KR20120054536A - Ｂｆｐ 1 유래 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골형성 촉진에 유효한 기능성을 갖는 펩타이드에 관한 것으로 보다 구체적으로는 BMP(Bone Morphogenetic Protein)-7에서 유래하는 15개의 아미노산서열로 이루어진 BFP1의 아미노산 서열속에 포함된 5 내지 10개의 아미노산서열로 이루어진 BFP1 유래 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물에 관한 것이다.

Description

ＢＦＰ 1 유래 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물{OSTEOGENIC SYNTHETIC PEPTIDES DERIVED FROM BFP 1, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND MEDIA CONTAINING THE SAME}
본 발명은 골형성 촉진에 유효한 기능성을 갖는 펩타이드에 관한 것으로 보다 구체적으로는 BMP(Bone Morphogenetic Protein)-7에서 유래하는 15개의 아미노산서열로 이루어진 BFP1의 아미노산 서열속에 포함된 5 내지 10개의 아미노산서열로 이루어진 BFP1 유래 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물에 관한 것이다.
뼈의 건강상태를 결정하는 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받는데, 특히 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경 또는 난소 절제 등이 골다공증의 원인으로 알려져 있다.
골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 골밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지는 증세로서, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다.
개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 일반적으로 14 내지 18세에 골량이 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이때 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고, 이로 인하여 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 되는 것이다.
따라서, 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다.
또한, 뼈와 관련된 질환으로는 골다공증 이외에도 골관절염(osteoarthritis) 및 골결손질환 등이 있는데, 골관절염은 관절의 연골이 손상되면서 국소적으로 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로 퇴행성관절염이라고도 한다. 크게 두 가지 원인이 있는데 관절의 연골이나 뼈는 정상적인데 비해 관절에 과도한 부하가 걸려 관절 조직이 손상을 받거나, 부하는 정상적인데 비해 관절의 연골이나 뼈가 약한 경우이다.
골결손 질환은 인체의 여러 부위에서 나타날 수 있는데, 그 주된 원인으로 골질 손실을 동반한 급성 외상, 수술 중 조직제거로 인한 골손실을 동반한 급성외상, 골 절제(boneresection)를 수반한 만성 감염, 분절성 골결손을 동반한 만성 불유합 등을 들 수 있다.
이와 같은 골질환 치료와 관련되어 전세계적으로 약 1,300억 달러 이상의 시장이 형성되어 있으며 그 규모는 향후 계속적으로 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.
특히 골다공증을 예로 들어 살펴보면 현재 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있고, 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사 (Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 라록시펜(raloxifene)을 골다공증 치료제로 개발한 바 있다.
한편, 골다공증 치료제로서 골흡수 억제제인 에스트로겐이 가장 널리 사용되고 있으나, 에스트로겐의 상용이 자궁내막암, 유방암의 발생빈도를 증가시키고, 혈전증, 담석증, 고혈압, 부종, 유방통 등을 유발시킬 수 있으며, 폐경 후 에스트로겐과 프로게스테론을 동시 투여한 여성을 추적 관찰한 결과, 유방암, 뇌졸중, 폐색전 등의 발생률이 높다는 것이 증명되었다.
이외에도 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 또는 칼슘 제제 등이 골다공증 치료제로서 사용되나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키며, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 용이하지 않으며, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다.
더욱이, 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없으며 약물의 장기 투여가 필수적이다. 따라서, 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과 본 발명자들은 저렴한 비용으로 합성 가능할 뿐만 아니라 골아 세포 분화 및 골 형성을 촉진하는 BMP-7에서 유래하는 15개의 아미노산 서열(Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe- Ser-Thr-Gln)로 이루어진 bone forming peptide 1(BFP 1)이라 명명된 합성펩타이드를 개발하여 국내특허출원번호 제10-2008-0045461호로 출원한 바 있다.
상기 특허에서 개시하고 있는 BFP1은 도 1에 도시된 바와 같은 15개의 아미노산서열로 이루어지고 있지만, 도2에 개시된 바와 같이 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 도3 내지 도7에 도시된 바와 같이 BMP-7보다 골아세포분화 및 골형성을 촉진하는 능력이 현저하게 우수하다.
