TWI692308B - 低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關用以製備低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法、由該方法所製備之大豆蛋白濃縮物，以及包括該大豆蛋白濃縮物之飼料組成物。
Description
本發明是有關一種於低溼度條件下水解而因此具有高含量之低分子量胜肽(low molecular weight peptides)的大豆蛋白濃縮物，以及其製備方法。
一般而言，動物飼料包含魚粉(fishmeal)作為蛋白質來源，但由於生產魚粉之國家中，近期的魚粉產量降低，或是魚粉的供需已變得不穩定，魚粉在全球的成本已提升。因此，對於可被用作魚粉之替代物之蔬菜蛋白質來源的需求增加，且研發該蔬菜蛋白質來源的努力已持續在進行。
使用大豆的脫脂大豆粕(defatted soybean meal)-其係一種蔬菜蛋白質-係自具有高蛋白質及脂肪含量之大豆萃取脂肪後剩餘的副產物，且大豆蛋白係使用水或有機溶劑自脫脂大豆粕萃取(見韓國發明專利第10-1612600號)。依據自脫脂大豆粕移除之非蛋白質成分的程度，諸如水溶性及非水溶性碳水化合物，這些大豆蛋白可以被分類為脫脂大豆粉(soy flour)、大豆蛋白濃縮物、結構化大豆蛋白(structured soy proteins)、水解大豆蛋白(hydrolyzed soy proteins)，或大豆蛋白分離物(soy protein isolates)等加 工蛋白產物(soy protein products)。由於大豆蛋白具有高度蛋白質含量，除了被用於肉類加工品、奶類加工品以及諸如麵包或零食等食物外，其可被用於家畜飼料(livestock feed)。
然而，大豆蛋白包含由大豆衍生之皂素(saponins)而因此可能造成魚體(包括鮭魚)之發炎反應，因此不利地影響其生長。另外，大豆蛋白包含具有1,000kDa或更高的分子量且由蛋白質次單元所組成的高分子量蛋白質，且亦包含可能損害消化作用的各種抗營養因子(anti-nutritional factors，ANFs)。這些抗營養因子主要存在於蔬菜蛋白質中，且係作為抑制動物之消化能力的因子(Li et al.,J Anim.Sci.,68：1790,1990)。
因此，為了將大豆蛋白用於動物飼料中，有需要聚焦於降低抗營養因子以增加飼料之消化率，並將高分子量蛋白轉換成低分子量胜肽之研究。
同時，目前被生產的加工大豆蛋白產品，諸如大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物或水解大豆蛋白，係由化學或是酵素處理所生產。然而，若在這些蛋白加工品(processed protein products)的生產中添加化學品，或在生產中加入與該酵素反應之條件有關之程序(process)，可能會產生下列問題：加工品的品質可能被減損(deteriorate)，且用於生產大豆蛋白水解物所需之時間與花費可能增加。另外，由於用以製備大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysates)之傳統方法包括在水溶液相(aqueous solution phase)中添加酵素的步驟，其具有必須被額外包括將產品乾燥之步驟的缺點。再者，使用新穎芽孢桿菌(Bacillus)菌株以製備發酵大豆蛋白之方法係揭露於，例如，韓國發明專利第10-1139027號，以及韓國發明專利公開案第 10-2015-0129238號。然而，酵素水解(enzymatic hydrolysis)方法以及微生物發酵(microbial fermentation)方法兩者都額外需要冗長(long)且昂貴之乾燥程序以獲得所欲之低分子量大豆蛋白之問題。
另外，相關前案包括美國發明專利公開案第20110136745A1號，但此揭露在熱處理後使用胃蛋白酶(pepsin)、胰酶(pancreatin)或類似物(其等係蛋白酶)來進行大豆之水解的手段。再者，美國發明專利第04376128A號揭露使用含有鳳梨酶(bromelin)或是木瓜酶(papain)之酵素進行處理的方法，以改良豆料(legumes)中可食用之蛋白質的產率，且美國發明專利第04512973A號揭露以海星胰蛋白酶(tarfish trypsin，DIT1)及羧肽酶B(carboxypeptidase B)處理，以降解胰蛋白酶抑制劑的方法。再者，日本發明專利第1994-170414號及第2004-252174號僅分別揭露用以在水溶液中水解大豆蛋白的方法，以及用以使用該水解的大豆蛋白作為植物生長促進劑的方法，植物生長促進劑使用鹼性蛋白酶(alkali protease)通過水解抑制大豆胰蛋白酶。此外，雖然使用乳酸菌之大豆蛋白的酵素水解的方法被揭露，本發明在低溼度條件下水解大豆蛋白濃縮物的技術不但未被揭露，亦未被教示(Aguirre et al.,Enzymatic hydrolysis of soy protein using lactic acid bacteria,Food Chemistry 111(2008)976-982)。因此，用以製備在低溼度條件下水解、具有低分子量胜肽之大豆蛋白濃縮物之方法，以及由此方法所製備之大豆蛋白濃縮物並未被揭露或教示於任何的先前技術中。
