以利于本发明多肽的检测。检测的例子包括各种荧光蛋白(例如GFP)以及"表位标签"，表位标签包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。

在一些实施方案中，本发明多肽与其他化合物连接。所述其他化合物包括双膦酸盐类药物、环烯醚萜化合物。所述双膦酸盐类药物包括阿仑膦酸、伊班膦酸盐、唑来膦酸。环烯醚萜化合物包括京尼平尼酸、京尼平-龙胆双糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸。

可以使用本领域已知的任何合适的方式制备可用于本发明的多肽。此类多肽包括分离的天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽、或通过这些方法的组合产生的多肽。用于制备此类多肽的手段和方法是本领域熟知的。

核酸、载体和宿主细胞

在一些实施方案中，本发明还提供编码本发明多肽的核酸、以及用于表达所述多肽的表达载体和宿主细胞。其它方面，本发明提供编码本发明多肽的多核苷酸、以及包含该多核苷酸的表达载体和宿主细胞。在一些实施方案中，优化多核苷酸以用于在宿主细胞中表达。

可以使用重组遗传学领域的常规技术，表达本发明多肽。公开了可以在本发明中使用的一般方法的基础教科书包括本领域已知的Sambrook和Russell eds.(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition；系列丛书Ausubel et al.eds.(2007，更新至2010)Current Protocols in Molecular Biology,等等。

表达可以使用本领域已知的任何合适宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。原核和真核表达系统均是可获得的。一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达系统，例如CHO细胞表达系统。一些实施方案中，可以对核酸进行密码子优化以利于在期望宿主细胞中的表达。

非病毒载体和系统包括质粒和附加型载体(典型地包含用于表达蛋白或RNA的表达盒)、和人工的人染色体。例如，可以用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达本发明多肽的非病毒载体包括pThioHis A,B&C,pcDNA3.I/His,pEBVHis A,B&C(Invitrogen,SanDiego,CA),MPSV载体、和本领域已知用于表达其它蛋白的许多其它载体。有用的病毒载体包括，但不限于，基于腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头状瘤病毒、HBP EB病毒的载体、禽痘病毒载体、痘苗病毒载体、和Semliki森林病毒(SFV)载体。

表达载体的选择取决于待表达所述载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码本发明多肽的多核苷酸有效连接的启动子和其它调节序列(例如增强子)。一些实施方案中，使用诱导性启动子以防止插入序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导性启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子或热休克启动子。此外，其它调节元件也可以并入以改善编码本发明多肽的核酸的表达，例如增强子、核糖体结合位点、转录终止序列等等。

一些实施方案中，编码本发明多肽的核酸也可以包括编码分泌信号序列的序列，以便多肽可以自宿主细胞分泌。该序列可以由载体提供、或作为存在于载体中的本发明多肽的核酸的一部分。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法可以根据宿主细胞类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其它细胞宿主。其它方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、生物轰击方法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合、试剂增强的DNA摄取、和离体转导。对于重组蛋白的长期高产率生产，常常期望稳定表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因的本发明表达载体，制备稳定表达本发明多肽的细胞系。

一些实施方案中，可以将编码本发明多肽的核酸递送给患者以治疗骨科疾病。可以使用本领域已知的任何方式递送该核酸，但典型地使用直接注射来实现递送。一些实施方案中，通过直接注射，以裸DNA的形式递送DNA。一些实施方案中，使用病毒载体，包括但不限于，腺病毒或腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒或痘苗病毒载体。

药物组合物

本发明的多肽或其编码核酸可按需要与合适的药物赋形剂一起施用。本领域技术人员将了解，组合物将视施药模式和剂量单位而变化。

一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物。

一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的本发明多肽的编码核酸的药物组合物。

一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的本发明前面所述的载体的药物组合物。

一些实施方案中，本发明提供含有治疗有效量的本发明前面所述的宿主细胞的药物组合物。

组合物通常包括常规药物载体或赋形剂，并且可另外包括其它药剂、载体、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂等。优选地，组合物将含有约0.01重量％至约90重量％、约0.1重量％至约75重量％、约0.1重量％至50重量％或约0.1重量％至10重量％的本发明的组合物或其组合，其余由合适的药物载体和/或赋形剂组成。可通过本领域中熟知的方法针对特定组合物和施药途径来定制适当的赋形剂。参见例如REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版，MackPublishingCo.,Easton,Pa.(1990)。

