JP2024046128A - 骨形成促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ＢＭＰアゴニストとして生体内に存在する物質を選択し、それをＢＭＰとともに含有する、副作用の少ない骨形成促進剤を提供すること。
【解決手段】 ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤を提供する。配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、ＢＭＰ－２の骨誘導活性を顕著に増強する作用を有する。ＫＣＰは生体で発現しているタンパク質であり、より少ないＢＭＰ－２投与量で大きな骨誘導活性が得られることから、副作用の少ない骨形成促進剤が提供可能である。
【選択図】 図２
【解決手段】 ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤を提供する。配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、ＢＭＰ－２の骨誘導活性を顕著に増強する作用を有する。ＫＣＰは生体で発現しているタンパク質であり、より少ないＢＭＰ－２投与量で大きな骨誘導活性が得られることから、副作用の少ない骨形成促進剤が提供可能である。
【選択図】 図２
Description
本発明は、キーリン／コーディン様タンパク質（ＫＣＰ、Ｋｉｅｌｉｎ／Ｃｈｏｒｄｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）及び／又はその部分タンパク質と、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）と、を含有する骨形成促進剤に関する。
間葉系細胞から骨芽細胞への分化を強力に誘導する骨誘導因子であるＢＭＰは、難治性骨折や骨欠損などに対して臨床応用されている。しかし、生体におけるＢＭＰの骨形成促進作用は必ずしも強くなく、大量のタンパク質が必要となる。そのため、ＢＭＰの作用を増強させるアゴニストの探索が肝要である。骨誘導におけるＢＭＰ－２の作用を増強させる因子として、例えば硫酸多糖の一種であるヘパリンが知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
一方、ＫＣＰは、複数のシステインリッチドメインを有するコーディン様タンパク質である。ＫＣＰは、ＢＭＰアンタゴニストであるコーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）タンパク質とは異なり、腎臓におけるＢＭＰシグナル伝達を強化する物質として発見された（例えば、非特許文献３参照）。
T. Takada et. Al., Journal of Biological Chemistry,Vol.278, No.44, pp.43229-43235, 2003.
B. Zhao et. Al., Journal of Biological Chemistry, Vol.281, No.32, pp.23246-23253, 2006.
J. Lin et.al., Nature Medicine Vol.11, No.4, pp.387-393, 2005.
非特許文献１及び２に記載されたヘパリンは、血液凝固阻害作用などの生理活性を有し、臨床で用いられている。したがって、ヘパリンを生体に用いる際には、様々な副作用も考慮に入れる必要がある。そのため、副作用の少ない新たなＢＭＰアゴニストの探索が求められていた。
そこで、本発明は、ＢＭＰアゴニストとして生体内に存在する物質を選択し、それをＢＭＰとともに含有する、副作用の少ない骨形成促進剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、ＢＭＰアゴニストとして腎臓におけるＢＭＰ－２のシグナル伝達を増強させるＫＣＰに着目し、鋭意研究を重ねた。その結果、驚くべきことに、ＢＭＰ－２の存在下で、配列番号１のアミノ酸配列からなるＫＣＰの部分タンパク質を作用させることで、ＢＭＰ－２の骨誘導活性を顕著に増強できること（すなわち、骨形成促進効果）を見出した。また、配列番号２のアミノ酸配列からなるＫＣＰの全長タンパク質を添加した場合にも、同様に骨形成促進効果が認められた。ＫＣＰは生体でも発現しているタンパク質であり、また、より少ないＢＭＰ－２投与量で大きな骨誘導活性が得られることから、ＢＭＰ－２とＫＣＰを併用する骨形成促進剤は、従来の骨形成促進剤に比べて副作用が少ないものと考えられる。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤に関する。前記「骨形成促進剤」は、例えば骨折又は骨欠損の治療剤とすることができる。
前記「ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質」は、例えばマウス又はヒト由来のタンパク質であってもよい。
また、前記「ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質」は、以下の（ｉ）～（iii）のうちいずれかのタンパク質であってもよい。
（ｉ）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（iii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（iii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
本発明は、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤を提供することを可能とする。ＫＣＰは生体でも発現しているタンパク質であり、また、より少ないＢＭＰ－２投与量で大きな骨誘導活性が得られることから、前記骨形成促進剤は副作用が少ないものと考えられる。
以下、本願の実施形態について詳細に説明する。
本実施形態は、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤に関する。
［ＫＣＰ、部分タンパク質］
本実施形態においてＫＣＰは、複数のシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）を有するキーリン／コーディン様タンパク質（Ｋｉｅｌｉｎ／Ｃｈｏｒｄｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質である。ここで、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用は、実施例で後述するように、骨芽細胞への分化の指標として一般的に用いられているアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の上昇によって評価することができる。
本実施形態においてＫＣＰは、複数のシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）を有するキーリン／コーディン様タンパク質（Ｋｉｅｌｉｎ／Ｃｈｏｒｄｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質である。ここで、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用は、実施例で後述するように、骨芽細胞への分化の指標として一般的に用いられているアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の上昇によって評価することができる。