數件發明專利文件之引用係顯示並敘述於本發明的說明書中。揭露於這些經引用的文件中的技術內容在參考本發明整體的前提下可以由本發明所屬技術領域具有通常知識者輕易了解。
在這些情況下，本發明之發明人已盡其努力研發用以製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法。結果，本發明之發明人已製備可增強動物之消化率(digestibility)的大豆蛋白濃縮物，此是由於此大豆蛋白濃縮物具有高含量之低分子量胜肽，以及低含量之抗營養因子，且因此可以被應用為飼料材料，藉此完成本發明。
(專利文件1)韓國發明專利第10-0612600號
(專利文件2)韓國發明專利第10-1139027號
(專利文件3)韓國發明專利公開案第10-2015-0129238號
(專利文件4)美國發明專利公開案第20110136745A1號
(專利文件5)美國發明專利第04376128A號
(專利文件6)美國發明專利第04512973A號
(專利文件7)日本發明專利第1994-170414號
(專利文件8)日本發明專利第2004-252174號
(非專利文件1)Li et al., J. Anim Sci., 68:1790, 1990
(非專利文件2)Aguirre et al., Enzymatic hydrolysis of soy protein using lactic acid bacteria, Food Chemistry 111(2008) 976-982
本發明的一個目的是提供用以製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法。
本發明的另一個目的是提供根據前述製備方法所製備的在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物。
本發明的再一個目的是提供包含在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的飼料組成物。
本發明的其他目的以及優點由詳細說明以及所附之申請專利範圍以及圖式將為顯見的。未於本說明書中敘述的內容可以由本發明所屬技術領域或相似技術領域具有通常知識者充分認知並推論而得，因此該等敘述將被省略。
揭露於本發明中的各說明及實施例可被分別應用於其他說明及實施例。即，此處所揭露之各種元件的所有組合都落於本發明的範圍內。另外，本發明的範圍並非意欲被下述特定說明所限制。
用以製備大豆蛋白水解物的傳統方法具有下列問題：由於其包括在水溶液態(aqueous solution state)下添加酵素及乾燥產品的步驟，其需要冗長且昂貴的乾燥程序(drying process)。因此，有必要研發近似固態之大豆蛋白濃縮物之水解物，其可節省成本及時間。
本發明係有關在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物以及其製備方法。更具體而言，本發明提供用以製備在低溼度條件下水解之大 豆蛋白濃縮物的方法，包含：製備大豆蛋白濃縮物；量測上述步驟所獲得之大豆蛋白濃縮物的含水量(moisture content)；基於上述步驟量測之含水量，控制大豆蛋白濃縮物的含水量；通過添加蛋白酶而水解大豆蛋白濃縮物，其中含水量係被控制；以及獲得前述步驟中水解的大豆蛋白濃縮物。該方法可在最少化(minimizing)處理步驟的同時增加水解效率。因此，具有經增強之消化率的水解大豆蛋白濃縮物可被非常有效地製備，而不用根據酵素之種類添加與反應條件相關的程序。
另外，根據本發明之方法包括通過添加酵素至固體大豆蛋白濃縮物而進行水解反應的步驟，因此可以在不額外包括乾燥步驟之下增強大豆蛋白濃縮物的水解效率。
由於其抗營養因子的含量低，且低分子量胜肽之含量被增加以改良對於家畜的消化率，由根據本發明之方法而水解的大豆蛋白濃縮物具有適合做為用於飼料的蛋白質材料的特徵。
此處所使用的用語「大豆蛋白濃縮物(soy protein concentrate)」代表自大豆萃取之蛋白質的濃縮物。自大豆萃取的蛋白質是通過使用己烷(其係有機溶劑)自大豆萃取大豆油，且接著自脫脂大豆移除非蛋白質成分諸如水溶性及非水溶性碳水化合物所生產的蛋白質。
此處所使用的用語「水解(hydrolysis)」代表其中一個大分子與水在化學反應中進行反應並分解成數個離子或分子的反應，且應用於澱粉α鍵、脂肪酯鍵及蛋白質胜肽鍵之降解。
此處所使用的用語「蛋白酶(protease)」代表蛋白水解酵素 (protein hydrolytic enzyme)，且是產生胺基酸或胜肽混合物的酵素。所使用之酵素的種類包括胃蛋白酶、肽酶及胰蛋白酶。
此處所使用的用語「蛋白質溶解度(protein solubility)」代表蛋白質溶於水中的程度(degree)，且當較多的親水性胺基酸存在於表面，蛋白質溶解度藉由蛋白質與溶劑之離子基團發生交互作用而增加。
根據一實施例，本發明之製備大豆蛋白濃縮物的步驟可由各種方法進行。較佳的是大豆蛋白是由相同區域內的相同種類的大豆不斷供應以供使用，以維持相同的品質。特別是，根據大豆種類之蛋白質含量的差異表示(indicates)最終產品中蛋白質含量的差異，且水解大豆蛋白濃縮物的品質隨著大豆之蛋白質含量的增加而增加。大豆蛋白濃縮物可以由下列方式製備：首先，以酒精清洗(washing)大豆蛋白並使用有機溶劑，諸如己烷或類似物萃取大豆油，並接著進一步添加酒精至殘餘的脫脂大豆粕，藉此移除蛋白質之外的水溶性及非水溶性的碳水化合物。