合适的赋形剂的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素以及聚丙烯酸，诸如Carbopol，例如Carbopol941、Carbopol980、Carbopol981等。组合物可另外包括润滑剂，诸如滑石、硬脂酸镁以及矿物油；湿润剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，诸如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸乙酯以及羟基苯甲酸丙酯(即，对羟苯甲酸酯)；pH调节剂，诸如无机和有机酸和碱；甜味剂；着色剂；以及调味剂。组合物还可以包含可生物降解的聚合物珠粒、葡聚糖以及环糊精包涵复合物。

对于经口施药来说，组合物可呈片剂、含片、胶囊、乳液、悬浮液、溶液、糖浆、喷雾、粉末以及持续释放制剂的形式。用于经口施药的合适的赋形剂包括药物级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。

在一些实施方案中，药物组合物采用药丸、片剂或胶囊的形式，组合物含有以下各物中的任一种：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂，诸如淀粉或其衍生物；润滑剂，诸如硬脂酸镁等；以及结合剂，诸如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素以及其衍生物。结合物还可以调配成例如配置于聚乙二醇(PEG)载体中的栓剂。

液体组合物可通过将本发明的多肽或其编码核酸与任选一或多种药学上可接受的佐剂溶解或分散于诸如盐水溶液(例如，0.9％w/v氯化钠)、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等载体中以形成例如用于经口、局部或静脉内施药的溶液或悬浮液来制备。

对于局部施药来说，本发明的组合物可呈乳液、洗液、凝胶、乳霜、冻胶、溶液、悬浮液、油膏以及经皮贴剂的形式。对于通过吸入递送来说，组合物可以干粉或液体形式通过喷雾器递送。对于肠胃外施药来说，组合物可呈无菌可注射溶液和无菌包装粉末的形式。优选地，可注射溶液是以约4.5至约7.5的pH值调配。

本发明的组合物还可以以冻干形式提供。此类组合物可包括缓冲剂(例如碳酸氢盐)以供在施药前复水，或在冻干组合物中可包括缓冲剂以供例如以水复水。冻干组合物可另外包含合适的药剂，如其他治疗骨科疾病的药物。冻干组合物可任选与复水缓冲剂组合包装以提供于注射器中，使得复水组合物可立即向患者施用。

在一些实施方案中，本发明的含肽组合物是以特定剂量的肽向受试者施用或被调配成用于向受试者单位剂量施用肽。在一些实施方案中，向受试者施用的剂量是每天约0.001至约1000mg。在一些实施方案中，向受试者施用的剂量是每天约0.1至约500mg。在一些实施方案中，向受试者施用的剂量是每天约0.5至约100mg。在一些实施方案中，本发明的组合物被调配成用于单位剂量施药，其中单位剂量是每天约0.001至约1000mg。在一些实施方案中，本发明的组合物被调配成用于单位剂量施药，其中单位剂量是每天约0.1至约500mg。在一些实施方案中，本发明的组合物被调配成用于单位剂量施药，其中单位剂量是每天约0.5至约100mg。

在一些实施方案中，可以将本发明多肽或编码本发明多肽的核酸制备成控释或缓释的制剂，如可注射微球，生物可蚀性颗粒，聚合物化合物，珠，或脂质体或其它生物相容性基质，然后制剂可以通过注射递送。例如，可以将本发明多肽或编码本发明多肽的核酸包囊在脂质体中、或配制成微粒或微囊，或可并入其他媒介物，如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和PLCA微球、可生物降解的纳米胶囊、和生物粘附性微球中，或经由蛋白质性载体或利用缀合物递送。

用于治疗骨科疾病的本发明的药物组合物的剂量，取决于给药的方式、个体的年龄和/或体重，以及受治个体的情况，是可变的，并最终由主治医师或兽医决定。施用于个体的剂量，在本发明的情况下，应当在一段时间足以在个体中引起有益的反应。该剂量是“治疗有效量”。

方法

本发明提供了一种预防或治疗骨科疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。

本发明提供了一种在有需要的受试者中增强骨形成或促进骨矿化的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。

本发明提供了一种在有需要的受试者中诱导骨沉积的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物。

应用

治疗和预防应用

本发明前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物在制备治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物制剂中的应用。在本发明中所述疾病或病症是骨科疾病。

本领域技术人员将了解，本发明的前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物可与用于治疗或预防骨科疾病的其它治疗剂共同施用。共同施用可以是同时的，例如呈单一药物组合物或独立组合物形式。本发明的组合物还可以与另一种治疗剂分开施用，例如以独立的给药时程。