따라서, BFP1은 15개의 아미노산을 인위적으로 합성하여 용이하게 얻을 수 있으므로 그 생산원가가 거의 430여개의 아미노산으로 이루어진 BMP-7보다 현저하게 절감되면서도 그 효과 또한 매우 우수한 것을 알 수 있다.
하지만, BFP1을 구성하는 아미노산의 개수보다 더 적은 수로 이루어진 합성펩타이드가 골아세포분화 및 골형성을 촉진한다면 그 원가가 보다 절감될 것이므로 인체에 영향을 최소화하는 범위내에서 가능하면 짧은 서열의 합성펩타이드가 개발될 필요가 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과 BFP1보다 더 짧은 서열을 가지면서도 유효한 골아세포형성 및 골형성을 촉진하는 합성펩타이드를 개발하게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 보다 저렴한 비용으로 손쉽게 합성 가능하도록 5개 내지 10개의 아미노산으로 이루어지고, 골아 세포 분화 및 골형성을 촉진하는 BMP-7에서 유래하는 합성펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 10개 이하의 아미노산서열로 이루어진 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하여 부작용이 없고 약효가 우수하면서도 생산단가가 상대적으로 낮은 골다공증을 예방하거나 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 10개 이하의 아미노산서열로 이루어진 합성 펩타이드를 포함하여 골아세포분화 속도를 조절할 수 있는 골아세포분화배지조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 BMP-7에 존재하는 하기 서열정보에 기재된 bone forming peptide 1 (BFP 1)의 일부 서열을 이루는 5개 내지 10개의 아미노산서열로 이루어진 펩타이드로서 골아세포분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드를 제공한다.
<서열 정보>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 1인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호1>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 2인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호2>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 3인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호3>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 4인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호4>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 5인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호5>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 6인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호6>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 7인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호7>
Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
바람직한 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 하기 서열번호 8인 펩타이드 또는 그의 상동체이다.
<서열번호8>
Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val
바람직한 실시예에 있어서, 골아세포분화 또는 골형성을 촉진하기 위한 골아세포 당 상기 합성 펩타이드의 첨가함량은 0.1 내지 2 ㎍/㎖이다.
또한, 본 발명은 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 합성펩타이드 또는 그의 무독성염은 골다공증, 골관절염 및 골결손질환 치료를 위한 유효성분으로 작용한다.
또한, 본 발명은 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 배지 제조시 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 골아세포배지조성물을 제공한다.
본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 가진다.
먼저, 본 발명의 합성 펩타이드는 10개 이하의 아미노산 서열로 이루어져 합성이 간편하고 비용이 절감될 뿐만 아니라 골아세포가 분화될 때 골아세포의 분화를 촉진시키게 되므로 골아세포 분화를 촉진시킬 필요가 있는 다양한 분야에서 응용될 수 있다.
또한, 본 발명의 합성 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약학조성물은 골다공증 치료시 기존의 치료물질에 비해 부작용이 없고 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효 즉 골아세포 분화 촉진효과를 가질 뿐만 아니라, 아직 골다공증이 발병하기 전이라도 처치하게 되면 골다공증을 예방할 수 있으며, 생산단가가 상대적으로 낮다.
또한 본 발명의 합성 펩타이드가 첨가된 배지조성물은 골아세포분화 속도를 실험자가 조절할 수 있게 되므로 다양한 실험조건을 구현하여 실험할 수 있다.
도 1은 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드의 서열을 그 일부로 포함하는 BFP 1의 아미노산서열정보이다.
도 2는 도 1에 도시된 BFP 1의 세포독성결과 그래프이다.
도 3은 도 1에 도시된 BFP 1에 의한 골아세포분화를 통해 축적되는 미네랄리제이션을 측정하는 알리자린 레드 염색을 통하여 확인한 결과 사진이다.
도 4는 도 1에 도시된 BFP 1에 의한 골아세포 특정 유전자, 콜라겐 타입1, 알칼리포스파타아제(ALP), 렁스-2 유전자의 발현을 측정한 결과그래프이다.
도 5는 도 1에 도시된 BFP 1에 의한 골아세포 분화에 관련된 세포표면마커의 발현을 FACS분석을 통하여 조사한 결과이다(회색화살표-ODM 단독; 검정색화살표-ODM+합성펩타이드).
도 6은 도 1에 도시된 중간엽줄기세포가 골아세포로 분화가 이루어지면서 세포의 이동을 확인하기 위하여 BFP 1에 대해 화학주성(chemotaxis)실험법을 수행한 결과그래프이다.