根據本發明的一實施例，大豆蛋白濃縮物的蛋白質含量可以根據所欲之最終低分子量胜肽的種類、含量、接受性(acceptability)及溶解度而在製備步驟中被控制。蛋白質含量可以使用氮滴定法(nitrogen titration method)或凱氏定氮儀(Kjeldahl instrument)而量測。大豆蛋白濃縮物的蛋白質含量可以在，例如，50重量%至70重量%，特別是55重量%至65重量%，以及58重量%至62重量%的範圍內。
另外，根據本發明的一實施例，大豆蛋白濃縮物的含水量可以使用體積滴定法(volume titration method)或庫倫滴定法(coulometric titration method)由溼度計(moisture meter)量測。在控制含水量之前的步驟中，大豆蛋白濃縮物的含水量可以在5%至10%的範圍內，更具體地在6%至8%的範圍內。
根據一實施例，SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳，sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)及GPC(gel permeation chromatography，凝膠滲透層析)可被用於量測大豆蛋白濃縮物之蛋白質降解及分子量分布。水解前的大豆蛋白濃縮物可包含70%或更多之具有30kDa或更高之分子量的高分子量胜肽以及30%或更少之具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽。在本發明中，胜肽通過肽鍵形成胺基酸之各種組合的聚合物，且此聚合物通常由2至50個彼此鍵結之胺基酸所組成。低分子量胜肽係具有低分子量的小胜肽(small peptide)且具有在消化期間促進吸收的優點，藉此在應用為動物飼料時增加消化率。依據包括於最終被製備之所欲的水解物中的低分子量胜肽的種類以及組成比例，大豆蛋白濃縮物(其係原料)之含水量、蛋白質含量或類似者可被適當選擇及使用。
另外，在本發明之水解作用之前，大豆蛋白濃縮物可進一步包含水溶性糖類(sugar)組分，諸如葡萄糖、蔗糖、水蘇糖(stachyose)、棉子糖(raffinose)或者類似者。
本發明之製備水解大豆蛋白濃縮物的方法包含控制大豆蛋白濃縮物之含水量的步驟。具體而言，含水量可以被控制於，基於大豆蛋白濃縮物之總重，10重量%至40重量%。更具體而言，含水量可以被控制於，基於大豆蛋白濃縮物的總重，10重量%至30重量%，10重量%至25重量%，10重量%至20重量%，及10重量%至15重量%。
當低含水量的條件被應用於大豆蛋白水解物的製備期間，其具有下列優點：與一般蛋白質水解作用是在液相發生不同的是，在生產程序中並不需要大豆蛋白濃縮物之額外乾燥步驟，藉此降低生產時間及成本。
根據一實施例，使用本發明的方法而在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物可以包含30%至90%或更多的具有30kDa或更低之分子量的胜肽。更具體而言，具有30kDa或更低之分子量的胜肽的含量可以是40%至90%、50%至90%、50%至85%、60%至90%，60%至85%，70%至90%，70%至85%，80%至90%，或80%至85%，但並不受限於此，且可依據所使用之酵素的量、反應時間或類似者改變。該百分比(%)可以代表由GPC測量之蛋白質分子量分布之總面積中，代表特定分子量範圍之部分區域所佔的百分比例。對於動物的消化率可隨著低分子量胜肽之含量增加而被增強，且根據此，具有經增強之消化率的大豆蛋白濃縮物及包含其之飼料組成物可使用本發明之方法製備。
本發明之用於製備水解大豆蛋白濃縮物之方法包含通過添加蛋白酶至大豆蛋白濃縮物而水解大豆蛋白濃縮物的步驟，其中含水量被控制。基於大豆蛋白濃縮物的總重，被添加之蛋白酶的量可以是0.05重量%至0.5重量%。更具體而言，基於大豆蛋白濃縮物之總重，被添加之蛋白酶的量可以是0.05重量%至0.35重量%、0.1重量%至0.35重量%，或0.2重量%至0.35重量%。
根據一實施例，蛋白酶可以是化學酵素或者生物酵素，包括衍生自微生物者，具體而言，可以是衍生自選自於由芽孢枯草桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，以及枯草桿菌 (Bacillus subtilis)所組成之群組的微生物的至少一酵素。蛋白酶可以通過根據所欲的水解大豆蛋白濃縮物的胜肽組成物或含量，適當地選擇適當酵素之種類及濃度以及反應時間而使用。根據一實施例，本發明之水解作用可以在30℃至90℃，更具體而言於50℃至85℃，或60℃至80℃下，進行30分鐘至300分鐘，更具體而言100分鐘至280分鐘、150分鐘至250分鐘，或180分鐘至240分鐘，以進行酵素反應。
根據一實施例，本發明提供包含由上述方法所製備之水解大豆蛋白濃縮物的飼料組成物。根據本發明之飼料組成物中水解大豆蛋白濃縮物的含量可以依據施用的家畜的種類以及年齡、應用形式、所欲效果或類似者而被適當控制。例如，其可以1重量%至99重量%，更具體而言，10重量%至90重量%，及20重量%至80重量%的量被使用，但不受限於此。