改变细胞性质方面的应用

本发明前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物在制备促进骨形成的药物中的用途。

本发明前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物在制备促进骨矿化的药物中的用途。

本发明前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物在制备诱导骨沉积的药物中的用途。

本发明前面所述的多肽、前面所述的核酸、前面所述的载体、前面所述的宿主细胞、前面所述的药物组合物在制备增强成骨细胞活性的药物中的用途。

“患者”或“受试者”在本文中指被给予本发明的多肽或其编码核酸，或包含其的药物组合物的任何个体。本发明考虑，本发明的多肽、组合物和方法可用于治疗哺乳动物。在本文中，“个体”指任何哺乳动物，包括人、家畜和农场动物，和动物园动物、运动动物或宠物动物，如牛(如母牛)、马、狗、绵羊、猪、兔、山羊、猫、小鼠、大鼠、猴子等。在本发明的一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体是小鼠。

如本文所用，术语“D-氨基酸”是指氨基酸的右旋立体异构体。字母D和L在本领域中通常用于指代氨基酸的立体异构体。D-氨基酸是那些可以从甘油醛的右旋异构体，即D-甘油醛合成的氨基酸。类似地，左旋氨基酸是那些可以从甘油醛的左旋异构体，即左旋甘油醛合成的氨基酸。

如本发明所用，本发明所用的术语“治疗”均指对患有疾病的受试者有益的任何类型的治疗，包括改善患者的状况(例如，在一种或多种症状中)、延迟疾病的进展等。

如本发明所用，表述“骨科疾病”是指引起一种或多种骨骼和/或骨细胞的各种异常或畸形的那些疾病中的任何一种。

优选地，所述骨科疾病包括骨质疏松症、佝偻病、骨软化症、成骨不全、大理石骨病、纤维异常增生、佩吉特病、慢性甲状旁腺功能亢进症、甲状腺功能亢进症、类风湿性关节炎、Gorham-Stout病、McCune-Albright综合征、各种癌症的溶骨性转移或多发性骨髓瘤、骨量丢失、全身骨骼脆弱、关节退变、非愈合性骨折、由糖尿病引起的骨科和牙科问题、植入性牙周炎、对骨移植物/植入物/骨替代性材料的不良反应、牙周病、骨骼老化、骨折、骨缺损、骨移植、植骨、骨癌、关节置换、关节修复、融合、小关节修复、骨质退变、牙种植体和修复、骨髓缺损、肢端肥大症患者的骨病、囊性纤维化相关骨病、无动力性骨病、与慢性肾病相关的肾性骨营养不良、与胱氨酸病相关的骨病和与高草酸尿相关的骨病；优选地，所述骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、男性和女性的老年性骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、制动性骨质疏松症、失重引起的骨质疏松症、移植后骨质疏松症、迁移性骨质疏松症、特发性骨质疏松症、青少年骨质疏松症。

实施例1多肽制备

通过液相合成法进行合成，具体步骤如下：

1、合成原料及相关试剂/仪器

1)树脂：取代度为1.03mmol/g的2-Chlorotrityl Chloride Resin(天津市南开合成科技有限公司)；

2)氨基酸：购自成都诚诺，>99％；

3)合成试剂：DMF(原产地韩国)，DCM(原产地韩国)，MEOH(原产地日本)，DIEA(新德化工，99％)，HBTU(昊帆生物科技，99％)；

4)脱保护试剂：哌啶(国药集团上海化学试剂公司，99％)；

5)检测试剂：苯酚试剂(自配)，吡啶试剂(自配)，茚三酮试剂(自配)；

6)裂解试剂：95％切割液：TFA(J.T.Baker，99％)，TIS(上海达瑞精细化工，98％)，EDT(上海达瑞精细化工，98％)，无水乙醚(上海实验，实测99.7％)；

7)氮气：(新联气体)；

8)仪器：①十二通道半自动多肽合成仪上海强耀生物科技有限公司自主设计并申请专利的半自动多肽合成仪，专利号为201020226529.2②SHIMADZU高效液相色谱仪(型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)③离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-40B)④LABCONCO冻干机(型号：Freezone.Plus.6，厂商：LABCONCO)。

2、多肽合成步骤如下：合成顺序为从C端到N端。

1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin加至反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。

2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔质量的C端第一个氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min；用甲醇封闭。