도 7은 도 1에 도시된 BFP 1의 골세포 형성을 확인하기 위하여, 마우스를 이용하여 동물실험을 수행한 결과사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예들에서 얻어진 합성펩파이드들에 의한 골아세포 특정 유전자 알칼라인포스파타아제(ALP)의 발현정도를 측정한 결과그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)에 의한 골아세포 특정 유전자 알칼라인포스파타아제(ALP)의 발현정도를 측정한 결과그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)에 의한 세포표면마커 CD44의 발현을 형광현미경을 통하여 관찰한 결과사진이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)에 의한 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단키트를 이용하여 확인한 결과그래프이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)의 세포독성실험결과를 각각 나타낸 결과그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)에 의한 알칼리포스파타제(ALP)의 발현을 각각 측정하여 나타낸 결과그래프이다.
도 14a 및 도 14b는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)의 함량에 따른 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단키트를 이용하여 각각 측정한 결과그래프이다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)의 함량에 따른 골아세포 알칼리포스파타아제(ALP), 오스테오칼신, 렁스-2 유전자의 발현정도를 확인한 결과사진이다.
도 16a 및 도 16b는 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)에 의한 골아세포 분화에 관련된 세포표면마커의 발현여부를 FACS분석을 통하여 조사한 각각의 결과 그래프이다(초록색화살표-ODM 단독; 붉은색화살표-ODM+합성펩타이드).
도 17은 본 발명의 실시예에서 얻어진 합성펩타이드 BFP1(1-9) 및 합성펩타이드 BFP1(6-15)에 의한 골형성 관찰사진이다.
본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다.
현재, 뼈 형태 발생 활성은 TGF(형질 전환 성장 인자)-β 수퍼패밀리에 속하는 뼈 형태 발생 인자 BMP에 대해서 보고되어 있다(Science 150, 893-897, 1965; Science 242; 1528-1534, 1988). 알려진 BMP종은 BMP-1 내지 BMP-14이다. 이 중, BMP-2 내지 BMP-14는 뼈 형태 발생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. BMP-2 내지 BMP-14의 BMP는 여러 가지 뼈 기능 장애 및 뼈 질환의 치료적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있지만, 이들은 자연계에 극소량으로 존재한다. 따라서, 이러한 처치에 이용되는 BMP-2 내지 BMP-14를 입수가능하게 다량으로 얻는 데는 재조합 단백질의 제조를 필요로 한다. 재조합 단백질의 제조는 일반적으로 저분자량 화합물에 비해 비용이 많이 소요된다. 다른 한편, 그의 단백질적 특성 때문에 물성 및 투여의 면에서 의약으로서는 많은 제약이 있다. 이러한 점들을 고려할 때, 상기 BMP 단백질과 동일한 활성을 갖는 저분자량 유기 화합물이 만일 존재한다면, 그것은 매우 유망한 의약이 될 것이다.
본 발명자들은 이러한 점에 착안하여 BMP-7에 존재하는 아미노산서열들을 연구한 결과 BMP-7에 존재하는 15개의 아미노산으로 이루어진 하기와 같은 서열을 갖는 펩타이드가 인간 BMP-7 (골형성 인자)의 발현을 유발시키는 활성을 가지고, 또한 인간 BMP-7과 동일한 효능을 가져서 매우 높은 유용성을 갖는 것을 발견하여 bone forming peptiede 1 (BFP 1)로 명명하였다.
<BFP 1의 서열정보>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
상기 BFP 1은 BMP-7에서 유래하는 15개의 아미노산으로 이루어진 서열의 펩타이드로서, 공지된 펩타이드합성방법을 통해 인위적으로 합성이 가능하다. 또한, 도 3 내지 도 7의 실험 결과 데이터로부터 분명하듯이 골아세포 분화배지를 사용하여 골아세포(정확하게는 마우스 중간엽 줄기세포)의 분화를 유도하였을 때, 일반적인 골아세포 분화배지만을 이용하여 분화할 때보다 BFP 1을 처리하였을 때, 더 강하게 골아세포가 분화됨을 확인할 수 있었으며, 결과적으로 골아세포 분아를 촉진시켜 분화능을 향상시키게 되므로 골형성 촉진효능을 가지고 있는 것을 알 수 있었다.