為了服用(administration)，除了水解大豆蛋白濃縮物，本發明之飼料組成物可進一步包括下列的混合物：至少一有機酸諸如檸檬酸、反丁烯二酸、己二酸、乳酸或類似物；磷酸鹽諸如磷酸鉀、磷酸鈉、聚磷酸鹽或類似物；天然抗氧化劑諸如多酚、兒茶素、生育酚、維生素C、綠茶提取物、甲殼素、單寧酸，或類似物。若需要的話，其他典型的添加劑諸如抗流感劑、緩衝劑、抑菌劑或類似物可被添加。另外，稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏結劑(binder)或潤滑劑可被額外添加以將該組成物調配成可注射的製劑(injectable preparation)，諸如水溶液、懸浮液、乳液(emulsion)或類似物，膠囊、顆粒或錠劑。
更甚者，除了主要成分-包括蔬菜蛋白質飼料諸如粉狀或碎塊小麥、大麥、玉米或類似物，動物蛋白質飼料諸如血粉、肉粉、魚粉 或類似物，動物脂肪以及蔬菜油-之外，本發明的飼料組成物可被與各種輔助組分，諸如胺基酸、無機鹽、維生素、抗氧化劑、抗真菌劑、抗微生物劑或類似物，營養補給、生長加速劑、消化-吸收加速劑，以及預防劑(prophylactic agent)一同使用。
當本發明之飼料組成物被用作飼料添加劑時，飼料組成物可單獨被添加或與其他組分一同使用，且可以根據典型地方法被適當使用。飼料組成物可以被製備成立即釋放(immediate-release)配方或持續(sustained-release)配方的服用形式，且與無毒藥學可接受之載體組合。可食用(edible)的載體可為玉米澱粉、乳糖、蔗糖或是丙二醇。固體載體可以呈錠劑、粉末、藥片(troches)或類似者的服用形式，且液體載體可以呈糖漿(syrups)、液體懸浮物、乳液、溶液或類似者的服用形式。另外，服用劑(administration agent)可包括防腐劑、潤滑劑、溶液加速劑，或是穩定劑(stabilizer)且亦可包括其他用以改良發炎疾病的助劑，以及對預防病毒有效的物質。
本發明的飼料組成物可被應用於動物的飲食中，即，用於動物之飼料，動物包括哺乳動物、禽類、魚類及甲殼類。其可以被用於商業上重要的哺乳類，諸如豬、牛、羊或類似者，用於動物園的動物諸如大象、駱駝或類似者，或用於家畜諸如狗、貓等。商業上重要的禽類可包括雞、鴨、鵝或類似者，且商業上培育之魚類及甲殼類諸如鱒魚及蝦亦被包括。
根據本發明之飼料組成物可以基於家畜飼料之乾重(dry weight)，每1公斤(kg)大約10克(g)至500克，較佳10克至100克的量被混合。在被完全混合後，飼料組成物較佳可以被作為粉料(mash)提供，或是進一步 受到粒化(pelletizing)、擴大(extensification)或是擠製(extrusion)程序。
根據本發明之在低溼度條件下製備大豆蛋白濃縮物的方法可在最少化處理步驟的同時增加水解效率。另外，由於其具有高含量之低分子量胜肽以及低含量之抗營養因子，由根據本發明的方法所製備的大豆蛋白濃縮物可增強動物之消化性，而因此在應用於作為飼料材料時展現絕佳效果。
圖1為顯示大豆蛋白濃縮物之SDS-PAGE結果的圖表。
圖2為顯示大豆蛋白濃縮物之TLC結果的圖表。
圖3為顯示根據含水量，使用衍生自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformi)之蛋白酶的大豆蛋白濃縮水解物之SDS-PAGE結果的圖表。
圖4為顯示當具有25重量%之含水量之大豆蛋白濃縮物被水解，根據蛋白酶之濃度及時間的大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
圖5為顯示當具有15重量%之含水量之大豆蛋白濃縮物被水解，根據蛋白酶之濃度及時間的大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
圖6為顯示根據含水量及酵素之大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
圖7為顯示根據含水量之使用衍生自枯草桿菌(Bacillus subtilis)之蛋白酶的大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
圖8為顯示在高溫條件下大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
此後，根據本發明之於低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物以及其製備將通過實例而被詳細敘述。然而，這些實例僅係用以達到說明之目的而提供，且不應被解釋為限制本發明之範圍者。此後，本發明將通過實例而被詳細敘述。
大豆蛋白濃縮物通過以酒精清洗大豆蛋白以移除大豆蛋白之外的組分，接著濃縮蛋白質。
根據實例1所製備的大豆蛋白濃縮物的含水量、蛋白質含量(protein content)、蛋白質降解及分子量分布，以及水溶性糖類組分以下列方式分析。
根據實例1所製備的大豆蛋白濃縮物之含水量係使用溼度計(moisture meter)而量測，且其蛋白質含量係使用凱氏定氮儀(Kjeldahl instrument)而量測。