3)脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。

4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。

5)洗涤：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量，反应30min。

7)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应。

8)洗涤：DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。

9)重复3)至6)操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。

10)抽干，洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。

11)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 95％；水1％；EDT 2％；TIS 2％；切割时间：120min。

12)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。

13)分析提纯：用高效液相色谱将粗品提纯。

14)冻干：收集目标多肽溶液于冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

15)将多肽送到质检部确认合格。

实施例2多肽及其衍生物的活性检测

1、不同长度多肽的活性检测

1.1合成不同长度的多肽

按照实施例1的方法合成。

1.2细胞实验

培养成骨细胞系MC-3T3E1细胞，使用终浓度为2μg/ml的不同长度的多肽孵育24小时后，QPCR检测ALP基因表达水平。

1.3结果

结果如图1所示，PGAPGP六个氨基酸的组合是增强成骨细胞活性的较好组合，串联至2-3个PGAPGP时均存在较好活性，串联至4个及以上时活性开始减弱。

2、多肽两端氨基酸延长后多肽活性检测

2.1合成不同长度的多肽

按照实施例1的方法合成。

2.2细胞实验

2.3结果

结果如图2所示，PGAPGP单侧延长1个无关氨基酸时对其活性无影响，单侧延长2个无关氨基酸时对其活性有较小影响，延长3个以上无关氨基酸时活性下降。双侧延长各1个无关氨基酸时对其活性无影响，双侧各延长2个以上无关氨基酸时活性开始下降。甘氨酸(G)为无关氨基酸的代表。

3、掺入非天然D型氨基酸的多肽活性检测

3.1合成掺入非天然D型氨基酸的多肽

按照常规方法进行，非天然D型氨基酸分布如表1所示。

表1非天然D型氨基酸分布

编号	非天然D型氨基酸分布
		P1	PGAPGP
P2	PGAPGP<sup>D</sup>
		P3	PGAPG<sup>D</sup>P
P4	PGAP<sup>D</sup>GP
		P5	PGA<sup>D</sup>PGP
P6	PG<sup>D</sup>APGP
		P7	P<sup>D</sup>GAPGP

3.2细胞实验

3.3结果

结果如图3所示，PGAPGP肽任意位置的氨基酸替换为非天然D型氨基酸后活性均有下降。

4、多肽修饰后的变体活性检测

4.1合成修饰后的变体

按照常规方法进行，多肽修饰如表2所示。

表2不同修饰的多肽

编号	修饰方式
		Pep1	N-甲基化
Pep2	N-豆蔻酰化
		Pep3	N-PEG修饰
Pep4	C-氟元素修饰
		Pep5	C-生物素修饰
Pep6	C-FAM荧光标记
		Pep7	未修饰的PGAPGP

4.2细胞实验

4.3结果

结果如图4所示，常见的多肽末端修饰对PGAPGP活性的影响。甲基化、豆蔻化、PEG修饰、氟元素修饰、生物素修饰、FAM荧光标记的PGAPGP都有活性。

5、多肽偶联物的活性检测

5.1合成多肽偶联物

按照常规方法进行，多肽偶联物如表3所示。

表3多肽偶联物

5.2细胞实验

培养成骨细胞系MC-3T3E1细胞，使用终浓度为5μg/ml的多肽偶联物孵育24小时后，QPCR检测ALP基因表达水平。

5.3结果

结果如图5所示，以阿伦磷酸钠为代表PGAPGP偶联双膦酸盐后具有活性。以RGD为代表PGAPGP偶联寡肽后具有活性。

6、多肽缓释剂型的活性检测

6.1合成微球缓释剂型

步骤：将PLGA搅拌溶解后，滴加入致孔溶液，并超声乳化形成乳化液；其中PLGA的LA与GA的摩尔比例为50:50；然后将乳化液逐滴加入到搅拌的外水相中，并加入预设体积的去离子水，改变速率持续搅拌，直至溶剂完全挥发。其中外水相为水溶性表面活性剂加入去离子水中，然后将有机溶剂完全挥发后的溶液进行离心，并用去离子水清洗，除去上清液，从而获得PLGA微球。将含有多肽的NaOH溶液加入到所述PLGA微球中混合均匀，并放到摇床继续反应，将反应后的PLGA微球用去离子水反复离心洗涤，冷冻干燥后备用。

