KR101630501B1 - 디자이너 골형성 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동족 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는 신규한 디자이너 골형성 단백질, 그를 코딩하는 핵산, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 신규한 디자이너 골형성 단백질은 디자이너 BMP이고, 동족 BMP 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는다. 디자이너 BMP는 변경된 생물학적 특징을 나타내고, 잠재적인 유용한 신규한 치료제를 제공한다.

Description

디자이너 골형성 단백질{DESIGNER OSTEOGENIC PROTEINS}

본원은 골형성 단백질, 개선된 골형성 단백질의 제조 방법, 및 골형성 단백질을 사용하여 환자를 치료하는 방법의 분야에 관한 것이다.

시스틴 노트 (knot) 시토카인 수퍼패밀리는 전환 성장 인자 β (TGFβ) 단백질, 당단백질 호르몬, 혈소판-유래 성장 인자-유사 (PDGF-유사) 단백질, 신경 성장 인자 (NGF), 및 신경모세포종에서 이상을 보이는 차별적인 스크리닝-선택된 유전자 (DAN) 패밀리 (예를 들어, 케르베루스 (cerberus))를 포함하는 하위패밀리로 나누어진다. 즉, TGFβ 수퍼패밀리는 3개의 하위패밀리, 즉 TGFβ, 액티빈 (activin) 및 골 형태형성/성장 분화 인자 단백질 (BMP/GDF)로 나누어지는 약 43개의 멤버를 포함한다.

TGF-β 수퍼패밀리 멤버는 표준 시스틴 노트 토폴로지를 포함한다. 즉, 시스틴 노트는 6개의 시스테인 잔기의 특이한 배열의 결과이다. 노트는 시스테인 1-4, 시스테인 2-5, 및 고리를 형성하는 개재 서열 사이의 결합으로 이루어지고, 이를 통해 시스테인 3-6 사이의 디술피드 결합이 통과한다. 이들 단백질의 활성형은 동종이량체 또는 이종이량체이다. 각각의 경우에, 단량체 토폴로지는 시스테인 노트에 의해 안정화되고, 추가의 시스테인이 추가의 사슬내 결합에 기여하고/하거나 또 다른 단백질 단위와의 이량체화를 매개한다 (문헌 [Kingsley, 1994, Genes Dev. 8:133-146]; [Lander et al, 2001, Nature 409:860-921] 참조).

BMP/GDF는 TGF-β 단백질 수퍼패밀리의 가장 많은 멤버이다. BMP/GDF 하위패밀리는 BMP2, BMP3 (오스테오게닌), BMP3b (GDF-10), BMP4 (BMP2b), BMP5, BMP6, BMP7 (골형성 단백질-1 또는 OP1), BMP8 (OP2), BMP8B (OP3), BMP9 (GDF2), BMP10, BMP11 (GDF11), BMP12 (GDF7), BMP13 (GDF6, CDMP2), BMP15 (GDF9), BMP16, GDF1, GDF3, GDF5 (CDMP1; MP52), 및 GDF8 (미오스타틴)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. BMP는 때로 골형성 단백질 (OP), 성장 분화 인자 (GDF), 또는 연골-유래 형태형성 단백질 (CDMP)로 언급된다. 또한, BMP는 다른 동물 종에도 존재한다. 또한, 인간 집단의 상이한 멤버 중에서 BMP 서열 내에 일부 대립유전자 변이가 존재한다.

BMP는 긴 전구 도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 전구단백질로서 천연적으로 발현된다. 이어서, 상기 전구단백질은 세포 기구에 의해 프로세싱되어 이량체성 성숙 BMP 분자를 생성한다. 전구 도메인은 BMP의 정확한 접힘 및 프로세싱을 돕는 것으로 생각된다. 또한, 모두는 아니지만 일부 BMP에서, 전구 도메인은 성숙 도메인에 비공유 결합할 수 있고, 샤페론, 및 억제제로서 작용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thies et al., Growth Factors 18:251-9 (2001)]).

BMP 신호 전달은 BMP 이량체가 2개의 타입 I 및 2개의 타입 II 세린/트레오닌 키나제 수용체에 결합할 때 개시된다. 타입 I 수용체는 ALK-1 (액티빈 수용체-유사 키나제 1), ALK-2 (ActRIa 또는 ActRI로도 불림), ALK-3 (BMPRIa로도 불림), 및 ALK-6 (BMPRIb로도 불림)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 타입 II 수용체는 ActRIIa (ActRII로도 불림), ActRIIb, 및 BMPRII를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 인간 게놈은 7개의 타입 I 및 5개의 타입 II 수용체를 포함하는 수용체 세린/트레오닐 키나제 패밀리의 12개의 멤버를 함유하고, 이들은 모두 TGF-β 신호전달에 관여한다 (그 개시문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Manning et al., Science 298:1912-34 (2002)]). 따라서, 12개의 수용체 및 43개의 수퍼패밀리 멤버가 존재하고, 이것은 적어도 일부의 TGF-β 수퍼패밀리 멤버가 동일한 수용체(들)에 결합함을 시사한다. BMP 결합 후에, 타입 II 수용체는 타입 I 수용체를 인산화하고, 타입 I 수용체는 전사 인자의 Smad 패밀리의 멤버를 인산화하고, Smad는 핵으로 이동하고, 많은 유전자의 발현을 활성화시킨다.

BMP는 TGF-β 수퍼패밀리의 대부분의 많은 멤버 사이에 존재하고, 다양한 세트의 세포 및 발달 과정, 예컨대 배아 패턴 형성 및 조직 특수화 및 성체 조직에서 상처 치유 및 복구 과정의 촉진을 제어한다. BMP는 일찍 골 및 연골 형성을 유도하는 능력에 의해 단리되었다. BMP 신호전달은 골절 및 관련 조직 손상에 의해 유도되어 골 재생 및 복구를 유도할 수 있다. 그의 수용체에 대해 변경된 친화도를 갖는 BMP 분자는 천연 단백질에 대해 개선된 생물학적 활성을 가질 것이다. 그러한 BMP는 증가된 생체내 활성을 갖는 단백질을 포함하고, 보다 낮은 단백질 수준에서 보다 큰 또는 변경된 활성을 제공하여 개선된 단백질 치료제를 제공함으로써 특히 조직 재생, 복구 등을 위한 잠재적인 개선된 치료제를 제공할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 포함하고, 여기서 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

한 측면에서, 단백질은 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 및 BMP9로 이루어진 군 중에서 선택된다.

또 다른 측면에서, 단백질은 타입 II 결합 도메인 A; 타입 II 결합 도메인 B; 타입 I 결합 도메인; 및 이들의 임의의 조합 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함하고, 여기서 돌연변이는 야생형 BMP2에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

한 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 A 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 V33, P36, H39, 및 F41에서의 돌연변이로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 A 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1에 대해 V33I, P36K, P36R, H39A, 및 F41N으로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 B 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 E83, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 B 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1에 대해 E83K, S85N, M89V, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 I 결합 도메인 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80에서의 돌연변이로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 I 결합 도메인 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, 및 V80A로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80에서의 돌연변이를 포함한다.

또 다른 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, 및 V80A이다.

또 다른 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함한다.

또 다른 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 V33I, P36K, H39A, S85N, M89, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I이다.

추가의 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함한다.

또 다른 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 V33I, P36K, H39A, H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, 및 V80A, S85N, M89, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I이다.

또 다른 측면에서, 단백질은 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 단일 아미노산의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 V33I, P36R, H39A, H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M의 돌연변이, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, 및 V80A, S85N, M89, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 단백질은 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합하고; 약 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합하고; 약 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합하고; 약 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합하고; 약 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합하고; 약 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합한다.

한 측면에서, 단백질은 타입 I 또는 타입 II 결합 영역 내에 위치하지 않는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다.

본 발명은 서열 8-73 중의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함한다.

본 발명은 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함한다.

본 발명은 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함한다.

본 발명은 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함한다.

본 발명은 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 골형성 단백질을 포함한다.

본 발명은 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 디자이너 BMP 단백질의 생산 방법을 포함하고, 여기서 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다. 이 방법은 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하고, 세포를 단백질이 생산되는 조건 하에 배양하고, 단백질을 정제하는 것을 포함한다.

한 측면에서, 핵산은 서열 74-139 중의 임의의 하나의 핵산 서열 중에서 선택된 서열을 포함한다.

본 발명은 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP6 단백질을 포함하고, 여기서 돌연변이는 야생형 BMP6에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

한 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 A 내의 돌연변이이고, 여기서상기 돌연변이는 서열 4의 서열에 대해 I57, K60, G61, A63, N65, Y66, 및 D68에서의 돌연변이로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 II 결합 도메인 B 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 4의 서열에 대해 K108, N110, A111, V114, F117, D119, N120, S121, N122, V123, 및 I124로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 타입 I 결합 도메인 내의 돌연변이이고, 여기서 상기 돌연변이는 서열 4의 서열에 대해 S72, N76, A77, H78, M79, N80, A81, N83, V87, T89, H92, L93, M94, N95, P96, E97, Y98, V99, 및 P100에서의 돌연변이로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 서열 4의 서열에 대해 각각의 아미노산 잔기 I57, K60, G61, A63, N65, Y66, 및 D68에서의 돌연변이이다.

추가의 측면에서, 돌연변이는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 각각의 아미노산 잔기 K108, N110, A111, V114, F117, D119, N120, S121, N122, V123, 및 I124에서의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 돌연변이는 서열 4의 아미노산 서열에 대해 각각의 아미노산 잔기 S72, N76, A77, H78, M79, N80, A81, N83, V87, T89, H92, L93, M94, N95, P96, E97, Y98, V99, 또는 P100에서의 돌연변이이다.

또 다른 측면에서, 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 돌연변이가 야생형 BMP6에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여하는 것인 디자이너 BMP6 단백질은 타입 I 또는 타입 II 결합 영역 내에 위치하지 않는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함한다.

본 발명은 서열 8 내지 73의 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

한 측면에서, 핵산은 서열 12, 서열 14, 서열 36 및 서열 37의 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩한다.

본 발명은 서열 74 내지 139로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

한 측면에서, 핵산은 서열 78, 서열 80, 서열 102, 및 서열 103의 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP6 단백질의 생산 방법을 포함하고, 여기서 돌연변이는 야생형 BMP6에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다. 이 방법은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 상기 단백질이 생산되는 조건 하에 배양하고, 상기 단백질을 정제하는 것을 포함한다.

본 발명은 골 손실과 연관된 골 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 골 손실과 연관된 골 질환의 치료 방법을 포함한다. 이 방법은 환자에게 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 치료 유효량의 디자이너 BMP 단백질을 투여하여 환자에서 골 질환을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

본 발명은 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증의 치료 방법을 포함한다. 이 방법은 환자에게 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 치료 유효량의 디자이너 BMP 단백질을 투여하여 섬유증을 치료하는 것을 포함하고, 여기서 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

본 발명은 조직에서 골 형성을 유도하는 방법을 포함한다. 이 방법은 조직을 적어도 하나의 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 디자이너 BMP 단백질과 접촉시켜 상기 조직에서 골 형성을 유도하는 것을 포함하고, 여기서 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 부여한다.

본 발명을 예시하기 위해, 본 발명의 특정 실시양태가 도면에 도시된다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시양태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
패널 A-C를 포함하는 도 1은 다양한 야생형 및 디자이너 BMP 아미노산 서열의 정렬을 보여주고 타입 I 및 타입 II 수용체 상호작용에 잠재적으로 관여하는 이들 단백질의 영역 (박스 내)을 나타내는 도면이다. 도 1a는 야생형 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 및 BMP9의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 도 1b는 상응하는 야생형 BMP가 BMP2인 다양한 디자이너 BMP의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 도 1c는 상응하는 야생형 BMP가 BMP6인 다양한 디자이너 BMP6 분자의 아미노산 서열 정렬을 보여준다.
도 2는 2개의 타입 I 및 2개의 타입 II BMP 수용체에 대한 야생형 BMP2 동종이량체 결합을 보여주는 구조적 모델의 예시도이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 3은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) (도 3A) 및 이. 콜라이 세포 (도 3B)에서 생성된 인간 BMP2 내의 히스티딘 도어스톱 (doorstop) (H54)의 위치를 보여주는 구조적 모델의 도면이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 4는 글리칸 테더 (tether) 및 잠재적인 히스티딘 (His) 도어스톱의 위치를 보여주는 도면이다. 도 4A는 비-도어스톱 배향의 글리칸 테더 (N56에서 N-연결된 글리칸) 및 히스티딘 54, 및 모두 CHO-생산 BMP2에서 R16과 글리칸 테더의 상호작용을 보여준다. 도 4B는 BMP6 내의 H78에서 비-도어스톱 입체형태의 글리칸 테더 (N80에서 N-연결된 글리칸) 및 히스티딘, 및 BMP2 내의 R16에 대응하는 R39를 보여준다. BMP2와 BMP6 사이의 상응하는 아미노산을 보여주는 BMP2 (11-KSSCKRHP) 및 BMP6 (35-KTACRKHE)의 서열 정렬이 도면의 상부에 제시된다.
패널 A-D를 포함하는 도 5는 BMP 및 디자이너 BMP의 정제 공정의 다양한 단계를 보여준다. 도 5A는 셀루핀 술페이트 칼럼을 사용한 BMP의 구배 용리를 보여주는 크로마토그램을 보여준다. 도 5B는 셀루핀 술페이트 칼럼 단계로부터의 분획의 샘플을 함유하는 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (좌측에 비-환원 및 우측에 환원) 겔의 영상이다. 도 5C는 예비 역상 정제 단계로부터의 프로파일을 보여주는 크로마토그램을 보여준다. 도 5D는 예비 역상 정제 단계에 의해 입수한 분획의 샘플을 함유하는 BMP의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE (좌측에 비-환원 및 우측에 환원) 겔의 영상이다.
패널 A-D를 포함하는 도 6은 각각의 겔 영상의 상부를 따라 나타낸 정제된 BMP2 야생형 및 다양한 돌연변이체를 보여주는 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 단백질 겔의 영상을 보여준다. 겔을 비-환원 (도 6A 및 6B) 및 환원 (도 6C 및 6D) 조건 하에 진행시켰다.
도 7은 그래프 기호 설명에 나타낸 바와 같이 야생형 BMP2 및 BMP2/6 이종이량체의 골형성 활성을 다양한 디자이너 BMP와 비교하는, C2C12 전구 근육모세포 (pre-myoblast)에서 알칼리성 포스파타제 검정 결과를 보여준다.
도 8은 BMP2에 비해 더 강한 BMPE에 의한 신호전달 및 BMP2/6에 동등한 신호전달을 보여주는 Smad 활성을 나타내는 C2C12 BMP-반응 요소 루시퍼라제 (BRE-루시퍼라제) 검정 결과를 보여준다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 9는 다양한 BMP에 의해 매개되는 이소성 골 형성을 보여준다. 도 9A는 나타낸 용량 (0.1 또는 0.5 ㎍)에서 나타낸 BMP (BMP2, BMPE, 및 BMP2/6)를 이식한 각각의 사지에 대한 μCT 분석에 의해 결정된 이소성 골의 양 (히드록시아파타이트의 mg으로서 계산됨; mg HA)을 보여주는 그래프이다. 도 9B는 나타낸 용량 (0.1 또는 0.5 ㎍)에서 나타낸 BMP (BMP2, BMPG, BMPA, 및 BMPF)를 이식한 각각의 사지에 대한 μCT 분석에 의해 결정된 이소성 골의 양 (히드록시아파타이트의 mg으로서 계산됨)을 보여주는 그래프이다. 제시된 데이터는 2회의 별개의 실험으로부터 얻은 것이다.
패널 A-D를 포함하는 도 10은 4 및 8주에 비-인간 영장류 (NHP) 비골 절골 모델의 결과를 보여주는 방사선 사진의 영상을 보여준다. 방사선 사진은 0.5 mg/ml (250 ㎍의 총 BMP 투여/사지)로 각각 BMPE 및 BMPG를 투여한 7마리의 대표적인 NHP의 비골을 보여준다. 각각의 NHP에는 반대쪽 사지에 동일한 용량의 WT BMP2를 투여하였다. 도 10a 및 10b는 각각 4주 및 8주에 BMP2 야생형에 비해 BMPE의 효과를 보여주는, 각각의 도면의 상부에 나타낸 NHP의 방사선 사진을 보여준다. 도 10c 및 10d는 각각 4주 및 8주에 BMP2 야생형에 비해 BMPG의 효과를 보여주는, 각각의 도면의 상부에 나타낸 NHP의 방사선 사진을 보여준다.
도 11은 BMP-E로 처리된 사지 대 BMP-2로 처리된 반대쪽 사지의 골 부피를 보여주는 그래프이다.
도 12는 야생형 BMP2 및 BMP-GER, BMP-GEP, 및 BMP2/6 이종이량체의 골형성 활성을 비교하는, C2C12 전구 근육모세포에서 알칼리성 포스파타제 검정의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 나타낸 용량 (0.05 또는 0.25 ㎍)에서 나타낸 BMP (BMP-2, BMP-2/6, BMP-E, BMP-GER, 및 BMP-6)를 이식한 각각의 사지에 대한 μCT 분석에 의해 결정된 이소성 골의 양 (히드록시아파타이트의 mg으로서 계산됨)을 보여주는 그래프이다.
도 14는 나타낸 용량 (0.05 또는 0.25 ㎍)에서 나타낸 BMP (BMP-2, BMP-2/6, BMP-E, BMP-GER, 및 BMP-6)를 이식한 각각의 사지에 대한 μCT 분석에 의해 결정된 이소성 골의 양 (히드록시아파타이트의 mg으로서 계산됨)을 보여주는 그래프이다. 이들은 도 13에 제시된 것과 별개의 실험으로부터 얻은 결과이다.
패널 A 및 B를 포함하는 도 15는 5 및 10주에 비-인간 영장류 (NHP) 비골 설상 (wedge) 절골 모델의 결과를 보여주는 방사선 사진의 영상 및 μCT 영상을 보여준다. 도 15A는 NHP 비골 설상 절골 모델에서 얻은 5주 방사선 사진의 영상을 보여준다. 도 15A는 5주에 한쪽 사지에는 BMP-GER을, 반대쪽 사지에는 WT BMP-2를 0.5 mg/ml (250 ㎍의 전달된 총 BMP/사지)로 투여한 4마리의 대표적인 NHP의 비골의 영상을 보여준다. 도 15B는 각각의 동물에 대해 BMP2-처리된 반대쪽 사지에 비해 BMP-GER 처리된 사지의 큰 가골을 보여주는, 10주에서의 동일한 사지의 μCT 영상을 보여준다.
패널 A-C를 포함하는 도 16은 BMP-GER 처리된 사지 대 BMP-2 처리된 반대쪽 사지의 강도 (도 16A), 강직도 (도 16B), 및 가골 골 부피 (도 16C)를 제시하는 그래프를 보여준다.
패널 A-C를 포함하는 도 17은 설상 결손 모델을 따라 담체로서 인산칼슘계 시멘트를 사용하여 0.5 mg/ml의 BMP-GER로 및 반대쪽 사지에서 1.5 mg/ml의 BMP-2로 처리된 3마리의 비-인간 영장류 (NHP) 비골의 경시적인 치유의 방사선 사진 영상을 보여준다. 도 17a, 상부 패널은 다음과 같이 0.5 mg/ml GER로 처리한 NHP 넘버 1 좌측 팔에 대한 결과를 보여준다: 패널 1 및 2는 각각 초기 시점에서의 LAT (측면) 및 AP (전후) 영상을 보여주고; 패널 3 및 4는 각각 2주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 5 및 6은 각각 4주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 7 및 8은 각각 6주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 9 및 10은 각각 7주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 11 및 12는 각각 8주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 도 17a, 하부 패널은 다음과 같이 1.5 mg/ml BMP-2로 처리한 NHP 넘버 1 우측 팔에 대한 결과를 보여준다: 패널 1 및 2는 각각 초기 시점에서의 LAT (측면) 및 AP (전후) 영상을 보여주고; 패널 3 및 4는 각각 2주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 5 및 6은 각각 4주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 7 및 8은 각각 6주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 9 및 10은 각각 7주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 패널 11 및 12는 각각 8주에서의 LAT 및 AP 영상을 보여주고; 도 17b는 도 17a에서 NHP #1에 대해 설명된 바와 같은, NHP 넘버 2에 대한 방사선 사진 결과를 보여주고; 도 17c는 도 17a에서 NHP #1에 대해 설명된 바와 같은, NHP 넘버 3에 대한 결과를 제시한다.
도 18은 BMP-E 및 BMP-6 WT의 결정 구조를 보여주고 이를 비교하는 구조적 모델의 도면이다. 분석되는 글리칸의 길이의 차이는 분석되는 BMPE에 대한 글리칸이 BMP6의 것보다 훨씬 더 길다는 것을 보여주도록 강조된다. 이것은 보다 많은 글리칸이 상기 모델에서 제공될 수 있도록 BMPE 글리칸이 BMP6의 것보다 더 입체형태적으로 제한됨을 나타낸다. BMPE 및 BMP6 둘 모두에 대한 히스티딘 도어스톱 잔기는 유사한 비-도어스톱 입체형태로 제시된다. 또한, BMPE 글리칸을 안정화하는 아르기닌 글리칸 "테더"는 아르기닌과 글리칸의 상호작용을 나타내는 점선에 의해 제시된다.
도 19는 도 18에 제시된 BMPE 및 BMP6의 히스티딘 도어스톱 및 아르기닌 테더의 근접도이다. 상기 영상은 둘 모두 비-도어스톱 위치에서 BMPE의 H54 히스티딘 잔기 및 BMP6의 동등한 히스티딘의 유사한 입체형태를 보여준다. 영상은 또한 보다 적은 BMP6 글리칸이 그 모델에서 가시화되도록 하는 BMP6의 보다 "딱딱하지 않고 (floppy)" 덜 제한된 글리칸에 비해 글리칸이 보다 경질이어서 모델에 의해 보다 많이 제공되도록 하는, BMPE 글리칸의 상호작용을 통한 R16 테더링 (tethering)을 보여준다. 상기 모델의 도면은 또한 글리칸의 N-연결 부착을 보여주는 BMPE의 아스파라긴 N56의 유사한 위치 및 BMP6의 동등한 유사하게 위치하는 아스파라긴을 보여준다. 도면은 또한 아미노산 잔기와 글리칸의 원위 말단 사이의 점선에 의해 제시된 BMPE E110의 잠재적인 추가의 글리칸 테더링 상호작용을 보여준다. 분석되는 글리칸의 길이의 차이는 BMPE에 대해 제공되는 보다 밝은 음영의 보다 긴 글리칸에 비해 보다 적은 더 어두운 BMP6 글리칸이 분석될 수 있음을 보여주도록 강조되고, 이것은 BMPE 글리칸이 보다 입체형태적으로 제한되어 보다 많은 글리칸이 구조 분석에서 제공됨을 나타낸다.
도 20은 BMP-2, BMPE 및 BMP-6의 골형성 활성을 그의 Endo-H 처리된 탈글리코실화 (Degly.) 대응물을 비교하는, C2C12 전구 근육모세포를 사용한 알칼리성 포스파타제 검정의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 R16에서 글리칸 테더의 위치를 보여주는 BMPE의 구조적 모델을 예시하고 아르기닌 (R16)과 글루탐산 (BMP2의 E109에 대응하는 E110) 잔기 사이의 안정화 상호작용을 예시하는 도면이다. 이 도면은 R16 및 E110 둘 모두가 제3 (β-만노스) 및 제4 (α-만노스) 글리칸 모이어티와 다수의 수소 결합을 형성함을 보여준다. 이 도면은 또한 글리칸의 N-연결된 부착 부위를 제공하는 H54 잠재적 "도어스톱" 및 아스파라긴 56 (N56)의 위치를 보여준다.
도 22는 BMP-E의 골형성 활성을 증가하는 용량의 노긴 (Noggin) (BMP-2의 천연 억제제)의 존재 하에 BMP-E-NR, BMP-GER 및 BMP-GER-NR과 비교하는 C2C12 전구 근육모세포를 사용한 알칼리성 포스파타제 검정의 결과를 보여주는 그래프이다. 데이터는 액티빈으로부터 유래된 서열을 포함하는 BMP-GER-NR이 고농도에서도 노긴에 의해 억제되지 않았지만 BMP-GER은 노긴 억제에 감수성임을 입증한다. 따라서, 액티빈으로부터 유래된 서열의 부가는 BMP-GER을 노긴 내성 (NR)으로 만들었다. 이들 결과는 적어도 상기 시험관내 검정에서 노긴 감수성인 BMP-GER 및 BMPE가, 단백질의 C-말단 영역을 액티빈으로부터 유래된 서열로 교체시에 노긴 내성 (NR)으로 됨을 입증한다.
도 23은 명시된 용량의 표시된 BMP로 처리된 래트 이소성 이식물에 대한 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 골 점수를 보여주는 그래프이다. 데이터는 분자의 C-말단 서열이 액티빈으로부터 유래된 서열 (NR)로 교체될 때 BMP-GER의 골 형성 활성이 크게 감소함을 보여준다. 따라서, 데이터는 BMP-GER-NR이 생체 내에서 BMP-GER보다 활성이 훨씬 더 작음을 입증한다.
도 24는 명시된 용량의 표시된 BMP로 처리된 래트 이소성 이식물에 대한 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 골 점수를 보여주는 그래프이다. 데이터는 BMP-E의 골 형성 활성이 크게 감소하고, 실제로 이 분자의 C-말단 서열이 액티빈으로부터 유래된 서열 (NR)로 교체될 때 완전히 제거됨을 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 본원에서 "디자이너 BMP", "디자이너 골형성 단백질" 및 "디자이너 단백질"로도 언급되는 "디자이너" 골 형태형성 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 디자이너 BMP는 야생형 비변형 BMP, 비제한적인 예를 들어 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, 및 BMP9의 아미노산 서열에 대응할 수 있다. 특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 그의 상응하는 야생형 BMP에 비교할 때 타입 I 및/또는 타입 II BMP 수용체에 대해 변경된 결합을 보인다. 추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP는 그의 상응하는 BMP에 비교할 때 변경된 반감기, 면역원성, 또는 임의의 약동학/약역학 (PK/PD) 파라미터를 갖도록 변형될 수 있다.