表1顯示大豆蛋白濃縮物之粗蛋白質(crude protein)及含水量(%)的四次量測結果。根據量測結果，本發明之大豆蛋白濃縮物包含6%至8%之水分及約60%之蛋白質。
為了使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳，sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)量測蛋白質之分子量分布，100毫克(mg)之大豆蛋白濃縮物被懸浮於5毫升之8莫耳/公升(M)之尿素溶劑中，經超聲波震盪(sonicated)，且接著以8000rpm離心10分鐘以分離上清液。上清液以二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)定量並裝載於 SDS-PAGE膠上。
圖1為顯示大豆蛋白濃縮物之SDS-PAGE結果的圖表。參考圖1，第二行(lane 2)的大豆蛋白濃縮物是由具有範圍在20kDa至75kDa之各種分子量的次單元所組成的蛋白質(圖1，第一行：生物指標；第二行：大豆蛋白濃縮物)。包含於大豆蛋白濃縮物中的蛋白質包括，例如，大豆球蛋白(glycinin)以及β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)。
GPC(凝膠滲透層析，gel permeation chromatography)為在被量測之樣品中推導蛋白質分子量分布的方法，其是藉由分析具有不同分子量的標準蛋白質以決定每個蛋白質的滯留時間，並接著通過計算標準曲線而推導分子量及滯留時間之間的關係。更具體而言，在具有特定分子量之蛋白質的滯留時間被計算後，層析圖係根據時間而被分割成幾個區塊，且在整個層析圖區域中的每個分子量範圍之部分區域的比例被計算以推導蛋白質分子量分布。為了使用此GPC方法來量測大豆蛋白濃縮物的蛋白質分子量分布，100毫克之大豆蛋白濃縮物被懸浮於5毫升之8M尿素溶劑中，經超聲波震盪，並接著以8000rpm離心10分鐘以分離上清液。隨後，上清液通過0.45微米(μm)之針筒過濾器(syringe filter)而過濾，且濾液係由GPC分析。
表2顯示使用GPC所得之大豆蛋白濃縮物之蛋白質分子量分布的量測結果。根據表2，已確認的是含有70%或更多具有30kDa或更高之分子量之蛋白質的大豆蛋白濃縮物主要是由聚合物胜肽(polymer peptides)所構成。
為了藉由TLC(薄層層析術，thin-layer chromatography)進行大豆蛋白濃縮物中之水溶性糖類的定性分析，1克之大豆蛋白濃縮物係與25毫升之蒸餾水混合，且混合物在其沸點下被萃取20分鐘。在萃取程序後，水溶性糖類通過於37℃下在180rpm下攪拌2小時而被充分地萃取。所得之萃取物被離心，且上清液中之水溶性糖類組分係由TLC辨識。
圖2為顯示大豆蛋白濃縮物之TLC結果的圖表。參考圖2，大豆蛋白濃縮物包含水溶性糖類組分諸如葡萄糖、蔗糖、水蘇糖及棉子糖(圖2，第一行：控制組；第二至六行：5個種類各者之生產批次(production batch))。
表3顯示大豆蛋白濃縮物中經辨識之水溶性糖類組分(5個生產批次，1至5)。大豆蛋白濃縮物包括葡萄糖、蔗糖、水蘇糖，及棉子糖，且特別的是，葡萄糖係以非常少的量被包括於大豆蛋白濃縮物中。
實例1中所獲得之大豆蛋白濃縮物的七個實驗群組被製備。
各實驗群組之大豆蛋白濃縮物中之含水量被量測，且接著水被加入其中以控制含水量至分別為基於總重之10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%及40重量%。在各實驗群組中，衍生自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶(Prozyme AK)被以基於大豆蛋白濃縮物之重量的0.35重量%之量添加。在大豆蛋白濃縮物實驗群組中，酵素反應在60℃下被誘發並進行4小時，而水及蛋白酶被加入其中。為了量測酵素反應已完成之實驗群組中的蛋白質降解，實驗群組受到100℃，20分鐘的熱處理以終止酵素反應。酵素反應被終止之各實驗群組中的大豆蛋白濃縮物藉由乾燥及粉碎(pulverization)而獲得。在各實驗群組中之蛋白質降解及分子量分布由敘述於實例2，第2)點中之SDS-PAGE及GPC量測。
圖3為顯示根據含水量，使用衍生自地衣芽孢桿菌之蛋白酶的大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。參照圖3，已確認的是隨著酵素反應期間含水量的降低，低分子量胜肽的量增加，藉此增加蛋白質降解之程度(degree)。(圖3：第M行：生物指標；第1行：大豆蛋白濃縮物之原料；第2行：含水量40重量%；第3行：含水量35重量%；第4行：含水量30重量%；第5行：含水量25重量%；第6行：含水量20重量%；第7行：含水量15重量%；第8行：含水量10重量%)。
具體而言，於具有40重量%、35重量%及30重量%之高含水量的水解物中，構成大豆蛋白濃縮物之存在的聚合物蛋白質次單元(主要為30kDa或更高者)被相對地清楚顯示。然而，於25重量%之含水量下，蛋白質次單元的一些聚合物帶(polymer bands)消失，且低分子量胜肽之帶開始強烈地顯現。再者，已確認的是於15重量%及10重量%之含水量下的水解物大多(mostly)是由具有25kDa或更低之分子量的蛋白質所構成。