6.2细胞实验

培养成骨细胞系MC-3T3E1细胞，使用终浓度为2μg/ml的微球孵育1-6天后，QPCR检测ALP基因表达水平。

6.3结果

结果如图6所示，以PLGA 50:50微球为代表，PGAPGP缓释剂型存在显著的生物学活性。

实施例3多肽对小鼠骨形成的影响

1、材料

野生型小鼠来源：全部小鼠均为SPF级，购自北京维通利华(Charles River)实验动物技术有限公司。

2、多肽溶液配制：称取1.000克氢氧化钠于烧杯中，加少量生理盐水溶解，然后倒入1000毫升容量瓶里，分3次洗烧杯，将溶液全部倒入容量瓶里，最后用生理盐水稀释至刻度线。摇匀后即得到1000mg/mL的多肽存贮母液。使用时按所需浓度等比例稀释。

3、药物处理

将小鼠随机分为两组，对照组和实验组，对照组小鼠每周1次注射生理盐水，实验组小鼠每周1次注射10mg/kg；注射12次后收集股骨样本进行Micro-CT扫描和H&E染色。

4、Micro-CT扫描

将收集的股骨样本进行骨小梁和皮质骨的Micro-CT扫描，分析骨小梁数目和骨小梁厚度。

4.1步骤

(1)将上述股骨样本置于4％多聚甲醛固定24小时后，转移至0.5％多聚甲醛溶液中防止结晶体在骨组织形成影响样本扫描。

(2)将样本放置于14mm管径的Micro-CT专用扫描管中，样本水平摆放，且横轴垂直于Micro-CT扫描轴，将扫描管放置于Micro-CT扫描机箱样本盘中。

(3)扫描程序相关参数如下：扫描电压为70kVp，扫描能量功率为14W，扫描电流为200μA，曝光时间为300ms，扫描BH 1200mg HA/cc，扫描精度为10μm，扫描滤光器(Filter)为0.5mm AI Filter。后期图像数据采用Mimics 13.0软件重建并分析。

(4)股骨数据重建时，骨小梁数据分析选取自股骨生长板下起始1mm，皮质骨内层的全部骨小梁；皮质骨数据分析选取生长板下5mm-6mm处皮质骨。

4.2结果

Micro-CT扫描结果如图7所示，应用多肽后小鼠骨密度显著升高(图7A)，骨小梁厚度显著增加(图7C)，骨小梁数目明显升高(图7D)，表明小鼠股骨矿化程度增强。

5、H&E染色

5.1步骤

1)切片：以常规方式制作组织的石蜡切片；

2)烤片：切片放置65℃烘箱30min；

3)脱蜡水化：依次对组织切片进行脱蜡处理，二甲苯I 30min，二甲苯II 30min。然后进行切片水化处理，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，90％酒精5min，75％酒精5min，蒸馏水5min。

4)染色：苏木素5min水洗，PBS浸泡5min，使细胞核返蓝。伊红染色2min，水洗。

5)脱水透明：梯度乙醇进行组织脱水，80％酒精、90％酒精、95％酒精分别10s后，室温条件下晾干。无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，室温晾干。浸入二甲苯中5min透明后，中性树脂封片。

6)观察：正置显微镜下观察拍照。

5.2结果

将上述股骨样本进行H&E染色，结果显示小鼠注射多肽后，生长板下骨小梁更致密(图7B)。

6、小鼠双荧光标记实验

6.1步骤

(1)将上述股骨样本(二甲酚橙与钙黄绿素腹腔注射剂量为80mg/kg，间隔时间为2周)进行硬组织切片，切片厚度约为15μm。

(2)DAPI染色：硬组织切片滴加1：1000稀释的DAPI染液，染色5min。在PBS中浸泡冲洗3次，每次时间5min。使用抗荧光淬灭封片剂封片。倒置荧光显微镜下观察红绿双色荧光标记，并统计骨沉积率。