정의

본원에서 달리 규정되지 않으면, 본 발명과 관련하여 사용되는 학술 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 본원에서 설명되는 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 공지되고 달리 나타내지 않으면 본원 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 방법에 따라 수행된다. 그러한 참고 문헌은 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)], 및 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990)]을 포함한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명에 따라, 당업계에서 통상 수행되는 바와 같이 또는 본원에서 설명되는 바와 같이 수행한다. 본원에서 설명되는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 실험 절차 및 기술은 당업계에 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 제약 제제, 제제화, 및 전달, 및 환자의 치료를 위한 표준 기술을 사용한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 각각의 다음 용어는 본 섹션에서 그와 연관된 의미를 갖는다.

관사 ("a" 및 "an")는 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

본원에서, "또는"의 사용은 달리 나타내지 않으면 "및/또는"을 의미한다.

통상적인 표기법이 폴리펩티드 서열을 묘사하기 위해 본원에서 사용된다: 폴리펩티드 서열의 좌측 말단부는 아미노-말단이고; 폴리펩티드 서열의 우측 말단부는 카르복실-말단이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 용법을 따른다 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)] 참조). 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산은 그의 전체 명칭에 의해, 그에 대응하는 3 문자 코드에 의해, 또는 그에 대응하는 1 문자 코드에 의해 다음과 같이 제시된다:

전체 명칭 3 문자 코드 1 문자 코드

아스파르트산 Asp D

글루탐산 Glu E

리신 Lys K

아르기닌 Arg R

히스티딘 His H

티로신 Tyr Y

시스테인 Cys C

아스파라긴 Asn N

글루타민 Gln Q

세린 Ser S

트레오닌 Thr T

글리신 Gly G

알라닌 Ala A

발린 Val V

류신 Leu L

이소류신 Ile I

메티오닌 Met M

프롤린 Pro P

페닐알라닌 Phe F

트립토판 Trp W

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성 (예를 들어, 하전 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환에 의해 상이한 경우에, 서열 동일성 % 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 높게 조정될 수 있다. 상기 조정을 위한 수단은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)] 참조).

유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; 2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; 3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; 4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; 6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다.

별법으로, 보존적 교체는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992)]에 개시된 PAM250 log-가능성 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 수준의 보존적" 교체는 PAM250 log-가능성 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다..

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위해 결합 친화도를 변경하고, (4) 상기 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변경하는 것이다. 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 유사체는 명시된 펩티드 서열 이외의 다른 서열의 다양한 뮤테인 (mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 명시된 서열에서 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의, 예를 들어 CDR 또는 타입 I 또는 타입 II 수용체 결합 부위 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들어, 교체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 파괴하거나, 또는 모 서열의 특징이 되는 다른 종류의 2차 구조를 붕괴시키는 경향을 보이지 않아야 한다). 당업계에서 인정되는 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; [Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 [Thornton et al., Nature 354:105 (1991)]에 설명되어 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", 및 "올리고뉴클레오티드"는 DNA 및 RNA 내의 일련의 뉴클레오티드 염기 ("뉴클레오티드"로도 불림)를 의미하고, 2개 이상의 뉴클레오티드의 임의의 사슬을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 키메라 혼합물 또는 유도체 또는 이들의 변형된 버전, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 분자의 안정성, 그의 혼성화 파라미터 등을 개선하기 위해 염기 모이어티, 당 모이어티, 또는 포스페이트 백본에서 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 대개 단백질 및 효소를 만들기 위해 세포 기구에 의해 사용되는 정보를 포함하는 유전 정보를 보유한다. 이들 용어는 이중- 또는 단일 가닥 게놈 및 cDNA, RNA, 임의의 합성 및 유전자 조작 폴리뉴클레오티드, 및 센스와 안티센스 폴리뉴클레오티드 둘 모두를 포함한다. 이것은 또한 변형된 염기, 예를 들어, 티오-우라실, 티오-구아닌, 및 플루오로-우라실을 함유하는, 또는 탄수화물, 또는 지질을 함유하는 핵산을 포함한다.

뉴클레오티드 서열의 맥락에서, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열이 공통적인 기능적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 공통적인 구조적 폴리펩티드 도메인 또는 공통적인 기능적 폴리펩티드 활성을 코딩하도록, 제2 핵산 서열 내의 정렬된 뉴클레오티드와 동일한 충분한 수의 또는 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 제1 핵산 서열을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 참조 서열에 대해 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.

"디자이너 BMP 핵산", 및 문법적 동등체는 본원에서 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 의미한다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 아미노산의 순차적인 사슬을 의미한다. 이 용어는 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 단일 폴리펩티드가 별개의 기능 단위이고 별개의 기능 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드와 영구적인 또는 일시적인 물리적 회합을 필요로 하지 않는다면, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 교화가능하게 사용될 수 있다. 별개의 기능 단위가 서로 물리적으로 회합되는 다수의 폴리펩티드로 이루어진다면, 본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 물리적으로 연결되어 별개의 단위로서 함께 기능하는 다수의 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명에 따라 발현시킬 단백질은 단백질 치료제일 수 있다. 단백질 치료제는 그 치료제가 작용하는 신체 내의 영역에 대해 또는 중간체를 통해 원격으로 작용하는 신체의 영역에 대해 생물학적 효과를 갖는 단백질이다. 단백질 치료제의 예는 아래에서 보다 상세하게 논의된다.

"디자이너 BMP"는 본원에서 사용될 때, 돌연변이가 없는 상응하는 야생형 BMP에 비해 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 BMP 단백질에 관한 것이고, 여기서 디자이너 BMP는 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 결합에 비해 적어도 타입 I 수용체 및/또는 적어도 하나의 타입 II 수용체에 대해 검출가능하게 변경된 결합을 갖는다.

"상응하는 야생형 단백질"은 임의의 돌연변이 도입 전의 디자이너 BMP의 야생형 버전을 의미한다. 예를 들어, 디자이너 BMP가 디자이너 BMP2일 경우, 상응하는 야생형 BMP는 야생형 BMP2이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 디자이너 BMP의 설계는 그럴 필요는 없지만 야생형 BMP 서열로 시작할 수 있고, 여기서 돌연변이 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입)는 야생형 서열 내로 도입된다. 따라서, 디자이너 BMP는 야생형 BMP에 상응할 수 있고, 돌연변이의 위치는 예를 들어 야생형의 상응 또는 "참조" BMP 서열의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 이 서열에 관련되고/되거나 이 서열에 따른다고 언급될 수 있다.

본 발명의 단백질은 본원에서 설명되는 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 단백질을 언급할 때 이들이 유래되는 단백질의 기능적 특성의 적어도 일부를 보유하는 임의의 단백질을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단편"은 폴리펩티드를 나타내고, 그 폴리펩티드에 특유하거나 특징적인 주어진 폴리펩티드의 임의의 별개의 부분으로서 규정된다. 또한, 본원에서 사용되는 상기 용어는 전장 폴리펩티드의 활성의 적어도 일부를 보유하는 주어진 폴리펩티드의 임의의 별개의 부분을 의미한다. 특정 실시양태에서, 보유되는 활성의 일부는 전장 폴리펩티드의 활성의 적어도 10%이다. 특정 실시양태에서, 보유되는 활성의 일부는 전장 폴리펩티드의 활성의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%이다. 특정 실시양태에서, 보유되는 활성의 일부는 전장 폴리펩티드의 활성의 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 특정 실시양태에서, 보유되는 활성의 일부는 전장 폴리펩티드의 활성의 100% 이상이다. 별법으로 또는 추가로, 본원에서 사용되는 상기 용어는 또한 적어도 전장 폴리펩티드에서 발견되는 확립된 서열 요소를 포함하는 주어진 폴리펩티드의 임의의 부분을 의미한다. 일부 실시양태에서, 서열 요소는 전장 폴리펩티드의 적어도 약 4-5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 초과의 아미노산에 걸친다. 본 발명의 단백질의 단편은 단백질 분해 단편, 및 결실 단편을 포함한다.

본 발명의 단백질의 변이체는 상기한 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연적으로 발생하거나 또는 비-천연적으로 발생할 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 변이체는 당업계에 공지된 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 단백질은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질은 기능적 측기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 단백질을 포함한다. 또한, 본 발명의 단백질로서 20개의 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 생성 아미노산 유도체를 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린이 프롤린을 대체할 수 있고; 5-히드록시리신이 리신을 대체할 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘을 대체할 수 있고; 호모세린이 세린을 대체할 수 있고; 오르니틴이 리신을 대체할 수 있다.

본원에서 사용되는 "재조합 방식으로 발현된 폴리펩티드" 및 "재조합 폴리펩티드"는 그 폴리펩티드를 발현하도록 조작된 숙주 세포로부터 발현된 폴리펩티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 조작은 하나 이상의 유전자 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 발현시킬 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 이종성 유전자의 도입에 의해 유전자 변형될 수 있다. 재조합 방식으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사할 수 있다. 재조합 방식으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 외래성, 예를 들어 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드에 이종성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 방식으로 발현된 이종성 폴리펩티드는 키메라이다. 예를 들어, 폴리펩티드의 일부는 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 함유하지만, 다른 부분은 숙주 세포에 외래성인 아미노산 서열을 함유한다. 추가로 또는 별법으로, 폴리펩티드는 둘 모두 숙주 세포에서 정상적으로 발현되는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 둘 모두 숙주 세포에 외래성인 2개 이상의 폴리펩티드로부터의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 활성화 또는 상향조절에 의해 유전적으로 변형된다.

서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성 (이들 용어는 본원에서 교환가능하게 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행한다. 2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 %를 결정하기 위해, 서열들을 최적 비교를 위해 정렬한다 (예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중의 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교를 위해 무시될 수 있다). 일반적인 실시양태에서, 비교를 위해 정렬되는 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 60%, 또는 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 그 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등한 것이다).

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 동일성 %를 결정하기 위해, 서열들을 최적 비교를 위해 정렬한다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 2개의 서열 사이의 동일성 %는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성= (동일한 위치의 수/위치의 총수) X 100). 2개의 서열 사이의 상동성 %의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 바람직한 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌 [Karlin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 90:5873-7 (1993)]에서 변형된 문헌 [Karlin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 87:2264-8 (1990)]의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., J Mol Biol 215:403-10 (1990)]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 내에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 탐색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어 길이=12을 이용하여 수행할 수 있다.

BLAST 단백질 탐색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어 길이=3을 이용하여 수행할 수 있다. 비교를 위한 갭 도입 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997)]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.

2개의 서열 사이의 동일성 %는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다

서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 %의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성%는 블로섬 (Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (gcg.com에서 이용가능함)의 GAP 프로그램 내로 포함된 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정된다 (Needleman et al., J Mol Biol 48:443-53 (1970)). 또 다른 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70, 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지 (gcg.com에서 인터넷을 통해 이용가능함) 내의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 1개의 일반적인 파라미터 세트 (및 달리 명시되지 않으면 사용되어야 하는 것)는 갭 페널티 12, 갭 연장 페널티 4, 및 프레임쉬프트 갭 페널티 5를 사용한 블로섬 62 스코어링 매트릭스이다.

2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 %는 PAM120 가중치 잔기표, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 포함된 이. 마이어스 (E. Myers) 및 더블류. 밀러 (W. Miller) (문헌 [Myers et al., Comput Appl Biosci 4:11-7 (1988)])의 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다.

본원에서 사용될 때, "사용 설명서"는 본원에서 언급되는 다양한 질환 또는 장애에 영향을 주거나, 완화하거나 치료하기 위한 키트 내의 본 발명의 화합물, 조합물, 및/또는 조성물의 유용성을 알리기 위해 사용될 수 있는 출판물, 기록, 도면, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 임의로, 또는 별법으로, 사용 설명서는 본원에서 개시되는 것을 비롯하여 세포, 조직, 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 완화하는 하나 이상의 방법을 설명한다.

키트의 사용 설명서는 예를 들어 본 발명의 화합물 및/또는 조성물이 담긴 용기에 부착되거나 또는 화합물 및/또는 조성물이 담긴 용기와 함께 수송될 수 있다. 별법으로, 사용 설명서는 수여자가 사용 설명서와 화합물을 함께 사용하도록 용기와 별개로 수송될 수 있다.

특별히 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 교환가능하게 사용되고, 포유동물, 예컨대 인간 환자 및 비-인간 영장류, 및 수의 대상체, 예컨대 토끼, 래트, 및 마우스 및 다른 동물을 의미한다. 바람직하게는, 환자는 인간을 나타낸다.

본원에서 교환가능하게 사용되는 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 조직 또는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때 화합물의 부재시에 검출된 반응에 비해 검출가능한 치료 반응을 매개하는 양이다. 치료 반응, 비제한적인 예를 들어 섬유증의 억제 및/또는 감소, 골 질량 또는 골 밀도의 증가 등은 예를 들어 본원에 개시된 방법을 비롯하여 당업계에서 인정되는 다양한 방법에 의해 쉽게 평가할 수 있다.

당업자는 본원에서 투여되는 화합물 또는 조성물의 유효량이 상이하고 많은 인자, 예컨대 치료되는 질환 또는 병태, 질환의 병기, 치료하는 포유동물의 연령 및 건강 및 신체 상태, 질환의 중증도, 투여되는 특정 화합물 등을 기초로 하여 쉽게 결정할 수 있음을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 질환의 증상 (예를 들어, 감소된 골 밀도, 골절, 섬유증 등)을 환자가 경험하는 빈도를 감소시키는 것을 의미한다. 이 용어는 질환의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 개시의 방지 또는 지연, 증상의 완화 또는 질환, 병태, 또는 장애의 추가 발생의 정지 또는 억제를 위한 본 발명의 화합물 또는 물질의 투여를 포함한다. 치료는 예방적 (질환의 발병을 방지하거나 지연하기 위해, 또는 그의 임상 또는 아임상 증상의 징후를 방지하기 위해) 또는 질환의 징후 후의 증상의 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.

본원에서 사용되는 문구 "특이적으로 결합하다"는 특이적 분자를 인식하고 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 화합물, 예를 들어, 단백질, 핵산, 항체 등을 의미한다. 예를 들어, BMP 단백질, 항체 또는 펩티드 억제제는 샘플 내의 동족 수용체 (예를 들어, BMP 타입 I 또는 타입 II 수용체, 그의 동족 항원에 결합하는 항체 등)를 인식하고 결합하지만, 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는다. 따라서, 설계된 검정 조건 하에서, 명시된 결합 모이어티 (예를 들어, BMP 또는 그의 수용체 결합 단편)는 특정 표적 분자에 우선적으로 결합하고, 시험 샘플 내에 존재하는 다른 성분에는 충분한 양으로 결합하지 않는다. 관심있는 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하기 위해 다양한 검정 형식을 사용할 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정, 면역침전, 비아코어 (BIAcore), FACS, 옥텟 (Octet), 및 웨스턴 블롯 분석이 BMP 수용체와 특이적으로 반응하는 BMP를 확인하기 위해 사용될 수 있는 많은 검정의 예이다. 일반적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 2배, 보다 바람직하게는, 배경 신호 또는 노이즈의 적어도 5배, 보다 일반적으로는 배경의 10배 초과일 것이고, 훨씬 더 구체적으로, BMP는 평형 해리 상수 (K_D)가 ≤ 100 μM, 보다 바람직하게는 ≤ 10 μM, 훨씬 더 바람직하게는 ≤ 1 μM, 더욱 더 바람직하게는 ≤ 100 nM, 가장 바람직하게는 ≤ 10 nM일 때 BMP 수용체에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다.

용어 "K_D"는 특정 리간드-수용체 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다.

"결합 친화도"는 일반적으로 분자의 결합 부위 (예를 들어, BMP 리간드)와 그의 결합 파트너 (예를 들어, BMP 타입 I 또는 타입 II 수용체) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않으면, 본원에서 사용되는 "결합 친화도"는 결합쌍의 멤버 (예를 들어, BMP 및 그의 동족 수용체) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 의미한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (K_d)로 표시될 수 있다.

친화도는 본원에서 설명되는 것을 비롯하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정할 수 있다. 저친화도 BMP는 일반적으로 수용체에 느리게 결합하고, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면에, 고친화도 BMP는 일반적으로 수용체에 보다 빠르게 결합하고 보다 오래 결합된 상태로 유지되는 경향을 보인다. 결합 친화도를 측정하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이중 임의의 방법이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 구체적인 예시적인 실시양태가 본원에서 설명된다.

본원에서 사용되는 용어 "k _on "은 M^-1 sec^-1 단위로 측정된 회합 또는 온 레이트 (on rate) 상수, 또는 정방향 또는 복합체-형성 반응의 특이적인 반응 속도를 나타내고자 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "k _off "는 sec^-1 단위로 측정된 해리 또는 오프 레이트 (off rate) 상수, 또는 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 특이적인 반응 속도를 나타내고자 의도된다.

본원에서 사용되는 용어 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 나타내고자 의도된다. 이것은 다음 식에 의해 계산된다:

k _off /k _on = K_d

본원에서 사용되는 용어 "변경된 결합"은 디자이너 BMP가 동일한 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 결합에 비해 적어도 타입 I 수용체 및/또는 타입 II 수용체에 대한 상이한 결합 특이성을 포함함을 의미한다. 디자이너 BMP는 수용체에 대한 야생형 BMP의 결합에 비해 수용체에 대해 더 크거나 더 작은 친화도로 결합할 수 있다. 예를 들어, 야생형 BMP가 특정 타입 I 수용체에 특정 결합 친화도로 결합한다면, 상응하는 디자이너 BMP는 그 수용체에 대해 야생형 BMP에 비해 더 크거나 더 작은 친화도로 결합한다. 디자이너 BMP는 야생형 BMP가 검출가능하게 결합하지 않은 수용체에 특이적으로 결합하고, 반대로 디자이너 BMP는 야생형 BMP가 결합하는 수용체에 더 이상 검출가능하게 결합하지 않을지도 모른다. 따라서, 변경된 결합은 상응하는 야생형 BMP에 의한 수용체의 결합에 비해 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 디자이너 BMP 결합의 임의의 검출가능한 변화를 포함한다. 디자이너 BMP의 K_d가 동일한 BMP 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 K_d보다 더 크거나 더 작도록, 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP에 대한 k _on 값에 비해 더 크거나 더 작은 k _on 값을 갖고/갖거나 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP의 k _off 값에 비해 더 크거나 더 작은 k _off 값을 가질 수 있다. 따라서, 디자이너 BMP와 상응하는 야생형 BMP 사이의 결합 특징 및/또는 친화도 값의 임의의 차이는 본원에서 사용되는 용어 "변경된 결합"에 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들어 비아코어 시스템 (파마시아 바이오센서 아베 (Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라, 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경의 검출에 의해 실시간 생체특이적 (biospecific) 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상을 의미한다. 추가의 설명에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Johnsson, et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993)]; [Johnsson, et al., Biotechniques 11:620-627 (1991)]; [Johnsson, et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995)]; 및 [Johnnson, et al., Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991)]을 참조한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 해당 물질종이 존재하는 우세한 물질종임을 의미이고 (즉, 몰 기준으로 조성물 내의 임의의 다른 개별 물질종보다 더 풍부함), 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 해당 물질종 (예를 들어, 디자이너 BMP)이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50% (몰 기준)를 구성하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 물질종의 약 80% 초과, 보다 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 및 99% 초과를 구성하는 물질종을 포함할 것이다. 가장 바람직하게는, 해당 물질종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 물질종으로 이루어진 기본적인 균일성 수준으로 정제된다 (오염 물질종은 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음).

