JPH02203784A - β―ガラクトシダーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アスペルギルス属に属するβ−ガラクトシダ
ーゼ生産菌をオカラを含有する固体培地で好気的に培養
し、培地中に産生蓄積したβ−ガラクトシダーゼを採取
することを特やとするβ−ガラクトシダーゼの製造方法
に関するものである。

オカラは豆腐や豆乳などの大豆蛋白質製品を製造する際
に副生ずる搾り粕を総称したもので、日本では非常に多
量産出され、一部加工食品や飼料に利用されているもの
を除き、かなりの量が廃棄処分されている。

一方、目的とするβ−ガラクトシダーゼは、乳糖をグル
コースとガラクトースに分解する酵素であり、食品産業
に於いては、牛乳やホエー中の乳糖の分解処理に利用さ
れ、医薬品産業に於いては、乳糖不耐症による下痢の治
療剤として広く利用され、一方、最近診断薬（酵素標識
抗体）としての用途も開発されている。本発明によれば
、産業廃棄物であるオカラの有効利用により、操作単純
、且つ純度、収率ともに優れたβ−ガラクトシダーゼの
製造方法が提供される。

（従来の技術） 従来より、アスペルギルスに属するβ−ガラクトシダー
ゼ生産菌の固体培養によるβ−ガラクトシダーゼの製造
方法については、種々の方法が周知である。一般にこの
固体培地の原料としては、ふすまが繁用されており、そ
の他米ぬか、もみがら、大豆粉、小麦胚芽、米胚芽、引
割小麦などが用いられている。

しかしながら、β−ガラクトシダーゼの採取を目的とし
てオカラを培地原料として利用した例は従来全く知られ
ていない。オカラを培地として微生物を培養する方法に
ついては、特開昭６１１７０３６３号公報に、アスペル
ギルスに属する微生物を培養して調味料を製造したこと
が記載されている。特開昭５８−７１８４８号公報には
、オカラを培地として種菌マンネンタケを培養して甘酒
様食品を製造したことが記載されている。又、特開昭６
２−１９５２７９号公報にはすカラに酸を加えて雑菌の
生育を抑制し、麹菌を生育させてオカラ麹を製造したこ
と、この麹は調味料の製造原料及び酵素の抽出原料とし
て有用であることなどが記載されているが、β−ガラク
トシダーゼの産生を示唆する事項は記載されていない。

（発明が解決しようとする課題） 従来一般に行なわれている、ふすま培地を用いるアスペ
ルギルス属微生物の大規模な通風式堆積培養に於いては
、ふすまの保水性が低いことと、微生物増殖過程の旺盛
な代謝熱に起因して培地に局所的微生物の発育不良（い
わゆる「焼現象」）が起こり易く、これを防ぐため、培
養期間中数回の手入れ（培地のかきまぜ作業）や水分補
給作業を繰返しているのが現状で、この作業は単に操作
上の煩雑に止まらず、雑菌汚染、さらには菌糸の切断等
の損傷に伴う酵素産生の一時的停止を招き易いという問
題があった。又、従来のふすま培地を利用してアスペル
ギルス属微生物を培養すれば、培地中にβ−ガラクトシ
ダーゼと共に褐色不純物が多量に生成し、これを除去す
るための精製操作も容易ではなかった。

本発明は、従来のふすま培地の１部又は全部をオカラに
代替することにより、操作単純且つ純度、収率共に優れ
たβ−ガラクトシダーゼの製造方法を提供しようとする
ものである。

（発明の構成） 本発明は、 ｒ　（１）　　アスペルギルス属に属するβ−ガラクト
シダーゼ生産菌をオカラを含有する固体培地で好気的に
培養し、培地中に産生蓄積したβ−ガラクトシダーゼを
採取することを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造
方法。

（２）　　固体培地が無機塩類及び油脂から選ばれる成
分の１種又は２種以上を含有することを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載のβ−ガラクトシダーゼの製造
方法。」に関するものである。