表4顯示根據水解前之含水量的大豆蛋白濃縮水解物之GPC量測結果。參考表4，隨著含水量降低，具有75kDa或更高之分子量的蛋白質之百分比降低，且低分子量胜肽之百分比逐漸增加。具體而言，在25重量%之含水量下，大豆蛋白水解物係由約80%之具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽所構成，且30kDa或更低之低分子量胜肽的含量隨著含水量進一步降低而增加。
意即，已確認的是，在使用含水量被控制於25%或更低之大豆蛋白濃縮物進行水解時，30kDa或更低之低分子量胜肽的含量被大幅增加。當水解係在低溼度條件下進行，不像一般在液相中進行的蛋白質水解反應，本案中最終產物乾燥的程序可以被省略，此是由於該反應之最終產物是固體，且最終水解物的生產所需之時間及成本可被降低。
根據用於處理具有相同含水量(包括基於總重之25重量%或15重量%之含水量)的大豆蛋白濃縮物的酵素之濃度而得的蛋白質降解及分子量分布被量測。
蛋白質降解及分子量分布係以與實例3相同的方式量測，除了含水量係控制於基於總重之25重量%或15重量%，且蛋白酶係在0.05重量%、0.1重量%、0.2重量%，及0.35重量%的濃度下(相對於大豆蛋白濃縮物之重量)進行處理並接著在60℃下反應。酵素反應係以1小時至4小時之間隔進行。各時間間隔及濃度的樣品在酵素反應後，藉由於100℃下加熱20分鐘而去活化。接著，通過乾燥及粉碎而製備分析樣品，且分析樣品之蛋白質 降解及分子量分布通過敘述於實例2第2)點之SDS-PAGE及GPC量測。
圖4為顯示根據蛋白酶濃度及時間，當含有25重量%之含水量之大豆蛋白濃縮物被水解時的大豆蛋白濃縮水解物之SDS-PAGE結果的圖表。參照圖4，當含有25重量%之含水量的大豆蛋白濃縮物被水解，蛋白質降解隨著蛋白酶濃度及該反應時間的增加而增加(圖4，第M行：生物指標；第1行：大豆蛋白濃縮物之原料；第2行：0.05重量%，1小時；第3行：0.05重量%，2小時；第4行：0.05重量%，3小時；第5行：0.05重量%，4小時；第6行：0.1重量%，1小時；第7行：0.1重量%，2小時；第8行：0.1重量%，3小時；第9行：0.1重量%，4小時；第10行：0.2重量%，1小時；第11行：0.2重量%，2小時；第12行：0.2重量%，3小時；第13行：0.2重量%，4小時；第14行：0.35重量%，1小時；第15行：0.35重量%，2小時；第16行：0.35重量%，3小時；第17行：0.35重量%，4小時)。
表5顯示根據蛋白酶濃度及時間，當包含25重量%之含水量的大豆蛋白濃縮物被水解之大豆代白濃縮物之水解物的GPC量測結果。
參照表5，已確認的是隨著酵素之濃度及反應時間的增加，高分子量蛋白質被分解成低分子量胜肽。更具體而言，當濃度0.1重量%之酵素被使用時，具有30kDa或更低之分子量的胜肽的含量平均為約50%或更多。當濃度0.2重量%之酵素被使用時，具有30kDa或更低之分子量的胜肽的含量平均為70%或更多。另外，當濃度0.35重量%之酵素被使用時，具有30kDa或更低之分子量的胜肽的含量平均為80%或更多。
圖5為顯示當根據蛋白酶濃度及時間，包含15重量%之含水量的大豆蛋白濃縮物被水解時之大豆蛋白濃縮水解物的SDS-PAGE結果的圖表。
參照圖5，當包含15重量%之大豆蛋白濃縮物被水解，蛋白質降解隨著蛋白酶濃度及反應時間增加而增加(圖5，第M行：生物指標；第 1行：0.05重量%，1小時；第2行：0.05重量%，2小時；第3行：0.05重量%，3小時；第4行：0.05重量%，4小時；第5行：0.1重量%，1小時；第6行：0.1重量%，2小時；第7行：0.1重量%，3小時；第8行：0.1重量%，4小時；第9行：0.2重量%，1小時；第10行：0.2重量%，2小時；第11行：0.2重量%，3小時；第12行：0.2重量%，4小時；第13行：0.35重量%，1小時；第14行：0.35重量%，2小時；第15行：0.35重量%，3小時；第16行：0.35重量%，4小時)。
表6顯示，根據蛋白酶濃度及時間當包含15重量%之含水量之大豆蛋白濃縮物被水解時的大豆蛋白濃縮物之水解物的GPC量測結果。
參照圖6，已確認的是隨著酵素濃度或反應時間增加，高分子量蛋白質被分解成低分子量胜肽。更具體而言，當0.1重量%之濃度的酵素被使用，具有10kDa或更低之分子量的胜肽之含量平均係約60%或更多，當0.35重量%之濃度的酵素被使用，具有10kDa或更低之分子量的胜肽之含量平均係約70%或更多。然而，具有30kDa或更低之分子量的胜肽之含量並未顯著增加，即使酵素之濃度自0.05重量%增加至0.35重量%，且其含量平均係約82%至87%或更多。
意即，已確認的是隨著酵素的濃度及反應時間增加，水解速率增加，且隨著大豆蛋白濃縮物之含水量降低，水解速率增加。