설명

골 형태형성 단백질 ( BMP )

본원에서 앞서 설명한 바와 같이, BMP는 그 전부가 6개의 보존된 시스테인 잔기를 특징으로 하는 TGF-β 단백질 수퍼패밀리의 멤버이다 (Lander et al, (2001) Nature, 409:860-921). BMP/GDF 하위패밀리는 BMP2, BMP3 (오스테오게닌) (예를 들어, 미국 특허 6,177,406 참조), BMP3b (GDF-10) (예를 들어, 미국 특허 6,204,047 참조), BMP4 (BMP2b) (예를 들어, 미국 특허 6,245,889 참조), BMP5 (예를 들어, 미국 특허 5,543,394 참조), BMP6 (예를 들어, 미국 특허 6,613,744 참조), BMP7 (골형성 단백질-1 또는 OP1) (예를 들어, 미국 특허 5,141,905 참조), BMP8 (OP2) (예를 들어, 미국 특허 5,688,678 참조), BMP8B (OP3) (예를 들어, 미국 특허 5,854,071 참조), BMP9 (GDF2) (예를 들어, 미국 특허 6,287,816 참조), BMP10 (예를 들어, 미국 특허 5,703,043 참조), BMP11 (GDF11) (예를 들어, 미국 특허 6,437,111 참조), BMP12 (GDF7) (예를 들어, 미국 특허 6,027,919 참조), BMP13 (GDF6, CDMP2) (예를 들어, 미국 특허 6,027,919 참조), BMP15 (GDF9) (예를 들어, 미국 특허 6,034,229 참조), BMP16 (예를 들어, 미국 특허 6,331,612 참조), GDF1 (예를 들어, 미국 출원 2004/0039162 참조), GDF3 (예를 들어, 미국 특허 6,025,475 참조), GDF5 (CDMP1; MP52) (예를 들어, 미국 특허 5,994,094 참조), 및 GDF8 (미오스타틴) (예를 들어, 미국 특허 5,827,733 참조)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

BMP는 타입 I 수용체: ALK-1, ALK-2 (ActRIa 또는 ActRI로도 불림), ALK-3 (BMPRIa로도 불림), 및 ALK-6 (BMPRIb로도 불림); 및 타입 II 수용체: ActRIIa (ActRII로도 불림), ActRIIb, 및 BMPRII를 포함하는 이들의 동족 수용체에 특이적으로 결합한다. BMP-수용체 결합 상호작용은 광범하게 연구되었고, 각각의 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 각각의 야생형 BMP의 결합 특이성은 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 표 1에 제시된다. 예를 들어, 문헌 [Nickel et al., Cytokine Growth Factor Rev 20:367-77 (2009)]; [Heinecke et al., BMC Biol 7:59 (2009)]을 참조한다.

개선된 골형성 활성을 갖는 디자이너 골 형태형성 단백질

본원은 부분적으로는 각각의 BMP 이량체가 4개의 BMP 수용체, 즉 2개의 타입 I 수용체 및 2개의 타입 II 수용체에 결합한다는 이해를 기초로 한다. 각각의 수용체에 대한 각각의 BMP의 특이성은 상기 표 1에 제시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 각각의 수용체에 대한 BMP의 결합을 매개하는 다양한 BMP의 수용체 결합 영역을 매핑하고 표 2에 제시한다. 예를 들어, 야생형 BMP2 및 BMP4가 타입 I BMP 수용체 ALK-3 및 ALK-6에 고친화도로 결합하고 타입 II BMP 수용체에는 보다 낮은 친화도로 결합함이 잘 확립되어 있다. 다른 한편으로, 야생형 BMP6 및 BMP7은 타입 II 수용체 ActrIIA, ActrIIB, 및 BMPRII에 고친화도로 결합하지만, 타입 I 수용체에는 타입 II에 결합하는 것보다 낮은 친화도로 결합한다고 알려져 있다. 약 12개의 수용체와의 상호작용을 통해 신호를 전달하는 약 43개 TGFβ 수퍼패밀리 멤버와 상이한 세포성 반응은 상이한 친화도로 결합하는 특정 수용체 레퍼토리를 이용하는 각각의 리간드에 의한 것으로 생각된다. 타입 I 및 II 결합 도메인을 표 2에서 설명한다.

디자이너 BMP 의 수용체 결합을 변경하기 위한 합리적인 아미노산 치환

한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 수용체 결합 부위에 아미노산 돌연변이를 도입하여, 수용체에 대한 상응하는 야생형 BMP의 결합에 비해 디자이너 BMP에 의한 타입 I 및 타입 II BMP 수용체에 대한 변경된 결합을 제공하는 것을 포함한다. 즉, 야생형 BMP2는 타입 I 수용체에 대해 비교적 고친화도를 보이는 반면, 야생형 BMP6은 타입 II 수용체에 대해 고친화도를 보인다고 당업계에 공지되어 있다. 야생형 BMP2 및 BMP6의 이종이량체는 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두에 비교적 고친화도로 결합하고, 각각의 BMP가 분명히 각각의 수용체에 대해 보다 고친화도 결합 부위를 제공함이 당업계에 추가로 공지되어 있다. 아래 표 3을 참조한다. BMP2/6 이종이량체는 시험관내 및 생체내 골 형성 검정 둘 모두에서 BMP2 또는 BMP6 단독 또는 동종이량체보다 더 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 표 3은 타입 I 및 II 수용체에 대한 BMP2 및 BMP6 결합 친화도의 예를 보여준다.

따라서, 타입 I 및/또는 타입 II 수용체에 대한 개선된 결합을 갖는 디자이너 BMP를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 도 1a 및 표 2에 제시된 바와 같이, 각각의 BMP는 수용체 결합에 기여하는 3개의 결합 부위를 포함한다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 BMP는 타입 II 수용체 결합 부위 A, 타입 I 수용체 결합 부위, 및 제2 타입 II 수용체 결합 부위 B를 포함한다. 야생형 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, 및 BMP9의 예시적인 정렬을 도 1에 도시하지만, 당업자는 TGFβ 수퍼패밀리의 멤버 중의 다양한 아미노산의 상대적인 위치를 제공하는 잘 공지된 정렬이 존재함을 이해할 것이다. 그러한 정렬은 특히 국제 특허 공개 WO 2009/086131 (예를 들어, 도 15-17, 도 31A), WO 2008/051526 (도 9-12), WO 2005/118636 (도 6), WO 2005/118635, WO 2005/113585 (도 3), WO 2001/92298 (도 6A-6C), 문헌 [Kirsch et al., EMBO J. 19:3314-3324 (2000) (도 1)], 미국 특허 출원 공개 2007/0293425 (도 6), 문헌 [Groppe et al., Nature 420:636-642 (2002)], [Nickel et al., J. Bone Joint Surg. Am. 83:7-14 (2001)], 및 [Weber et al., BMC Structural Biol. 7:6 (2007)]에 제시되어 있다. 따라서, 다양한 TGFβ 수퍼패밀리 멤버의 아미노산 서열의 정렬, 및 본원에서 제시되는 개시내용을 포함하여 당업계에 공지된 단백질 서열 정렬 알고리즘 및 도구를 사용하여, 하나의 BMP/GDF 단백질 내의 임의의 위치에서의 아미노산에 비해 또 다른 BMP/GDF 단백질 내의 상응하는 아미노산이 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 및 BMP-9 내의 상응하는 아미노산 잔기가 제시된다 (예를 들어, 도 1a 참조).

본 발명의 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인 또는 타입 II 결합 도메인에 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대한 변경된 결합을 부여한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인 및 제1 (결합 도메인 A) 또는 제2 (결합 도메인 B) 타입 II 결합 도메인 둘 모두에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 두 타입 II 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 제1 타입 II 결합 도메인, 제2 타입 II 결합 도메인, 및 타입 I 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 수용체에 대한 결합을 개선한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 II 수용체에 대한 결합을 개선한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 아래에서 보다 상세하게 제시되는 바와 같이 글리칸 테더를 생성하거나 파괴한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 아래에서 보다 상세하게 제시되는 바와 같이 His 도어스톱을 생성하거나 파괴한다.

BMP는 당업계에서 잘 특성화되고 이해되고 있기 때문에, 본원에서 제시되는 개시내용이 제공되면, 디자이너 BMP의 활성에 추가로 영향을 주지 않고 이루어질 수 있는 가능한 돌연변이의 위치를 알 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 디자이너 BMP는 변이체 BMP의 수용체 결합 친화도에 영향을 주지 않는 추가의 삽입, 결실, 또는 치환을 함유한다는 점에서 상응하는 야생형 또는 디자이너 BMP와 상이한 변이체 BMP를 포함한다. 일부 비제한적인 실시양태에서, 당업자는 시스테인 노트 형성에 관여하는 시스테인 및 수용체 상호작용에 관여하는 아미노산은 돌연변이되지 않아야 하거나 또는 보존적 치환으로 변경되어야 하지만, 다른 아미노산은 디자이너 BMP의 생물학적 활성에 유해한 영향을 주지 않으면서 보다 자유롭게 치환, 삽입, 또는 결실될 수 있음을 이해할 것이다.

달리 언급되지 않으면, 설계된 또는 변형된 BMP의 모든 위치에 따른 넘버링은 성숙 천연 BMP의 서열을 기초로 함을 유의하여야 한다. 디자이너 BMP는 그를 BMP 서열의 천연 생성 대립유전자 또는 종간 변이와 구분시키는 특징인 소정의 변이 특성을 특징으로 한다. 디자이너 BMP의 변이체는 아래에서 설명하는 적절한 검정을 이용하여 결정할 때 하나 이상의 세포 종류에서 상응하는 야생형의 활성 또는 디자이너 BMP 활성의 적어도 50%를 보유하여야 한다. 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 야생형 활성을 보유하는 변이체가 보다 바람직하고, 야생형보다 큰 활성을 갖는 변이체가 특히 바람직하다. 디자이너 BMP는 N-말단, C-말단, 또는 내부에 삽입, 결실, 및/또는 치환을 보유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 설계된 또는 변형된 BMP는 가장 유사한 인간 BMP 서열과 상이한 적어도 1개의 잔기를 갖고, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 상이한 잔기가 보다 바람직하다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP 단백질 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 유지한다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP 단백질 서열의 C-말단 영역의 보존된 시스테인 도메인과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 유지할 수 있다.

디자이너 BMP는 추가의 단백질 특성, 예컨대 안정성 또는 면역원성을 변경하거나 또는 번역후 변형, 예컨대 PEG화 또는 글리코실화를 가능하게 하거나 방지하는 추가의 변형, 예를 들어 돌연변이를 포함할 수 있다. 디자이너 BMP는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, PEG화, 환상 순열, 고리화, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩티드 태그 또는 표지의 부가를 포함하고 이로 제한되지 않는 공동-번역 또는 번역후 변형에 적용될 수 있다.

유전자 코드의 축퇴성 때문에, 디자이너 BMP의 아미노산 서열을 변경하지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 단순히 변경함으로써 그 전부가 본 발명의 디자이너 BMP를 코딩하는 극히 많은 수의 핵산이 제조될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 WO2008/051526 또는 WO2009/086131에 제시된 상기 서열을 포함하지 않는다.

상기한 바와 같이, BMP는 긴 전구 도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 전구단백질로서 천연적으로 발현된다. 이어서, 상기 전구단백질은 세포 기구에 의해 프로세싱되어 이량체성 성숙 BMP 분자를 생성한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 유사한 방식으로 생산된다. 전구 도메인은 BMP의 정확한 접힘 및 프로세싱을 돕는 것으로 생각된다. 또한, 모두는 아니지만 일부 BMP에서, 전구 도메인은 성숙 도메인에 비공유 결합할 수 있고, 샤페론, 및 억제제로서 작용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thies et al., Growth Factors 18:251-9 (2001)]). 바람직하게는, 본 발명의 변형된 BMP는 상기 형태로 치료 목적으로 생산 및/또는 투여된다. 별법으로, BMP는 성숙 도메인이 직접 생산되거나 또는 봉입체로부터 재접힘되거나 또는 전장 무손상 전구단백질을 포함하는 형태를 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 형태로 생산될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 이들 형태 및 다른 형태로 유용할 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 백본 BMP, 즉, 디자이너 BMP가 그에 대응하는 야생형 BMP를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 백본 BMP는 야생형 BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, 또는 BMP9 백본일 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인 및/또는 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 상응하는 야생형 BMP의 결합에 비해 타입 I 또는 타입 II BMP 수용체에 대한 변경된 결합을 부여한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 I 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이 및 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 결합 도메인 A 및 타입 II 결합 도메인 B에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 결합 도메인 A, 타입 II 결합 도메인 B, 및 타입 I 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.

특정 실시양태에서, 돌연변이는 아미노산 또는 핵산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 아미노산 치환을 포함한다.

일부 실시양태에서, 백본 BMP는 야생형 BMP이고, 돌연변이는 표 4 내지 6에 나열된 하나 이상의 돌연변이이다. 디자이너 BMP는 이들 표에 나열된 임의의 조합물 및 임의의 수의 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 백본 BMP는 야생형 BMP이고, 돌연변이는 표 4 내지 6에 나열된 하나 이상의 돌연변이이다. 디자이너 BMP는 이들 표 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 순열 및 임의의 모든 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 수용체에 대한 결합을 개선한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 II 수용체에 대한 결합을 개선한다. 다른 실시양태에서, 돌연변이는 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합을 감소시킨다.

상기 표 4-6은 돌연변이의 위치가 상응하는 야생형 BMP 아미노산 서열에 대해 제시되는 본 발명의 예시적인 돌연변이의 비-제한적인 편집을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 다음 돌연변이의 바람직한 조합을 포함한다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP2이다. 추가로, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이는 V33, P36, G37, H39, F41, Y42 및 H44로 이루어진 군 중에서 선택된 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 P48, F49, A52, D53, H54, L55, N56, S57, N59, V63, T65, N68, S69, V70, N71, S72, K73, I74, 및 P75에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 1의 서열에 대해 E83, S85, A86, M89, L92, E94, N95, E96, K97, V98, 및 V99에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 H44, P48, A52, D53, L55, S57, N68, S69, V70에서의 돌연변이, N71 다음의 P의 삽입, S72, K73, I74, A77, 및 V80에서의 돌연변이를 포함한다.

한 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, 및 V80A의 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33, P36, H39, S85, M89, L92, E94, E96, K97, 및 V99에서의 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 각각의 아미노산 V33I, P36K, H39A, S85N, M89, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I의 돌연변이를 포함한다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 V33I, P36K, H39A, H44D, P48S, A52N, L54M, S56M, N68H, V70M, S72E, K73E, K73 다음의 Y의 삽입, I74V, 77AP, S85N, M89V, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I의 돌연변이를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 1의 서열에 대해 V33I, P36R, H39A, H44D, P48S, A52N, L54M, S56M, N68H, V70M, S72E, K73E의 돌연변이, K73 다음의 Y의 삽입, I74V, 77AP, S85N, M89V, L92F, E94D, E96S, K97N, 및 V99I의 돌연변이를 포함한다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP4이다. 특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이는 서열 2의 V35, P38, G39, Q41, F43, Y44, 및 H46에서의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP4는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 2에 대해 P50, A54, D55, H56, L57, N58, S59, N61, V65, T67, N70, S71, V72, N73, S74, S75, I76, 및 P77에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP4는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 2의 E85, S87, A88, M91, L94, E96, K97, V98 및 V99에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP5이다. 특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 돌연변이는 서열 3의 I56, E59, G60, A62, F64, Y65, 또는 D67에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 3의 S71, F72, N75, A76, H77, M78, N79, A80, N82, V86, T88, H91, L92, M93, F94, P95, D96, H97, V98, 또는 P99에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 3의 K107, N109, A110, V113, F116, D118, S119, S120, N121, V122, 또는 I123에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP6이다. 특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 돌연변이는 서열 4의 I57, K60, G61, A63, N65, Y66, 또는 D68에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP6은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 4의 S72, N76, A77, H78, M79, N80, A81, N83, V87, T89, H92, L93, M94, N95, P96, E97, Y98, V99, 또는 P100에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP6은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 4의 K108, N110, A111, V114, F117, D119, N120, S121, N122, V123, 또는 I124에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP7이다. 특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 돌연변이는 서열 5의 I57, E60, G61, A63, Y65, Y66, 또는 E68에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP7은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 5의 A72, F73, N76, S77, Y78, M79, N80, A81, N83, V87, T89, H92, F93, I94, N95, P96, E97, T98, V99, 또는 P100에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP7은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 5의 Q108, N110, A111, V114, F117, D119, S120, S121, N122, V123, 또는 I124에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP에 상응하는 야생형 BMP는 BMP8이다. 특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 돌연변이는 서열 6의 I57, Q60, G61, S63, Y65, Y66, 또는 E68에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP8은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 6의 S72, F73, D76, S77, C78, M79, N80, A82, N83, L87, S89, H92, L93, M94, M95, P96, D97, A98, V99, 또는 P100에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP8은 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 6의 K108, S110, A111, V114, Y117, D118, S119, S120, N121, N122, V123, 또는 I124에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

특정 실시양태에서, 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 돌연변이는 서열 7의 I27, K30, E31, E33, Y35, 또는 E36에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP9는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 돌연변이는 서열 7의 F42, F43, A46, D47, D48, V49, T50, P51, K53, V57, T59, H62, L63, K64, F65, P66, T67, K68, V69, 또는 G70에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP9는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이, 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 타입 IIB 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다. 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 돌연변이는 서열 7의 K78, S80, P81, V84, K87, D89, M90, G91, V92, P93, 또는 T94에서의 적어도 하나의 돌연변이이다.

디자이너 BMP의 예시적인 아미노산 서열을 아래 표 7에 제시한다. 표 7은 설계된 분자의 명칭 및 서열을 보여준다.

상기 나열된 디자이너 BMP가 본 발명의 실시양태를 구성하지만, 본 발명은 어떠한 방식으로도 임의의 구체적인 분자로 제한되지 않는다. 대신에, 본 발명은 변경된 수용체 결합을 포함하는 임의의 디자이너 BMP를 포함하고, 여기서 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 A 내의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 훨씬 더 바람직하게는, 디자이너 BMP는 타입 I 수용체 결합 도메인 내의 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함하고, 가장 바람직하게는, 디자이너 BMP는 타입 II 수용체 결합 도메인 B 내의 또 다른 적어도 하나의 추가의 돌연변이를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 상기 기재된 서열 중 하나에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 8-73의 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 8-73 중 임의의 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP의 아미노산 서열은 서열 8-73의 서열 중 하나로 이루어진다.

추가로, 한 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 12의 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 12의 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 BMPE이다.

추가의 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 14의 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 14의 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 BMPG이다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 36의 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 36의 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 BMPGE이다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 서열 37의 서열에 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 37의 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 BMPGER이다.

본 발명의 디자이너 BMP는 상기한 서열의 임의의 하나의 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 디자이너 BMP 단편은 서열 8-73의 서열 중 임의의 하나의 서열로부터 적어도 차단되지 않은 20, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 43, 44, 45, 47, 50, 53, 54, 56, 58, 60, 62, 66, 68, 70, 71, 74, 77, 80, 83, 85, 88, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100, 102, 105, 108, 110, 112, 115, 117, 119, 120, 121, 122, 또는 125개의 아미노산 서열의 단편을 포함할 수 있다.

BMP가 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단에서 종종 불균일하다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 즉, 본 발명은 디자이너 BMP의 C 및/또는 N 말단으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는, 9개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는, 8개의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 7개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 6개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 4개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 3개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 2개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는, 아미노 및/또는 카르복실 말단에 아미노산 결실/말단절단을 포함하는 디자이너 BMP를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 8-73의 서열 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하고 단백질의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 결실/말단절단을 추가로 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 8-73 중의 임의의 서열의 아미노산 서열을 포함하는 BMP 단백질로부터 유래된 디자이너 BMP 단백질을 포함하고, 여기서 단백질은 디자이너 BMP 단백질 아미노산 서열의 C 및/또는 N 말단으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 9개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 8개의 아미노산 잔기, 더욱 더 바람직하게는 7개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 6개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 5개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 4개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 3개의 아미노산 잔기, 훨씬 더 바람직하게는 2개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하는, 아미노 및/또는 카르복실 말단에 아미노산 결실/말단절단을 포함한다.

글리코실화에 의해 매개된 변경된 수용체 친화도를 갖는 BMP 의 구조 설계

본원에 개시된 데이터는 글리코실화되지 않은, 이. 콜라이에서 생산된 BMP2 동종이량체 (본원에서 "이. 콜라이 BMP2"로 칭함)가 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포에서 생산된 글리코실화된 BMP2 (본원에서 "CHO BMP2"로 칭함)보다 활성이 작음을 입증한다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 이. 콜라이에서 생산된 BMP6 동종이량체가 포유동물 세포 배양액에서 생산된 BMP6 동종이량체에 비해 본질적으로 비-기능성임을 추가로 입증한다.

본원에 개시된 데이터는 타입 I 수용체 결합 영역에서 CHO BMP2에 비해 이. 콜라이 BMP2의 결정 구조에 유의한 변이가 존재함을 입증한다.