本発明に利用するオカラは豆腐や豆乳などの大豆蛋白質
製品を製造する際に副生する搾り粕の総称である。一般
に、豆腐は丸大豆を原料とし、豆乳は脱脂大豆を原料と
して製造されるので、それぞれの製造工程から副生ずる
オカラは油脂の含量が相違しており、前者は含油オカラ
、後者は脱脂オカラと区別されているが、本発明に於い
ては、どちらのオカラも利用することが出来る。オカラ
は固体培地として単独で利用出来るが、勿論従来利用さ
れている、ふすま、米ぬか、もみがら、大豆粉、小麦胚
芽、引割小麦などと混合して利用することも出来る。

オカラは保水性が高く、通常、繊維約３％、蛋白質約５
％、糖質約６〜７％、灰分約１％及び水分約８０％の組
成を有している。又、オカラを含有する固体培地は予想
外に良好な通気性を保持しており、含水量も豊富である
ことから、この培地を利用すれば、培養期間中の手入れ
作業と給水作業を省略しても菌の生育が良好であり、培
養作業を著しく省力化することが出来る。しかも、この
培養によれば雑菌汚染が少なく、培地中に、高収率でβ
−ガラクトシダーゼを産生じ、褐色不純物の産生は少な
く、白色乃至淡黄色の高純度のβ−ガラクトシダーゼが
容易に抽出採増される。又、意外なことに、オカラ培地
で産生したβ−ガラクトシダーゼは、従来の、ふすま培
地で産生じたものと比較して、耐熱性が優れていること
、及びオカラ培地に少量の無機塩類及び油脂を添加する
ことによりβ−ガラクトシダーゼの生産性が著るしく向
上することも見出された。無機塩類としては、例えばＮ
ａＨｚＰＯ４、Ｎａｇ肝Ｏｎ　、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２Ｈ
ＰＯ，、。

ＮＨ４１１ｚＰＯ４、（ＮＨ４）ｚ１１ＰＯ４、Ｃａ（
ｌＩｚＰＯｎ）ｚ、ＣａＨＰＯいＣａ５（ＰＯ４）ｚ　
　、Ｍｇ（ＨｚＰＯ４）ｚ、ＭｇＨＰＯ＜、Ｍｇ：＋（
ＰＯ４）ｚ　　、ＣａＳＯ４、ＣａＣ１２、Ｃａ（ＮＯ
３）ｚ等の無水又は水和塩を単独又は混合して使用出来
る。これら無機塩の添加量はオカラ１００ｇに対し、無
機塩類の種類により異なるが、通常的１〜５ｇ程度が適
当である。

油脂の添加は特に脱脂オカラを培地とする場合にβ−ガ
ラクトシダーゼの産生を著るしく向上させる。添加する
油脂としては、大豆油、オリーブ油、菜種油、コーン油
、サフラワー油、落花生油、パーム油、ヤシ油等の植物
性油脂及び肝油等の動物性油脂を使用することが出来る
。油脂の添加量は脱脂オカラ１００ｇに対し、通常約８
〜１６ｇが好ましい。

本発明に利用するβ−ガラクトシダーゼ生産菌はアスペ
ルギルス属に属する微生物でβ−ガラクトシダーゼを産
生ずるものであれば野生株、変異株、形質転換株等いず
れでもよい。

利用出来る微生物として、例えば、アスペルギルス・オ
リーゼＩＡＭ２７０３株、アスペルギルス・エフユーザ
スＩＡＭ２８２２株、アスペルギルス・タマリＩＡＭ２
５０２株、アスペルギルス・ニガーＩＡＭ２０２０株、
アスペルギルス・オリーゼロー８株（微工研菌寄第７３
７８号〉を例示することが出来る。

本発明を実施するに際しては、まず初めに固体培地とし
てオカラを準備し、これに適宜無機塩と油脂を添加し、
堆積層を形成させるために必要あれば水分を補給し、充
分均一に混合して滅菌処理した後、種麹又はその分生子
を接種する。培地のｐＨは約５．５〜６．０とし、約３
０℃で好気的に培養を行う、培養時間は培養規模によっ
て異なるが、通常１〜５日で充分である。培養終了後、
培養物より常法に従ってβ−ガラクトシダーゼを分離採
取する。