6.2结果

结果如图8所示，红色标记与绿色标记相隔2周，间距为新骨沉积。与对照组相比，实验组股骨骨沉积量明显增加。分析结果表明小鼠注射多肽后，骨形成显著增强。

7、Von Kossa染色

7.1步骤

(1)硝酸银染液染色：配置0.2％硝酸银溶液，滴加于股骨硬组织切片上，覆盖股骨组织，强光照射15min，流水冲洗切片2-3s。

(2)硫代硫酸钠孵育：配置5％硫代硫酸钠溶液，滴加于切片上，覆盖股骨组织，5s，流水冲洗切片2-3s。

(3)甲基绿衬染：甲基绿染液衬染5min，流水冲洗5s，冲去浮色，65℃烘箱烘干30min。

(4)封片与观察：切片滴加二甲苯透明5min后，中性树脂封片。在体式显微镜下观察并拍照。

7.2结果

骨组织中的钙离子与银离子置换呈黑色，表示矿化骨的密度与骨矿化水平。VonKossa染色结果如图9所示，多肽注射组生长板下骨小梁密度增加，说明骨矿化程度显著增强。

8、骨矿化相关指标Dmp-1检测

8.1免疫组化染色

(1)切片：股骨组织脱钙后，常规石蜡组织切片；

(2)烤片：切片放65℃烘箱30min；

(3)脱蜡水化：依次对组织切片进行脱蜡处理，二甲苯I 30min，二甲苯II 30min。然后进行切片水化处理，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，90％酒精5min，75％酒精5min。蒸馏水5min。浸入PBS中冲洗三次，每次时长3min。

(4)抗原修复：根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。

(5)内源性过氧化物酶灭活：切片上滴加适量的过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min(用以阻断内源性过氧化物酶的活性)。滴加PBS冲洗三次，每次5min。

(6)组织封闭：切片上滴加适量的正常非免疫动物血清，室温下孵育10min。

(7)孵育一抗：甩去组织上的血清，在组织上滴加适量的一抗，在室温下孵育60min或4℃过夜。滴加PBS 3min冲洗三次。

(8)孵育二抗：切片滴加适量生物素标记的二抗，室温下孵育10min，用PBS冲洗三次，每次3min。

(9)除去PBS，每张切片加1滴或50μl链霉素抗生物素标记的第二抗体(试剂D)，室温下孵育10min，用PBS冲洗三次，每次3min。

(10)DAB显色：滴加DAB显色液(现配现用)，显微镜下观察3-10min。待显色结束后，自来水冲洗，终止显色。

(11)细胞核复染：甲基绿染液复染，PBS返蓝。

(12)脱水透明：梯度乙醇进行组织脱水，80％酒精、90％酒精、95％酒精分别10s后，室温条件下晾干。无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min室温晾干。在二甲苯中透明5min后。进行封片和观察。

8.2结果

结果图10所示，注射多肽组免疫组化显色程度升高，说明小鼠矿化蛋白Dmp1表达显著增强。

实施例3多肽对骨质疏松症小鼠骨量的影响

1、骨质疏松症小鼠模型构建

(1)选用12周龄雌性WT小鼠18只，分为3组(OVX组，OVX+多肽组，OVX+PTH组)。

(2)35mg/kg剂量戊巴比妥钠麻醉小鼠。

(3)小鼠下腹部备皮，碘伏消毒，75％酒精擦去碘伏，于肋骨下1cm腹部中线偏左0.5cm做一个0.5cm长度切口。

(4)剪开筋膜与肌肉，钝性拓宽手术视野。在下腹部找到白色脂肪组织牵拉出体外，延子宫上行找到输卵管与卵巢。

(5)结扎输卵管后剪下卵巢与输卵管，双侧切除后，将子宫与脂肪归置入腹。

(6)分层缝合皮肤与肌肉。

(7)骨质疏松症模型小鼠自建模后三个月，模型趋于稳定后，通过静脉注射多肽，总计注射12次，每周1次，剂量为10mg/kg；PTH给药方式为皮下给药，剂量为0.1μg/kg，注射4周，每周3次。

2、Micro-CT扫描

步骤同实施例1。

结果如图11所示，与OVX组相比，多肽组与PTH组小鼠骨量明显增加，说明多肽能够增加骨质疏松症小鼠骨量。

3、荧光双标实验

步骤同实施例1。

结果如图12所示，多肽组与PTH组，骨沉积量较OVX组小鼠显著升高，说明多肽治疗后小鼠骨形成功能升高。

实施例4多肽对骨折愈合的影响

1、构建小鼠骨折模型

按照文献[Glycosylation of dentin matrix protein 1 is critical forfracture healing via promoting chondrogenesis.Frontiers of Medicine.2019Oct；13(5):575-589]中描述的方法构建小鼠骨折模型。建模1周后，小鼠每周1次注射10mg/kg多肽，注射6次后取材评价小鼠骨折断端骨痂形成情况与骨痂密度。