본 발명은 상술된 서열정보에 기재된 바와 같이 15개의 아미노산 서열로 이루어진 BFP1의 서열 중 일부를 이루는 5개 내지 10개의 아미노산서열이 골아세포 분화유도 및 골형성을 촉진하는 활성을 갖는지 여부를 확인하여 BFP1 보다 더 짧은 서열의 합성 펩타이드를 제조하는데 그 기술적 특징이 있다.
그 결과, BFP1의 서열 중 일부를 이루는 5개 내지 10개의 아미노산 서열로 이루어진 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드들 및 그의 상동체들이 골아세포 분화의 유도 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
여기서, 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드의 "상동체"란 "기능적 동등물"로서, 후술하는 서열번호1 내지 서열번호8로 이루어진 펩타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩타이드를 말한다. "동질의 생리활성"이란 이성화 능력이 있으며, 적어도 60% 이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 90%이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 말한다. 또한 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe,Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met).
이하, 바람직한 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다.
실시예 1
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호1과 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 5개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-5)을 합성하였다.
<서열번호1>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser
실시예 2
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호2와 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 6개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-6)을 합성하였다.
<서열번호2>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr
실시예 3
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호3과 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 7개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-7)을 합성하다.
<서열번호3>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro
실시예 4
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호4와 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 8개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-8)을 합성하였다.
<서열번호4>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr
실시예 5
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호5와 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 9개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-9)을 합성하였다.
<서열번호5>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys
실시예 6
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호6과 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단의 10개 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(1-10)을 합성하였다.
<서열번호6>
Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala
실시예 7
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호7과 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단 6번째부터 후단까지의 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(6-15)를 합성하였다.
<서열번호7>
Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
실시예 8
공지된 구성의 펩타이드합성기를 사용하여 하기 서열번호8과 같이 BFP1의 아미노산서열 중 전단 5번째부터 11번째까지의 아미노산서열로 이루어진 펩타이드 BFP1(5-11)을 합성하였다.
<서열번호8>
Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val
실시예1 내지 실시예8에서 합성된 펩타이드들인 BFP1(1-5), BFP1(1-6), BFP1(1-7), BFP1(1-8), BFP1(1-9), BFP1(1-10), BFP1(6-15), BFP1(5-11)이 골아세포분화 활성에 어떤 영향을 주는지 확인하기 위하여 다음과 같은 실험들을 수행하였다.
실험예 1
1. 골아세포 및 골아세포분화배지의 준비
10% FBS가 첨가된 DMEM에 1 ㅧ 104개의 중간엽 줄기세포(Balb/c mouse bone marrow stromal cell로부터 클론됨)가 들어가도록 분주한 후, 약 3일 동안 약 37℃의 온도를 유지하는 5%의 이산화탄소가 함유된 대기속에서 배양하여 본 발명의 실험들에서 사용되는 골아세포로서 상기 중간엽 줄기세포가 준비되었다. 골아세포 분화 배지(osteogenic differentiation medium: 이하"ODM")는, 50㎍/㎖ 아스코르브산, 10-8 M 덱사메타손 및 10mM 베타-글리셀로포스페이트 등이 첨가된 DMEM으로 이루어진다.
2. 알칼라인포스파타아제(ALP)의 농도측정
골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제가 본 발명의 합성펩타이드들 즉 BFP1(1-5), BFP1(1-6), BFP1(1-7), BFP1(1-8), BFP1(1-9), BFP1(1-10), BFP1(6-15), BFP1(5-11)에 의해 발현되는 정도를 상업적으로 판매되는 진단키트를 이용하여 분석하는 실험을 수행하고 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
즉, 골아세포로 분화가 이루어지게 되면 골아세포 특정 단백질의 발현이 나타나는데, 특히 알칼라인포스파타아제(alkaline phosphatase)는 골형성의 지표가 되는 효소로써 골아 세포의 분화 중기에 생성되는 것이기 때문이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 알칼라인포스파타아제가 본 발명의 합성펩타이드들인 BFP1(1-5), BFP1(1-6), BFP1(1-7), BFP1(1-8), BFP1(1-9), BFP1(1-10), BFP1(6-15), BFP1(5-11)을 처리했을 때 상기 펩타이드들에 의해 발현이 유도되는 정도가 골아세포분화배지(ODM)보다는 매우 유효한 것을 알 수 있다.