한 실시양태에서, 디자이너 BMP는 글리코실화에 의해 매개되어 결합 모티프에 영향을 주고, 이는 다시 타입 I 수용체에 대한 변경된 결합을 매개하는 변경된 입체형태를 포함한다. 이것은 포유동물 (예를 들어, CHO) 세포에서 생산된 야생형 BMP2에서 D53는 수용체 계면을 향하고, H54는 수용체로부터 멀어진다는 본 발명의 발견을 기초로 한다. 이것은 D53 잔기가 수용체 계면으로부터 멀어지고 H54 잔기가 수용체를 향해 배열되고, 도 3에 도시된 바와 같이 프롤린 잔기에 대해 적층되어 분명히 "도어스톱"으로서 작용하는 이. 콜라이에서 생산된 BMP2와 대조적이다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 완전히 글리코실화되고 활성을 보이는 CHO 생산 BMP6이 또한 도입되는 수용체를 향하는 히스티딘 잔기, 즉, 히스티딘 "도어스톱"을 포함함을 처음으로 입증한다.

임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 본원에 개시된 데이터는 수용체 계면으로부터 멀리 이동하는 "도어스톱" 잔기가 BMP 리간드와 그의 수용체 사이의 증가된 결합을 매개할 수 있음을 처음으로 제안한다. 데이터는 추가로 도어스톱 잔기 자체가 도어스톱을 제거하기 위해 돌연변이될 수 있거나 또는 도어스톱 잔기의 위치를 옮기기 위해서 다른 잔기가 돌연변이될 수 있음을 입증한다. 추가로, 본원에 개시된 데이터는 다른 잔기가 돌연변이되어 "글리칸 테더"를 제공할 수 있고, 이는 다시 글리칸의 테더링이 도어스톱 잔기를 재배향시키도록 글리칸을 배향시킬 수 있음을 추가로 입증한다.

따라서, 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 글리칸 테더에 영향을 주고/주거나 히스티딘 도어스톱 구조를 제거하여 변경된 수용체 결합을 갖는 디자이너 BMP를 제공하는 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 도입함으로써 생산될 수 있다.

요약하면, 일부 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 변경된 타입 I 및/또는 타입 II 수용체 결합을 부여하는 BMP의 타입 I 및/또는 타입 II 결합 도메인에 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, BMP 서열은 조작된 또는 "디자이너" BMP의 수용체 결합 및/또는 골형성 활성을 변경하고 개선하기 위해 BMP의 수용체 친화도를 변경하도록 조작된다. 한 실시양태에서, 상기 조작은 타입 I 및 타입 II 수용체 결합에 관련되는 잔기를 확인하고, 이를 특히 디자이너가 그로부터 유래되는 모 BMP보다 더 높은 친화도를 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두에 대해 보이는 디자이너 BMP 분자를 생성하기 위해 교체하는 것을 수반한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 새로운 아르기닌 "글리칸 테더"를 생성하거나 또는 타입 I 수용체 결합 도메인을 재형성하기 위해 존재하는 것을 파괴하는 돌연변이를 포함한다. 즉, BMP2의 R16에 동등한, 제1 시스테인으로부터 2개 잔기만큼 C-말단인 위치에서 아르기닌으로의 돌연변이는 글리칸 사슬이 BMP 표면 상에 "테더링되도록" 하고 따라서 돌연변이가 결여된 야생형 BMP에 비해 예비-나선 루프 영역의 입체형태를 변경하는 것으로 보인다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 디자이너 BMP는 BMP와의 추가의 결합으로부터 타입 I 수용체를 차단하는 "도어스톱" 잔기를 변경하거나, 생성하거나, 파괴하는 (폐기하는) 적어도 하나의 돌연변이를 포함할 수 있다. 즉, 디자이너 BMP 내의 H54, 또는 그의 상응하는 동등한 잔기의 돌연변이는 타입 I 수용체와 디자이너 BMP의 상호작용을 방해하거나 증가시키도록 맞춰진다.

일부 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP에 존재하는 돌연변이가 아르기닌 "글리칸 테더"의 생성 및/또는 폐기를 매개하도록 디자이너 BMP의 입체형태에 영향을 준다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 디자이너 BMP 내의 히스티딘 도어스톱 입체형태를 생성하거나 제거/폐기하는 변경된 입체형태를 매개하고, 여기서 상기 도어스톱 입체형태는 각각 상응하는 야생형 BMP에서 존재하지 않거나 활성을 갖는다.

따라서, 당업자는 본원에서 제시되는 내용을 통해 TGFβ 수퍼패밀리 멤버 내의 아르기닌 "글리칸 테더" 및/또는 히스티딘 "도어스톱"의 존재 또는 부재는 본원에서 예시되는 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는, 단백질의 구조 분석을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 평가할 수 있음을 이해할 것이다. "도어스톱" 잔기의 존재가 확인되면, 적어도 하나의 돌연변이가 히스티딘을 수용체 결합 계면으로부터 멀리 재배향하도록 분자 내에 도입될 수 있다. 별법으로, 존재할 경우 히스티딘 "도어스톱"의 억제 효과가 감소되거나, 보다 바람직하게는 제거되도록, "글리칸 테더"를 생성하거나 향상시킬 돌연변이가 도입될 수 있다.

한 실시양태에서, TGFβ 수퍼패밀리 멤버가 BMP2일 경우, 히스티딘 도어스톱을 제거하는 돌연변이는 H54의 또 다른 아미노산으로의 치환이다. 일부 실시양태에서, H54는 알라닌, 글리신, 세린, 또는 트레오닌으로 교체된다.

본 발명이 BMP2에 대한 상기 "도어스톱"-제거 돌연변이를 개시하지만, 당업자는 당업계의 지식을 기초로 하여 다른 TGFβ 수퍼패밀리 멤버에 대한 상응하는 돌연변이를 확인하고 "도어스톱" 결여 돌연변이체를 쉽게 생산하는 방법, 즉, 결합 계면에 대면하거나 그 내로 돌출됨으로써 수용체 결합을 방해하는 잔기를 제거하거나 재배향시키는 방법을 이해할 것이다. 단백질 입체형태에 대한 돌연변이의 효과는 본원에 개시된 것 (이로 제한되지 않음)과 같이 단백질의 구조 분석을 위해 당업계에서 인정되는 임의의 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 별법으로, 도어스톱을 제거하고 타입 I 수용체에 대한 리간드 결합을 증가시킬 수 있는 돌연변이는 당업계에 이용가능한 컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 인 실리코 (in silico)로 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 수용체 계면에 존재하는 히스티딘 "도어스톱" 잔기가 결여되기 때문에 타입 I 수용체와 개선된 결합을 갖는 TGFβ 수퍼패밀리 멤버의 설계를 포함한다.

본 발명은 당업자에게 아르기닌 글리칸 테더를 생성하거나 파괴하는 다른 TGFβ 패밀리 멤버에 대한 돌연변이의 확인 방법에 대한 이해를 추가로 제공한다. 테더가 결여된 단백질에 아르기닌 글리칸 테더를 부가하는 돌연변이가 본 발명에 의해 고려된다. 따라서, 본 발명은 타입 I 수용체 결합 도메인의 입체형태를 변경하는 아르기닌 글리칸 테더를 보유하기 때문에 타입 I 수용체와의 개선된 결합을 갖는 TGFβ 수퍼패밀리 멤버의 설계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 히스티딘 도어스톱을 제거하여 글리칸 테더의 필요성을 제거하면, 생물학적 활성을 유지하면서 글리코실화 없이 생산될 수 있는 디자이너 BMP가 제공된다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 글리코실화 활성이 포유동물 세포와 상이하거나 존재하지 않는 세포, 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 점균류 세포 내에서 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 이. 콜라이에서 생산되고 생물학적 활성을 유지할 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 글리코실화가 결여되거나 또는 포유동물 세포에 의해 생산된 것과 상이한 변경된 글리칸이 생산되도록 변경된 글리코실화를 포함하는 세포에서 생산될 수 있는 BMP의 설계 및 생산 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 수용체 결합을 손상시키거나 억제할 도어스톱 잔기를 제거하는 돌연변이를 도입하는 방법을 포함한다. 당업자는 본 발명의 교시내용을 통해 수용체-리간드 계면에 대해 악영향을 주는 도어스톱 잔기가 완전히 제거되도록 그 잔기가 돌연변이될 수 있거나 또는 그 잔기가 계면으로부터 멀리 배향되도록 다른 돌연변이가 도입될 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 다른 돌연변이는 글리칸의 입체형태를 변경하고 이에 의해 도어스톱 잔기가 결합 계면으로부터 멀리 배향되도록 리간드의 입체형태를 변경하는 글리칸 테더를 제공하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

디자이너 BMP 를 코딩하는 핵산

본 발명은 또한 본원에서 설명되는 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에서 설명되는 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 제조될 수 있다.

한 예에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 전체적인 유전자 합성, 또는 야생형 또는 변형된 BMP를 코딩하는 핵산의 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 제조된다. 주형-유도 (directed) 라이게이션, 반복 (recursive) PCR, 카세트 돌연변이 유발, 부위-지정 돌연변이 유발 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Strizhov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:15012-15017 (1996)]; [Prodromou and Perl, Prot. Eng. 5:827-829 (1992)]; [Jayaraman and Puccini, Biotechniques 12: 392-398 (1992)]; 및 [Chalmers et al., Biotechniques 30: 249-252 (2001)] 참조).

따라서, 본 발명의 실시양태는 본 발명의 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 8 내지 66의 아미노산 서열 중의 하나를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 12의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 12의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 표 8에 제시된 BMPE의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 14의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 14의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 표 8에 제시된 BMPG의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 36의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 36의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 표 8에 제시된 BMPGE의 아미노산 서열을 코딩한다.

다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 37의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 디자이너 BMP 단백질을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 표 8에 제시된 BMPGER의 아미노산 서열을 코딩한다.

디자이너 BMP를 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열을 아래 표 8에 제시한다. 표 8은 코딩되는 단백질의 명칭 및 그 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 일반적으로, 성숙 단백질 코딩 서열은 아래 나열된 서열의 뉴클레오티드 847에서 시작한다.

다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 74-139에 제시된 핵산 서열 중의 하나 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 표 8에 제시된 핵산 서열 중의 하나 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 74-139에 제시된 임의의 서열의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 서열 74-139의 핵산 서열 중의 임의의 하나의 핵산 서열로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 78의 핵산 서열, 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자 서열 78의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 BMPE를 코딩하는 서열 78의 핵산 서열로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 80의 핵산 서열, 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 80의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 BMPG를 코딩하는 서열 80의 핵산 서열로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 102의 핵산 서열, 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 102의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 BMPGE를 코딩하는 서열 102의 핵산 서열로 이루어진다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 103의 핵산 서열, 또는 그의 단편에 적어도 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산 분자는 서열 103의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 BMPGER을 코딩하는 서열 103의 핵산 서열로 이루어진다.

디자이너 BMP 의 생산 방법

BMP는 긴 전구도메인, 하나 이상의 절단 부위, 및 성숙 도메인을 포함하는 전구단백질로서 천연적으로 발현된다. 상기 전구단백질은 이어서 세포 기구에 의해 프로세싱되어, 일반적으로 이량체성 성숙 BMP 분자를 생성한다. 일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 유사한 방식으로 생산된다. 전구도메인은 BMP의 접힘 및 프로세싱에서 기능하는 것으로 생각된다. 또한, 일부 BMP에서, 전구도메인은 성숙 단백질에 비공유 방식으로 결합하고, 용해도 향상제, 샤페론, 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, BMP는 봉입체로부터 직접 생산되거나 재접힘된 성숙 도메인으로서 생산될 수 있다. 다른 실시양태에서, BMP는 화학적 합성 또는 단백질 생산을 위한 임의의 다른 공지의 방법을 통해 생산된다.

한 실시양태에서, 디자이너 BMP는 화학적 합성 방법, 비제한적인 예를 들어 당업계에 공지된 합성 방법을 사용하여 생산된다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 전체적인 유전자 합성, 또는 야생형, 디자이너, 또는 변이체 BMP를 코딩하는 핵산의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 제조된다. 방법은 주형 유도 라이게이션, PCR, 카세트 돌연변이 유발, 부위-지정 돌연변이 유발, 제한 효소 소화 및 라이게이션, 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 기술을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Prodromou et al., Protein Eng 5:827-9 (1992)]; [Jayaraman et al., Biotechniques 12:392-8 (1992)]; [Chalmers et al., Biotechniques 30:249-52 (2001)]; 및 [Sambrook and Russell, In: Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)] 참조).

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조한다. 다양한 숙주 세포에 대한 수많은 종류의 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 당업계에 공지되어 있다. 발현 벡터는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 종결인자 신호, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는 전사 및 번역 조절 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 중지 서열을 포함한다. 추가로, 발현 벡터는 그를 2개의 유기체에서 유지되도록 허용하는 추가의 요소, 예컨대 2개의 복제 시스템을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 염색체외 벡터 또는 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 게놈 내로의 통합을 촉진하기 위해 숙주 세포의 게놈에 상동성인 적어도 하나의 서열을 함유한다. 벡터 통합을 위한 구축물은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 안정하게 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하는 선택가능 마커 유전자를 포함한다. 선택 마커 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 사용된 숙주 세포에 따라 상이하다.

발현 벡터는 숙주 세포로부터 디자이너 BMP의 분비를 제공하는 분비 리더 서열 또는 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 적합한 분비 리더 서열 및 신호 펩티드는 당업계에 공지되어 있다.

디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 디자이너 BMP가 핵산으로부터 발현되도록 숙주 세포 내에 단독으로 또는 발현 벡터와 조합되어 도입될 수 있다. 도입 방법은 주로 숙주 세포 종류에 따라 좌우된다. 형질감염/형질전환의 예시적인 방법은 CaPO₄ 침전, 리포솜 융합, 전기천공, 바이러스 감염, 덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 원형질체 융합, 직접 미세주사, 및 당업계에 공지된 다른 방법을 포함한다. 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있거나 또는 세포질 내에 일시적으로 또는 안정적으로 존재할 수 있다.

디자이너 BMP를 발현시키기 위한 적절한 숙주 세포는 효모, 박테리아, 고세균, 진균, 곤충, 및 동물 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는, 야생형 또는 천연 BMP를 발현하기 위해 적합한 임의의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 사카로미세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 293 (예를 들어, 293-T 및 293-EBNA), BHK, CHO (예를 들어, CHOK1 및 DG44), COS, 주르카트 (Jurkat), NIH3T3, 또는 C2C12 세포이다. 다른 적합한 세포는 ATCC 카탈로그에서 찾을 수 있다. 디자이너 BMP는 식물 및 동물을 포함하고 이로 제한되지 않는 보다 복잡한 유기체에서 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는, 예컨대, 디자이너 BMP 핵산을 포함하는 발현 벡터 이외의 다른 외인성 핵산을 함유하도록 추가로 유전자 조작될 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 디자이너 BMP의 발현을 유도하거나 야기하기에 적절한 조건 하에 디자이너 BMP를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 생산한다. 디자이너 BMP 발현에 적절한 조건은 천연 또는 야생형 BMP를 발현시키기 위해 적절한 것으로 공지된 것과 동일한 조건이다. 이들 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 상이할 것이고, 통상적인 실험을 통해 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 발현 후에 정제 또는 단리될 수 있다. 표준 정제 방법은 전기영동, 분자, 면역학적, 및 크로마토그래피 기술, 예컨대 이온 교환, 소수성, 친화도, 및 역상 HPLC 크로마토그래피, 및 크로마토포커싱을 포함한다. 적합한 정제 기술의 일반적인 지침은 문헌 [Scopes, In: Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 3^rd Ed. (1994)]에서 볼 수 있다. 필요한 정제 정도는 목적하는 용도에 따라 상이할 것이고, 일부 경우에는정제가 불필요할 것이다.

박테리아 세포로부터의 정제는 봉입체 내의 BMP의 발현 및 CHAPS/고염 시스템에서의 후속적인 재접힘 단계를 거칠 수 있다. 포유동물 세포로부터의 정제는 셀루핀-술페이트 및 역상 크로마토그래피 칼럼을 통한 2단계 정제를 수반할 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 공유 또는 비-공유 변형될 수 있다. 공유 변형은 단백질의 표적화된 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 단백질에 도입될 수 있다. 최적 변형 부위는 육안 검사, 구조 분석, 서열 분석, 및 분자 모의실험을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 기준을 사용하여 선택할 수 있다.

일부 실시양태에서, 디자이너 BMP는 적어도 하나의 요소, 동위원소, 또는 화학적 화합물로 표지될 수 있다. 표지는 동위원소 표지, 예컨대 방사성 또는 중금속 동위원소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 면역 표지, 예컨대 항체 또는 항원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 착색 또는 형광 표지, 예컨대 플루오레세인일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지는 비오틴, 태그 (예를 들어, FLAG, Myc, His)일 수 있다.

디자이너 BMP는 단백질에 결합하는 항체 또는 단백질을 정제할 때 또는 스크리닝 검정에서 결합을 검출할 때 사용하기 위해 디자이너 BMP를 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합시키는 이중기능적 물질로 유도체화될 수 있다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종이관능성 이미도에스테르, 예를 들어 디숙신이미딜 에스테르, 예컨대 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 이중기능적 말레이미드, 예컨대 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프랄린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 아미노 기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다. 그러한 유도체화는 용해도, 흡수, 혈액 뇌 관문을 통한 전달, 혈청 반감기 등을 개선할 수 있다. 디자이너 BMP의 변형은 단백질의 임의의 가능한 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 상기 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980)]에 개시되어 있다.

디자이너 BMP의 또 다른 종류의 공유 변형은 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 단백질을 다양한 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 연결하는 것을 포함한다. 다양한 커플링 화학이 당업계에 공지된 바와 같이 PEG 부착을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 디자이너 BMP는 단백질을 CovX-바디 (body) 링커를 통해 CovX-바디 항체, 예컨대 미국 특허 5,733,757, 및 미국 특허 공개 US 2009/0098130에 기재된 CovX-바디에 연결하는 것을 포함한다. 그러한 CovX-바디는 개선된 안정성 및 연장된 혈청 반감기를 포함하고 이로 제한되지 않는 개선된 특성을 보일 수 있다.

디자이너 BMP 의 수용체 결합 활성의 검정 방법

디자이너 BMP의 수용체 결합 활성은 야생형 BMP의 활성을 평가하기 위해 사용된 임의의 방법을 이용하여 평가할 수 있다.

하나 이상의 BMP 수용체에 대한 디자이너 BMP의 친화도는 수용체 결합 검정에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, ALK-2, ALK-3, ALK-6, ActRII, ActRIIb, 또는 BMPRII에 대한 친화도를 결정할 수 있다. 적합한 결합 검정은 ELISA, 형광 이방성 및 강도, 섬광 근접 검정 (SPA), 비아코어 (Pearce et al., Biochemistry 38:81-89 (1999)), 델피아 (DELFIA) 검정, 및 알파스크린(AlphaScreen)™ (퍼킨엘머 (PerkinElmer)로부터 상업적으로 입수가능함; 문헌 [Bosse R., Illy C, and Chelsky D (2002)])을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

일부 실시양태에서, 비아코어 또는 표면 플라스몬 공명 검정을 이용한다 (예를 들어, 문헌 [McDonnell, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:572-577 (2001)] 참조). 비아코어 실험은 그의 수용체에 대한 TGF-β 이소형의 결합을 특성화하기 위해 이전에 사용되었다 (문헌 [De Crescenzo et al., J. Biol. Chem., 276:29632-29643 (2001)]; [De Crescenzo et al., J. Mol. Biol. 328: 1173-1183 (2003)]).

다른 실시양태에서, 플레이트-기반 직접 결합 검정이 하나 이상의 BMP 수용체에 대한 하나 이상의 변형된 BMP의 친화도를 결정하기 위해 사용된다. 상기 방법은 BMP를 항-BMP 모노클로날 항체를 사용하여 포획한 후, BMP 수용체-Fc 융합 단백질을 사용하여 검출하는 변형된 샌드위치 ELISA이다.

다른 실시양태에서, 수용체 및 억제제 결합을 특성화하기 위해 알파스크린™ 검정 (Bosse R. et al., Principles of AlphaScreen™, PerkinElmer Literature Application Note Ref #4069, http://lifesciences.perkinelmer.com/ Notes/S4069-0802.pdf (2002))을 이용할 수 있다. 또한, 형광 검정이 수용체 및 억제제 결합을 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, BMP2 또는 BMP2 수용체 또는 억제제는 형광 염료로 표지될 수 있다 (적합한 염료의 예에 대해서는 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes) 카탈로그를 참조한다). 추가로, 섬광 근접 검정 (SPA)이 수용체 결합 친화도를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, BMP 수용체-Fc 융합체는 단백질 A 코팅된 SPA 비드 또는 플래시-플레이트 (flash-plate)에 결합하고, S35-표지된 BMP로 처리될 수 있고; 결합 사건은 광을 생성한다.

특정 실시양태에서, 특이적 BMP 돌연변이체의 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 K_D는 인간 IgG-Fc에 대한 수용체 세포외 도메인 융합을 사용하여 결정할 수 있다. 수용체는 항-인간-IgG-Fc 센서를 사용하여 옥텟 센서에 결합될 수 있고, BMP는 Kon 및 Koff 레이트를 결정하기 위해 용액 내의 수용체 세포외 도메인에 결합할 수 있다. 옥텟 시스템은, 생체분자 상호작용의 실시간 무표지 분석을 가능하게 하고 친화도, 운동학 및 농도에 대한 정보를 제공하기 위해 독점권이 있는 바이오레이어 간섭법 (BioLayer Interferometry; BLI)를 이용한다. 단백질이 옥텟 센서에 결합할 때, 센서를 통과하는 광은 파장 이동을 보이고, 이것은 분광광도계로 측정될 수 있다. 이동 비율은 분석물이 센서에 결합하고 결합을 상실할 때 측정된다.

디자이너 BMP 의 골형성 활성의 검정 방법

디자이너 BMP의 골형성 활성은 야생형 BMP의 활성을 평가하기 위해 사용된 임의의 방법을 이용하여 평가할 수 있다.