2、荧光双标实验

步骤同实施例1。

结果如图13所示，多肽组小鼠的骨形成能力增强。

3、Micro-CT扫描

步骤基本同实施例1。不同点在于：骨折样本数据重建时，骨痂展示部位为骨折断端上下各500μm，数据分析选取自相应部位皮质骨外的骨痂部分。

结果如图14所示，骨折模型小鼠注射多肽组骨折部位愈合加快。骨痂部位重建结果显示，多肽注射后骨痂较对照组致密，多肽组骨密度显著高于对照组。

实施例5多肽的生物安全性评价

通过血清生化指标评价与重要脏器的病理切片分析等方法探讨多肽的生物安全性。

1、ELISA检测

通过ELISA检测小鼠注射多肽后，血清中BUN(血尿素氮)，CK(肌酸激酶)，ALT(谷丙转氨酶)，评估小分子多肽对生化指标的影响。

2.1步骤

2.1.1小鼠血清采集

(1)小鼠眼眶后静脉丛采血：

取内径为1.0-1.5mm的玻璃毛细管，临用前折断成2～2.5cm长的毛细管段，浸入1％肝素溶液中，干燥后用。取血时左手抓住鼠两耳之间的颈背部皮肤以固定头部，轻轻向下压迫颈部两侧，引起头部静脉血液回流困难使眼眶静脉丛充血，右手持毛细管由内眦部插入结膜，再轻轻向眼底部方向推进，轻轻旋转毛细管以划破静脉丛，让血液顺毛细管流出，接收入事先准备的容器中。采血后纱布轻压眼部止血。

(2)经上述的方法取得血液后，在EP管中室温静置一小时以上(或37℃水浴1小时，4℃冰箱静置2小时或者过夜)以3000rpm离心10分钟，上清即为血清。可在-80℃保存。

2.1.2、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)

(1)平衡：取出CK(肌酸激酶)，BUN(血尿素氮)，ALS(醛固酮)ALT(谷丙转氨酶)，ELISA kit室温平衡20min。

(2)稀释洗涤液：dd H₂O稀释20X洗涤液至1X。

(3)血清预备：使用不含热源和内毒素的试管(在后续实验操作过程中需要避免任何细胞刺激)收集血液后，室温下3000rpm离心10分钟后，小心吸取，将血清和红细胞分离。

(4)加样：取出所需数量的孔板，放在96孔底板上，板上标记加样顺序。在空白和标准品孔中，加入20μl Matrix solution，标准品分别加入0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4ng/ml标准品各20μl。样品孔中加入对照组与多肽组小鼠稀释后血清各10μl，再加入样本稀释液40μl，空白孔不加。

(5)手动洗板：沿着孔壁缓缓加入洗板液，静置1min后，弃去洗板液，在吸水纸上轻拍。重复5次。加入不同样本时及时更换枪头，避免污染。

自动洗板：在每个反应孔中加入350μl洗涤液，程序为浸泡1min，洗板5次。

(6)除空白孔外，在标准品反应孔与样本反应孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，封板膜封住反应孔后，在37℃水浴锅或恒温箱孵育60min。

(7)洗板：上述方式洗板5次。

(8)显色：在每个反应孔中加入底物A，B各50μl，37℃避光孵育15min。

(9)测量：每孔加入终止液50μl，10min后，酶标仪450nm波长读取吸光度。制作标准曲线后，用相应的公式计算样品中各蛋白含量。

2.2结果

结果如图15所示，小鼠每周给与静脉注射10mg/ml多肽，于第2，4，6，8，10，12周抽血进行检测。圆形标记为对照组，方形标记为多肽组。

3、H&E染色

小鼠每周给与静脉注射10mg/ml多肽，于第12周后处死取材进行检测。对重要脏器进行H&E染色进行病理学评价，探讨多肽对内脏器官是否具有慢性毒理作用。对心，肺，肝，脾，肾等组织石蜡切片，并进行H&E染色。结果如图16所示，与对照组相比，注射多肽后重要脏器(心、肺、肝、脾、肾)未产生肿瘤或炎性浸润等明显病理性改变。本实施例的结果表明本发明的多肽具有较好的生物安全性。

上述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的核心序列包含脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸；

优选地，所述多肽的核心序列含有3-60个氨基酸，所述脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸的个数比例是(1～3)：(1～8)：1；

优选地，所述多肽的核心序列具有如下通式：(PGAPGP、PGAPG、PGAP、PGA、GAPGP、APGP、PGP、或APG)n，其中，n为自然数；

优选地，n为1至5。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括以下任一项：

1)在所述核心序列基础上经一个或多个氨基酸缺失、添加、取代获得的变体；

2)氨基酸序列与所述核心序列的氨基酸序列具有85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％、98％、或99％同源性的变体；