또한, BMP2를 처리했을 때와 비교해 보면 그 발현정도가 일부는 동등하지만 대부분 더 효과적으로 발현되는 것을 알 수 있다.
또한, BMP-7을 처리했을 때와 비교해 보면 그 발현정도가 일부는 약간 못미치지만 오차를 고려하면 동등 정도이고 일부는 BMP-7을 처리했을 때보다 현저하게 우수함 알 수 있다. 즉, 도 9에 도시된 바와 같이 서열번호5, 서열번호7의 0.1ug/ml의 농도에서 비교한 결과 BMP7보다 더 높게 유의적으로 증가됨을 관찰할 수 있었기 때문이다
실험예 2
실시예5 및 실시예7에서 얻어진 BFP1(1-9)[서열번호5] 및 BFP1(6-15)[서열번호7]에 의한 세포표면마커 CD44의 발현을 형광현미경을 통하여 관찰한 후 그 결과를 도 10에 나타내었다.
즉, 세포분화에서 세포가 살아있음을 확인하기 위하여 핵에 염색을 하여 파란색을 나타내는 DAPI 염색과 CD44에 결합하여 붉은색을 나타내는 CD44 항체를 이용하여 형광현미경하에서 관찰한 결과이다.
일단 핵이 파란색으로 염색되는 것을 관찰할 수 있었고, CD44의 염색이 붉게 나타나는 것을 관찰되었으며 이 염색을 겹쳐 확인한 결과, 세포에서 CD44가 발현된다는 것을 알 수 있었다. 그리고 골아세포 분화배지를 단독으로 처리한 것보다, 골아세포 분화배지에 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)을 넣어 주었을 때 강하게 CD44가 발현됨을 알 수 있었다. 또한, BMP-7을 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)과 같은 농도를 사용하여 형광현미경하에서 관찰하였는데, BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)보다 약하게 염색되었음을 확인할 수 있었다.
따라서, 골아세포분화에 관련이 있는 CD44의 발현을 조사한 결과 본 발명의 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)이 BMP7보다 더 강하게 발현됨을 관찰할 수 있어, 본 발명의 합성펩타이드가 BMP7에 비해 골아세포분화 및 골형성 촉진에 보다 효과적임을 알 수 있다.
실험예 3
골아세포의 분화에서 중요한 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단키트를 이용하여 BFP1, BMP7, BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)의 0.1ug/ml의 농도에서 확인하고, 그 결과를 도 11에 도시하였다.
도 11로부터, 비교한 결과 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)이 BMP7보다 높게 유의적으로 증가됨을 관찰할 수 있었다.
실험예 4
실시예5 및 실시예7에서 얻어진 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)의 세포에 대한 독성을 조사하기 위하여 실험에 사용된 농도 범위내에서 세포독성 실험을 MTT방법을 이용하여 수행하고 그 결과를 도 12a 및 도12b에 각각 나타내었다.
도 12a 및 도 12b로부터 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)은 세포독성을 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
실험예 5
상업적으로 판매하는 진단키트를 이용하여 골아세포의 분화에서 발현되는 골아세포 특정 효소인 ALP의 농도를 측정하는 실험을 수행하였는데, 특히 BFP1(1-9) 및 BFP1 (6-15)의 함량에 따른 ALP의 농도를 측정하는 실험을 수행하고 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 각각 나타내었다.
도 13a 및 도 13b에 도시된 바와 같이, 활성이 농도 의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었고, BMP7 0.1ug/ml에서 BFP1(1-9) 및 BFP1 (6-15)와 비교하면 BMP7보다 본 발명의 펩타이드의 활성이 높게 유의적으로 증가됨을 관찰할 수 있다.
실험예 6
골아세포의 분화에서 중요한 칼슘의 농도를 상업적으로 판매하는 진단키트를 이용하여 측정하는 실험을 수행하였는데, 특히 BFP1(1-9) 및 BFP1 (6-15)의 함량에 따른 칼슘농도를 측정하는 실험을 수행하고 그 결과를 도 14a 및 도 14b에 각각 나타내었다.
도 14a 및 도 14b로부터 활성이 처리되는 농도 의존적으로 증가함을 관찰할 수 있었고, BMP7 0.1ug/ml에서 BFP1(1-9) 및 BFP1 (6-15)와 비교하면 BMP7보다 본 발명의 펩타이드의 활성이 높게 유의적으로 증가됨을 알 수 있다.