BMP는 많은 종류의 세포의 성장 및 분화를 촉진한다. 분화는 예를 들어 알칼리성 포스파타제에 대한 발광 리포터 또는 비색 시약, 예컨대 알시안 블루 (Alcian Blue) 또는 PNPP를 사용하여 모니터링할 수 있다 (문헌 [Asahina et al. (1996) Exp. Cell Res., 222:38-47]; [Inada et al., (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:317-322]; [Jortikka et al., (1998) Life Sci. 62:2359-2368]; [Cheng et al., (2003) J. Bone Joint Surgery 95A:1544-1552]).

또한, 래트 지아 (limb bud) 연골 분화 검정을 사용하여 1차 세포에서 활성을 모니터링할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 리포터 유전자 또는 키나제 검정을 사용할 수 있다. BMP는 JAK-STAT 신호 전달 경로를 활성화하기 때문에, STAT-반응성 리포터, 예컨대 GFP 또는 루시퍼라제를 함유하는 BMP 반응성 세포주를 사용할 수 있다 (Kusanagi et al. (2000) Mol Biol. Cell., 11:555-565). 예를 들어, 신장 세포에서 BMP 활성은 세포-기반 검정을 사용하여 결정할 수 있고; 예를 들어 문헌 [Wang and Hirschberg (2004) J. Biol. Chem., 279:23200-23206]을 참조한다.

골형성 활성은 세포 기반 검정, 예컨대 알칼리성 포스파타제, BRE-루시퍼라제, 또는 알리자린 레드 (Alizarin red) 무기질화 (mineralization)로 측정될 수 있고, 이 모두는 문헌 [Isaacs et al., Mol. Endocrinol. 24:1469-1477 (2010)]에 기재되어 있다.

골형성 활성은 또한 생체 내에서, 래트 이소성 골 검정 또는 포유동물 골 성장 모델을 통해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 골형성 활성은 비-인간 영장류 모델에서 측정된다. 이들 모델은 문헌 [Isaacs et al., Mol. Endocrinol, 24:1469-1477 (2010)]에 기재되어 있다.

골 질량 및 품질의 평가 방법은 당업계에 공지되어 있고, X-선 회절; DXA; DEQCT; pQCT, 화학적 분석, 밀도 분별화, 조직광도측정 (histophotometry), 조직형태계측 (histomorphometry), 및 예를 들어 문헌 [Lane ei al., J. Bone Min. Res. 18:2105-2115 (2003)]에 기재된 조직화학적 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 피질성 골 밀도를 측정하기 위한 1개의 검정은 마이크로CT (MicroCT) 검정이다. pQCT 측정 후에, 마이크로CT 평가는 예를 들어 대퇴골에 대해 스캔코 (Scanco) mCT40 (스캔코 메디칼 아게 (Scanco Medical AG))을 사용하여 수행할 수 있다.

골 성장/밀도/강도를 평가하기 위한 임의의 공지의 또는 추후 개발될 시험관내 또는 생체내 방법을 사용하여 본 발명의 디자이너 BMP의 골형성 활성을 평가할 수 있다.

제약 조성물

본 발명의 디자이너 BMP는 제약 조성물의 일부로서 그를 필요로 하는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 비경구, 경구 또는 국소 투여할 수 있다. 설계된 BMP가 목적하는 조직 부위에 국소, 예컨대 주사에 의해, 또는 전신, 예컨대 정맥내, 피하, 근내, 안와내, 눈, 심실내, 두개내, 관절낭내, 척수내, 수조내, 복강내, 구강내, 직장, 질내, 비내 또는 에어로졸 투여에 의해 투여되는 경우에, 조성물은 바람직하게는 수용액을 포함한다. 용액은 바람직하게는 포유동물에 대한 그의 투여가 포유동물의 정상적인 전해질 및 유체 부피 균형에 대해 유해한 영향을 주지 않도록 생리학상 허용되는 것이다. 따라서, 수용액은 예를 들어 정상적인 생리식염수 (0.9% NaCl, 0.15M) (pH 7-7.4)를 포함할 수 있다.

경구 또는 비경구 전신 투여에 유용한 용액은 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990)]에 기재된 제약 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 제제는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물 기원의 오일, 수소화 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 직접 투여를 위한 조성물은 특히 글리세롤 및 고점도의 다른 조성물을 포함할 수 있다.

생체적합성, 바람직하게는 생체재흡수성 중합체, 예를 들어, 히알루론산, 콜라겐, 제3인산칼슘, 폴리부티레이트, 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 및 락타이드/글리콜라이드 공중합체는 생체 내에서 디자이너 BMP의 방출을 제어하는 유용한 부형제일 수 있다. 본원에서 설명되는 디자이너 BMP에 대한 다른 잠재적으로 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포솜을 포함할 수 있다. 흡입 투여를 위한 제제는 부형제로서, 예를 들어 락토스를 함유할 수 있거나, 또는 예를 들어 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 또는 데옥시콜레이트를 함유하는 수용액, 또는 점비액의 형태로 또는 비내 적용되는 겔로서 투여하기 위한 오일상 용액일 수 있다.

별법으로, 본원에서 설명되는 바와 같이 확인된 디자이너 BMP2 및 BMP6을 포함하는 본 발명의 디자이너 BMP는 경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP의 액체 제제는 표준 실무, 예컨대 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" (상기 문헌)]에 기재된 것에 따라 제조될 수 있다. 이어서, 상기 액체 제제를 투여를 위해 음료 또는 또 다른 식품 보충제에 첨가할 수 있다. 경구 투여는 이들 액체 제제의 에어로졸을 사용하여 달성될 수 있다. 별법으로, 당업계에서 인정되는 유화제를 사용하여 제조된 고체 제제는 경구 투여에 적합한 정제, 캡슐 또는 로젠지로 제조될 수 있다.

임의로, 디자이너 BMP는 목적하는 조직에 의한 단백질의 흡수를 향상시키기 위한 수단을 포함하는 조성물 내에 제제화될 수 있다. 예를 들어, 테트라사이클린 및 디포스포네이트 (비스포스포네이트)는 포유동물에 전신 제공될 때 특히 골 재형성 대역에서 골 무기질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 그러한 성분은 본 발명의 디자이너 BMP를 골 조직으로 전달하는 것을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 목적하는 표적 조직, 예컨대 세포 표면 항원에 특이적으로 결합하는 접근가능한 물질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 일부도 사용될 수 있다. 원하는 경우에, 상기 특이적 표적화 분자는 예를 들어 산 불안정성 결합, 예컨대 Asp-Pro 연결을 생성하기 위해 화학적 가교결합에 의해 또는 표준 유전 공학 기술을 사용하여 본 발명의 디자이너 BMP에 공유 결합될 수 있다. 유용한 표적화 분자는 예를 들어 미국 특허 5,091,513의 교시내용에 따라 설계될 수 있다.

또한, 일부 디자이너 BMP가 담체 매트릭스, 즉, 불용성 중합체 매트릭스와 조합될 때 생체 내에서 최고 수준의 활성을 보일 수 있음이 고려된다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,266,683 참조). 현재 바람직한 담체 매트릭스는 특성상 이종성, 동종성 또는 자가성 (autogenic)이다. 그러나, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리부티르산, 그의 유도체 및 공중합체를 포함하는 합성 물질도 적합한 담체 매트릭스를 생성하기 위해 사용될 수 있음이 고려된다. 바람직한 합성 및 천연적으로 유래되는 매트릭스 물질, 이의 제조, 이를 본 발명의 디자이너 BMP와 함께 제제화하는 방법, 및 투여 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에서 상세하게 논의되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 5,266,683을 참조한다.

특정 실시양태에서, 디자이너 BMP는 단독으로 또는 조직 형태형성에 유익한 효과를 갖는 것으로 알려진 또 다른 물질과 조합되어 그를 필요로 하는 포유동물에게 투여될 수 있다. 그러한 물질 (본원에서 보조인자)의 예는 조직 복구 및 재생을 촉진하고/하거나 염증 또는 섬유증을 억제하는 물질을 포함한다. 골다공증 개체에서 골 조직 성장을 자극하기 유용한 보조인자의 예는 예를 들어 비타민 D3, 칼시토닌, 프로스타글란딘, 부갑상선 호르몬, 덱사메타손, 에스트로겐 및 IGF-I 또는 IGF-II를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 신경 조직 복구 및 재생에 유용한 보조인자는 신경 성장 인자를 포함할 수 있다. 다른 유용한 보조인자는 증상-완화 보조인자, 예를 들어 방부제, 항생제, 항바이러스제 및 항진균제, 진통제 및 마취제를 포함한다.

디자이너 BMP는 바람직하게는 제약상 허용되는 비독성 부형제 및 담체와 혼합되어 제약 조성물로 제제화된다. 상기한 바와 같이, 상기 조성물은 전신, 예를 들어, 비경구 투여를 위해 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로; 경구 투여를 위해 특히 정제 또는 캡슐의 형태로; 또는 비내 투여를 위해 특히 분말, 점비액 또는 에어로졸의 형태로 제조할 수 있다. 조직 표면에 대한 부착이 요구되는 경우에, 조성물은 피브리노겐-트롬빈 분산제 또는 예를 들어 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 PCT US91/09275에 개시된 다른 생체접착제를 포함할 수 있다. 이어서, 조성물은 목적하는 조직 표면에 바르거나, 분무되거나 또는 다른 방식으로 적용될 수 있다.

투여될 때, 본 발명의 제약 조성물은 일반적으로 발열원을 함유하지 않는 생리학상 허용되는 형태로 전달된다. 추가로, 조성물은 바람직하게는 골 연골 또는 조직 손상의 부위로 전달하기 위해 봉입되거나 점성 형태로 주사될 수 있다. 상처 치유 및 조직 복구를 위해 국소 투여가 적합할 수 있다. 바람직하게는, 골 및/또는 연골 형성을 위해, 조성물은 발생하는 골 및 연골에 대한 구조를 제공하고 최적으로 체내로 재흡수될 수 있는, BMP 단백질을 골 및/또는 연골 손상의 부위에 전달할 수 있는 매트릭스를 제공한다. 그러한 매트릭스는 다른 이식되는 의료 용도로 현재 사용되는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용상 외형 및 계면 특성을 기초로 한다. 디자이너 BMP 조성물의 특정 용도는 적절한 제제를 규정할 것이다. 조성물에 대한 잠재적인 매트릭스는 생분해성이고, 화학적으로 규정된 황산칼슘, 제3인산칼슘, 히드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안히드라이드일 수 있다. 다른 잠재적인 물질은 생분해성이고, 생물학상 잘 규정된, 예컨대 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진다. 다른 잠재적인 매트릭스는 비생분해성이고, 화학적으로 규정된, 예컨대 소결 히드록시아파타이트, 생체유리, 알루미네이트, 또는 다른 세라믹이다. 매트릭스는 임의의 상기 언급된 종류의 물질의 조합물, 예컨대 폴리락트산 및 히드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 제3인산칼슘으로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 공극 크기, 입자 크기, 입자 형상 및 생분해성을 변경하기 위해서 조성, 예컨대 칼슘-알루미네이트-포스페이트 및 프로세싱에서 변경될 수 있다.

투여 요법은 디자이너 BMP 단백질의 작용을 변경하는 다양한 인자를 고려하여 담당의에 의해 결정될 것이다. 이들 인자는 비제한적으로 형성이 요구되는 골 중량, 골 손상의 부위, 손상된 골의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 종류, 환자의 연령, 성별, 및 섭생, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 포함한다. 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스의 종류에 따라 상이할 수 있다. 최종 조성물에 대한 다른 공지의 성장 인자, 예컨대 IGF I (인슐린 유사 성장 인자 I)의 추가도 투여량에 영향을 줄 수 있다. 경과는 골 성장 및/또는 복구의 주기적 평가에 의해 모니터링할 수 있다. 골 성장 또는 복구를 평가하는 하나의 방법은 많은 당업계에서 인정되는 방법 중에서 x-선 영상화 및/또는 CT 스캐닝에 의해 실시된다.

조성물은 치료 유효량, 예를 들어 목적하는 효과를 유도하기 위해 충분한 시간 동안 표적 조직에 디자이너 BMP의 적절한 농도를 제공하는 양으로 인간 또는 다른 포유동물에게 비경구 또는 경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 모르포겐-연관 생물학적 반응, 예컨대 노화 조직 (예를 들어, 골감소성 골 조직)에 대한 조직-특이적 기능의 유지 또는 조직-특이적 표현형의 회복 또는 조직에서 섬유증 반응의 억제 또는 역전에 대한 포유동물의 필요성을 완화하거나 경감시킨다.

당업자가 이해할 바와 같이, 치료 조성물에서 설명되는 화합물의 농도는 투여할 약물의 투여량, 사용되는 화합물의 화학적 특징 (예를 들어, 소수성), 및 투여 경로를 포함하는 많은 인자에 따라 상이할 것이다. 투여되는 약물의 바람직한 투여량은 또한 질환의 종류 및 정도, 조직 손실 또는 결함, 특정 환자의 전체 건강 상태, 선택된 화합물의 상대적인 생물학적 효능, 화합물의 제제, 제제 내의 부형제의 존재 및 종류, 및 투여 경로와 같은 변수에 따라 결정될 수 있다.

일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 비경구 투여를 위해 약 0.1 내지 10% w/v 화합물을 함유하는 수성 생리학적 완충제 용액 내에 제공될 수 있다. 일반적인 용량 범위는 약 10 ng/kg 내지 약 1 g/kg (체중)/일이고; 바람직한 용량 범위는 약 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg (체중)이다.

치료 용도

디자이너 BMP는 야생형 BMP가 유용한 임의의 적응증에 대해 또는 TGFβ 수퍼패밀리 멤버가 사용될 수 있는 임의의 방법에 사용될 수 있다. 디자이너 BMP는 골 및 연골 형태형성의 발생 캐스케이드를 유도하고 Smad 신호전달 경로를 유도하거나 매개할 수 있다. 디자이너 BMP는 상응하는 야생형 BMP보다 더 큰 골 질량, 골 강직도 및 골 밀도를 포함하고 이로 제한되지 않는 보다 큰 골 증대 및 복구를 유도한다. 따라서, 디자이너 BMP는 조직에서 골 형성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 디자이너 BMP는 신체의 다양한 위치에서 골 및 연골의 증식을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 무릎, 팔꿈치, 발목, 및 손가락과 같은 관절을 복구하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 관절염 또는 다른 연골 변성 질환으로 고통 받는 환자에서 연골을 재생하기 위해 유용할 수 있다. 추가로, 디자이너 BMP는 손상에 의한 연골 파열을 치료하기 위해 권고된다. 추가로, 디자이너 BMP는 환자에서 골 성장의 유도를 위해 유용하다. 예를 들어, 디자이너 BMP는 골절 또는 절골, 골다공증으로 고통받는 환자, 또는 척추 고정이 필요한 환자의 치료 또는 척추, 척추골 등의 복구에 사용하기 위해 권고된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 골 증대 및/또는 복구의 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 치료 유효량의 디자이너 BMP를 검출가능한 골 증대 또는 복구를 매개하는 부위에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 Smad 발현을 유도하거나 증가시키는 방법을 포함한다. 방법은 Smad 매개 발현 경로를 포함하는 세포를 본 발명의 디자이너 BMP와 접촉시키는 것을 포함한다.

디자이너 BMP는 골 또는 연골과는 상이한 포유동물 내의 다양한 조직에 대해 골 형태형성 및 조직 형태형성의 발생 캐스케이드를 유도할 수 있다. 상기 형태형성 활성은 전구 세포의 증식 및 분화를 유도하는 능력, 및 골, 연골, 비-무기질화된 골격 또는 결합 조직, 및 다른 성체 조직의 형성을 유도하는 사건의 진행을 통해 분화 표현형을 지지하고 유지하는 능력을 포함한다.

예를 들어, 디자이너 BMP는 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/하거나 골 질량을 증가시키는 치료를 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용하여 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/하거나 골 질량을 증가시키는 치료를 위한 일반적인 방법은 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,674,844에 개시되어 있다. 또한, 디자이너 BMP는 손상 부위, 예컨대 절골, 골절, 및 연골 파열의 골 또는 연골을 교체하거나 복구하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명의 디자이너 BMP는 치주 조직 재생을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 치주 조직 재생을 위한 일반적인 방법은 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,733,878에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 간 재생을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 간 재생을 위한 일반적인 방법은 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 5,849,686에 개시되어 있다. 디자이너 BMP는 만성 신부전의 치료를 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 만성 신부전의 치료를 위한 일반적인 방법은 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,861,404에 개시되어 있다. 디자이너 BMP는 중추신경계 허혈증 또는 외상 후의 기능적 회복을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 중추신경계 허혈증 또는 외상 후의 기능적 회복을 향상시키기 위한 일반적인 방법은 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,407,060에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 수지상 성장을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 수지상 성장을 유도하기 위한 일반적인 방법은 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,949,505에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 신경 세포 부착을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 신경 세포 부착을 유도하기 위한 일반적인 방법은 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,800,603에 개시되어 있다.

디자이너 BMP는 파킨슨 질환의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있다. 골형성 단백질을 사용한 파킨슨 질환의 치료 및 예방을 위한 일반적인 방법은 그 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 6,506,729에 개시되어 있다.

상기한 다양한 치료 용도를 위해 본 발명의 변형된 BMP를 사용하는 일반적인 방법을 변경하는 것은 당업자의 기술 범위 내에 포함된다. 본 발명의 변형된 BMP의 치료 용도의 예시적인 실시양태를 아래에 추가로 설명한다.

디자이너 BMP는 이환된 또는 손상된 포유동물 조직의 복구를 위해 사용될 수 있다. 복구되는 조직은 바람직하게는 평가되고, 과량의 괴사 또는 방해하는 상처 조직은 수술, 화학적, 제거 또는 의학에 공지된 다른 방법에 의해 필요에 따라 제거된다. 이어서, 디자이너 BMP는 수술에 의한 이식 또는 주사에 의해 멸균 생체적합성 조성물의 일부로서 조직 로커스에 직접 제공될 수 있다. 별법으로, 변형된 BMP-자극된 전구 세포를 함유하는 멸균 생체적합성 조성물이 조직 로커스에 제공될 수 있다. 이환되거나 손상된 로커스에 존재하는 조직은 전구 세포의 증식 및 조직-특이적 분화를 허용하기 위해 적절한 매트릭스를 제공한다. 추가로, 손상된 또는 이환된 조직 로커스, 특히 수술 수단에 의해 추가로 침습된 것은 형태형성적으로 허용되는 환경을 제공한다. 일부 조직에 대해, 변형된 BMP의 전신 제공이 충분할 것으로 생각된다.

디자이너 BMP는 손상 후에 상처 조직 형성을 방지하거나 실질적으로 억제하기 위해 사용될 수 있다. 디자이너 BMP가 새로 손상된 조직 로커스에 제공되면, 이것은 로커스에서 조직 형태형성을 유도하고, 비-분화된 결합 조직 내로의 이동하는 섬유모세포의 응집을 방지할 수 있다. 디자이너 BMP는 바람직하게는 손상 5시간 내에 조직 로커스 내로 주사되는 멸균 제약 제제로서 제공된다.

예를 들어, 디자이너 BMP는 부분적인 간절제술 후에 실질적으로 손상된 간 조직의 단백질-유도된 형태형성을 위해 사용될 수 있다. 상기 일반적인 프로토콜에 대한 변경은 다른 조직을 위해 사용될 수 있다. 일반적인 방법은 조직의 본질적으로 비재생되는 부분을 절제하고, 변형된 BMP를, 바람직하게는 가용성 제약 제제로서 절제된 조직 로커스에 제공하고, 상처를 폐쇄하고, 향후 부위를 조사하는 것을 수반한다. 골과 마찬가지로, 간은 태아기 후 동안 손상시에 재생 가능성을 갖는다.

또 다른 예로서, 디자이너 BMP는 또한 상아질발생을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 지금까지, 손상에 대한 치아 속질 조직의 예측불가능한 반응이 치의학에서 기본적인 임상 문제이다. 표준 치과 수술 절차를 이용하여, 샘플 치아의 속질 바로 위의 사기질 및 상아질을 제거하고 (드릴에 의한 천공에 의해), 치아머리 속질 조직의 부분적 절단을 수행함으로써 치아 속질의 작은 영역 (예를 들어, 2 mm)을 수술에 의해 노출시키고, 지혈을 유도하고, 치아 속질 치료를 수행하고, 및 표준 절차에 의해 구멍을 밀봉 및 충전을 수행할 수 있다.

본 발명의 디자이너 BMP는 섬유증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 섬유증은 다양한 신체 부위에 위치할 수 있고, 특정 종류일 수 있고, 예를 들어, 섬유증은 신장 (예를 들어 사구체신염, 당뇨병성 신병증, 동종이식 거부, 및 HIV 신병증에서 관찰되는 섬유증); 간 (예를 들어, 경변증, 및 정맥-폐쇄성 질환); 폐 (예를 들어, 특발성 섬유증 (및 자가면역 섬유증)); 피부 (예를 들어, 전신 경화증, 켈로이드, 반흔, 및 호산구증가증-근육통 증후군); 중추신경계 (예를 들어, 안내 섬유증); 심혈관계 (예를 들어, 혈관 재협착); 코 (예를 들어, 비강 폴립증); 골 또는 골수; 내분비 장기; 및 위장관계에 위치할 수 있다.

한 실시양태에서, BMP7의 결합 특징, 또는 그의 유용한 변형 (연장된 반감기, 야생형 BMP7에 비해 동일하거나 상이한 수용체에 대한 결합 친화도 증가, BMP7 길항제, 비제한적인 예를 들어 노긴 등에 의한 억제에 대한 내성)을 갖는 디자이너 BMP는 섬유증을 치료, 개선 또는 역전시키기 위해 유용할 수 있다. 즉, 최근에 문헌 [Weiskirchen et al., 2009, Frontiers in Biosci. 14:4992-5012]에서 검토된 바와 같이, TGFβ₁은 상피-중간엽 이행을 포함하고 이로 제한되지 않는 증가된 섬유증을 유도하는 캐스케이드를 매개한다. TGFβ₁의 섬유증-유도 효과는 BMP7에 의해 억제 또는 역전될 수 있다. 또한, 문헌 [Loureiro et al., 2010, Nephrol. Dial. Transplant. 25:1098-1108]을 참조한다. 추가로, 특정 섬유증 병태는 또한 BMP4의 투여에 의해 치료 또는 개선될 수 있다 (문헌 [Pegorier et al., 2010, Resp. Res. 11:85] 참조). 따라서, 본 발명은 수용체 결합을 변경하고, 섬유증의 치료를 필요로 하는 환자에서 섬유증의 치료를 위한 잠재적인 유용한 치료제를 제공하기 위해 BMP7 프레임워크를 기초로 하고/하거나 본원에 개시된 타입 I 및 타입 II 돌연변이를 포함하는 디자이너 BMP를 포함한다.