次に本発明の実施態様を詳細に説明するため実施例を示
す。

実施例１　（通風式堆積培養） 含油オカラ２４０　ｇ、　　リン酸１ナトリウム・２水
和物２．４ｇ、塩化カルシウム２．４ｇ、　　リン酸１
カリウム０．６　ｇ及び水４２ｔａｌからなる培地にア
スペルギルス・オリーゼＵ−８株（微工研菌寄第７３７
８号）の分生子を接種し、３０℃、５日間好気的に静置
培養して麹を得、これを本培養の種麹として用いた。

本培養培地は、豆腐製造工場から産出された市販の含油
オカラ１０ｋｇに硫酸カルシウム・１／２永和物５０ｇ
、硫酸マグネシウム・７水和物８０ｇ。

及び水０．７５ｆｆを混合して加圧蒸気滅菌した後、こ
れに別に滅菌したリン酸１ナトリウム・２水和物１００
ｇ、　　リン酸１カリウム２５ｇ及び水０．７５４を添
加し、均一に混合して調製した。この培地（堆積層の高
さ１４ｃｍ）に種麹を加えて混合した後培養室に入れた
。

培地の下面から上面に向って３０℃、飽和湿度の新鮮な
無菌空気を強制的に送りながら培養を行った。

培養は６６時間行い、その間麹の手入れや加水は全く行
わなかった。

培養期間中、培養室の温度はほぼ正確に３０℃に維持さ
れた。麹の水分は培養開始時に７７％、培養終了時に７
６％とほぼ一定に保たれていた。

培地のρ］１は培養開始時に５．７、培養終了時に７．
０であった。生育は極めて盛んで、培養６０時間を経過
すると緑色の分生子頭を豊富に着生した。

培養終了時、麹の収量は８．６７　ｋｇであり、この麹
から水抽出して得たβ−ガラクトシダーゼは褐色不純物
を含まず、総括性は２０８万Ｕであり、麹１ｇ当りの活
性は２４ｏｕ／ｇ麹であった。

（発明の効果） 本発明のβ−ガラクトシダーゼの製造方法に於いて、オ
カラ培地に共存させる無機塩類及び油脂等添加物の酵素
生産性に及ぼす効果あるいは、微生物の種類と本発明の
効果との関係等を詳細に説明するため試験例を示す。

試験例１　（添加物の効果試験） アスペルギルス・オリーゼＵ−８株をポテトデキストロ
ース寒天平板上で３０℃、５日間好気的に培養して分生
子を形成させた。

脱脂オカラ２ｇ及び水０．３ｍｌを基本培地とし、これ
に所定量のカルシウム塩、リン酸塩及び油脂を添加して
均一に混合し、試験管に入れ、オートクレーブで滅菌し
て各種の培地を調製した。各培地に上記分生子１白金耳
量を°接種し、３０℃、７２時間好気的条件で静置培養
した。培養終了後、各々の麹を秤量した後、水２０ｎ＋
１に懸濁させ、３０℃、１時間振盪後遠心分子％ｉｌ　
（１５０００ｒｐｍ、１０分間）して上清両分を得た。

各上清液について、β−ガラクトシダーゼ活性（υ）を
測定し、麹１ｇ当りのβ−ガラクトシダーゼ産生量（Ｕ
／ｇ麹）を求めた。本試験の結果は第１表に示す。

第１表の成績から明らかなように、β−ガラクトシダー
ゼの産生量は脱脂オカラ培地にカルシウム塩及び／又は
リン酸塩を単独又は混合して添加することにより、著し
く増加し、これに大豆油を添加すれば、さらに顕著に増
加した。

なお、本試験に於ける脱脂オカラは次の方法で調製した
ものを利用した。

（脱脂オカラの調製） 脱脂大豆粉（４０メツシュ通過）５０ｇを水５００ｍｊ
！に懸濁させ、オートクレーブで５分間加熱処理した後
遠心分離して残渣（１）を得た。

この残渣（１）を再び水５００ｎ＋ｆに懸濁させ上述の
操作を繰返して残渣（ｎ）を得た。この残渣（ＩＩ）を
ガーゼ（４枚重ね）で充分しぼり、水分７５％の脱脂オ
カラを得た。