前記ＫＣＰの由来は特に制限されず、例えば哺乳類が挙げられる。前記哺乳類としては、例えばヒト又は非ヒト哺乳類が挙げられる。前記非ヒト哺乳類としては、例えば霊長類、げっ歯類等が挙げられ、特にマウスが好ましい。
前記ＫＣＰは、部分タンパク質であっても、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有している限り、用いることができる。前記ＫＣＰは、当該部分タンパク質のみを用いてもよく、ＫＣＰの全長タンパク質のみを用いてもよく、これらを併用してもよい。これらのＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、例えばMyBiosource社（California, San Diego (USA)）より市販されており、容易に入手可能である。
前記ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、人工的に合成した合成物でもよい。前記合成物の合成方法は、特に制限されず、例えば、以下のような遺伝子工学的な手法が挙げられる。
すなわち、前記ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、従来公知の方法によりプラスミド（例えば、pMAL-c5E）等の適当な発現ベクターに挿入し、得られた発現ベクターを従来公知の方法により大腸菌等の適当な宿主に導入することによって、形質転換体を作製する。次に、当該形質転換体をIPTGにより発現誘導して大量培養することによって標的タンパク質を大量生産させる。その後、菌体を破砕し、得られた可溶画分から、アフィニティークロマトグラフィーやゲルろ過等により標的タンパク質を精製することによって、前記ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質を合成することができる。
このようにして合成された組換えタンパク質は、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のようなタグ融合タンパク質として発現させることによって、容易にかつ効率よく精製することができる。したがって、本実施形態におけるＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、前記した効果を奏する限り、任意のタンパク質タグを含むものであってもよい。
前記ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、改変タンパク質であってもよい。前記改変タンパク質は、例えば、天然のＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質でもよく、１若しくは数個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。このようなタンパク質は、ＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有する限り、本実施形態におけるＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質に含まれる。
なお、当業者は、従来公知の方法を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を容易に変異させて、前記のような改変タンパク質を得ることができる。例えば、公知の点変異導入法（変異誘発法）に従えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。
前記ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、例えば、以下の（A1）～（A3）、（B1）～（B3）、（C1）～（C3）、（D1）～（D3）のいずれかのタンパク質であってもよい。
（A1）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号１：QALSNCTEDLVGSELVPPDPCYTCQCQDLTWLCTHRACPELSCPLWERHTTPGSCCPVCKDPTQSCMHQGRWVASGEQWAVDACTSCSCVAGTVHCQTQRCRKLACSRDEVPALSPGSCCLRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHGEDFSVHVTNDDRGRRGVAWTQEVAVLLGTVAVRLLQGRTVMVDQHTVTLPFLREPLLYIELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVRVPSSYRGQTCGLCGNFNGFAQDDLQGPDGRLLPTEASFGNSWKVPKGLGPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGILKTSPFSHCHAV
配列番号１：QALSNCTEDLVGSELVPPDPCYTCQCQDLTWLCTHRACPELSCPLWERHTTPGSCCPVCKDPTQSCMHQGRWVASGEQWAVDACTSCSCVAGTVHCQTQRCRKLACSRDEVPALSPGSCCLRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHGEDFSVHVTNDDRGRRGVAWTQEVAVLLGTVAVRLLQGRTVMVDQHTVTLPFLREPLLYIELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVRVPSSYRGQTCGLCGNFNGFAQDDLQGPDGRLLPTEASFGNSWKVPKGLGPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGILKTSPFSHCHAV
（A2）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（A3）配列番号１のアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（B1）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号２：MAGARAALLPLLLHLGSLALAARGGEGVSREQPRLADAISQQQAPSHSLVPGETHQQQWCPLEERLERLEAEVTDLRKQNRELQARVVQLESCECWGPGHTCPEGARWEPDACTACVCRDGTAHCGPQPNLPHCRGCSHNGQSYGHGETFSPDACTTCRCLAGTVQCQGPSCSELNCLESFIPPGECCPCRPGCEYEGQLHQEGSSFLSSSNPCLQCSCLRSLVRCVPVKCQPSPCLNPVPRLGHCCPVCQASGCTEGNSHRDHGQEWTTPGDPCRICQCLEGHIQCRQRECASLCPYPARPLPGTCCPVCDGCFLNGREHSSGEPVGSQDPCSSCRCTNGSVQCEPLPCPPAPCRYPGRIPGQCCPVCDGCKYQGHEYRSQETFTLQENGRCLRCVCQAGEVSCEEQDCPVTPCVRSASGPQLCSACVLNGEEFAEGIQWEPDDQPCTSCSCQDGVPVCRAVLCSPVPCQHPTQPPGACCPSCDSCTYHSLVYANGQNFTDVDSPCQTCYCEDGTVRCSLINCPFTTCAKPQNGPGQCCPKCPDCILEAQVFVDGERFPHPRDPCQECWCQEGQAHCQLRACPSAPCVHPLPGTCCKNDCTGCAFGGKEYPNGADFPHPTDPCRLCRCLSGNVQCLARRCPPLSCPQPVLTPGDCCPQCPDAPADCPQSGNMVPVRHQEHFFQPGDPCSRCLCLDGSVSCQRLTCPPAPCAHPRRDACCPSCDGCLYQGKEFASGERFPSPNVACHVCLCWEGSVKCEPRTCAPAQCPFPTREDCCPACDSCDYLGVSYLSSQEFPDPREACNLCTCLGGFVTCTRRPCEPPACSHPLIVPEHCCPTCQGCLYHGITAALGETLPDPLDPTCSLCTCEEGSMRCQKKPCPPAPCAHPSPGPCFCPVCRSCLSQGREHQDGEEFEGPEGSCERCRCLAGQVSCTRLQCPSLPCLHQVTEPGTCCPRCTGCLARGEEHPEGSSWVPADSPCSSCMCHKGIITCAQVQCVSACIWPQEGPSDCCPQCSGCEHGGRKYEPGESFQPGADPCEVCICKQKREGPPSLHCSRRQCPSLVGCPPSQLLPPGPQHCCPTCAQALSNCTEDLVGSELVPPDPCYTCQCQDLTWLCTHRACPELSCPLWERHTTPGSCCPVCKDPTQSCMHQGRWVASGEQWAVDACTSCSCVAGTVHCQTQRCRKLACSRDEVPALSPGSCCLRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHGEDFSVHVTNDDRGRRGVAWTQEVAVLLGTVAVRLLQGRTVMVDQHTVTLPFLREPLLYIELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVRVPSSYRGQTCGLCGNFNGFAQDDLQGPDGRLLPTEASFGNSWKVPKGLGPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGILKTSPFSHCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSSDTCLCDALEAYASHCRQAGVTPVWRGPTLCVVGCPVDRGFVFDECGPPCPRTCFNRHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEGHCISPEVCPPVLLTGD
配列番号２：MAGARAALLPLLLHLGSLALAARGGEGVSREQPRLADAISQQQAPSHSLVPGETHQQQWCPLEERLERLEAEVTDLRKQNRELQARVVQLESCECWGPGHTCPEGARWEPDACTACVCRDGTAHCGPQPNLPHCRGCSHNGQSYGHGETFSPDACTTCRCLAGTVQCQGPSCSELNCLESFIPPGECCPCRPGCEYEGQLHQEGSSFLSSSNPCLQCSCLRSLVRCVPVKCQPSPCLNPVPRLGHCCPVCQASGCTEGNSHRDHGQEWTTPGDPCRICQCLEGHIQCRQRECASLCPYPARPLPGTCCPVCDGCFLNGREHSSGEPVGSQDPCSSCRCTNGSVQCEPLPCPPAPCRYPGRIPGQCCPVCDGCKYQGHEYRSQETFTLQENGRCLRCVCQAGEVSCEEQDCPVTPCVRSASGPQLCSACVLNGEEFAEGIQWEPDDQPCTSCSCQDGVPVCRAVLCSPVPCQHPTQPPGACCPSCDSCTYHSLVYANGQNFTDVDSPCQTCYCEDGTVRCSLINCPFTTCAKPQNGPGQCCPKCPDCILEAQVFVDGERFPHPRDPCQECWCQEGQAHCQLRACPSAPCVHPLPGTCCKNDCTGCAFGGKEYPNGADFPHPTDPCRLCRCLSGNVQCLARRCPPLSCPQPVLTPGDCCPQCPDAPADCPQSGNMVPVRHQEHFFQPGDPCSRCLCLDGSVSCQRLTCPPAPCAHPRRDACCPSCDGCLYQGKEFASGERFPSPNVACHVCLCWEGSVKCEPRTCAPAQCPFPTREDCCPACDSCDYLGVSYLSSQEFPDPREACNLCTCLGGFVTCTRRPCEPPACSHPLIVPEHCCPTCQGCLYHGITAALGETLPDPLDPTCSLCTCEEGSMRCQKKPCPPAPCAHPSPGPCFCPVCRSCLSQGREHQDGEEFEGPEGSCERCRCLAGQVSCTRLQCPSLPCLHQVTEPGTCCPRCTGCLARGEEHPEGSSWVPADSPCSSCMCHKGIITCAQVQCVSACIWPQEGPSDCCPQCSGCEHGGRKYEPGESFQPGADPCEVCICKQKREGPPSLHCSRRQCPSLVGCPPSQLLPPGPQHCCPTCAQALSNCTEDLVGSELVPPDPCYTCQCQDLTWLCTHRACPELSCPLWERHTTPGSCCPVCKDPTQSCMHQGRWVASGEQWAVDACTSCSCVAGTVHCQTQRCRKLACSRDEVPALSPGSCCLRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHGEDFSVHVTNDDRGRRGVAWTQEVAVLLGTVAVRLLQGRTVMVDQHTVTLPFLREPLLYIELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVRVPSSYRGQTCGLCGNFNGFAQDDLQGPDGRLLPTEASFGNSWKVPKGLGPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGILKTSPFSHCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSSDTCLCDALEAYASHCRQAGVTPVWRGPTLCVVGCPVDRGFVFDECGPPCPRTCFNRHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEGHCISPEVCPPVLLTGD
（B2）配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（B3）配列番号２のアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（C1）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号３：QSCVHQGREVASGERWTVDTCTSCSCMAGTVRCQSQRCSPLSCGPDKAPALSPGSCCPRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHSGDFSVHVTNDDRGRSGVAWTQEVAVLLGDMAVRLLQDGAVTVDGHPVALPFLQEPLLYVELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVSVPGSYQGRTCGLCGNFNGFAQDDLQGPEGLLLPSEAAFGNSWQVSEGLWPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGVLKSSPFSRCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSADACLCDALEAYASHCRQAGVTPTWRGPTLCVVGCPLERGFVFDECGPPCPRTCFNQHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEAHCIPPEAC
配列番号３：QSCVHQGREVASGERWTVDTCTSCSCMAGTVRCQSQRCSPLSCGPDKAPALSPGSCCPRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHSGDFSVHVTNDDRGRSGVAWTQEVAVLLGDMAVRLLQDGAVTVDGHPVALPFLQEPLLYVELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVSVPGSYQGRTCGLCGNFNGFAQDDLQGPEGLLLPSEAAFGNSWQVSEGLWPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGVLKSSPFSRCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSADACLCDALEAYASHCRQAGVTPTWRGPTLCVVGCPLERGFVFDECGPPCPRTCFNQHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEAHCIPPEAC
（C2）配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（C3）配列番号３のアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（D1）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質。
配列番号４：MAGVGAAALSLLLHLGALALAAGAEGGAVPREPPGQQTTAHSSVLAGNSQEQWHPLREWLGRLEAAVMELREQNKDLQTRVRQLESCECHPASPQCWGLGRAWPEGARWEPDACTACVCQDGAAHCGPQAHLPHCRGCSQNGQTYGNGETFSPDACTTCRCLTGAVQCQGPSCSELNCLESCTPPGECCPICRPGCDYEGQLYEEGVTFLSSSNPCLQCTCLRSRVRCMALKCPPSPCPEPVLRPGHCCPTCQGCTEGGSHWEHGQEWTTPGDPCRICRCLEGHIQCRQRECASLCPYPARPLPGTCCPVCDGCFLNGREHRSGEPVGSGDPCSHCRCANGSVQCEPLPCPPVPCRHPGKIPGQCCPVCDGCEYQGHQYQSQETFRLQERGLCVRCSCQAGEVSCEEQECPVTPCALPASGRQLCPACELDGEEFAEGVQWEPDGRPCTACVCQDGVPKCGAVLCPPAPCQHPTQPPGACCPSCDSCTYHSQVYANGQNFTDADSPCHACHCQDGTVTCSLVDCPPTTCARPQSGPGQCCPRCPDCILEEEVFVDGESFSHPRDPCQECRCQEGHAHCQPRPCPRAPCAHPLPGTCCPNDCSGCAFGGKEYPSGADFPHPSDPCRLCRCLSGNVQCLARRCVPLPCPEPVLLPGECCPQCPAAPAPAGCPRPGAAHARHQEYFSPPGDPCRRCLCLDGSVSCQRLPCPPAPCAHPRQGPCCPSCDGCLYQGKEFASGERFPSPTAACHLCLCWEGSVSCEPKACAPALCPFPARGDCCPDCDGCEYLGESYLSNQEFPDPREPCNLCTCLGGFVTCGRRPCEPPGCSHPLIPSGHCCPTCQGCRYHGVTTASGETLPDPLDPTCSLCTCQEGSMRCQKKPCPPALCPHPSPGPCFCPVCHSCLSQGREHQDGEEFEGPAGSCEWCRCQAGQVSCVRLQCPPLPCKLQVTERGSCCPRCRGCLAHGEEHPEGSRWVPPDSACSSCVCHEGVVTCARIQCISSCAQPRQGPHDCCPQCSDCEHEGRKYEPGESFQPGADPCEVCICEPQPEGPPSLRCHRRQCPSLVGCPPSQLLPPGPQHCCPTCAEALSNCSEGLLGSELAPPDPCYTCQCQDLTWLCIHQACPELSCPLSERHTPPGSCCPVCRAPTQSCVHQGREVASGERWTVDTCTSCSCMAGTVRCQSQRCSPLSCGPDKAPALSPGSCCPRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHSGDFSVHVTNDDRGRSGVAWTQEVAVLLGDMAVRLLQDGAVTVDGHPVALPFLQEPLLYVELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVSVPGSYQGRTCGLCGNFNGFAQDDLQGPEGLLLPSEAAFGNSWQVSEGLWPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGVLKSSPFSRCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSADACLCDALEAYASHCRQAGVTPTWRGPTLCVVGCPLERGFVFDECGPPCPRTCFNQHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEAHCIPPEACPQVLLTGDQPLGARPSPSREPQETP
配列番号４：MAGVGAAALSLLLHLGALALAAGAEGGAVPREPPGQQTTAHSSVLAGNSQEQWHPLREWLGRLEAAVMELREQNKDLQTRVRQLESCECHPASPQCWGLGRAWPEGARWEPDACTACVCQDGAAHCGPQAHLPHCRGCSQNGQTYGNGETFSPDACTTCRCLTGAVQCQGPSCSELNCLESCTPPGECCPICRPGCDYEGQLYEEGVTFLSSSNPCLQCTCLRSRVRCMALKCPPSPCPEPVLRPGHCCPTCQGCTEGGSHWEHGQEWTTPGDPCRICRCLEGHIQCRQRECASLCPYPARPLPGTCCPVCDGCFLNGREHRSGEPVGSGDPCSHCRCANGSVQCEPLPCPPVPCRHPGKIPGQCCPVCDGCEYQGHQYQSQETFRLQERGLCVRCSCQAGEVSCEEQECPVTPCALPASGRQLCPACELDGEEFAEGVQWEPDGRPCTACVCQDGVPKCGAVLCPPAPCQHPTQPPGACCPSCDSCTYHSQVYANGQNFTDADSPCHACHCQDGTVTCSLVDCPPTTCARPQSGPGQCCPRCPDCILEEEVFVDGESFSHPRDPCQECRCQEGHAHCQPRPCPRAPCAHPLPGTCCPNDCSGCAFGGKEYPSGADFPHPSDPCRLCRCLSGNVQCLARRCVPLPCPEPVLLPGECCPQCPAAPAPAGCPRPGAAHARHQEYFSPPGDPCRRCLCLDGSVSCQRLPCPPAPCAHPRQGPCCPSCDGCLYQGKEFASGERFPSPTAACHLCLCWEGSVSCEPKACAPALCPFPARGDCCPDCDGCEYLGESYLSNQEFPDPREPCNLCTCLGGFVTCGRRPCEPPGCSHPLIPSGHCCPTCQGCRYHGVTTASGETLPDPLDPTCSLCTCQEGSMRCQKKPCPPALCPHPSPGPCFCPVCHSCLSQGREHQDGEEFEGPAGSCEWCRCQAGQVSCVRLQCPPLPCKLQVTERGSCCPRCRGCLAHGEEHPEGSRWVPPDSACSSCVCHEGVVTCARIQCISSCAQPRQGPHDCCPQCSDCEHEGRKYEPGESFQPGADPCEVCICEPQPEGPPSLRCHRRQCPSLVGCPPSQLLPPGPQHCCPTCAEALSNCSEGLLGSELAPPDPCYTCQCQDLTWLCIHQACPELSCPLSERHTPPGSCCPVCRAPTQSCVHQGREVASGERWTVDTCTSCSCMAGTVRCQSQRCSPLSCGPDKAPALSPGSCCPRCLPRPASCMAFGDPHYRTFDGRLLHFQGSCSYVLAKDCHSGDFSVHVTNDDRGRSGVAWTQEVAVLLGDMAVRLLQDGAVTVDGHPVALPFLQEPLLYVELRGHTVILHAQPGLQVLWDGQSQVEVSVPGSYQGRTCGLCGNFNGFAQDDLQGPEGLLLPSEAAFGNSWQVSEGLWPGRPCSAGREVDPCRAAGYRARREANARCGVLKSSPFSRCHAVVPPEPFFAACVYDLCACGPGSSADACLCDALEAYASHCRQAGVTPTWRGPTLCVVGCPLERGFVFDECGPPCPRTCFNQHIPLGELAAHCVRPCVPGCQCPAGLVEHEAHCIPPEACPQVLLTGDQPLGARPSPSREPQETP
（D2）配列番号４のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（D3）配列番号４のアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
前記（A1）は、マウスのＫＣＰ部分タンパク質である。配列番号１のアミノ酸配列は、前記ＫＣＰ部分タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２のＫＣＰ全長アミノ酸配列において、１０８５番から１４２５番までの領域に相当する。配列番号１のアミノ酸配列には、ＢＭＰアンタゴニストであるコーディンが持つシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）が複数存在する。
前記（A2）において、前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個又は数個であり、好ましくは１個～１０個、より好ましくは１個～５個、さらに好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個である。
前記（A3）において、前記配列同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算することができる（以下、同様）。
前記（B1）は、マウスのＫＣＰである。配列番号２のアミノ酸配列は、マウスＫＣＰの全長アミノ酸配列であり、例えばRefseqのアクセッションNo.NP_001025156.3に登録されている。配列番号２のアミノ酸配列には、ＢＭＰアンタゴニストであるコーディンが持つシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）が多数存在する。
前記（B2）において、前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個又は数個であり、好ましくは１個～１０個、より好ましくは１個～５個、さらに好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個である。
前記（B3）において、前記配列同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
前記（C1）は、ヒトのＫＣＰ部分タンパク質である。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号４のＫＣＰ全長アミノ酸配列において、１１４９番から１５４３番までの領域に相当する。配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のマウスＫＣＰ部分タンパク質のアミノ酸配列との間に、約８４％の配列同一性を有する。
前記（C2）において、前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個又は数個であり、好ましくは１個～１０個、より好ましくは１個～５個、さらに好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個である。
前記（C3）において、前記配列同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
前記（D1）は、ヒトのＫＣＰである。配列番号４のアミノ酸配列は、ヒトＫＣＰの全長アミノ酸配列であり、例えばUniProtのアクセッションNo.Q6ZWJ8.3に登録されている。配列番号４のアミノ酸配列は、配列番号２のマウスＫＣＰの全長アミノ酸配列との間に、約８１％の配列同一性を有する。
前記（D2）において、前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸の個数は、特に制限されず、例えば、１個又は数個であり、好ましくは１個～１０個、より好ましくは１個～５個、さらに好ましくは１個～３個、特に好ましくは１個又は２個である。
前記（D3）において、前記配列同一性は、特に制限されず、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。
［ＢＭＰ－２］
ＢＭＰ－２は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、間葉系細胞から骨芽細胞への分化を強力に誘導する骨誘導因子である。本実施形態において、前記ＢＭＰ－２の由来は特に制限されず、例えば哺乳類が挙げられる。前記哺乳類としては、例えばヒト又は非ヒト哺乳類が挙げられる。前記非ヒト哺乳類としては、例えば霊長類、マウス、ラット、牛、豚等が挙げられる。これらのＢＭＰ－２は、例えばR&D Systems社より市販されており、容易に入手可能である。
ＢＭＰ－２は、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、間葉系細胞から骨芽細胞への分化を強力に誘導する骨誘導因子である。本実施形態において、前記ＢＭＰ－２の由来は特に制限されず、例えば哺乳類が挙げられる。前記哺乳類としては、例えばヒト又は非ヒト哺乳類が挙げられる。前記非ヒト哺乳類としては、例えば霊長類、マウス、ラット、牛、豚等が挙げられる。これらのＢＭＰ－２は、例えばR&D Systems社より市販されており、容易に入手可能である。
前記ＢＭＰ－２は、人工的に合成した合成物でもよい。前記合成物の合成方法は、特に制限されず、例えば、前述した遺伝子工学的な手法が挙げられる。
前記ＢＭＰ－２は、改変タンパク質であってもよい。前記改変タンパク質は、例えば、天然のＢＭＰ－２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質でもよく、１若しくは数個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。このようなタンパク質は、骨誘導活性を有する限り、本実施形態におけるＢＭＰ－２に含まれる。