在量測於實例1中所獲得之大豆蛋白濃縮物中的含水量後，水被添加以將含水量控制於基於總重的15重量%及25重量%。基於大豆蛋白濃縮物之重量，0.35重量%之衍生自芽孢枯草桿菌之蛋白酶(Bision Biocam, Alphalase NP)或是衍生自地衣芽孢桿菌之蛋白酶(Bision Biocam,FoodPro Alkaline Protease)被補充(supplemented)給各實驗群組。酵素反應於添加水及酵素的大豆蛋白濃縮物中被誘發，條件為60℃，4小時。為了量測酵素反應已完成之實驗群組中的蛋白質降解程度，實驗群組在100℃下受到熱處理20分鐘以終止酵素反應。在各實驗群組中之大豆蛋白濃縮物被乾燥及粉碎。在各實驗群組中之蛋白質之降解及分子量分布由敘述於實例2第2)點之SDS-PAGE及GPC量測。
已確認的是在以酵素處理之大豆蛋白濃縮物的SDS-PAGE(圖6)及GPC(圖7)之兩個實驗結果中，與在25重量%之含水量下進行之水解相比，在15重量%之含水量下進行水解時低分子量胜肽的量較高(圖6，第M行：生物指標；第1行：大豆蛋白濃縮物之原料；第2行：衍生自芽孢枯草桿菌之蛋白酶，含水量25重量%；第3行：衍生自芽孢枯草桿菌之蛋白酶，含水量15重量%；第4行：衍生自地衣芽孢桿菌之蛋白酶，含水量25重量%；第5行：衍生自地衣芽孢桿菌之蛋白酶，含水量15重量%)。具體而言，根據圖6，具有15重量%之含水量的第3及5行，高分子量胜肽帶的存在變得模糊，而低分子量胜肽帶強烈顯現。再者，根據表7，以前述兩種酵素處理之大豆蛋白濃縮水解物的GPC實驗結果中，當使用衍生自芽孢枯草桿菌之蛋白酶時，在25重量%及15重量%的含水量下，具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽的組成比例分別是顯示為33.9%及68.1%，而當使用衍生自地衣芽孢桿菌之蛋白酶時，在25重量%及15重量%的含水量下，具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽的組成比例分別是顯示為69.1%及83.6%。意即，當衍生自芽孢枯草桿菌及地衣芽孢桿菌的蛋白酶被用於具有 低含水量之大豆蛋白濃縮物的水解時，已證實大豆蛋白濃縮物之降解已被顯著地增加。
在量測於實例1中獲得之大豆蛋白濃縮物的含水量後，水被添加以將含水量控制於基於總重的10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%，及40重量%。基於大豆蛋白濃縮物之重量的0.35重量%之衍生自枯草桿菌(Benesol,Alkaline protease)之蛋白酶被補充於各實驗群組。酵素反應於添加水及酵素的大豆蛋白濃縮物中被誘發，條件為45℃，4小時。隨後，為了量測酵素反應已完成之實驗群組中的蛋白質降解程度，實驗群組在100℃下受到熱處理20分鐘以終止酵素反應。在各實驗群 組中之大豆蛋白濃縮物被乾燥及粉碎。在各實驗群組中之蛋白質之分子量分布由敘述於實例2第2)點之SDS-PAGE及GPC量測。
根據量測結果，當使用酵素進行水解時，低分子量胜肽之量隨著大豆蛋白濃縮物中含水量降低而增加。特別是，當含水量為20重量%或更低，特別是15重量%或更低時，已確認的是低分子量胜肽之量顯著地高(圖7，第M行：生物指標；第1行：40重量%之含水量；第2行：35重量%之含水量；第3行：30重量%之含水量；第4行：25重量%之含水量；第5行：20重量%之含水量；第6行：15重量%之含水量；第7行：10重量%之含水量)。
表8顯示使用衍生自枯草桿菌之大豆蛋白濃縮水解物的GPC量測結果。
參考表8，當具有10重量%至20重量%之含水量的大豆蛋白濃縮物被水解，具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽的含量係約64% 至80%。意即，已確認的是即使使用衍生自枯草桿菌之酵素進行具有低含水量之大豆蛋白濃縮物的水解，蛋白質降解係大幅增加。
大豆蛋白濃縮物在酵素反應溫度為80℃時之水解度(level of hydrolysis)被確認。具有10重量%之含水量的大豆蛋白濃縮物被以0.2%(原料之重量比)之衍生自地衣芽孢桿菌(Prozyme AK)之酵素處理以在80℃進行酵素反應4小時。酵素反應已完成之樣品的蛋白質之降解及分子量分布由敘述於實例2第2)點之SDS-PAGE及GPC確認。
圖8為顯示在高溫下大豆蛋白濃縮水解物之SDS-PAGE結果的圖表。
參照圖8，已確認的是即使在80℃之高溫下，大豆蛋白濃縮物被水解，低分子量胜肽之含量亦藉此增加(圖8，第M行：生物指標；第1行：大豆蛋白濃縮物之原料；第2行：酵素反應物)。
表9顯示在高溫下之大豆蛋白濃縮水解物之GPC結果。
參照表9，已確認的是具有30kDa或更低之分子量的低分子量胜肽的含量係約84.2%，其係高程度(high level)的。因此，已確認即使在於約80℃之高溫下進行酵素反應，在具有低含水量之大豆蛋白濃縮物中進行水解，具有高含量之低分子量胜肽的大豆蛋白濃縮物之水解物可被製備。
Claims (10)