실험예 7
골아세포 특정 유전자인 알칼라인포스파타아제, 오스테오칼신, 렁스-2 유전자가 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드 중 BFP1(1-9) 및 BFP1 (6-15)에 의해 발현되는 정도를 확인하는 실험을 수행하였고 그 결과를 도 15a 및 도 15b에 각각 도시하였다.
즉, 골아세포로 분화가 이루어지게 되면, 골아세포 특정 유전자의 발현이 나타나는데, 이러한 유전자의 발현을 최신 기술인 실시간유전자증폭(real-time PCR)을 이용하여 확인한 결과인 도 15a 및 도 15b에 도시된 바와 같이 오스테오칼신, 렁스-2(Runx-2)유전자 및 알칼라인포스파타아제가 발현됨을 관찰할 수 있었고, 같은 농도에서 BMP7보다 더 강하게 발현됨을 확인할 수 있었다.
여기서, 오스테오칼신은 골아 세포에서 분비되는 골기질 물질로 각각의 활성정도는 골아세포 증식의 판정요소로 그 농도가 증가하면 골아 세포의 성장 및 분화가 활발함을 알려주고, 렁스-2(Runx-2)유전자는 골아세포에서 골아세포 특정 단백질을 생산하는데 중요한 작용을 하는 전사조절인자로서 골아세포 분화에 중요한 역할을 수행하며, 알칼라인포스파타아제는 골형성의 지표가 되는 효소로서 골아 세포의 분화 중기에 생성된다.
실험예 8
중간엽 줄기세포는 골, 연골, 지방조직, 근육, 건, 인대, 신경조직 및 혈관으로 분화될 수 있도록 다양한 표면단백질을 포함하고 있다. 본 실험에서는 다양한 표면 단백질 중 중간엽 줄기세포가 골아 세포로 분화되면서 나타나는 특정 표면 단백질 CD44, CD45의 발현정도를 FACS분석을 통해 측정하여 본 발명의 합성펩타이드들 중 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)가 어떠한 영향을 주는지 확인하였고 그 결과를 도 16a 및 도 16b에 나타내었다.
도 16a 및 도 16b는 중간엽 줄기세포에서 발현되는 세포표면마커인 CD44가 BFP1(1-9) 및 BFP1(6-15)를 골아세포 분화배지에 첨가하면 골아세포로 분화되는 과정 중에서 강하게 발현되는 것을 보여준다. 한편, CD45는 조혈계줄기세포의 표면인자로서 본 실험에 사용된 세포가 조혈계에서 유래하지 않음을 보여주기 위하여 사용하였다. 도 16a 및 도 16b로부터 CD45의 발현이 없음을 확인할 수 있고, 이로부터 본 실험에 사용한 세포가 조혈계 유래 줄기세포가 아님을 확인할 수 있다.
실험예 9
동물실험을 수행하기 위하여, 세포를 배양한 후, 3일째에 골아세포분화배지로 교환해준 다음, 다시 3일 후에 새로운 골아세포분화배지로 교환하면서 BFP1(1-9)과 BFP1 (6-15)를 1 ug/ml 농도로 처리하였다. 48시간 후에 수집하여, 상용되는 Matrigel과 1:1의 비율로 혼합한 후 쥐 등에 주사를 하여, 6주 후에 주입된 메트리젤을 획득한 후, 일반사진과 x-ray 분석을 수행하고 그 결과 사진을 도 17에 도시하였다.
도 17에 도시된 바와 같이 본 발명의 합성펩타이드에 의한 골 형성을 관찰할 수 있었다.
이러한 실험결과로부터 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드들은 BFP 1의 일부서열을 이루는 5개 내지 10개의 아미노산서열로 이루어졌지만, 종래에 골아세포분화를 촉진하는 것으로 알려진 BMP-2 및 BMP-7와 비교하여 동등하거나 그 보다 효과적으로 골아세포 분화 촉진에 중요한 영향을 미치는 것을 보여주므로, 본 발명의 펩타이드들이 빠른 골형성을 유도할 수 있음을 알 수 있다.
그 결과, 본 발명은 골형성촉진용 합성펩타이드들 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물을 제공할 수 있다. 여기서, 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체는 제한되지 않고 공지된 것을 모두 사용할 수 있으므로 상세한 설명은 생략하기로 한다.