なお、前述のように、当業者は、従来公知の方法を使用してタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を容易に変異させて、前記のような改変タンパク質を得ることができる。
〔骨形成促進剤〕
本実施形態の骨形成促進剤は、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有することを特徴とする。
本実施形態の骨形成促進剤は、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有することを特徴とする。
「骨形成促進剤」とは、骨芽細胞系列への分化能を潜在的に有する幹細胞又は前駆細胞に対して作用し、骨芽細胞系列へと分化誘導することによって骨組織の形成を促す薬剤である。したがって、当該骨形成促進剤は骨芽細胞の分化促進剤ということもできる。また、前記骨形成促進剤は骨芽細胞による石灰化を促進する機能も有する。前記骨形成促進剤は、生体外で間葉系細胞から骨芽細胞を分化誘導させる場合にも適応され得る。
前記骨形成促進剤は、骨形成が直接又は間接的に治療ないし予防効果をもたらす各種疾患に対して広く適用可能である。例えば、前記骨形成促進剤は、骨折、骨欠損、仮骨延長法を利用した骨延長術に適用することができる。骨折には１回の衝撃で発生する外傷性骨折、反復する負荷により発生する疲労骨折を含む。骨欠損には、外傷性骨欠損、腫瘍切除後骨欠損、先天性偽関節症、骨系統疾患、歯槽骨欠損、変形矯正後骨欠損を含む。前記骨形成促進剤の投与形態は、例えば局所投与とすることができる。
ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質の有効投与量は、局所投与の場合、乾燥粉末として１０μｇ以上、好ましくは５０μｇ以上である。また、ＢＭＰ－２の有効投与量は、局所投与の場合、乾燥粉末として１０μｇ以上、好ましくは５０μｇ以上である。
前記有効量のＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、前記有効量のＢＭＰ－２と、を骨折、骨欠損等の患部に投与することによって、骨形成促進、骨芽細胞分化促進、骨芽細胞による石灰化等の薬理効果が得られることが期待される。ただし、対象の年齢、体重、症状、担体の種類などにより、投与量や投与回数を適宜決定することが望ましい。通常、局所投与の場合、手術時及び治癒過程において、１～数回の投与が行われる。
前記骨形成促進剤におけるＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質並びにＢＭＰ－２の含有量としては、それぞれ前記有効量を確保できるように含有するものであればよい。具体的には、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質は、局所投与の場合、０．０００５質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．００５質量％以上となるように前記骨形成促進剤に含有させることができる。また、ＫＣＰは生体でも発現しているタンパク質であるため、副作用の問題はないが、費用対効果の観点から、ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質の含有量の上限としては、局所投与の場合、例えば０．０１質量％以下を挙げることができる。
ＢＭＰ－２は、局所投与の場合、例えば０．０００５質量％、好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．００５質量％以上となるように前記骨形成促進剤に含有させることができる。また、ＢＭＰ－２の含有量の上限としては、異所性骨形成などの副作用の観点から、局所投与の場合、例えば０．０１質量％以下を挙げることができる。
前記骨形成促進剤の形態としては、特に制限されない。具体例には、ペースト状、粉末状等とすることができ、医学的に許容可能な担体に前記有効成分を含有させた形態とすることもできる。前記骨形成促進剤は、前記有効成分のほかに、前記薬理効果が奏される限りにおいて、医学的に許容可能な担体、添加剤、他の薬効成分等が含まれていても良い。
以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。なお、以下において「％」とは、特別な記載がない場合、「質量％」を意味する。
〔マウスＫＣＰ部分タンパク質〕
以下の試験に用いるマウスＫＣＰ部分タンパク質は、組換えタンパク質をMyBiosource社（California, San Diego (USA)）より購入した。図１に、この部分タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。当該部分タンパク質は、全長１５５０アミノ酸のマウスＫＣＰのうち、Ｎ末端側の１０８５番アミノ酸（ｑ）から１４２５番アミノ酸（ｖ）までの３４１アミノ酸からなる部分的タンパク質である。図１のアミノ酸配列には、ＢＭＰアンタゴニストのコーディンが持つシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）が存在する。
以下の試験に用いるマウスＫＣＰ部分タンパク質は、組換えタンパク質をMyBiosource社（California, San Diego (USA)）より購入した。図１に、この部分タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。当該部分タンパク質は、全長１５５０アミノ酸のマウスＫＣＰのうち、Ｎ末端側の１０８５番アミノ酸（ｑ）から１４２５番アミノ酸（ｖ）までの３４１アミノ酸からなる部分的タンパク質である。図１のアミノ酸配列には、ＢＭＰアンタゴニストのコーディンが持つシステインリッチドメイン（ＣＸＸＣＸＣ、ＣＣＸＸＣ）が存在する。
〔骨芽細胞への分化誘導試験（１）〕
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（RIKEN BRC（理化学研究所バイオリソース研究センター）より購入）を使用した（以下同様）。組換えヒトタンパク質ＢＭＰ－２はR&D Systems社より購入した（以下同様）。細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２ (１００ｎｇ／ｍｌ)及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、３７℃で７２時間培養した。骨芽細胞への分化評価法として、下記の（Ａ）ＡＬＰ活性測定、（Ｂ）ＡＬＰ活性染色を用いて、骨形成促進効果を測定した。
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞（RIKEN BRC（理化学研究所バイオリソース研究センター）より購入）を使用した（以下同様）。組換えヒトタンパク質ＢＭＰ－２はR&D Systems社より購入した（以下同様）。細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２ (１００ｎｇ／ｍｌ)及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、３７℃で７２時間培養した。骨芽細胞への分化評価法として、下記の（Ａ）ＡＬＰ活性測定、（Ｂ）ＡＬＰ活性染色を用いて、骨形成促進効果を測定した。
図２は、マウスＫＣＰ部分タンパク質及びＢＭＰ－２を用いた骨芽細胞への分化誘導試験（１）の結果を示す図である。図２（Ａ）はＡＬＰ活性を表すグラフであり、値は平均値±ＳＤを表し、＊＊はＰ＜０．０１で有意差があることを示す（ｎ＝３、student t-test）。図２（Ｂ）はＡＬＰ活性染色した細胞の顕微鏡写真像図を示す。