섬유증 장애는 다음을 포함하는 많은 원인에 의해 유도될 수 있다: 화학요법, 예를 들어, 블레오마이신, 클로람부실, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 무스틴, 또는 프로카르바진 치료로 인한 폐 섬유증; 사고 또는 방사선 요법에서와 같이 의도적인 방사선 노출, 예를 들어 방사선에 의한 간질성 폐 질환 (ILD); 환경 또는 산업 인자 또는 오염물질, 예컨대 화학물질, 연기, 금속, 증기, 기체 등, 예를 들어, 석면증 또는 석탄 가루에 의한 ILD; ILD를 유발할 수 있는 약물 또는 약물의 조합, 예를 들어, 항생제 (예를 들어 페니실린, 술폰아미드 등), 심혈관 약물 (예를 들어, 히드랄라진, 베타 차단제 등), CNS 약물 (페니토인, 클로르프로마진 등), 소염 약물 (예를 들어, 금 염, 페닐부타존 등) 등; 면역 반응 장애, 예를 들어, 피부 섬유증이 있는 만성 이식편-대-숙주 질환; 질환 상태, 예컨대 ILD의 공지의 원인인 흡인 폐렴, 및 기생충 유발 섬유증; 및 상처, 예를 들어, 둔상, 수술에 의한 절개, CNS의 관통 손상과 같은 전투 상처 등.

특정 실시양태에서, 타입 I 수용체 ALK2에 대한 결합이 개선된 디자이너 BMP, 예컨대 BMPE는 ALK2에 관련된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

키트

본 발명은 애플리케이터 (applicator) 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 디자이너 BMP의 사용을 설명하는 사용 설명서와 함께 치료 유효량의 본 발명의 디자이너 BMP를 포함하는 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 키트를 아래에 설명하지만, 다른 유용한 키트의 내용물은 본 명세서에 비추어 당업자에게 명백할 것이다. 각각의 이들 키트는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 골 질량의 손실을 방지하고/하거나 골 질량을 증가시키는 치료를 필요로 하는 환자의 대사적 골 질환에서 골 질량의 손실을 방지하고/하거나 골 질량을 증가시키는 치료를 위한 키트를 포함한다. 키트는 본 발명의 디자이너 BMP를 포함한다. 키트는 환자에 대한 키트의 성분 투여를 위한 시린지, 골 시멘트 혼합 장치 등을 포함하고 이로 제한되지 않은 애플리케이터를 추가로 포함한다. 추가로, 키트는 환자에서 골 손실을 치료 또는 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위한 키트의 사용을 위한 관련 정보를 제시하는 사용 설명서를 포함한다.

보다 바람직하게는, 키트는 서열 8-73의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 항체로부터 선택된 적어도 하나의 디자이너 BMP를 포함하고, 훨씬 더 바람직하게는, 디자이너 BMP는 서열 12, 서열 14, 서열 36 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 디자이너 BMP는 BMPE, BMPG, BMPGE 및 BMPGER이다.

키트는 골 손실을 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위해 치료를 위한 임의의 수의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 상기 물질은 앞서 기재되어 있고, 특히 치료 화합물, 시토카인, 비타민, TGFβ 수퍼패밀리의 다른 구성원을 포함한다.

본 발명은 또한 디자이너 BMP를 골 손실을 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위해 효과적인 양 (예를 들어, 10 mg/kg 초과, 적어도 15 mg/kg, 또는 15 mg/kg)으로 포함하는 제조품 (예를 들어, i.v. 또는 경구 투여를 위해 적합하게 된 투여 형태)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제조품은 디자이너 BMP를 포함하는 용기(들) 및 골 손실을 치료 또는 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위해 사용하기 위한 라벨 및/또는 지시서를 포함한다.

본 발명은 또한 섬유증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에서 조직 또는 장기에서 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 본 발명의 디자이너 BMP를 포함한다. 키트는 환자에게 키트의 성분의 투여를 위한, 단백질을 전달하기 위한 시린지 또는 장치, 혼합 장치 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 애플리케이터를 추가로 포함한다. 추가로, 키트는 환자에서 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 사용을 위한 관련 정보를 기재한 사용 설명서를 포함한다.

보다 바람직하게는, 키트는 서열 8-73의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질로부터 선택된 적어도 하나의 디자이너 BMP를 포함하고, 훨씬 더 바람직하게는, 디자이너 BMP는 서열 12, 서열 14, 서열 36 및 서열 37의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 디자이너 BMP는 BMPE, BMPG, BMPGE 또는 BMPGER이다.

키트는 골 손실을 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키거나 또는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위해 치료를 위한 임의의 수의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 상기 물질은 앞서 기재되어 있고, 특히 치료 화합물, 시토카인, 비타민, TGFβ 수퍼패밀리의 다른 구성원을 포함한다.

본 발명은 또한 골 손실을 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위해 또는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위해 효과적인 양 (예를 들어, 1 mg/kg 초과, 적어도 10 mg/kg, 적어도 15 mg/kg, 또는 15 mg/kg)으로 디자이너 BMP를 포함하는 제조품 (예를 들어, i.v. 또는 경구 투여를 위해 적합하게 된 투여 형태)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 제조품은 디자이너 BMP를 포함하는 용기(들) 및 골 손실을 치료 또는 예방하고/하거나 골 질량을 증가시키기 위해 또는 섬유증을 치료 또는 예방하기 위한 라벨 및/또는 지시서를 포함한다.

본 발명을 다음 실험 실시예를 참조하여 추가로 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위해 제공되고, 달리 명시되지 않으면 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 결코 다음 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되고, 대신에, 본원에 제공된 교시내용의 결과로서 임의의 모든 변이를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

실시예

실시예 1

디자이너 BMP 단백질의 생산 및 정제

포유동물 세포 배양을 이용한 생산

표준 재조합 DNA 절차를 이용하여 야생형 및 디자이너 BMP를 생산하고 분비하는 재조합 숙주 CHO 세포를 생성하였다. 부착 세포 배양액으로부터 조건화 배지를 생성하였다. 간단히 설명하면, CHO 세포를 10% dFBS를 함유하는 배지 내에 접종하고, 3-4일 동안 거의 융합시까지 성장시켰다. 상기 성장기 후에, 성장 배지를 폐기하고, 세포를 PBS-CMF로 1회 세정하고, 후속적으로 200 ㎍/ml 덱스트란 술페이트, 2 mM 부티르산나트륨, 및 10 mM HEPES로 보충한 혈청-비함유 배지로 바꾸었다. 이어서, 세포를 7일 동안 31℃의 온도에서 배양하였다. 조건화 배지를 수거하고, 멸균화 0.2 μM 여과를 이용함으로써 청정화하였다. 조건화 배지를 정제시까지 -20℃에서 저장하였다.

디자이너 BMP 의 정제

CHO 세포 조건화 배지로부터 신규 디자이너 BMP 분자를 정제하기 위해, BMP를 통상적인 크로마토그래피의 2개 단계에 의해 포획하였고, 결과를 패널 A-D를 포함한 도 5에 제시한다. 모든 다른 신규한 디자이너 BMP는 본질적으로 유사한 방식으로 정제되므로, 단지 BMPE의 정제에 대한 상세한 내용을 본원에 제시한다.

CHO 조건화 배지 (CHO CM) (1.0 M 트리스(Tris) (pH 8.0)을 사용하여 pH를 8.0으로 조정하였다)를 20 mM MES (pH 8.0)로 평형화시킨 셀루핀 술페이트 칼럼 (65 ml, 2.6 x 12.3 cm) 상에 부가하였다. 칼럼을 10배 칼럼 부피 (CV)의 20 mM 트리스 (pH 8.0), 10 CV 50 mM MES (pH 5.6) 및 10 CV의 완충제 A (6.0 M 우레아, 50 mM MES, pH 5.6)로 세척하였다. BMP를 5 CV (완충제 B = 6.0 M 우레아, 50 mM MES, 1.0 M NaCl, pH 5.6)에 걸쳐 선형 0-1.0 M NaCl 구배로 용리하였다. 염화나트륨 구배의 적용 시에, BMP2의 특징적인 30 내지 45 mS/cm의 전도도의 넓은 피크가 관찰되었다 (도 5A). 분획들을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하고, BMP 함유 분획을 모았다. 분획 내의 BMP는 SDS-PAGE 비-환원 겔 상에서 환원가능한 이량체로서 확인되었다 (도 5B의 좌측 패널). 셀루핀 술페이트 크로마토그래피 단계로부터의 BMP 풀 (pool)을 10 x 250 mm Vydac 15 ㎛ C8 칼럼 (용매 A = 0.1% TFA, 용매 B = 90% 아세토이트릴, 0.1% TFA) 상에서 정제용 역상 HPLC에 의해 추가로 정제하였고, 여기서 BMP를 약 32% 아세토니트릴로 용리하였다. 역상 크로마토그래피 단계의 자취를 도 5C에 제시한다. 단백질을 농축하고, 스피드백 (speedvac)을 사용하여 아세토니트릴을 제거하고, 농축물을 투석을 통해 MFR-169 완충제 내로 제제화하였다. 정제된 BMP를 SDS-PAGE, A280 및 LAL 검정 (내독소)에 의해 특성 결정하였다. 동일한 겔 분획 (F13 내지 F18)을 보여주는 비-환원 SDS-PAGE 겔 (도 5D의 좌측 측면) 및 환원 SDS-PAGE 겔 (도 5D의 우측 측면)의 사진을 제시한다. 총 16개의 BMP 디자이너 단백질을 본질적으로 동일한 수준의 순도 및 0.3-1.4 mg/L CM의 발현/정제 수율로 정제하고, 그 결과를 사진을 보여주는 도 6에 제시한다 (도 6). 간단히 설명하면, 야생형 BMP2 (WT) 및 디자이너 BMP인 BMPSE, BMPE, E109R, BMPD, BMP S85R, BMP SNE, BMPB, 및 BMP-EN을 비-환원 겔 (도 6A) 및 환원 SDS-PAGE (도 6B)의 사진에 제시하고, 디자이너 BMP인 ai (BMPA의 변이체), aii (BMPA의 변이체), c (BMPC), hi (BMPI의 변이체), hii, i, f, 및 g를 비-환원 SDS-PAGE (도 6C) 및 환원 SDS-PAGE (도 6D)의 사진에 제시한다.

실시예 2

시험관내 및 생체내 검정을 이용하여 입증된 디자이너 BMP 의 골형성 활성

알칼리성 포스파타제 검정

96웰 플레이트 내의 약 8000개 C2C12 세포/웰을 지시된 BMP 및 지시된 용량으로 처리하였다. 처리 24시간 후에, 플레이트를 골형성 활성에 대해 당업계에서 인정되는 검정인 알칼리성 포스파타제의 측정을 위해 처리하였다. 배양 배지를 제거하고, 플레이트를 칼슘/마그네슘-비함유 PBS로 2회 세척하였다. 50 ㎕의 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 (4-MUP 액체 알칼리성 포스파타제 기질; 시그마 (Sigma) cat. # M3168)를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 암소에서 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 형광을 빅토르 (Victor) 광도계 (설정: 355 nm에서 여기; 460 nm에서 방출; 1120에서 CW 램프 에너지) 상에서 1초/웰로 측정하였다. 판독이 완료된 후에, 50 ㎕의 2x 단백질 검정 용해 완충제 (200 mM 트리스-HCl, pH 9.8/0.4% 트리톤 (Triton) X-100)를 각각의 웰에 첨가하고, 단백질 농도를 제조자의 마이크로플레이트 절차에 따라 BCA 단백질 검정 (피어스 (Pierce))를 이용하여 결정하였다. 이어서, 알칼리성 포스파타제 측정치를 총 단백질 농도에 대해 표준화하였다 (즉, 단백질 1 마이크로그램당 형광 단위). 도 7의 그래프에 제시된 바와 같이, 다수의 디자이너 BMP 분자로 처리한 C2C12 근육 전구 근육모세포는 야생형 BMP2를 사용한 처리에 비해 골모세포 분화의 마커로서 유의하게 증가된 알칼리성 포스파타제 활성을 보였다 (작은 원이 있는 굵은 선). WT BMP2에 비해 증가된 AP 활성을 보이는 디자이너 BMP는 디자이너 BMPA, BMPF, BMPG, 및 BMPE를 포함하였다. 놀랍게도, 디자이너 BMPE는 고친화도로 BMP2의 타입 I 수용체 및 BMP6의 타입 II 수용체 모두에 결합하는 것으로 공지되어 있는 야생형 BMP2/6 이종이량체 (네모가 있는 굵은 선)의 것에 동등한 활성을 나타냈다. 디자이너 BMPE는 BMP6의 저친화도 타입 I 결합 영역을 BMP2 내로 도입한 결과물이다. 디자이너 BMPE 분자의 극히 높은 활성은 매우 놀라운 것이고, 그 이유는 BMPE가 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두에 대해 저친화도 결합을 가질 것으로 예측되었기 때문이다. 흥미롭게도, 다른 디자이너 BMP 분자, 즉 디자이너 BMPA, 디자이너 BMPF, 및 디자이너 BMPG는 BMP2 내로 도입된 BMP6의 타입 II (고친화도) 수용체에 결합하는 야생형 BMP6의 영역을 갖고 (도 1b 참조), 이들 디자이너 BMP는 BMP2에 비해 증가된 활성을 보이지만, 야생형 BMP2/6 이종이량체만큼 높지는 않았다 (도 7).

BRE - 루시퍼라제 검정

BMP-반응-요소 루시퍼라제 리포터 (요소는 Id1 프로모터로부터 유래됨)를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포를 96웰에 8000개 세포/웰로 첨가하고, 지시된 BMP 및 용량으로 처리하였다. 처리 48시간 후에, 세포를 용해하고, 루시퍼라제 활성을 프로메가 (Promega) 듀얼-글로(Dual-Glo) 검정 키트를 사용하여 판독하였다.

본원에 개시된 데이터는 BMPE의 활성이 알칼리성 포스파타제 검정에서 BMP-2/6의 것과 동등할 뿐만 아니라, 도 8에 제시한 바와 같이 C2C12 세포에서 BRE-루시퍼라제 검정에서 동등함을 입증한다. 추가로, BMPE는 BRE-루시퍼라제 검정에서 야생형 BMP-2에 비해 약 10-20배 더 큰 활성을 보였다 (도 8). 따라서, BRE-루시퍼라제 (BRE-luc) 검정에서 관찰된 결과는 상기 동일한 세포 종류에서 알칼리성 포스파타제 (Alk-phos) 활성 검정에서 얻은 것과 큰 상관관계가 있었다 (도 7 및 도 8 비교). 야생형 BMP2 및 지시된 디자이너 BMP에 대한 Alk-phos 및 BRE-luc 검정 둘 모두로부터의 결과를 또한 표 10에 제시한다.

임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 이들 데이터는 BMPE에 대한 고친화도 수용체로서 ALK-2의 추가가 그의 증가된 골형성 활성에 대한 이유일 수 있음을 시사한다. 이것은 ALK-2 돌연변이가 어린 아동에서 부적절한 이소성 골 형성을 야기하는 질환인 진행성 골화성 섬유이형성증 (FOP)을 야기하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 따라서, ALK-2 결합의 돌연변이는 증가된 골형성과 연관되고, BMPE의 증가된 골형성 활성과 상관관계가 있을 수 있다. 따라서, BMPE는 타입 I 수용체 ALK-2, 3, 및 6에 대해 고친화도를 갖는 새로운 부류의 BMP 분자이다.

세포 무기질화에 대한 알리자린 레드 염색

C2C12 세포를 6웰 조직 배양 플레이트에 4 x 10⁴개 세포/cm²의 밀도로 플레이팅하고, 5% CO₂/95% 가습 공기 인큐베이터에서 밤새 37℃에서 인큐베이션하였다. 회수기 후에, 배양 배지를 새로 제조된 골형성 분화 배지로 교체하였다: 성장 배지는 50 ㎍/ml L-아스코르브산 포스페이트 (L-아스코르브산 포스페이트 마그네슘염 n-수화물; 와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈 (WAKO Pure Chemical Industries); Cat. No. 013-12061); β-글리세롤 포스페이트 (β-글리세롤 포스페이트 이나트륨염, 10 mM 오수화물; 플루카 바이오케미카 (Fluka BioChemica) Cat. No. 50020); 및 100 nM 메나디온 중아황산나트륨 (비타민 K3; 시그마 Cat. No. M2518)을 함유하였다. 표시된 BMP를 적절한 웰에 목적하는 농도로 첨가하였다. 플레이트를 배지를 2 내지 3일마다 교체하면서 37℃에서 약 15일 동안 인큐베이션하였다. 세포를 간행된 표준 프로토콜에 따라 알리자린 레드 염료로 염색하였다.

아래 표 9에 제시한 바와 같이, 디자이너 BMPE는 알리자린 레드 염색에 의해 표시되는 바와 같이 상응하는 야생형 BMP2보다 훨씬 더 큰 정도로 C3H10T-1/2 마우스 중간엽 줄기 세포의 무기질화를 유도하였다. 즉, 아래에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 야생형 BMP-2가 C3H10T-1/2 세포의 무기질화를 유도할 수 없는 용량에서 (5, 25, 50, 및 100 ng/ml), BMPE 동종이량체는 모두 표 9에 제시한 바와 같이 BMP-2/6 이종이량체의 것과 유사한 강한 무기질화를 유도하였다. 따라서, 알리자린 레드 염색 검정 결과는 또한 본원에서 앞서 개시된 바와 같은 Alk-phos 및 BRE-luc 검정에서 얻어진 결과와 상관관계가 있다.

래트 근육내 이소성 골 검정

디자이너 BMP에 의해 시험관 내에서 관찰된 보다 강한 골형성 활성이 생체 내에서 유사한 증가된 활성에 상응하는지를 결정하기 위해, 래트 이소성 골 형성 검정을 수행하였다. 간단히 설명하면, 160 마이크로리터의 완충제 내의 지시된 총량의 디자이너 BMP로 함침된 ACS (흡수성 콜라겐 스폰지)를 8주령 수컷 롱 에반스 (Long Evans) 래트의 슬와부 내로 이식하였다. 보다 구체적으로, 3개의 8 mm 생검 천공 ACS 디스크를 비-재흡수가능 실크 봉합사로 함께 봉합하였다. 스폰지를 도 9의 도면에 나타낸 BMP의 양 (즉, 0.1 ㎍ 또는 0.5 ㎍)을 함유하는 160 마이크로리터의 BMP 용액으로 적셨다. 적신 스폰지를 실온에서 20분 동안 평형화시켰다. 이어서, 스폰지를 수술에 의해 각각의 래트의 슬와부 내에 양쪽으로 배치하였다. 각각의 BMP (야생형 및 디자이너 분자)를 4마리의 래트의 두 사지 내로 위치시켰다. 이식 2주 후에, 동물을 희생시키고, 슬와부를 절단하여 10% 포르말린 내에 넣고, 존재하는 이소성 골의 양을 결정하기 위해 μCT (스캐노 인크. (Scanco Inc.))로 스캐닝하였다. 처리한 동물의 사지에 존재하는 밀리그램 단위의 히드록시아파타이트의 양 (mg HA)을 도 9에 제시한다. 도 9A는 BMP2, BMPE 및 BMP2/6 이종이량체에 대한 결과를 보여준다. 도 9B는 BMP2, BMPG, BMPA, 및 BMPF에 대한 결과를 보여준다. 각각의 디자이너 BMP에 대해, 이소성 골은 야생형 BMP2가 검출가능한 골 질량을 형성할 수 없는 용량에서 형성되었다. 야생형 BMP2와 디자이너 BMPE의 직접 (head-to-head) 비교는 야생형 BMP2/6 이종이량체와 동일한 정도로 이소성 골을 유도할 수 있었고, 이것은 이전에 개시된 시험관내 실험에서 얻어진 결과와 근접하게 일치하였다. 디자이너 BMP인 BMPG, BMPA, 및 BMPF는 또한 야생형 BMP2에 비해 유의하게 더 높은 이소성 골 형성을 보였다 (도 9B). 상기 검정 결과를 도 9에 제시하고, 또한 표 10에 제시한다.

실시예 3

BMP 수용체 결합

디자이너 BMP의 증가된 골형성 활성의 메카니즘을 추가로 규명하기 위해서, 일군의 BMP 수용체를 사용한 각각의 디자이너 BMP의 결합 운동학 분석을 옥텟 시스템 (포르테바이오 (ForteBio, 미국 캘리포니아주 멘로 파크))을 이용하여 수행하였다. 옥텟 QK 분석을 0.1% 트윈 (Tween)-20이 존재하는 TBS에서 단계적으로 수행하였다. 샘플을 1000 rpm에서 교반하였다. 항-인간 IgG 옥텟 단부를 10 ㎍/mL의 각각의 수용체-인간-IgG1-Fc 융합 단백질로 20분 동안 포화시켰고, 이것은 일반적으로 일렬의 8개의 단부 내에 포화된 수용체의 포획 수준을 생성하였다. 각각의 BMP를 7배 연속 희석액 (일반적으로 단일의 200-3 nM) + 완충제 블랭크 (blank)로서 제조하였다. 각각의 수용체/BMP 결합쌍은 적어도 이중으로 시험하였다. 회합을 10분 동안 모니터링하고, 이어서 해리는 30분 동안 완충제 단독 내에서 이루어졌다. 동역학적 파라미터 (kon 및 koff) 및 친화도 (K_D)는 제조자의 지시에 따라 부분 결합 1:1 모델을 사용하여 옥텟 데이터 분석 소프트웨어 6.0을 사용하여 계산하였다.