또한, 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드들을 생체에 투여했을 때 골형성이 촉진되는 것을 보여주는 실험예 9의 결과로부터, 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드들 또는 그의 무독성염이 유효성분으로 포함된 약학조성물을 골다공증 및/또는 골관절염이 발생한 골수부위에 투여하게 되면 골수의 골아세포 분화를 촉진하여 골형성을 촉진할 수 있음을 분명히 알 수 있으므로 본 발명의 약학조성물은 유효한 골다공증 및/또는 골관절염치료제로 작용할 수 있다.
동일하게 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염이 유효성분으로 포함된 약학조성물을 골결손질환의 골결손 부위에 채워넣거나 투여하게 되면 골형성촉진을 통해 골수복을 효과적으로 수행할 수 있다.
따라서, 골다공증, 골관절염 또는 골결손질환 등을 포함하는 골질환으로 인해 골손실이 있는 경우, 본 발명의 합성펩타이드들 또는 그의 무독성염을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 골결손 부위에 채워 넣거나 투여하게 되면 골다공증, 골결손질환 및/또는 골관절염을 치료할 수 있는 효능이 있다는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 골형성촉진용 합성펩타이드를 골아세포분화배지조성물에 첨가하게 되면 골아세포를 이용하는 실험시 실험자가 실험속도를 조절할 수 있어 용이하게 실험을 수행할 수 있는 것은 당연하다할 것이다.
한편, 구체적인 실시예로 제시하지는 않지만 본 발명에 실시예로 개시된 합성펩타이드들인 BFP1(1-5), BFP1(1-6), BFP1(1-7), BFP1(1-8), BFP1(1-9), BFP1(1-10), BFP1(6-15), BFP1(5-11)이외에도 BFP1의 일부 서열을 이루는 5개 내지 10개로 이루어진 다른 아미노산 서열에 대해서도 본 발명의 범위가 확장될 수 있을 것이다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY et al <120> OSTEOGENIC SYNTHETIC PEPTIDES DERIVED FROM BFP 1, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING THE SAME, AND MEDIA CONTAINING THE SAME <130> DPP-2011-0176-KR <150> KR 10-2010-0115707 <151> 2010-11-19 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 1 Gly Gln Gly Phe Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 2 Gly Gln Gly Phe Ser Tyr 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 3 Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 4 Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from BMP-7 <400> 5 Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 6 Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 7 Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser Thr Gln 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Being the part of Bone forming peptide 1(BFP1) which is derived from human BMP-7 <400> 8 Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val 1 5

Claims (13)

  1. BMP-7에 존재하는 하기 서열정보에 기재된 bone forming peptide 1 (BFP 1)의 일부 서열을 이루는 5개 내지 10개의 아미노산서열로 이루어진 펩타이드로서 골아세포분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열 정보>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 1인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호1>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 2인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호2>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 3인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호3>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 4인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호4>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 5인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호5>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 6인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호6>
    Gly-Gln-Gly-Phe-Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 7인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호7>
    Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val-Phe-Ser-Thr-Gln
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 서열번호 8인 펩타이드 또는 그의 상동체인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
    <서열번호8>
    Ser-Tyr-Pro-Tyr-Lys-Ala-Val
  10. 제 1 항에 있어서,
    골아세포분화 또는 골형성을 촉진하기 위한 골아세포 당 상기 합성 펩타이드의 첨가함량은 0.1 내지 2 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 골형성촉진용 합성펩타이드.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 제약상 또는 수의학상 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 약학조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 합성펩타이드 또는 그의 무독성염은 골다공증, 골관절염 및 골결손질환 치료를 위한 유효성분으로 작용하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 골형성촉진용 합성펩타이드 또는 그의 무독성염과 배지 제조시 허용가능한 액체 또는 고체 담체를 포함하는 골아세포배지조성물.
KR1020110120264A 2010-11-19 2011-11-17 Ｂｆｐ 1 유래 골형성촉진용 합성펩타이드, 상기 합성 펩타이드를 포함하는 약학조성물 및 배지조성물 KR20120054536A (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113388005A (zh) * 2021-06-30 2021-09-14 北京泽勤生物医药有限公司 增强成骨细胞活性的多肽及其在治疗骨科疾病中的应用

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