（Ａ）ＡＬＰ活性測定
上記培養後、細胞に１％ＮＰ－４０を含む生理食塩水を処理し、超音波破砕機にて細胞を破壊した。破砕された細胞中のＡＬＰ活性を測定するために、Disodium-P nitrophenyl phosphate hydroxyrateを含むＡＬＰ活性試薬を加え、３７℃で１５分間処理し、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。ＢＭＰ－２及びＫＣＰ無処理群のＡＬＰ活性を１としたときのそれぞれの群の相対的なＡＬＰ活性を求めた。
上記培養後、細胞に１％ＮＰ－４０を含む生理食塩水を処理し、超音波破砕機にて細胞を破壊した。破砕された細胞中のＡＬＰ活性を測定するために、Disodium-P nitrophenyl phosphate hydroxyrateを含むＡＬＰ活性試薬を加え、３７℃で１５分間処理し、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。ＢＭＰ－２及びＫＣＰ無処理群のＡＬＰ活性を１としたときのそれぞれの群の相対的なＡＬＰ活性を求めた。
結果を図２（Ａ）に示す。ＫＣＰ単独処理群ではＡＬＰ活性は認められなかった。ＢＭＰ－２単独処理群よりもＢＭＰ－２とＫＣＰを共に処理した群は有意差（Ｐ＜０．０１）をもってＡＬＰ活性が顕著に上昇した。
（Ｂ）ＡＬＰ活性染色
上記培養後、細胞を１０％ホルマリン溶液を用いて室温で２０分間処理し、その後、アセトン／エタノール溶液を用いて室温で１分間処理した。ＡＬＰ活性染色を行うために、Ｎ－Ｎジエチルホルマリンにて溶解したナフトールＡＳ－ｍＸ及びFast blue BB salt hemiを含むＡＬＰ染色液を３７℃で１５分間処理し、細胞のＡＬＰ活性を染色にて観察した。
上記培養後、細胞を１０％ホルマリン溶液を用いて室温で２０分間処理し、その後、アセトン／エタノール溶液を用いて室温で１分間処理した。ＡＬＰ活性染色を行うために、Ｎ－Ｎジエチルホルマリンにて溶解したナフトールＡＳ－ｍＸ及びFast blue BB salt hemiを含むＡＬＰ染色液を３７℃で１５分間処理し、細胞のＡＬＰ活性を染色にて観察した。
結果を図２（Ｂ）に示す。紫色（図では黒色又は灰色）に染色されている部分がＡＬＰ活性を有する。ＢＭＰ－２無処理の群では、ＫＣＰの有無にかかわらずＡＬＰ活性はほとんど認められなかった。一方、ＢＭＰ－２処理群のうちでは、ＫＣＰ無しに比べてＫＣＰ有りの方が、ＡＬＰ活性が顕著に増加したことが確認された。
これらの結果から、筋芽細胞に対してＫＣＰ部分タンパク質とＢＭＰ－２を共に作用させることで、骨芽細胞への分化が強力に誘導されることが示された。また、ＫＣＰ単独処理ではＡＬＰ活性が認められなかったことから、ＫＣＰ自体には骨誘導活性はなく、ＢＭＰ－２による骨誘導活性をＫＣＰが増強しているものと考えられた。
〔骨芽細胞への分化誘導試験（２）〕
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。細胞を６穴プレートに１穴あたり１．０×１０５個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ作用させ、３７℃で７２時間培養した。骨芽細胞への分化評価法として、骨芽細胞分化マーカー遺伝子であるAlpの発現量を用いて、骨形成促進効果を測定した。
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。細胞を６穴プレートに１穴あたり１．０×１０５個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ作用させ、３７℃で７２時間培養した。骨芽細胞への分化評価法として、骨芽細胞分化マーカー遺伝子であるAlpの発現量を用いて、骨形成促進効果を測定した。
すなわち、細胞からTRIzol試薬 (Life Technologies社)によりtotal RNAを抽出し、逆転写酵素にてｃＤＮＡを合成した。Alp遺伝子の発現量はTaq MANプローブ（Applied Biosystems社）による定量的ＰＣＲ解析により測定した。内在的コントロールと考えられているGapdh遺伝子発現量でAlp遺伝子の発現量を補正した（Alp/Gapdh）。ＢＭＰ－２及びＫＣＰ無処理群のAlp/Gapdh値を１とした時のそれぞれの群の相対的値を求めた。
結果を図３に示す。図３は、マウスＫＣＰ部分タンパク質及びＢＭＰ－２を用いた骨芽細胞への分化誘導試験（２）の結果を示すグラフである。図中、縦軸はAlp/Gapdhの遺伝子発現量の比を表す。また、値は平均値±ＳＤを表し、＊＊はＰ＜０．０１で有意差があることを示す（ｎ＝３、student t-test）。
ＢＭＰ－２単独処理群よりもＢＭＰ－２とＫＣＰを共に処理した群は有意差をもってAlp遺伝子発現が上昇した（図３）。
〔骨芽細胞の石灰化度による評価試験〕
図４は、（Ａ）本試験例の工程表、及び（Ｂ）骨芽細胞の石灰化度の測定結果を示す図である。細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。図４（Ａ）に示すように、細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し（０日目）、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ作用させ（１日目）、３７℃で３日間培養した。その後、培地交換の際、石灰化培地（アスコルビン酸（５０μｌ／ｍｌ）、β-Glycerophosphate（１０ｍＭ）、Dexametasone（１０ｎＭ）を含む分化用培地）で１１日間培養した（計１４日間、培地交換は３日おきに行った）。ＢＭＰ－２は最初の３日間のみ処理した。ＫＣＰは２週間の培養期間中処理し続けた。
図４は、（Ａ）本試験例の工程表、及び（Ｂ）骨芽細胞の石灰化度の測定結果を示す図である。細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。図４（Ａ）に示すように、細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し（０日目）、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、ＢＭＰ－２（１００ｎｇ／ｍｌ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ）をそれぞれ作用させ（１日目）、３７℃で３日間培養した。その後、培地交換の際、石灰化培地（アスコルビン酸（５０μｌ／ｍｌ）、β-Glycerophosphate（１０ｍＭ）、Dexametasone（１０ｎＭ）を含む分化用培地）で１１日間培養した（計１４日間、培地交換は３日おきに行った）。ＢＭＰ－２は最初の３日間のみ処理した。ＫＣＰは２週間の培養期間中処理し続けた。
続いて、細胞における石灰化度を調べた。骨芽細胞への分化の過程で、石灰化（カルシウムの沈着）が起こることが知られている。石灰化度の指標として、カルシウムを染色できるアリザリンレッド染色を用いた。すなわち、上記培養後の細胞を９５％エタノールにて室温で２０分間処理した。次に、１％アリザリンレッドＳ水溶液とアンモニウム水溶液５ｍｌを含む石灰化染色溶液を室温で５分間処理し、細胞の染色を行った。その後、１０％セチルピリジニュウム塩化物水溶液を加えてアリザリンレッドを溶出し、吸光度計にて吸光度（５７０ｎｍ）を測定した。