优选地，所述多肽是在所述核心序列的氨基端和/或羧基端添加1至3个氨基酸获得的；

优选地，所述多肽是在所述核心序列的氨基端和/或羧基端添加1至3个无关氨基酸获得的；

优选地，所述无关氨基酸是甘氨酸；

优选地，所述多肽是在所述核心序列的氨基端或羧基端添加3个氨基酸构成的寡肽获得的；

优选地，所述寡肽是RGD；

优选地，所述取代是指将所述核心序列的任意位置的氨基酸替换为非天然D型氨基酸后获得的。

3.一种多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物包括权利要求1或2所述的多肽经常规修饰获得的产物、所述多肽与异源肽连接形成的融合蛋白、所述多肽与其他化合物连接形成的偶联物；

优选地，所述的常规修饰为氨基化、甲基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、豆蔻酰化、非金属化学元素修饰、固定化修饰等；

优选地，所述异源肽包括人血清白蛋白、免疫球蛋白重链恒定区、谷胱甘肽S转移酶、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、甘露糖结合蛋白、谷胱甘肽、α淀粉酶、荧光蛋白、His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact；

优选地，所述其他化合物包括双膦酸盐类药物、环烯醚萜化合物；优选地，所述双膦酸盐类药物包括阿仑膦酸、伊班膦酸盐、唑来膦酸；优选地，环烯醚萜化合物包括京尼平尼酸、京尼平-龙胆双糖苷、京尼平苷和京尼平苷酸。

4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的多肽。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述包括权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5述的载体、权利要求6述的宿主细胞；优选地，所述药物组合物还包括常规药物载体或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包括其它药剂、载体、佐剂、稀释剂、组织渗透增强剂、增溶剂。

8.一种方法，其特征在于，所述方法包括以下任一项所述的方法：

1)一种增强成骨细胞活性的方法，所述方法包括施用权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物；

2)一种预防或治疗骨科疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物；

3)一种在有需要的受试者中促进骨形成的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物；

4)一种在有需要的受试者中诱导骨沉积的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物；

5)一种在有需要的受试者中促进骨矿化的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多肽衍生物、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求7所述的药物组合物。

9.权利要求1或2所述的多肽的用途，其特征在于，所述用途包括以下任一项所述的用途：

1)在制备权利要求3所述的多肽衍生物中的用途；

2)在制备权利要求7所述的药物组合物中的用途；

3)在制备促进骨形成的药物中的用途；

4)在制备增强成骨细胞活性的药物中的用途；

5)在制备促进骨矿化的药物中的用途；

6)在制备诱导骨沉积的药物中的用途；

7)在制备预防或治疗骨科疾病的药物中的用途；

10.权利要求3所述的多肽衍生物的用途，其特征在于，所述用途包括以下任一项所述的用途：

1)在制备权利要求7所述的药物组合物中的用途；

2)在制备促进骨形成的药物中的用途；

3)在制备增强成骨细胞活性的药物中的用途；

4)在制备促进骨矿化的药物中的用途；

5)在制备诱导骨沉积的药物中的用途；

6)在制备预防或治疗骨科疾病的药物中的用途；

优选地，所述骨科疾病包括骨质疏松症、佝偻病、骨软化症、成骨不全、大理石骨病、纤维异常增生、佩吉特病、慢性甲状旁腺功能亢进症、甲状腺功能亢进症、类风湿性关节炎、Gorham-Stout病、McCune-Albright综合征、各种癌症的溶骨性转移或多发性骨髓瘤、骨量丢失、全身骨骼脆弱、关节退变、非愈合性骨折、由糖尿病引起的骨科和牙科问题、植入性牙周炎、对骨移植物/植入物/骨替代性材料的不良反应、牙周病、骨骼老化、骨折、骨缺损、骨移植、植骨、骨癌、关节置换、关节修复、融合、关节修复、骨质退变、牙种植体和修复、骨髓缺损、肢端肥大症患者的骨病、囊性纤维化相关骨病、无动力性骨病、与慢性肾病相关的肾性骨营养不良、与胱氨酸病相关的骨病和与高草酸尿相关的骨病；优选地，所述骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症、男性和女性的老年性骨质疏松症、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、制动性骨质疏松症、失重引起的骨质疏松症、移植后骨质疏松症、迁移性骨质疏松症、特发性骨质疏松症、青少年骨质疏松症。