표 12에 제시된 데이터는 야생형 BMP2 및 BMP6 단백질이 각각 타입 I (ALK-3 및 ALK-6) 및 타입 II 수용체 (ActRIIA, ActRIIB, 및 BMPRII)에 대해 예상된 고친화도 결합을 각각 나타내었음을 보여준다. 야생형 BMP2/6 이종이량체는 BMP2의 타입 II 결합 도메인 A 및 B가 야생형 BMP6의 도메인에 의해 교체된 디자이너 BMPG처럼 타입 I 및 타입 II 수용체의 두 군 모두에 대해 고친화도 결합을 보였다. 디자이너 BMPE는 타입 II 결합 영역 내에 돌연변이가 이루어지지 않았으므로, 예상된 바와 같이 타입 II 수용체에 대해 야생형 BMP2와 유사한 친화도를 보였다. 예기치 않게, BMP2의 것 대신에 치환된 BMP6의 타입 I 결합 도메인을 갖는 디자이너 BMPE는 타입 I 수용체 ALK-3 및 ALK-6에 대한 고친화도 결합을 유지하였고, 또한 2 nM의 K_D로 타입 I 수용체 ALK-2에도 예기치 않게 결합하였다. 따라서, BMPE는 놀랍게도 WT BMP2 또는 WT BMP6에서 관찰되지 않은, ALK-2에 대한 매우 높은 친화도 결합을 보였다.

표 13에 제시한 바와 같이, 각각 BMP-GEP (BMPGE P36으로도 칭함) 및 BMP-GER (BMPGE P36R로도 칭함)을 생산하기 위해, 서열 1에 제시된 바와 같은 야생형 BMP2의 아미노산 서열에 비해 아미노산 잔기 36에서 프롤린 또는 아르기닌 (P36R)을 포함하는 BMPG 및 BMPE의 돌연변이를 조합하면, ALK-2를 비롯한 모든 타입 I 및 타입 II BMP 수용체에 대해 고친화도, 낮은 nM K_D를 나타낸 디자이너 BMP가 생산되었다.

따라서, 본원에 개시된 데이터는 이들 신규한 디자이너 BMP들이 ALK2, ALK3, ALK6, ActRIIA, ActRIIB 및 BMPRIIA를 포함하고 이로 제한되지 않는 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두의 넓은 레퍼토리에 고친화도 결합을 나타내도록 BMP-G 및 BMP-E의 특질을 조합한 신규한 디자이너 BMP, 비제한적으로, 예컨대 BMP-GER 및 BMP-GEP를 입증한다. 데이터는 WT BMP2의 아미노산 서열 (서열 1)의 잔기 번호 36에서 프롤린을 아르기닌으로 교체하면 아미노산이 교체되지 않은 동일한 BMP만큼 효과적인 디자이너 BMP가 생산되었음을 추가로 입증하였다. BMP-GER로 예시되는 이들 신규한 골형성 BMP는 높은 수준의 생물학적 활성을 제공하여, 보다 낮은 투여량 및 일부 경우에 보다 신속한 골형성 반응을 허용하고, 이것은 이들 분자가 고도로 효과적인 치료제를 제공할 것임을 강하게 제안한다.

실시예 4

비-인간 영장류에서 생체내 골형성 활성

NHP 비골 절골 모델

본 발명의 신규한 디자이너 BMP의 잠재적인 치료 가능성을 추가로 평가하기 위해, 디자이너 BMPE 및 BMPG의 활성을 NHP (비-인간 영장류) 비골 절골 모델에서 야생형 BMP2에 비교하였다.

비골의 골간-중앙 절골술을 평균 체중 (및 표준 편차)이 7.5±0.2 kg이고 연령 범위가 7 내지 10년인 성체 수컷 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))에서 진동톱의 1-mm 톱날을 사용하여 양쪽으로 수행하였다. 보다 균일한 비틀림 생물기계적 시험을 위해 근위 및 원위 골 단부들의 정렬을 유지하기 위해 작은 수질내 커슈너 (Kirschner) 와이어를 앞에 설명한 비골 절골 모델에 첨가하였다. 상기 모델의 2가지 주요 이점은 수술의 낮은 이환율의 결과로서 양측 연구 설계를 이용하는 능력, 및 동물을 희생시킬 필요없이 후속적인 생물기계 및 조직학 평가를 위해 절골 부위를 포함한 비골의 6 내지 8-cm 절편을 제거할 수 있는 능력이다. 0.5 mg/ml의 야생형 또는 디자이너 BMP의 용액 500 ㎕을 30 mm X 15 mm ACS 스폰지에 첨가하였다. 스폰지를 수술 후 결손 둘레에 감쌌다. 골격이 성숙한 NHP의 각각의 사지의 비골의 약 2 mm 골절에 디자이너 BMP 분자를 0.5 mg/ml 용량 (총 250 ㎍이 전달됨)으로 또는 반대쪽 사지에 동일한 양의 야생형 BMP2를 포함하는 ACS 스폰지로 감쌌다. 따라서, 각각의 동물은 하나의 사지에 야생형 BMP를, 반대쪽 사지에 디자이너 BMP를 제공받았다.

상기 모델에서, 각각 상이한 부류의 디자이너 분자를 나타내므로 디자이너 BMPE 및 BMPG를 선택하였고; 여기서, 디자이너 BMPG는 타입 I 및 타입 II 수용체 둘 모두에 대해 고친화도를 보인 반면, BMPE는 타입 I 수용체 ALK-3 및 ALK-6에 고친화도로 결합하는 이외에 타입 I 수용체 ALK-2에 고친화도로 결합한다. 각각의 동물에서 야생형 BMP2로 처리한 반대쪽 사지의 치유에 비해 디자이너 BMP 분자로 처리한 사지의 치유를 비교하기 위해 방사선 사진을 2주마다 찍었다. 도 10a-10c에 제시한 바와 같이, 각각의 군으로부터 7마리의 동물을 포함하는 데이터는 야생형 BMP2로 처리한 사지에서 관찰된 골 형성에 비해 각각의 디자이너 BMP (도 10a에 제시된 BMPE 및 도 10b-10c에 제시된 BMPG) 분자로 처리한 사지에서 가골이 보다 일찍 및 보다 강력하게 형성되었음을 입증한다.

아래 표 14 및 15는 야생형 BMP2로 처리한 사지와 디자이너 BMPE로 처리한 사지 사이에서 관찰된 골 질량 및 골 부피의 차이의 정량적 평가를 제공하는 데이터를 제시한다. 도 11에 제시한 바와 같이, BMPE 투여는 야생형 BMP2 처리된 사지에서의 골 부피 증가에 비해 골 부피 (mm³)의 평균 33% 증가를 일으켰다. 상기 μCT 분석은 가골이 있는 모든 천연 골을 포함하였고, 따라서, BMP-E는 동일한 동물에서 BMP-2보다 훨신 더 강력하였다.

야생형 BMP2 에서 P36 의 아르기닌으로의 교체는 BMPGE 의 활성에 영향을 미치지 않았다

서열 1에 제시된 야생형 BMP2의 아미노산 서열에서 위치 36의 프롤린은 야생형 BMP2에 노긴 내성을 부여하고 증가된 골형성 활성을 제공하는데 중요한 것으로 알려져 있다 (예를 들어, WO 2009/086131 참조). 따라서, P36을 비-보존된 아미노산 치환으로 교체하는 것의 BMPGE의 신규한 활성에 대한 효과를 평가하기 위해, BMPGEP의 P36을 아르기닌으로 돌연변이시켜 BMPGER을 생산하고, 2개의 디자이너 분자의 골형성 활성을 시험관 내에서 평가하였다. 도 12에서 본원에 개시된 데이터는 P36을 아르기닌으로 교체하는 것 (P36R)은 신규한 BMP-GE 디자이너 BMP의 결합 친화도에 영향을 미치지 않고, BMPGEP 및 BMPGER 둘 모두가 BMP2/6 이종이량체만큼 활성이었음을 입증한다.

BMP - GER 은 BMP2 /6 이종이량체와 대등한 생체내 활성을 갖는다

도 13 및 14에 제시한 바와 같이, 래트 이소성 실험은 모든 분자가 ACS 스폰지 상에 전달될 때 0.25 ㎍의 총 BMP의 매우 낮은 용량에서 이소성 골의 형성을 추진할 때 BMP-GER이 BMP-2/6만큼 강력함을 보여준다. 도 13은 이소성에서 형성된 HA의 mg를 μCT 분석에 의해 정량할 때 단지 BMP-2/6 및 BMP-GER만이 상기 낮은 용량에서 BMP-2보다 유의하게 더 활성이었지만, BMPE 또는 BMPG는 그렇지 않았음을 보여준다.

동일한 샘플을 탈무기질화하고, 조직학에 의해 골 형성 (골 점수)에 대해 점수를 매기고, 이들 결과를 도 14에 제시한다. 상기 점수매김 방법에 의해, 0.25 ㎍의 낮은 용량에서 전달된 BMP-2는 골 형성을 유도하지 않고, BMP-GER 및 2/6은 최고 점수를 보였다. BMP-G 및 BMP-E는 또한 BMP-2보다 유의하게 더 강력하였지만, BMP-GER만큼의 활성을 보이지는 않았다.

골형성 및 조직 복구의 생체내 모델에서 BMP - GER 과 BMP -2의 비교

도 15 및 16은 BMP-2 및 BMP-GER의 활성을 비교하는, 중증 NHP 비골 절골 모델의 결과를 보여준다. 상기 모델에서, 폭이 약 4-6 mm인 설상을 NHP의 각각의 비골에 대해 제거하고, 제자리에 다시 넣고 티타늄 핀으로 유지하였다. 이어서, 결손을 0.5 mg/ml의 용량에서 250 ㎍의 총 BMP를 함유하는 ACS 스폰지로 감쌌다. 각각의 NHP에서, BMP-2를 하나의 사지에 넣고, BMP-GER을 반대쪽 사지에 넣었다. 도 15A는 6마리의 동물 중 4마리에서 결손을 보여주는, 5주에 찍은 방사선 사진을 보여준다. BMP-GER 사지는 BMP-2보다 유의하게 더 강력한 골 형성을 보였다. 도 15B (도면의 저변 패널)는 제10주에 이들의 희생 후에 동일한 4마리 동물의 비골의 μCT 영상을 보여준다. 제시된 바와 같이, 형성된 골의 양은 BMP2로 처리한 반대쪽 사지에서보다 BMP-GER 사지에서 훨씬 더 강력하다.

도 16A-C는 각각의 동물로부터 BMP-2 및 BMP-GER 처리한 사지를 비교하는, 강도, 강직도, 및 가골 골 부피를 비교하는 이들 사지의 분석을 보여준다. 평균적으로, BMP-GER 처리한 사지는 BMP-2 처리한 반대쪽 사지보다 21% 더 큰 파단 토크 (torque to break)를 필요로 하고 (도 16A), 24% 더 강직하고 (도 16B), 가골은 평균 55% 더 컸다 (도 16C). 이들 비교는 모두 대응표본 분석에 의해 0.01 미만의 p 값을 가졌다. 이들 데이터는 BMP-GER이 동일한 동물에서 BMP-2보다 골절 복구 및 골 형성을 유의하게 보다 일찍 및 보다 강력하게 유도하였음을 보여준다.

BMP - GER 은 NHP 모델에서 3배 더 낮은 용량에서 BMP -2와 동등한 골 형성을 유도하였다.

NHP에서 BMPE 골 형성의 유효성을 추가로 평가하기 위해, 설상 결손 검정에서 골형성을 유도하는 BMPE의 능력을 BMP2와 비교하였다. 도 17a-c는 3마리의 비-인간 영장류에서 설상 결손 모델 후에 골 형성의 방사선 사진을 보여주고, 여기서 인산칼슘 시멘트 기반 담체를 사용하여 1.5 mg/ml의 BMP-2를 하나의 사지에 사용하고, 단지 0.5 mg/ml의 BMP-GER을 다른 사지에서 사용하였다. 방사선 사진에서, 치유 및 골 형성은 처리가 고용량의 BMP-2이든 또는 보다 낮은 용량의 BMP-GER이든 각각의 동물에 대해 동등하였다. 따라서, 심지어 1/3의 용량에서도, BMPE는 골 형성을 유도하는데 있어서 BMP2와 동등하였고, 이것은 야생형 BMP2에 비해 상기 디자이너 BMP의 크게 증가된 활성을 입증한다.

실시예 5

BMP 구조 분석

결정화 BMP -2 및 BMP -6

정제된, 완전-글리코실화된 야생형 BMP2/6 이종이량체, 야생형 BMP2/2 동종이량체 및 야생형 BMP6/6 동종이량체 (각각 포유동물 세포에서 생산됨)를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 3.5) 내에서 6-10 mg/ml로 농축하고, 결정화 시도는 18℃에서 "모스키토 (mosquito)" 자동화 로봇 셋업 (TTP 랩테크 인크. (TTP LabTech Inc., 미국 매사추세츠주 캠브리지))을 사용하여 수행하였다. 각각의 이량체에 대한 초기 결정화 히트 (hit)를 얻고, 우수한 회절 품질의 결정을 얻기 위해 후속적으로 조건을 최적화하였다.

야생형 BMP2/6, BMP2/2 및 BMP6/6의 결정을 일시적으로 동결보호시키고 액체 질소 내에 동결시킨 후, 신크로트론 (synchrotron) 공급원 (개량 광자원 (Advanced Photon Source) SER-CAT의 ID 빔라인)에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 데이터는 정확한 결정 격자 종류를 추론하고 데이터를 통합/스케일링하기 위해 프로그램 Mosflm/Scala를 이용하여 처리하고 스케일링하였다. 해상도 및 단위 셀 파라미터를 다음과 같이 나열한다: BMP2/6은 비대칭 단위당 2개 카피의 이종이량체를 갖는 P4₃2₁2의 공간군에 속하고; 이것은 한 방향에서 2.8Å 및 다른 2개의 방향에서 3.0Å로 회절하였고, 여기서 단위 셀은 a=b=105.23Å, c=188.73Å, α=β=γ=90°이다. BMP2/2는 비대칭 단위당 2개 카피의 동종이량체를 갖는 P3₁의 공간군에 속하고; 이것은 2.7Å로 회절하였고, 여기서 단위 셀은 a=b=62.74Å, c=126.35Å, α=β=90°, γ=120°이다. BMP6/6은 비대칭 단위당 1개 카피의 동종이량체를 갖는 P3₁21의 공간군에 속하고; 이것은 2.6Å로 회절하였고, 여기서 단위 셀은 a=b=97.40Å, c=85.64Å, α=β=90°, γ=120°이다. BMP2/6 결정의 이방성 회절 성질 때문에, 고해상도 데이터의 기여를 보존하기 위해 데이터를 타원형 절단하고 이방성으로 스케일링하였다.

CHO BMP2/6, BMP2/2 및 BMP6/6의 구조를 탐색 모델로서 이. 콜라이 BMP2 (PDB 기탁: 1REW) 및 이. 콜라이 BMP6 (PDB 기탁: 2R52)를 사용하여, 프로그램 페이저 (Phaser)를 사용한 분자 치환 방법에 의해 결정하였다. 정확한 분자 치환 해답을 얻고 공간군을 확인한 후에, 페이저-계산된 전자 밀도 지도를 사용하여 탐색 모델의 품질을 평가하였고, 모델 편차 (model bias)를 피하기 위해 문제의 영역 (특히 타입 I 및 타입 II 수용체 결합을 수반하는 영역)을 재구축을 위해 본래의 모델로부터 벗겨냈다.

구조적 모델을 강체 (rigid-body) 정밀화에 이어, 모의 어닐링, 위치에 따른 및 온도 인자 정밀화를 수행하였다. 벗겨낸 영역은 생략 지도 (omit map)를 이용하여 재구축하였고, 정밀화가 안정화할 때까지 TLS 정밀화와 함께 공정을 반복하였다. 최종 정밀화 통계학은 다음과 같다: BMP2/6에 대해, Rw/Rf = 0.2231/0.2775, rmsd 결합 = 0.008, rmsd 각 = 1.545; BMP2/2에 대해, Rw/Rf = 0.2114/0.2659, rmsd 결합 = 0.005, rmsd 각 = 0.982; BMP6/6에 대해, Rw/Rf = 0.2170/0.2510, rmsd 결합 = 0.006, rmsd 각 = 1.182. 3개의 모든 구조는 프로체크 (Procheck) 결과에 기반하여 매우 우수한 기하학으로 존재한다.

CHO BMP2/6 결정 구조는 광범한 글리코실화를 보여주었다. 특히, 타입 I 수용체에 대한 중요한 결합 모티프인 CHO-생산된 BMP2의 나선-전 (prehelical) 루프는 이. 콜라이에서 생산되고 다시 접힌 BMP2의 상응하는 영역과 상이하다. 글리코실화의 존재 하에, CHO BMP2 루프는 보다 나선인, 박테리아에 의해 다시 접힌 BMP2 내의 동일한 영역에 비해 특유하게 "루프가 많은" 입체형태를 가진다 (Keller et al., Nat Struct Mol Biol 11:481-488 (2004)). 데이터는 도 3A에 제시한 바와 같이 CHO-생산된 BMP2의 D53이 수용체 계면을 향하는 반면, H54는 수용체로부터 멀리 향함을 보여주었다. 이. 콜라이 BMP2에서, D53은 수용체로부터 멀리 향하고, H54는 수용체를 향하여 줄을 이루어 (본원에서 "히스티딘 도어스톱"으로 칭함), 도 3B에 제시한 바와 같이 BMP2 타입 I 수용체 Alk3 상의 프롤린 잔기 (P45) 상에 적층된다 (H54는 H336으로 별도로 표지한다). 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 상기 적층물은 타입 I 수용체가 이. 콜라이 다시 접힌 BMP2에 충분히 결합하는 것을 방해하고, 이것은 CHO BMP2에 비해 이. 콜라이 BMP2의 감소된 결합 활성을 설명한다. 상기 구조적 특징을 도 3A-B에 예시한다. 이 도면에서, 히스티딘 54 (H54)는 H336으로서 번호를 매기고, 아스파라긴 56 (N56)은 N338로 표지하고, ALK3의 P45는 보다 암회색으로 제시한다.

도 4에 예시된 바와 같이, 완전 글리코실화된 CHO BMP6은 또한 수용체 결합 부위 내로 향하는 상기 "도어스톱" 히스티딘 잔기를 가진다. 상기 도어스톱 His 구조 모티프는 BMP 사이의 공통적인 구조적 특징이다 (CHO BMP2 제외) (예를 들어, 문헌 [Keller et al., Nat Struct Mol Biol 11:481-8 (2004)]; [Kotzsch et al., EMBO J 28:937-47 (2009)] 참조). 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, CHO BMP2의 특이적 글리칸이 아르기닌 16과의 광범한 수소 결합형성을 통해 연결될 수 있다 (R298로서 또한 지정된 "글리칸 테더"). 상기 글리칸 테더를 도 4A에 예시하고, 글리칸과 그의 상호작용을 글리칸 및 그의 테더 R298 (본원에서 R16으로도 칭함) 사이에 점선을 사용하여 도시한다. 따라서, 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 글리칸 테더는 달리 존재하면 히스티딘 도어스톱이 대신에 타입 I 수용체 계면으로부터 멀리 배향되어, 히스티딘 도어스톱의 존재하에서보다 더 큰 정도로 리간드가 수용체와 접촉하도록 허용하도록 BMP2 분자의 나선-전 루프의 입체형태를 안정화시키는 역할을 할 수 있다. 즉, CHO BMP2에서 관찰된 바와 같은 히스티딘 도어스톱의 재-배향은 아마도 글리칸 테더링의 결과인 것 같다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 본원에 개시된 데이터는 히스티딘 도어스톱이 존재하는 경우에, 글리코실화의 부재 하에 도어스톱의 제거 (즉, 수용체 계면으로부터 멀리 His의 배향을 변화시키는 돌연변이를 도입함으로써)가 타입 I 수용체와 BMP 리간드의 결합을 증가시킴을 제안한다.

BMP2의 저친화도 타입 II 결합 도메인 및 BMP6과 유사한 저친화도 타입 I 결합 도메인을 함유하는 디자이너 BMPE는 (1) 시험관내 및 생체내 검정 모두에서 증가된 골형성 활성을 보이고; (2) 저친화도 타입 I 수용체 결합 도메인의 존재에도 불구하고 Alk2, 타입 I 수용체에 결합하는 예상치 않은 기능 획득을 보여준다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 상기 놀라운 발견은 BMPE의 타입 I 수용체-결합 도메인 내에 글리칸 모이어티 및 R16 ("글리칸 테더") 사이에서 형성된 다수의 수소 결합에 의해 매개될 수 있는 것 같다. 상기 테더링 상호작용은 H54 ("도어스톱")를 계면으로부터 멀리 향하게 하여 BMP 및 수용체 사이에 보다 가까운 상호작용을 허용함으로써 Alk2에 대한 적합한 결합 표면을 제시하는 BMPE 분자의 나선-전 영역에서 구조적 재배열을 매개할 수 있다. 이와 반대로, 도 4B에 예시된 바와 같이, BMPE에 유사한 저친화도 타입 I 결합 도메인을 갖는 BMP6은 Alk2에 결합하지 않고, 이것은 그의 글리칸 모이어티를 테더링하기 위해 필요할 그의 "글리칸 테더" (R413)가 BMPE 테더 (R298/R16)에 비해 위치가 이동하기 때문이다. 따라서, BMP6에서, 글리칸은 테더링되지 않고, 도어스톱 (H454)은 리간드-수용체 계면으로부터 멀리 위치하지 않는다. "글리칸 테더"는 야생형 글리코실화 BMP2 (CHO 세포에서 생산된 BMP2로 예시되는 바와 같이)에 대한 특유한 현상인 것으로 보이고, "글리칸 테더"를 도입 (또는 제거)함에 의한 BMP의 나선-전 루프의 구조적 재형성은 이제, 최초로, 다른 BMP의 타입 I 수용체-결합 능력을 조정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 이제 본원에 제공된 교시내용을 알고 있는 당업자는 테더링이 H54 내의 이동을 매개하도록 글리칸 테더에 영향을 미침으로써 또는 H54를 멀리 흔드는 돌연변이를 도입함으로써 도어스톱을 수용체 계면으로부터 멀리 위치시키기 위해 BMP를 돌연변이시키는 방법을 이해할 것이고, 이들 교시내용이 그의 수용체에 대해 증가된 (또는 H54를 도어스톱 위치 내로 흔들기 위해 돌연변이가 도입되면 감소된) 결합을 갖는 BMP를 설계하기 위해 또는 이들이 이전에 결합하지 않았던 신규한 수용체에 결합하도록 기능 획득 돌연변이를 갖는 디자이너 BMP를 생성하기 위해 사용될 수 있음을 추가로 알 것이다. 아래에 보다 상세히 제시하는 바와 같이, 본 발명은 개선된 골형성 단백질을 설계하기 위해 상기 신규한 도어스톱/테더 설계 방법을 사용하는 방법을 보여준다. 따라서, 본 발명은 변경된 수용체 결합을 포함하는 개선된 골형성 단백질의 합리적인 설계를 위한 신규한 방법을 제공한다.