図４（Ｂ）は、アリザリンレッド染色による石灰化度を数値化したグラフである。図中、縦軸は各群の吸光度（５７０ｎｍ）を示す。また、値は平均値±ＳＤを表し、＊はＰ＜０．０５で有意差があることを示す（ｎ＝３、student t-test）。ＢＭＰ－２とＫＣＰを共に処理した群では、石灰化が進んでいた（図４（Ｂ））。ＢＭＰ－２とマウスＫＣＰ部分タンパク質を併用することによって、骨芽細胞への分化が誘導された結果、石灰化が進んだものと考えられた。
〔異なる濃度のＫＣＰ及びＢＭＰ－２による骨形成促進作用〕
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、下記濃度のＢＭＰ－２及びマウスＫＣＰ部分タンパク質をそれぞれ作用させ、３７℃で７２時間培養した。表１の試験では、ＢＭＰ－２濃度を固定（３００ｎｇ／ｍｌ）し、ＫＣＰの濃度を０～１０００ｎｇ／ｍｌの間で変化させて、影響を調べた。表２の試験では、ＢＭＰ－２の濃度を０～３００ｎｇ／ｍｌの間で変化させ、ＫＣＰ（５００ｎｇ／ｍｌ）の有無による影響を調べた。
細胞はマウス由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を使用した。細胞を９６穴プレートに１穴あたり２．０×１０４個ずつ播種し、分化用培地（２．５％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）中に、下記濃度のＢＭＰ－２及びマウスＫＣＰ部分タンパク質をそれぞれ作用させ、３７℃で７２時間培養した。表１の試験では、ＢＭＰ－２濃度を固定（３００ｎｇ／ｍｌ）し、ＫＣＰの濃度を０～１０００ｎｇ／ｍｌの間で変化させて、影響を調べた。表２の試験では、ＢＭＰ－２の濃度を０～３００ｎｇ／ｍｌの間で変化させ、ＫＣＰ（５００ｎｇ／ｍｌ）の有無による影響を調べた。
上記培養後、細胞に１％ ＮＰ－４０界面活性剤を含む生理食塩水を処理し、超音波破砕機にて細胞を破壊した。破砕された細胞中のＡＬＰ活性を測定するために、Disodium-P nitrophenyl phosphate hydroxyrateを含むＡＬＰ活性試薬を加え、３７℃で１５分間処理し、吸光度（４０５ｎｍ）を測定した。ＢＭＰ－２及びＫＣＰ無処理群のＡＬＰ活性を１とした時のそれぞれの群の相対的なＡＬＰ活性を求めた。
表１及び表２は、異なる濃度のマウスＫＣＰ部分タンパク質及びＢＭＰ－２による骨形成促進作用を示す表である。表１は、ＢＭＰ－２濃度を３００ｎｇ／ｍｌとし、ＫＣＰの濃度を変化させた場合、表２は、ＫＣＰ濃度を５００ｎｇ／ｍｌ又は０ｎｇ／ｍｌ（無処理）とし、ＢＭＰ－２の濃度を変化させた場合の結果を示す。表中、値は平均値±ＳＤを表し、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１で有意差があることを示す（ｎ＝３、student t-test）。表１での有意差はＢＭＰ－２濃度を３００ｎｇ／ｍｌ及びＫＣＰ無処理群の相対的ALP活性に対する有意差、表２での有意差はＫＣＰ無処理群の相対的ALP活性に対する有意差を表す。
表１ではＫＣＰの濃度依存的にＡＬＰ活性が上昇した。表２では、ＫＣＰ無処理の群ではＢＭＰ－２の濃度依存的にＡＬＰ活性が上昇し、ＫＣＰ処理によりさらにＡＬＰ活性が有意に上昇した。しかし、ＢＭＰ－２とＫＣＰを共に処理した場合、ＢＭＰ－２濃度が１００ｎｇ／ｍｌと３００ｎｇ／ｍｌではＡＬＰ活性がほぼ同レベルとなっており、ＡＬＰ活性が頭打ちになっている可能性がある。
〔マウス頭蓋骨欠損部修復実験〕
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に全身麻酔を実施し、頭頂部を剃毛後、切開し、頭蓋骨にφ3.3ｍｍのトレフィンバーで穴を開けて骨欠損部を形成した。（Ａ）ＢＭＰ－２（０．５μｇ）のみ、又は（Ｂ）ＢＭＰ－２（０．５μｇ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（２．５μｇ）、を含ませたType I atelocollagen spongesを上記の穴に埋入させ、縫合した。３週間の通常飼育後、μＣＴにて骨欠損部の撮影を行った。骨欠損部の修復率（％）は、μＣＴ画像に基づいてIMAGE Jソフトを利用して求めた。試験開始時における骨欠損部の全体の面積に対し、３週間後における修復された骨の面積の割合（％）を計算して修復率とした。
ＩＣＲマウス（雄、７週齢）に全身麻酔を実施し、頭頂部を剃毛後、切開し、頭蓋骨にφ3.3ｍｍのトレフィンバーで穴を開けて骨欠損部を形成した。（Ａ）ＢＭＰ－２（０．５μｇ）のみ、又は（Ｂ）ＢＭＰ－２（０．５μｇ）及びマウスＫＣＰ部分タンパク質（２．５μｇ）、を含ませたType I atelocollagen spongesを上記の穴に埋入させ、縫合した。３週間の通常飼育後、μＣＴにて骨欠損部の撮影を行った。骨欠損部の修復率（％）は、μＣＴ画像に基づいてIMAGE Jソフトを利用して求めた。試験開始時における骨欠損部の全体の面積に対し、３週間後における修復された骨の面積の割合（％）を計算して修復率とした。
マウス頭蓋骨欠損部修復実験から、ＢＭＰ－２単独処理では欠損部が２２．４％修復されたのに対し、ＫＣＰ及びＢＭＰ－２処理では７５．０％修復された。この結果から、ＢＭＰ－２存在下でマウスＫＣＰ部分タンパク質を作用させると骨欠損部位の修復が促進されることが示された。
以上、図面を参照して、本発明の実施形態及び実施例について詳述してきたが、具体的な構成は、これらに限らず、本発明の要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本発明に含まれる。
例えば、前記実施例では、ＢＭＰ－２存在下でマウス由来のＫＣＰ部分タンパク質を作用させることによる骨形成促進効果について説明したが、これに限定されるものではなく、ＫＣＰ部分タンパク質の代わりにＫＣＰ全長タンパク質を用いた場合や、マウス由来のＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質の代わりに他の哺乳類（例えばヒト）由来のＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質を用いた場合も、本発明に含めることができる。
本発明は、生体内で発現しているＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質を用い、また、より少ないＢＭＰ－２投与量で大きな骨誘導活性が得られることから、副作用が少ない骨形成促進剤を提供することが可能であり、難治性骨折や骨欠損等の治療剤として医療分野での貢献が期待される。
Claims (4)
- ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質と、ＢＭＰ－２と、を含有する骨形成促進剤。
- 骨折又は骨欠損の治療剤である、請求項１に記載の骨形成促進剤。
- 前記「ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質」が、マウス又はヒト由来のタンパク質である、請求項１又は２に記載の骨形成促進剤。
- 前記「ＫＣＰ及び／又はその部分タンパク質」が、以下の（ｉ）～（iii）のうちいずれかのタンパク質である、請求項１又は２に記載の骨形成促進剤。
（ｉ）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列と配列同一性８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
（iii）配列番号１～４のいずれかのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＢＭＰ－２による骨誘導活性を増強する作用を有するタンパク質。
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