- 一種用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其包含：製備一大豆蛋白濃縮物；量測上述步驟中所獲得之該大豆蛋白濃縮物之含水量；基於上述步驟中所量測之含水量，控制該大豆蛋白濃縮物之含水量於基於該大豆蛋白濃縮物之總重的10重量%至低於30重量%；藉由添加一蛋白酶至該大豆蛋白濃縮物而水解該大豆蛋白濃縮物，其中該含水量係被控制；以及獲得於前述步驟中水解之大豆蛋白濃縮物。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中，在控制該大豆蛋白濃縮物之含水量的步驟中，含水量係被控制於基於該大豆蛋白濃縮物之總重的10重量%至25重量%。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中，該水解之大豆蛋白濃縮物包含30%至90%之具有30kDa或更低之分子量的胜肽。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中該蛋白酶係以基於該大豆蛋白濃縮物之總重的0.05%至0.5%之量被添加。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中，該蛋白酶係衍生自選自於由芽孢枯草桿菌、地衣芽孢桿菌，以及枯草桿菌所組成之群組之微生物的至少一種酵素。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中，水解該大豆蛋白濃縮物之步驟係在30℃至90℃下進行酵素反應30分鐘至300分鐘。
- 如請求項1所述之用於製備在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物的方法，其中，製備該大豆蛋白濃縮物的步驟係製備具有50重量%至70重量%之蛋白質含量且包含選自於由葡萄糖、蔗糖、水蘇糖及棉子糖所組成之群組之至少一糖類的大豆蛋白濃縮物的步驟。
- 一種在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物，其係根據請求項1至7之任一項所述的方法所製備。
- 如請求項8所述之在低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物，其中該水解之大豆蛋白濃縮物包含30%至90%之具有30kD或更低之分子量的胜肽。
- 一種飼料組成物，其包含請求項8或請求項9所述之大豆蛋白濃縮物。
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Family Applications (1)
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| TW107130539A TWI692308B (zh) | 2017-08-31 | 2018-08-31 | 低溼度條件下水解之大豆蛋白濃縮物及其製備方法 |
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| JPH06170414A (ja) | 1992-12-02 | 1994-06-21 | Sumitomo Metal Ind Ltd | 電縫鋼管の冷間圧延方法 |
| KR20020087571A (ko) * | 2001-05-14 | 2002-11-23 | 주식회사 인섹트 바이오텍 | 단백질 분해효소를 포함하는 사료첨가용 조성물 |
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| KR100612600B1 (ko) | 2003-12-24 | 2006-08-14 | 주식회사 신동방 | 저분자 대두 펩타이드의 제조방법 |
| KR100673433B1 (ko) * | 2005-07-15 | 2007-01-24 | 주식회사 계명푸덱스 | 관능미와 영양학적 특성이 향상된 저분자 전두유액의제조방법 |
| KR101139027B1 (ko) | 2009-09-09 | 2012-04-27 | 씨제이제일제당 (주) | 바실러스균을 이용한 발효 대두박의 제조방법 |
| KR101694908B1 (ko) * | 2014-06-18 | 2017-01-10 | 이화여자대학교 산학협력단 | 단백질 분해 효소를 이용한 알레르기 항원성이 저감화된 대두의 제조 방법 |
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2018
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- 2018-08-31 TW TW107130539A patent/TWI692308B/zh active
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN102018096A (zh) * | 2009-09-09 | 2011-04-20 | Cj第一制糖株式会社 | 使用杆菌菌株制备发酵大豆粉的方法 |
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Also Published As
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| KR20190024611A (ko) | 2019-03-08 |
| AR112992A1 (es) | 2020-01-15 |
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