무엇이 ALK-2에 대한 BMP-E 및 BMP-GER 결합을 추진하는지를 보다 충분히 이해하기 위해, 및 도어스톱/글리칸 테더를 사용하여 수용체 결합에 영향을 미치는 상기 신규한 메카니즘을 추가로 해명하기 위해, BMP-E의 결정 구조를 밝히고 이를 BMP-2 및 BMP-6과 비교하였다. 핵심적인 구조적 발견을 도 18 및 19에 제시한다. 도 18에 예시한 바와 같이, BMP-E는 BMP-6의 중심 나선 구조를 유지하면서 BMP-2의 질서정연한 당을 유지한다. 도 18에 제시된 구조는 BMP-E 및 아마도 BMP-GER이 타입 I 수용체 결합의 중대한 영역에서 BMP-2 및 BMP-6과 상이함을 입증한다. 도 19는 BMPE (연회색) 및 BMP6 (암회색)의 잠재적인 His 도어스톱을 둘러싸는 영역을 비교하는 확대도이다. 상기 도면은 두 분자 내에서 히스티딘 및 아스파라긴의 정렬의 유사성을 나타내고, 또한 글리칸 위치선정에서 차이를 보여주고, R16 (테더)에 의한 BMPE 글리칸의 테더링을 나타내고, 이것은 BMP6에 대해 제공된 보다 짧은 글리칸 (암회색으로)에 비해 분석에 의해 BMPE에 대해 보다 긴 글리칸이 제공되도록 글리칸의 보다 경질 입체형태를 또한 유발한다.

BMP-E의 글리칸이 ALK-2와의 상호작용 및 그의 보다 높은 활성을 추진하는지 결정하기 위해, BMP-2, BMP-6 및 BMP-E를 당을 2개의 GlcNac 단위로 자르기 위해 Endo H로 처리하였다. ALK-2에 대한 BMP-E의 결합 친화도는 400 nM로 감소한 반면, ALK-3 및 ALK-6에 대한 그의 친화도는 여전히 3-6 nM 범위 내에 있고, 이것은 무손상 탄수화물이 상기 상호작용을 위해 극히 중요함을 보여준다. 상기 탈글리코실화 돌연변이체의 활성은 또한 유의하게 감소하였다. 도 20에 제시한 바와 같이, 상기 실험에서, Endo H 처리된 탈글리코실화 BMP-E 활성은 우측으로 이동하고, BMP-6 WT와 거의 동등하다. EC-50은 3 nM에서 약 50 nM로 이동한다. 이들 데이터는 BMP-E의 탄수화물이 그의 활성을 위해 필수적임을 보여주고, 이것은 단지 핑거 도메인만 상이하면서 BMP-2 내로 치환된 BMP-6의 정확한 동일한 영역을 가지므로 BMP-GER로 번역되어야 한다. 증가된 수용체 결합 및 골형성 활성을 위해 탄수화물이 필수적이므로, 이들 결과는 이. 콜라이 또는 글리코실화가 결핍되는 임의의 다른 시스템에서 BMP-E 또는 BMP-GER의 생산이 BMP-2 WT보다 뛰어난 활성을 갖는 BMP를 생산하지 않을 것임을 나타낸다.

결정화 BMP -E 및 BMP - GER

정제된, 완전-글리코실화된 BMP-E를 25 mM 아세트산나트륨 (pH 3.5) 내에서 8.7 mg/ml로 농축하고, 결정화 시도는 18℃에서 "모스키토" 자동화 로봇 셋업 (TTP 랩테크 인크. (미국 매사추세츠주 캠브리지))을 사용하여 수행하였다. 각각의 이량체에 대한 초기 결정화 히트를 얻고, 우수한 회절 품질의 결정을 얻기 위해 후속적으로 조건을 최적화하였다.

BMP-E의 결정을 일시적으로 동결보호시키고 액체 질소 내에서 동결시킨 후, 신크로트론 공급원 (개량 광자원 SER-CAT의 ID 빔라인)에서 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 데이터는 정확한 결정 격자 종류를 추론하고 데이터를 통합/스케일링하기 위해 CCP4 패키지에서 프로그램 Mosflm/Scala를 이용하여 처리하고 스케일링하였다. 해상도 및 단위 셀 파라미터를 다음과 같이 나열한다: BMPE는 각각의 비대칭 단위 내에 2개의 카피의 BMPE를 갖는 P4₃2₁2의 공간군에 속하고; 이것은 2.7Å로 회절되었고, 여기서 단위 셀은 a=b=67.78Å, c=148.01Å, α=β=γ=90°이다.

BMPE의 구조를 탐색 모델로서 완전 글리코실화된 CHO BMP2 및 BMP6 (둘 모두 화이자 (Pfizer)에서 결정됨)를 사용하여 프로그램 페이저를 사용한 분자 치환 방법에 의해 결정하였다. 정확한 분자 치환 해답을 얻고 공간군을 확인한 후에, 페이저-계산된 전자 밀도 지도를 사용하여 탐색 모델의 품질을 평가하고, 모델 편차를 피하기 위해 문제의 영역 (특히 타입 I 수용체 결합 및 글리코실화 주변의 영역)을 재구축을 위해 본래의 모델로부터 벗겨냈다.

BMPE의 구조적 모델을 강체 정밀화에 이어, 프로그램 페닉스 (Phenix)를 사용한 모의 어닐링, 위치에 따른 및 온도 인자 정밀화를 수행하였다. 벗겨낸 영역은 생략 지도를 이용하여 재구축하였고, 정밀화가 안정화할 때까지 TLS 정밀화와 함께 공정을 반복하였다. 최종 정밀화 통계학은 Rw/Rf = 0.2252/0.2840, rmsd 결합 = 0.006, rmsd 각 = 0.935이다. 구조는 프로체크 결과에 기반하여 매우 우수한 기하학으로 존재한다.

BMPE (BMP2의 잔기 44-80이 BMP6으로부터의 상응하는 영역에 의해 교체된 디자이너 분자)는 BMP6의 타입 I 수용체-결합 절편을 소유하면서 BMP2의 전체적 프레임워크를 유지한다. 도 21에 제시된 바와 같이, 결정 구조는, 그라프팅된 절편이 그 내부에서 "도어스톱" H54가 수용체를 향하는 나선-전 루프에서 작은 나선을 형성하는, BMP6에서와 유사한 입체형태를 여전히 유지함을 밝혔다. 그러나, 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, R16 및 E110^* (BMP-2의 E109) (둘 모두 제3 및 제4 글리칸 모이어티 (각각 β-만노스 및 α-만노스)와 다수의 수소 결합을 형성할 수 있다)에서 "글리칸 테더"의 존재로 인해, 연장된 글리코실화 사슬이 정확하게 CHO BMP2에서 보이는 바와 같이 단백질 표면에 부착된 것일 수 있다. 글리칸 사슬의 테더링은 또한 나선-전 루프를 총 프레임워크에 관하여 약 2Å 탈구시켰다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, BMP2-유사 글리코실화와 조합된 BMP6-유사 나선-전 루프는 정상적으로 BMP2 또는 BMP6과 상호작용하지 않는, Alk2 수용체에 대한 결합 에피토프를 제시한다는 놀라운 발견일 수 있다. 탈글리코실화는 BMPE가 Alk2에 결합할 수 없도록 하고, 이것은 BMPE에 대한 Alk2 인식을 매개하는데 있어서 글리코실화의 중요성을 강조한다.

실시예 6

노긴 내성

분비된 BMP 억제제 노긴에 대한 내성이 BMP-GER 또는 BMP-E의 활성을 증가시킬 것인지 조사하기 위해, 이들 잠재적인 치료 분자를 노긴에 대한 그들의 내성을 잠재적으로 증가시키도록 추가로 변형하였다. 최근에, 이. 콜라이-생산된 단백질에서, 액티빈-A의 C-말단 부분을 야생형 BMP2 내로 포함시키면 노긴 억제에 대한 내성을 증가시킨 것으로 입증되었다. WO 2010/099219의 예를 들어, 도 15 및 16을 참조한다. 따라서, 본원에 개시된 신규한 디자이너 단백질이 액티빈-A 서열의 첨가에 의해 추가로 더욱 개선될 수 있는지 결정하기 위해, 노긴 내성 (NR) 아미노산 서열을 BMP-E (서열 12) 및 BMP-GER (서열 37) 내로 치환하여 BMP-E-NR (서열 70) 및 BMP-GER-NR (서열 71)을 생산하였다. 도 22에 제시한 바와 같이, BMP-E-NR 및 BMP-GER-NR은 알칼리성 포스파타제 활성 검정에서 BMP-E 및 BMP-GER에 비해 동등한 시험관내 활성을 갖고, BMP-E 및 BMP-GER은 노긴에 감수성인 반면 노긴에 대해 완전히 내성이다.

BMPE-NR 및 BMP-GER-NR에 의해 시험관 내에서 나타난 노긴 내성에 대한 잠재적인 기초를 이해하기 위해, 타입 II 액티빈 수용체 ActRIIB에 대한 이들 분자의 결합 친화도를 평가하였다. 아래 표 16에 제시된 바와 같이, 액티빈-A는 노긴에 결합할 수 없지만, 노긴 내성 BMP-E-NR 및 BMP-GER-NR은 BMP-2, BMP-E, 또는 BMP-GER만큼 강하지는 않지만 노긴에 결합한다. 이들 데이터는 또한 노긴 내성 BMP가 타입 II BMP 수용체 ActRIIB에 BMP-GER보다 훨씬 더 높은 극히 높은 친화도로 결합함을 보여준다. 임의의 특정 이론에 매이기를 바라지 않지만, 이들 데이터는 노긴보다 BMP 타입 II 수용체에 대한 이들의 훨씬 더 높은 친화도 때문에 BMP-GER-NR 및 BMP-E-NR이 노긴에 내성이고, 따라서 심지어 다량의 노긴의 존재 하에서도 BMP 수용체에 결합할 수 있음을 제안한다.

액티빈-A의 노긴 내성 부분을 포함하는 BMP-E 및 BMP-GER 분자는 시험관 내에서 노긴 내성을 나타냈지만, 이들 결과는 개선된 생체내 활성에 상관되지 않았다. 즉, 이들 BMP-E-NR 및 BMP-GER-NR의 골형성 활성을 래트 이소성 검정에서 BMP-E 및 BMP-GER과 비교할 때, NR 분자가 훨씬 덜 강력하였다. 상기 데이터를 도 23 및 24에 제시한다. 보다 구체적으로, BMP-GER 및 BMP-GER-NR에 대한 골 점수를 비교하였고, 시험한 모든 농도 (0.125 ㎍, 0.25 ㎍, 0.5 ㎍ 및 1.0 ㎍)에서, BMP-GER은 도 23에 제시한 바와 같이 BMP-GER-NR을 크게 능가하였다. 유사하게, 도 24는 BMP-E가 상기 생체내 검정에서 BMP-E-NR에 비해 훨씬 더 높은 골 점수를 생성하였음을 보여준다. 따라서, BMP-E 및 BMP-GER 모두에 대해, 주장된 바와 같은 노긴 내성 버전은 이들의 NR (노긴 내성) 대응물보다 생체 내에서 훨씬 덜 강력하였고, BMP-E의 경우에, 액티빈-A의 서열의 포함 때문에 거의 모든 생체내 활성은 상실되었다 (BMP-E-NR을 BMP-E와 비교하는 도 24 참조).

이들 데이터는 잠재적으로 노긴 내성을 부여하는 서열의 포함이 특정 타입 II 수용체 (예를 들어, ActRIIB)에 대한 결합을 증가시키면서 디자이너 BMP의 생체내 골형성 활성을 증가시키지 않았음을 입증한다.

추가로, 노긴의 추가가 생체 내에서 디자이너 BMP의 골형성 활성을 개선하지 않았지만, 실제로, 이들의 생체내 활성을 감소시키기 위해, 본 발명의 신규한 디자이너 BMP는 야생형 BMP에 비해 크게 증가된 골형성 특징을 나타내고, 시험관 내에서 노긴 내성을 나타내지 않으면서도 매우 다양한 용도를 위한 잠재적인 신규한 치료제를 제공하는 것으로 나타냈다. 따라서, 본 발명의 디자이너 BMP는 특히 골 증대 및 복구를 위한 크게 개선된 임상 프로파일을 나타내는 뛰어난 신규한 잠재적인 치료제를 제공한다.

본원에 언급되는 각각의 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 구체적인 실시양태를 참조로 개시되었지만, 본 발명의 진정한 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 당업자에 의해 본 발명의 다른 실시양태 및 변동이 고안될 수 있음이 명백하다. 첨부된 특허청구범위는 그러한 모든 실시양태 및 동등한 변이를 포함하도록 해석되는 것으로 의도된다.

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Synthetic polynucleotide" <400> 102 atggtggctg gcaccagatg tctgctggcc ctgctgctgc cccaggtgct gctgggcgga 60 gctgctggac tggtgcccga gctgggcaga agaaagttcg ccgctgcctc ctctggccgg 120 ccttccagcc agccttccga cgaggtgctg tccgagttcg agctgcggct gctgtccatg 180 ttcggcctga agcagcggcc caccccttct agggacgccg tggtgccccc ctacatgctg 240 gacctgtacc ggcggcactc cggccagcct ggatctcctg cccccgacca cagactggaa 300 agagccgcct cccgggccaa caccgtgcgg tctttccacc acgaggaatc cctggaagaa 360 ctgcccgaga catccggcaa gaccacccgg cggttctttt tcaacctgtc atccatcccc 420 accgaagagt tcatcacctc cgccgagctg caggtgttcc gcgagcagat gcaggacgcc 480 ctgggcaaca actcctcctt ccaccaccgg atcaacatct acgagatcat caagcccgcc 540 accgccaact ccaagttccc cgtgacccgg ctgctggaca cccggctggt gaaccagaac 600 gcctccagat gggagtcctt cgacgtgacc cctgccgtga tgagatggac cgcccagggc 660 cacgccaacc acggctttgt ggtggaagtg gcccacctgg aagagaagca gggcgtgtcc 720 aagcggcacg tgcggatctc tcggtccctg caccaggacg agcacagctg gtcccagatc 780 cggcccctgc tggtgacatt cggccacgat ggcaagggcc accccctgca 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 133 atgccggggc tggggcggag ggcgcagtgg ctgtgctggt ggtgggggct gctgtgcagc 60 tgctgcgggc ccccgccgct gcggccgccc ttgcccgctg ccgcggccgc cgccgccggg 120 gggcagctgc tgggggacgg cgggagcccc ggccgcacgg agcagccgcc gccgtcgccg 180 cagtcctcct cgggcttcct gtaccggcgg ctcaagacgc aggagaagcg ggagatgcag 240 aaggagatct tgtcggtgct ggggctcccg caccggcccc ggcccctgca cggcctccaa 300 cagccgcagc ccccggcgct ccggcagcag gaggagcagc agcagcagca gcagctgcct 360 cgcggagagc cccctcccgg gcgactgaag tccgcgcccc tcttcatgct ggatctgtac 420 aacgccctgt ccgccgacaa cgacgaggac ggggcgtcgg agggggagag gcagcagtcc 480 tggccccacg aagcagccag ctcgtcccag cgtcggcagc cgcccccggg cgccgcgcac 540 ccgctcaacc gcaagagcct tctggccccc ggatctggca gcggcggcgc gtccccactg 600 accagcgcgc aggacagcgc cttcctcaac gacgcggaca tggtcatgag ctttgtgaac 660 ctggtggagt acgacaagga gttctcccct cgtcagcgac accacaaaga gttcaagttc 720 aacttatccc agattcctga gggtgaggtg gtgacggctg cagaattccg catctacaag 780 gactgtgtta tggggagttt 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gaccacccgg cggttctttt tcaacctgtc atccatcccc 420 accgaagagt tcatcacctc cgccgagctg caggtgttcc gcgagcagat gcaggacgcc 480 ctgggcaaca actcctcctt ccaccaccgg atcaacatct acgagatcat caagcccgcc 540 accgccaact ccaagttccc cgtgacccgg ctgctggaca cccggctggt gaaccagaac 600 gcctccagat gggagtcctt cgacgtgacc cctgccgtga tgagatggac cgcccagggc 660 cacgccaacc acggctttgt ggtggaagtg gcccacctgg aagagaagca gggcgtgtcc 720 aagcggcacg tgcggatctc tcggtccctg caccaggacg agcacagctg gtcccagatc 780 cggcccctgc tggtgacatt cggccacgat ggcaagggcc accccctgca caagagagag 840 aagcggcagg ccaagcacaa gcagcggaag cggctgaagt cctcctgcaa gcggcacccc 900 ctgtacgtgg acttctccga cgtgggctgg aacgactgga tcattgcccc caggggctac 960 gccgccttct actgcgacgg cgagtgctcc ttccccctga acgcccacat gaacgccacc 1020 aaccacgcca tcgtgcagac cctggtgcac ctgatgaacc ccgagtacgt gcccaagcct 1080 tgttgcgccc ccaccaagct gagacccatg tccatgttgt actatgatga tggtcaaaac 1140 atcatcaaaa aggacattca gaacatgatc gtggaggagt gtgggtgctc atag 1194 <210> 138 <211> 1194 <212> DNA <213> 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caccaagatg aacacagctg gtcacagata 780 aggccattgc tagtaacttt tggccatgat ggaaaagggc atcctctcca caaaagagaa 840 aaacgtcaag ccaaacacaa acagcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 900 ttgtacgtgg acttcagtga cgtggggtgg aatgactgga ttgtggctcc cccggggtat 960 cacgcctttt actgcgatgg agaatgctcc ttcccactca acgcacacat gaatgcaacc 1020 aaccacgcga ttgtgcagac cttggttcac cttatgaacc ccgagtatgt ccccaaaccg 1080 tgctgtgcgc caactaagct aaatgccatc tcggttcttt actttgatga caactccaat 1140 gtcattctga aaaaatacag gaatatggtt gtaagagctt gtggatgcca ctaa 1194 <210> 139 <211> 1194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 139 atggtggctg gcaccagatg tctgctggcc ctgctgctgc cccaggtgct gctgggcgga 60 gctgctggac tggtgcccga gctgggcaga agaaagttcg ccgctgcctc ctctggccgg 120 ccttccagcc agccttccga cgaggtgctg tccgagttcg agctgcggct gctgtccatg 180 ttcggcctga agcagcggcc caccccttct agggacgccg tggtgccccc ctacatgctg 240 gacctgtacc ggcggcactc cggccagcct 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actttgatga caactccaat 1140 gtcattctga aaaaatacag gaatatggtt gtaagagctt gtggatgcca ctaa 1194

Claims (26)

1. 돌연변이를 포함하는 디자이너 골형성 단백질이며, 여기서의 돌연변이는 상응하는 야생형 BMP2에 의한 타입 I 또는 타입 II 수용체에 대한 결합과 비교하여 타입 I 또는 타입 II BMP2 수용체에 대해 변경된 결합을 부여하고,
   서열 1의 돌연변이된 서열을 포함하며, 상기 돌연변이가 서열 1의 서열에 대해 V33I, P36R, H39A, H44D, P48S, A52N, D53A, L55M, S57A, N68H, S69L, V70M, N71 다음의 P의 삽입, S72E, K73Y, I74V, A77P, V80A, S85N, M89V, L92F, E94D, E96S, K97N 및 V99I인 것을 특징으로 하는 디자이너 골형성 단백질.
2. 제1항에 있어서, 서열 37의 아미노산 서열을 갖는 디자이너 골형성 단백질.
3. 서열 37의 아미노산 서열에 노긴(Noggin) 내성 아미노산 서열을 치환하여 생성되는 서열 71의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 디자이너 골형성 단백질.
4. 제3항에 있어서, 서열 71의 아미노산 서열을 갖는 디자이너 골형성 단백질.
5. 제1항에 있어서, 2 nM 이하의 K_D로 ALK2 수용체에 결합하고, 2 nM 이하의 K_D로 ALK3 수용체에 결합하고, 1 nM 이하의 K_D로 ALK6 수용체에 결합하고, 2 nM 이하의 K_D로 ActRIIA 수용체에 결합하고, 0.5 nM 이하의 K_D로 ActRIIB 수용체에 결합하고, 3.5 nM 이하의 K_D로 BMPRIIA 수용체에 결합하는 디자이너 골형성 단백질.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 디자이너 골형성 단백질을 코딩하는 핵산을 숙주 세포 내로 도입하고,
   상기 세포를 상기 단백질이 생산되는 조건 하에 배양하고,
   상기 단백질을 정제하는 것
   을 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 디자이너 골형성 단백질의 생산 방법.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 디자이너 골형성 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
8. 제7항에 있어서, 서열 71 및 서열 37의 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 디자이너 골형성 단백질을 포함하는, 골 손실과 연관된 골 질환의 치료가 필요한 환자에서 골 손실과 연관된 골 질환을 치료하거나, 섬유증의 치료가 필요한 환자에서 섬유증을 치료하거나, 또는 골 형성의 유도가 필요한 환자에서 골 형성을 유도하기 위한 제약 조성물.
10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 디자이너 골형성 단백질,
    애플리케이터(applicator), 및
    골 손실을 치료 또는 예방하기 위한 키트의 사용을 위한 관련 정보를 제시하는 사용 설명서
    를 포함하는 키트.
11. 제7항의 단리된 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
12. 서열 37의 아미노산 서열로 이루어진 디자이너 골형성 단백질.
13. 서열 71의 아미노산 서열로 이루어진 디자이너 골형성 단백질.
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