試験例２（各種微生物の酵素生産性試験）含油オカラ２
ｇ及び水０．３ｍｆを均一に混合して試験管に入れ、オ
ートクレーブで滅菌後、培地（基本培地）として利用し
た。アスペルギルス属に属する公知の微生物７種につい
て、試験例１と同様な方法で分生子を形成させ、上記基
本培地に接種して培養した。各微生物が産生じたβ−ガ
ラクトシダーゼを水で抽出し、抽出液のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性（１１）を測定して麹１ｇ当りのβガラクト
シダーゼ産生量（Ｉｔ／ｇａ）を求めた。さらに、この
抽出液をｐＨ４，５に調製した後、６０℃、３０分間保
温後に残存するβ−ガラクトシダーゼ活性（Ｕ゛）を測
定して活性残存率（Ｕ″／Ｕｘ１００％）を求め、これ
をβ−ガラクトシダーゼの耐熱性（％）と見倣した。培
地添加成分の効果を比較するため、含油オカラ２ｇ、リ
ン酸トナトリウム・２水和物２０■、リン酸ｌカリウム
５■、硫酸カルシウム・１／２水和物１０ｒｒｇ、硫酸
マグネシウム・７水和物１０■及び水０．３ｍ７！から
なる培地（塩類添加培地）及び麩１．５ｇ及び水２，１
ｍｊ！からなる公知慣用の培地（対照培地）についても
同様な試験を行った。

本試験に利用した微生物は次の７種である。

アスペルギルス・オリーゼ　　　ＩＡＭ　２３６０アス
ペルギルス・オリーゼ　　　ＲＩＢ　１０３１アスペル
ギルス アスペルギルス アスペルギルス アスペルギルス アスペルギルス 本試験の結果は第 ・オリーゼ ・ソニー ・エフユーザス ・タマリ ・ニガー ２表に示す。

υ−８ Ｈ団２７０３ １Ａ月　２８２２ ＩＡＩ’ｌ　２５０２ ＪＡＭ　２０２０ 第２表の成績から明らかなように、β−ガラクトシダー
ゼの産生１（Ｕ／ｇ麹）は、利用する微生物の種類によ
りかなり大巾に相違するが、平均して見れば慣用の麩培
地（対照）を利用する場合に比較して、本発明の培地、
すなわち含油オカラ培地（基本培地）及び含油オカラに
無機塩類等を添加した培地（塩類添加培地）の場合は、
前者が３０％近く増加し、後者は４倍以上増加した。

一方、産生されたβ−ガラクトシダーゼの耐熱性は、こ
れも微生物の種類によりかなり相違するが、平均して見
れば、対照の麩培地で産生したものの値４２％に比較し
て、本発明の含油オカラを含む培地で産生じたものの値
は、培地中に無機塩類の存在有無にかかわらず、いずれ
も高い値６３％を示した。

なお、これら上述の平均値について認められた傾向〈発
明の効果）は、特定の菌株に躍定されること無く、本試
験に利用したすべての菌株について、はぼ同様に認めら
れた。

なお、本明細書に於けるβ−ガラクトシダーゼ活性は次
の方法で測定した。

（β−ガラクトシダーゼ活性の測定法）ｐＨ４，５に３
周整した５、７ｍＭのＯ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラ
クトピラノシド溶液３．５ｍｌと試料の酵素溶液０．５
１１１１との混合液を３０’Ｃに１０分間保った後、１
Ｍ炭酸ナトリウム溶液１　　ｍｌを加えて反応を停止さ
せた。４２０ｎｍに於ける吸光度を測定して生成した０
−二トロフェノールの量を求めた。

１分間当り、１μ５ｏｌｅの０−ニトロフェニルβ−Ｄ
−ガラクトピラノシドを加水分解する酵素量を１単位（
Ｕ）とした。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アスペルギルス属に属するβ−ガラクトシダーゼ
   生産菌をオカラを含有する固体培地で好気的に培養し、
   培地中に産生蓄積したβ−ガラクトシダーゼを採取する
   ことを特徴とするβ−ガラクトシダーゼの製造方法。
2. （２）固体培地が無機塩類及び油脂から選ばれる成分の
   １種又は２種以上を含有することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載のβ−ガラクトシダーゼの製造方法
   。